Способ получения белков растительного происхождения

Способ получения белков растительного происхождения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способам приготовления белков растительного происхождения. Более конкретно, настоящее изобретение обеспечивает способы для получения белков, включающих белковые супраструктуры, из растений и растительных тканей.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В современных стратегиях рекомбинантной экспрессии в клетках-хозяевах, таких как Е. coli, культура клеток насекомых и культура клеток млекопитающих экспрессируют и выделяют белки в очень высокой степени в культуральную среду. При использовании этих систем высоких степеней экспрессии, достигается правильная укладка белка и посттрансляционная модификация белков. Более того, очистка экспрессированного белка упрощается, так как внутриклеточные белки могут быть быстро выделены из других компонентов (ДНК, пузырька, мембран, пигментов и так далее). В случае растительных или дрожжевых систем экспрессии оболочка клетки предотвращает выделение экспрессированного белка в культуральную среду.

Для получения клеточных экстрактов в науке широко используются различные подходы. Механические подходы с разрушением оболочки клетки и высвобождения ее содержимого обычно не являются селективными для конкретного класса белков или клеточных компонентов. При направлении экспрессии целевого белка в клеточную культуральную среду, становится возможным удаление внутриклеточных загрязняющих веществ центрифугированием или путем фильтрованием, что позволяет простое и быстрое обогащение целевого белка. Также может потребоваться разделение целевого белка или целевой белковой супраструктуры, включающей белковые розетки, наночастицы, большие белковые комплексы, антитела или вирусоподобные частицы (ВПЧ) и подобное от некоторых или всех белков, ДНК, фрагментов мембраны, пузырьков, пигментов, углеводов и т.д., присутствующих в растении или растительном материале до того, как целевая белковая супраструктура будет использоваться в составе вакцины.

Иммуноглобулины (IgGs) представляют собой комплексные гетеромультимерные белки с характерным сродством к специфическим антигенным аналогам различной природы. На сегодняшний день стандартное выделение IgG-продуцирующих клеточных линий и появляющиеся методики IgG-направленного развития и молекулярной инженерии оказали глубокое воздействие на их развитие в качестве биотерапевтических препаратов и на рынке общей медико-биологической науки. Терапевтические моноклональные IgG (моноклональные антитела, MAT) доминируют в настоящее время на рынке новых противовоспалительных и противораковых лекарственных средств, и сотни новых возможных средств в настоящее время находятся в стадии разработки и клинического развития для улучшенного или нового применения. Ежегодно на рынке требуются MAT в количестве от нескольких грамм (диагностические средства), нескольких килограмм (антитоксин) до вплоть одной или нескольких сотен килограмм (биозащита, противораковые, противоинфекционные и противовоспалительные средства). Способы производства модифицированных гликопротеинов из растений описаны в WO 2008/151440 (которая включена в настоящее описание посредством отсылки).

Способ экстрагирования белка из межклеточного пространства растений, включающий процесс вакуумирования и центрифугирования для того, чтобы получить экстракт межтканевой жидкости, включающей целевой белок, описан в публикации РСТ WO 00/09725 (Turpen et al.). Этот подход является подходящим для небольших белков (50 кДа или менее), которые проходят сквозь сеть микрофибр при вакуумировании и центрифугировании, но не подходит для больших белков, суперструктурных белков, белковых розеток, наночастиц, больших белковых комплексов, таких как антитела и ВПЧ.

В McCormick et al 1999 (Ргос Nati Acad Sci USA 96:703-708) раскрывается применение сигнального пептида амилазы риса, сшитого с одноцепочечным Fv-эпитопом (scFv), для направления экспрессированного белка во внеклеточное пространство с последующей вакуумной инфильтрацией ткани листа и стебля для выделения scFv-полипептидов. В Moehnke et al., 2008 (Biotechnol Lett 30:1259-1264) описывается применение способа вакуумной инфильтрации по McCormick для получения рекомбинантного растительного аллергена из табака с использованием апопластовой экстракции. В публикации РСТ WO 2003/025124 (Zhang et al) раскрывается экспрессия scFv-иммуноглобулинов в растениях, направленная на образование пространства апопласта, при использовании мышиных сигнальных последовательностей.

Вирусоподобные частицы (ВПЧ) могут применяться для приготовления противогриппозных вакцин. Супраструктуры, такие как ВПЧ, имитируют структуру вирусного капсида, но теряют геном и, таким образом, не могут реплицировать или обеспечить путь для повторного инфицирования. ВПЧ предлагают усовершенствованную альтернативу изолированным (растворимым) рекомбинантным антигенам для стимулирования сильного иммунного ответа. ВПЧ собираются в результате экспрессии специфических белков вируса и находятся на внешней поверхности, наподобие их когнатного вируса, но в отличие от истинной вирусной частицы не внедряют генетический материал. При нахождении антигенов в конкретной и мультивалентной структуре подобно исходному вирусу достигается улучшенное стимулирование иммунного ответа при сбалансированных гуморальных и клеточных компонентах. Такое улучшение стимулирования изолированными антигенами, как полагают, является особенно верным для вирусов с оболочкой, так как ВПЧ с оболочкой присутствуют на поверхности антигенов в их естественном мембраносвязанном состоянии (Grgacic and Anderson, 2006, Methods 40, 60-65). Более того, ВПЧ гриппа с их наноструктурной организацией показали, что они являются лучшими кандидатами для вакцины по сравнению с рекомбинантным гемагглютинином ГА (то есть мономерным ГА или ГА, сформированным в розетки; сборкой из 3-8 тримеров ГА), и они способны активировать как гуморальный, так и клеточный иммунный ответ (Bright, R.A., et. al., 2007, Vaccine 25, 3871-3878).

ВПЧ гриппа были получены в культивируемых клетках млекопитающих при совместной экспрессии всех 10 белков гриппа (Меnа et al., 1996, J. Virol. 70, 5016-5024). Несколько белков вируса являются не обязательными для образования ВПЧ, и ВПЧ гриппа для программ развития вакцин получают при совместной экспрессии 2 главных антигенных белков с оболочкой (ГА и НА) с Ml или при совместной экспрессии только ГА и M1 (Kang et al., 2009, Virus Res. 143,140-146). В Chen et al. (2007, J. Virol. 81, 7111-7123) было показано, что ГА в отдельности способен запускать образование и отпочковывание ВПЧ, и совместная экспрессия Ml может быть исключена в их системе. Однако поскольку было обнаружено, что ГА связывается с сиалированными гликопротеинами на поверхности клеток млекопитающих, образующих ВПЧ, сиалидаза вируса подвергалась совместной экспрессии для того, чтобы допустить высвобождение ВПЧ из продуцирующих клеток после отпочковывания.

В публикации РСТ WO 2006/119516 (Williamson и Rybicki) раскрывается экспрессия полного и процессированного человеческого кодона, оптимизированного Н5 ГА Гриппа A/Vietnam/1194/2004 в растениях. В процессированном конструкте отсутствует фиксирующий мембрану домен. Наибольшая концентрация белка ГА была получена с конструктами, которые направлены на ЭР. Конструкты, не имеющие направленного на мембраны домена, не образуют обнаруживаемого ГА. Об образовании ВПЧ не сообщалось.

Образование ВПЧ ГА гриппа, которые включают липидную оболочку, были ранее описаны изобретателями в WO 2009/009876 и WO 2009/076778 (tD'Aoust et al.; обе из которых включены в настоящее описание посредством отсылки). В случае вирусов с оболочкой может быть предпочтительным сохранять липидный слой или мембрану вируса. Состав липидного слоя может варьироваться в системе (например, полученный из растения вирус с оболочкой будет включать растительные липиды растений или фитостеролы в оболочке) и может вносить вклад в улучшение иммунного ответа.

Сборка ВПЧ с оболочками в трансгенном табаке, экспрессирующая поверхностный антиген вируса гепатита В (HBsAg), была описана в Mason et al.(1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 11745-11749). Показали, что полученные из растений ВПЧ вируса гепатита В вызывают сильные иммунные ответы В- и Т-клеток у мышей при парентеральном введении (Huang et al., 2005, Vaccine 23,1851 -1858), но пероральная иммунизация при исследованиях с введением препарата в пищу вызывала только умеренный иммунный ответ (Smith et al., 2003, Vaccine 21,4011-4021). В Greco (2007, Vaccine 25, 8228-8240) показано, что эпитопы вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) при слиянии с HBsAg, накапливались в качестве ВПЧ при экспрессии в трансгенном табаке и Arabidopsis с образованием бивалентной вакцины ВПЧ.

Экспрессия вирусного капсидного белка (NVCP) в трансгенном табаке и картофеле привело к сборке ВПЧ без оболочек (Mason et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 5335-5340). ВПЧ NVCP образовывались в агроинфильтрованных листьях N. benthamiana (Huang et al. 2009, Biotechnol. Bioeng. 103, 706-714), и их иммуногенность при пероральном введении продемонстрирована на мышах (Santi et al., 2008, Vaccine 26,1846-1854). Введение 2 или 3 доз сырых картофелин, содержащих 215-751 мкг NVCP в виде ВПЧ здоровьм взрослым добровольцам привело к появлению иммунного ответа у 95% иммунизированных добровольцев (Tacket et al. 2000, J. Infect. Dis. 182, 302-305). ВПЧ без оболочки также были получены из экспрессии корового антигена вируса гепатита В (HBcAg; Huang et al., 2009, Biotechnol. Bioeng. 103,706-714) и главного капсидного белка LI вируса папилломы человека (HPV) (Varsani et al., 2003, Arch Virol. 148, 1771-1786).

Требуется более простой белок или система продуцирования белковой супраструктуры, например, та, которая основывается на экспрессии только одного или нескольких белков. Продуцирование белков или белковых супраструктур, например, но не ограничиваясь, белковых розеток, наночастиц, больших белковых комплексов, таких как антитела или ВПЧ, в растительных системах является предпочтительным, в том, что растения можно вырастить в теплице или на поле, и не требуется асептических способов выращивания и обработки тканевой культуры.

Необходимы способы приготовления белков или белков, или супраструктурных белков, которые по существу не содержат растительных белков или легко от них отделяются, сохраняя, тем не менее, структуру и характеристики белка.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способам приготовления белков растительного происхождения. Более конкретно настоящее изобретение обеспечивает способы получения белков, включающих белковые супраструктуры, из растений и растительных тканей.

Объектом изобретения является обеспечение улучшенного способа приготовления белков растительного происхождения.

Настоящее изобретение обеспечивает способ (А) приготовления белков растительного происхождения или белков, или супраструктурных белков, включающий получение растения или растительного материала, включающего белки растительного происхождения или супраструктурных белков, локализованные в апопласте; получение протопласта и фракции апопласта, причем фракция апопласта включает белки растительного происхождения или супраструктурные белки; и выделение фракции апопласта. Способ может далее включать стадию очистки белков растительного происхождения, или белков, или супраструктурных белков из фракции апопласта. Белки растительного происхождения, или белки, или супраструктурные белки могут быть химерными белками растительного происхождения или супраструктурным белком. Белки растительного происхождения, или белки, или супраструктурные белки могут быть гетерологичными по отношению к растению. Белки растительного происхождения, или белки, или супраструктурные белки могут включать белковую розетку, белковый комплекс, протеасому, метаболон, транскрипционный комплекс, рекомбинантный комплекс, фотосинтетический комплекс, комплекс переноса через мембрану, комплекс ядерной поры, белковую наночастицу, гликопротеин, антитело, поликлональное антитело, моноклональное антитело, одноцепочечное моноклональное антитело, вирусоподобную частицу, белок оболочки вируса, структурный белок вируса, вирусный капсидный белок и белок вирусной оболочки, химерный белок, химерный белковый комплекс, химерную белковую наночастицу, химерный гликопротеин, химерное антитело, химерное моноклональное антитело, химерное одноцепочечное моноклональное антитело, химерный гемагглютинин, белок оболочки вируса, структурный белок вируса, вирусный капсидный белок и белок вирусной оболочки. Моноклональное антитело растительного происхождения может содержать химерное моноклональное антитело мыши, человека, например, но не ограничиваясь С2 В8. ВПЧ растительного происхождения могут включать гемагглютинин гриппа.

Фракции апопласта и протопласта могут быть получены путем обработки растения или растительного материала ферментной композицией. Ферментная композиция может включать одну или более чем одну пектиназу, одну или более чем одну целлюлазу или одну или более чем одну пектиназу и одну или более чем одну целлюлазу. Более того, если требуется, ферментная композиция не включает липазу или протеазу или композиция не включает добавленную липазу или протеазу.

Растение или растительный материал могут быть получены путем выращивания, сбора или выращивания и сбора. Растительный материал может включать несколько или все из растений, одну или более чем одну клетку растения, листья, стебли, корни или культивированные клетки растений.

Настоящее изобретение обеспечивает способ приготовления белков растительного происхождения или белков, или супраструктурных белков, как описано выше (Способ А), где нуклеиновая кислота, кодирующая белки или супраструктурные белки, вводится в растение транзиторным образом. В качестве альтернативы нуклеиновая кислота стабильно интегрируется в геном растения.

Настоящее изобретение обеспечивает способ приготовления белков растительного происхождения или супраструктурных белков, как описано выше (Способ А), далее включающий стадию очистки белков растительного происхождения или супраструктурных белков из фракции апопласта. Стадия очистки может включать фильтрование фракции апопласта с образованием осветленного экстракта с последующей хроматографией осветленного экстракта с использованием катионнобменной смолы, аффинной хроматографии, размерно-эксклюзионной хроматографии или их комбинаций.

Не желая быть связанными с теорией, белки, полученные из апопласта являются более гомогенными чем промежуточные формы посттрансляционных модифицированных белков или белки других видов обработки, которые встречаются в различных внутриклеточных пространствах, например, митохондриях, хлоропласте и других органеллах не подвергаются совместной экстракции. Наибольшая степень гомогенности рекомбинантного белка, как правило, приводит к более высокому качеству состава, содержащего белок, и может привести к продукту с полезными свойствами, включающими более высокий потенциал, больший период полураспада или улучшенную иммуногенную способность. Например, белки крови, содержащие высокоманнозное гликолизирование, расщепляются в кровотоке более быстро, чем белки, включающие комплексное гликолизирование. При получении гликолизированного белка во фракции апопласта в большей степени проявляется тип комплексного гликолизирования. Таким образом, полученный из апопласта протеин, приготовленный с использованием способов, описанных в настоящей заявке, включающих расщепление оболочки клетки, проявляет, например, улучшенный период полураспада в кровотоке.

Белки растительного происхождения или супраструктурные белки могут включать белковые розетки, белковые комплексы, белковые наночастицы, антитела, моноклональные антитела, ВПЧ. ВПЧ могут включать один или более полипептидов ГА гриппа. Супраструктурный белок может быть химерным супраструктурным белком, например, моноклональное антитело может быть химерным моноклональным антителом, или полипептид ГА гриппа может быть химерным полипептидом ГА. Если супраструктурный белок представляет собой ВПЧ, тогда ВПЧ растительного происхождения может также иметь гемагглютинирующую активность. Растение или растительный материал могут быть получены путем выращивания, сбора или выращивания и сбора растения. Растительный материал может включать несколько или все растенияй, одну или более чем одну растительную клетку, листья, стебли, корни или культивированные клетки растений.

Настоящее изобретение также обеспечивает способ (В) приготовления белков растительного происхождения или супраструктурных белков, включающий получение растения или растительного материала, включающего белки растительного происхождения или супраструктурные белки, расщепление растительного материала с использованием разрушающей оболочку клетки ферментной композиции с образованием расщепленной фракции, и фильтрование расщепленной фракции с получением отфильтрованной фракции, и выделение белков растительного происхождения или супраструктурных белков из отфильтрованной фракции.

Ферментная композиция может включать одну или более чем одну пектиназу, одну или более чем одну целлюлозу или одну или более чем одну пектиназу и одну или более чем целлюлазу. Более того, если требуется, ферментная композиция не включает липазу или протеазу или композиция не включает добавленную липазу или протеазу. Супраструктурный белок растительного происхождения может быть химерным супраструктурным белком растительного происхождения. Супраструктурный белок растительного происхождения может включать белковую розетку, белковый комплекс, протеасому, метаболой, транскрипционный комплекс, рекомбинантный комплекс, фотосинтетический комплекс, комплекс переноса через мембрану, комплекс ядерной поры, белковую наночастицу, гликопротеин, антитело, поликлональное антитело, моноклональное антитело, одноцепочечное моноклональное антитело, вирусоподобную частицу, белок оболочки вируса, структурный белок вируса, вирусный капсидный белок и белок вирусной оболочки, химерный белок, химерный белковый комплекс, наночастицу химерного белка, химерный гликопротеин, химерное антитело, химерное моноклональное антитело, химерное одноцепочечное моноклональное антитело, химерный гемагглютинин, белок оболочки вируса, структурный белок вируса, вирусный капсидный белок и белок вирусной оболочки. Моноклональное антитело растительного происхождения может включать химерное мышиночеловеческое моноклональное антитело, например, но не ограничиваясь, С2 В8. ВПЧ растительного происхождения могут включать гемагглютинин гриппа.

Настоящее изобретение обеспечивает способ приготовления белков растительного происхождения или супраструктурных белков, как описано выше (Способ В), где нуклеиновая кислота, кодирующая белки или супраструктурные белки, вводится в растение транзиторным методом. В качестве альтернативы нуклеиновая кислота стабильно встраивается в геном растения.

Настоящее изобретение обеспечивает способ приготовления ВПЧ растительного происхождения, как описано выше (Способ В), далее включающий стадию разделения белков или супраструктурных белков в отфильтрованной фракции от продуктов распада клетки и нерастворимых материалов. Стадия разделения может быть проведена путем центрифугирования, глубинной фильтрации или как центрифугированием, так и глубинной фильтрацией с получением осветленной фракции. Белки растительного происхождения или супраструктурные могут быть далее очищены хроматографией, например, осветленный экстракт может быть очищен с использованием катионообменной смолы, аффинной смолы, размерно-эксклюзионной хроматографии или их комбинаций.

Белки растительного происхождения или супраструктурные белки могут включать белковые розетки, белковые комплексы, белковые наночастицы, антитела, моноклональные антитела, ВПЧ. ВПЧ могут включать один или более полипептидов ГА гриппа. Супраструктурный белок может быть химерным супраструктурным белком, например, моноклональное антитело может быть химерным моноклональным антителом или полипептид ГА гриппа может быть химерным полипептидом ГА. Если супраструктурный белок представляет собой ВПЧ, тогда ВПЧ растительного происхождения может также иметь гемагглютинирующую активность.

Не желая быть связанными с теорией, полученные из растений ВПЧ, содержащие липиды растительного происхождения, могут вызывать более сильную иммунную реакцию, чем ВПЧ, полученные в других системах производства, и указанная иммунная реакция, вызываемая этими полученными из растений ВПЧ, является более сильной по сравнению с имунной реакцией, вызванной вакцинами живого или ослабленного цельного вируса.

Композиция белкового экстракта, полученная из клетки-хозяина, представляет собой комплекс и, как правило, включает, межклеточные и внутриклеточные компоненты наряду с белком или целевой супраструктурой, которые необходимо выделить. Приготовление фракции апопласта с последующей стадией разделения внутриклеточных белков и компонентов является предпочтительным, так как целевые белок или супраструктура могут быть обогащены, и увеличена эффективность в ходе процесса производства. Имея более простой способ, включающий меньшее количество эффективных стадий, это может привести к значительному увеличению выхода и снижению стоимости. Также было обнаружено, что при процессе расщепления оболочки клетки с применением расщепляющих оболочку клетки ферментов увеличивается выход супраструктурного белка даже, если протопласты не остаются интактными в ходе процедуры экстракции. Не желая быть связанными с теорией, на стадии расщепления клеточной оболочки полимерные компоненты клеточной оболочки могут разрыхляться и способствовать высвобождению белков или супраструктурных белков, в иных случаях объединенных внутри оболочки клетки. При указанной процедуре также может минимизироваться загрязнение белков или супраструктурных белков межклеточными компонентами.

Способы расщепления оболочек растительных клеток являются известными, и смеси ферментов, которые расщепляют оболочки клеток, могут варьироваться. Настоящее изобретение не ограничивается используемьм методом расщепления оболочки клетки.

Способы, описанные в настоящей заявке, приводят к меньшему разрушению и загрязнению экстракта супраструктурного белка растительного происхождения по сравнению с методами приготовления супраструктурного белка растительного происхождения, включающими гомогенизацию, смешивание или перемалывание. В способах, описанных в настоящей заявке, обеспечивается фракция апопласта растительной ткани, и, тем самым, может сохраняться целостность протопластов и их компонентов. Способ, как он описан в настоящей заявке, является эффективным при очищении белков или супраструктурных белков, даже если протопласты или часть протопластов теряют свою целостность и больше не являются интактными.

Эти способы обеспечивают более высокий выход белков или супраструктурных белков по сравнению со способами экстракции супраструктурных белков, включающими стандартные методики разрушения ткани, например, гомогенизацию, смешивание или перемалывание. Больший выход может быть получен отчасти благодаря снижению сил сдвига, которые разрушают структурную целостность белков или супраструктурных белков, и в случае ВПЧ, липидную оболочку. Приготовление белков или супраструктурных белков из фракции апопласта может быть предпочтительным, так как во фракциях апопласта значительно уменьшены или отсутствуют цитоплазматические белки. Таким образом, отделение супраструктурного белка от других белков и материалов, включающих мономеры, димеры, тримеры или фрагменты супраструктурных белков, во фракции апопласта осуществляется легко. Однако увеличенные выходы белков или супраструктурных белков также могут быть получены с использованием способов, описанных в настоящей заявке, даже если приготовление протопласта или приготовление части протопласта не является интактным.

Гликопротеины, включающие супраструктурыне гликопротеины, например, моноклональные антитела, которые секретируют в апопласт, включают больший процент N-гликанов, у которых завершено деление, включают терминальные N-ацетилглюкозаминнные или галактозные остатки (комплекс N-гликанов) по сранению с экстракционными способами, при которых не расщепляется оболочка клетки, например, смешивание экстрагированных растений. Обнаружено, что супраструктурные гликопротеины, например, моноклональные антитела, включающие комплекс N-гликанов, проявляют полезное свойство увеличенного периода полураспада в кровотоке по сравнению с моноклональными антителами, включающими терминальные остатки маннозы (незрелые N-гликаны).

При использовании ферментного расщепления оболочки клеток может быть возможным высвобождение пула антител апопласта, включающих N-гликаны, у которых завершено деление. Этот способ экстракции может позволить выделение обогащенную популяции или гомогенной популяции гликозилированных антител, содержащих комплекс N-гликанов, при выделении незрелых форм гликолизированных антител во фракции протопласта. Если требуется пул антител, содержащих комплекс N-гликанов, фракция протопласта может быть сохранена, а антитела выделены из фракции протопласта.

ВПЧ по настоящему изобретению также характеризуются как проявляющие более высокую гемагглютининовую активность, чем те, которые получены при использовании стандартных методик разрушения ткани. Эта улучшенная гемагглютинирующая активность может быть результатом большего выхода интактных ВПЧ (меньше свободных мономеров или тримеров ГА в растворе), большего выхода интактных ВПЧ с интактными липидными оболочками или их комбинации.

Вакцины, полученные с применением ВПЧ, обеспечивают преимущество по сравнению с вакцинами, полученными из цельных вирусов, которые являются неинфекционными. Таким образом, биологическое сдерживание не является проблемой, и это не требуется для производства. Полученные из растения ВПЧ обеспечивают еще одно преимущество, позволяющее выращивать систему экспрессии расти в теплице или на поле, будучи тем самьм значительно более экономичными и подходящими для увеличеннных масштабов.

В дополнение к этому, растения не включают ферменты, связанные с синтезом и добавлением остатков сиаловой кислоты к белкам. ВПЧ могут быть получены в отсутствие нейраминидазы (НА), и нет необходимости в совместной экспрессии НА или в обработке продуцирующих клеток или экстракта сиалидазой (нейраминидазой) для гарантированного производства ВПЧ в растениях.

Это краткое описание изобретения не обязательно описывает все признаки изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Эти и другие признаки изобретения будут более понятными из следующего описания, в котором сделана ссылка на приложенные чертежи, где:

На Фигуре 1 показано схематическое изображение основанной на CPMVHT экспрессионной кассеты (конструкт 685) для экспрессии гемагглютинина Н5 A/Indonesia/5/05.

На Фигуре 2А изображена нуклеиновокислотная последовательность (SEQ ID NO. 1) части конструкта для экспрессии H5/Indo (конструкт номер 685) от РасI (против хода промотора 35S) до AscI (непосредственно по ходу терминатора NOS). Кодирующая последовательность Н5 из A/Indonesia/5/2005 подчеркнута. На Фигуре 2В изображена аминокислотная последовательность (SEQ ID NO. 2) гемагглютинина Н5 A/Indonesia/5/05, кодированного конструктом номер 685.

На Фигуре 3 изображена характеристика содержащих гемагглютинин (ГА) структур, полученная эксклюзионной хроматографией (SEC). После центрифугирования расщепленного растительного экстракта пеллет ресуспендировали и разделяли на фракции с помощью SEC. На Фигуре 3А показано общее содержание растворимого белка на фракцию (сплошные треугольники; % от максимального, левая ось Y; определено с использованием метода Брэдфорд). Также показана гемагглютинирующая активность собранных фракций (сплошные полоски, правая ось Y). На Фигуре 3В показан анализ с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) элюированных с помощью SEC фракций. Фракции были осаждены ацетоном и ресуспендированы в 1/40 объем восстанавливающего буфера для нанесенияобразца до анализа. Гель был окрашен 0.1% раствором Кумасси R-250. Очищенные ВПЧ использовались в качестве контроля. Полоса, соответствующая мономеру ГАО, указана стрелкой. MM - Молекулярная масса стандартов (кДа); С - Очищенные ВПЧ (контроль); полосы от 7 до 10 и от 14 до 16 соответствуют номеру фракций, элюированных при анализе SEC, показаны на Фигуре 3А.

На Фигуре 4 показано сравнение профилей белков, полученных после ферментного расщепления и путем механической гомогенизации с использованием гомогенизатора Comitrol. Образцы обрабатывали в денатурирующем буфере для нанесения образца, и белки разделялись с помощью анализа SDS-PAGE элюированных фракций. Гели были окрашены 0.1% раствором Кумасси R-250. MM - Молекулярная масса стандартов (кДа); полоса 1-25 мкл ферментной смеси; полоса 2-25 мкл ферментного расщепления растительной ткани и полоса 3-35 мкл экстракта, полученного в гомогенизаторе Comitrol.

На Фигуре 5 изображена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 9) экспрессионной кассеты ГА, включающей промотер пластоцианина люцерны и 5' UTR, гемагглютинин, кодирующий последовательность Н5 из A/Indonesia/5/2005 (Конструкт №660), 3' UTR пластоцианина люцерны и терминирующей последовательности.

На Фигуре 6 изображен захват ГА-ВПЧ на катионообменной смоле, непосредственно образующий выделение ГА-ВПЧ во фракцию апопласта. Образцы были обработаны в невосстанавливающем денатурирующем буфере для нанесения образца, и белки выделяли SDS-PAGE. Гели были окрашены 0.1% раствором Кумасси R-250. Полоса 1: Фракция апопласта после центрифугирования, Полоса 2-3: Фракция апопласта после успешной микрофильтрации; Полоса 4: Загрузка катионообменной смолы; Полоса 5: Поток через фракцию катионообменной смолы; Полоса 6: элюирование из катионообменника, сконцентитрованна 10Х; Полоса 7: Молекулярная масса стандартов (кДа).

На Фигуре 7 изображен профиль, полученный способом Nanoparticles Tracking analysis (NTA), ВПЧ H5/Indo (Фигура 7А) и ВПЧ Hl/Cal (Фигура 7В) после осветления без добавления NaCl к расщепляющему буферу и ВПЧ Hl/Cal (Фигура 7С) с таким добавлением. Эксперименты NTA проводили с NanoSight LM20 (NanoSight, Amesbury, UK). Инструмент оборудован синим лазером (405 нм), камерой для проб и фторопластовым уплотнительным кольцом Viton. При комнатной температуре были записаны видеоролики и проанализированы с использованием программного обеспечения NTA 2.0. Образцы записывались в течение 60 сек. Выдержку и диафрагму выбирали вручную таким образом, чтобы получить оптимальное разрешение частиц.

На Фигуре 8 показан Вестерн-блоттинг экстракта ВПЧ НЗ/Brisbane, полученного при ферментном расщеплении с использованием различных буферов. Полоса 1) Стандарт чистого рекомбинантного ГА (5 мкг из Immune Technology Corp.IT-003-0042p), Полоса 2-5 содержит 7 мкл центрифугированного ферментного экстракта, полученного в следующих буферах:

Полоса 2) 600 мМ маннита+125 мМ цитрата+75 мМ NaPO₄+25 мМ ЭДТА+0.04% бисульфита рН 6.2, Полоса 3) 600 мМ маннита+125 мМ цитрата+75 мМ NaPO₄+50 мМ ЭДТА+0.04% бисульфита рН 6.2, Полоса 4) 200 мМ маннита+125 мМ цитрата+75 мМ NaPO₄+25 мМ ЭДТА+0.03% бисульфита рН 6.2, Полоса 5) 200 мМ маннита+125 мМ цитрата+75 мМ NaPO₄+50 мМ ЭДТА+0.03% бисульфита рН 6.2. Стрелка показывает сигнал иммунодетекции ГАО.

На Фигуре 9 изображена последовательность фрагмента ДНК, синтезированного для сборки конструкта №590 (фрагмент LC; (SEQ ID NO.15).

На Фигуре 10 изображена последовательность фрагмента ДНК, синтезированного для сборки конструкта №592 (фрагмент НС; (SEQ ID NO.16).

На Фигуре 11А и Фигуре 11В показано схематическое изображение конструктов №595 (Фигура 11А) и №R472 (Фигура 11В) соответственно.

Фигура 12 SDS-PAGE сравнение антител, очищенных из экстрактов, образованных в результате механического разрушения (экстракция в измельчителе) и ферментного расщепления оболочек клетки. Для каждого способа экстракции, получали и очищали две партии независимо друг от друга.

На Фигуре 13А показано сравнение части олигоманнозных N-гликанов на С2 В8, очищенных с помощью механического разрушения (экстракция в измельчителе) и ферментного расщепления оболочек клеток.

На Фигуре 13В показано сравнение части комплекса N-гликанов на С2 В8, очищенных с помощью механического разрушения (экстракция в измельчителе) и ферментного расщепления оболочек клеток.

ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способам приготовления белков растительного происхождения. Более конкретно настоящее изобретения обеспечивает способы получения белков, или белков, или белков, или супраструктурных белков из растений и растительных тканей.

Нижеследующее описание является предпочтительным воплощением.

Настоящее изобретение обеспечивает способ получения целевых белка или белковой супраструктуры. Целевой белок может находиться в апопласте или внеклеточном пространстве, соответствующем части растительной клетки, не включающей пространство протопласта/сферопласта. Способ включает удаление, расщепление или как расщепление, так и удаление целлюлозной оболочки клетки, которая окружает растительные клетки. При расщеплении оболочки клетки полимерные компоненты оболочки клетки разрыхляются, и целевые белок или белки, или белки, или супраструктурные белки могут более легко высвобождаться. При использовании этого способа целевые белок или белки, или белки, или супраструктурные белки обогащаются, так как пространство протопласта/сферопласта, которое содержит большую часть белков и компонентов клеток-хозяев, выделяется из апопласта. Как отмечено ниже, способ в соответствии с настоящей заявкой, все равно является эффективным при получении целевого белка или белковой супраструктуры, если в ходе процесса нарушается целостность пространства протопласта/сферопласта, если пространство протопласта/сферопласта не является интактным, и если часть белков и компонентов клетки-хозяина пространства протопласта/сферопласта находятся во фракции апопласта. При использовании способов, описанных ниже, если нарушается целостность пространства протопласта/сферопласта, белок или белковую супраструктуру все равно можно отделить от интактных органелл, включающих митохондрию, хлоропласт и другие органеллы, и по-прежнему могут быть получены благоприятные результаты.

Под «белком» или «целевым белком» (эти термины используются взаимозаменяемо) понимается белок или белковая субъединица, закодированная нуклеотидной последовательностью, или кодирующим участком таким образом, чтобы быть экспрессированным в растении или части растения. Белки могут иметь молекулярную массу от около 1 до около 100 кДа или какую угодно между ними, например, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 кДа или какую угодно между ними. Белок может быть мономерным, двумерным, трехмерным или мультимерным.

Белковая супраструктура, также называемая супраструктурным белком, белковой суперструктурой или суперструктурным белком, представляет собой белковую структуру, состоящую из двух или более полипептидов. Полипептиды могут быть одинаковыми или разными; если разные, они могут присутствовать в соотношении от около 1:1 до около 10:1 или больше. Супраструктурные белки могут включать, но не ограничиваясь, белковые розетки, белковые комплексы, белковые наночастицы, гликопротеины, антитела, поликлональные антитела, моноклональные антитела, одноцепочечные моноклональные антитела или вирусоподобные частицы, протеасомы, метаболоны, транскрипционные комплексы, рекомбинантные комплексы, фотосинтетические комплексы, комплексы переноса через мембрану, комплексы ядерной поры, химерные белки, химерные белковые комплексы, наночастицы химерного белка, химерные гликопротеины, химерные антитела, химерные моноклональные антитела, химерные одноцепочечные моноклональные антитела или химерный гемагглютинин (ГА). Если белковая супраструктура представляет собой ВПЧ, ВПЧ может быть выбрана из группы белков оболочки вируса, структурных белков вируса, вирусных капсидных белков и белков вирусной оболочки. ВПЧ растительного происхождения могут включать вирус гриппа (ГА).

Как правило, белковая супраструктура (белковая суперструктура) при объединении являет