Композиции рекомбинантного cdv и ее применение

Композиции рекомбинантного cdv и ее применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Данная заявка притязает на преимущество предварительной заявки на патент США, №61/308620, поданной 26 февраля 2010.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к композициям для борьбы с вирусом чумы плотоядных и другими вирусными инфекциями собачьих у животных. Конкретно настоящее изобретение относится к векторам, которые содержат и экспрессируют in vivo или in vitro CDV НА, которые вызывают иммунную реакцию у животных против вируса чумы плотоядных, включая композиции, содержащие указанные векторы, способы вакцинации против вируса чумы плотоядных и наборы для применения с такими способами и композициями. Настоящее изобретение также относится к векторам, которые содержат и экспрессируют in vivo или in vitro CDV НА и GM-CSF, которые вызывают иммунную реакцию у животных против вируса чумы плотоядных и других вирусов собачьих, и к композициям, содержащим указанные векторы.

Предпосылки создания изобретения

Чума плотоядных (CD) является высоко инфекционным лихорадочным заболеванием собак и других плотоядных (Fenner et al., 1987, Veterinary Virology, Academic Press, Inc., pp.485-503). Показатель смертности высокий, колеблющийся от 30 до 80 процентов. Выжившие собаки часто имеют необратимое повреждение центральной нервной системы (Fenner et al., 1987). Установленная этиология CD представляет собой заражение членом семейства парамиксовирусов рода Morbillivirus, известного как вирус CD (CDV). Вообще парамиксовирусы являются оболочечными вирусами, содержащими геном одноцепочечной РНК в 18-20 т.п.о. отрицательной полярности. Геном кодирует 5-7 структурных белков, включая гибридный (F) гликопротеин и гликопротеин или гемагглютинин-нейроамидазу (NH) или гемагглютинин (НА). Мембранный гликопротеин гемагглютинин (НА) ответственен за гемагглютинацию и присоединение вируса к клетке-хозяину, и гибридный гликопротеин (F) вызывает слияние мембран между вирусом и инфицированной клеткой или между инфицированной и соседней неинфицированной клетками (Graves et al., 1978, Virology, 86:254-263). В случае CDV обнаружено, что в оболочке вируса и на поверхности инфицированных клеток присутствуют гликопротеины как F, так и НА. По заключению из анализов с другими членами Morbillivirus оказывается, что гликопротеины CDV F и НА важны для заражения CDV и его иммунобиологии (Diallo А., 1990, Vet. Micro., 23:155-163). Разработаны вакцины с рекомбинантным CDV на основе поксвирусов для защиты и лечения собак (US 5756102). В заявке на патент США USSN 09/587964 раскрываются вакцины на основе плазмиды ДНК, экспрессирующие антигены CDV.

Гранулоцитарно-макрофагиальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) впервые обнаружен в 1977 (Burgess et al., 1977, J. Biol. Chem., 252:1998-2003). GM-CSF играет несколько физиологических ролей. В частности, GM-CSF стимулирует продуцирование, развитие и образование колоний гранулоцитов, макрофагов, эозинофилов и мегакариоцитов (Dy М., в «Les Cytokines», Cavailon, 1995, ed. Masson, Paris, France, 43-56). В частности, GM-CSF индуцирует макрофагиальную цитотоксичность, стимулирует антителозависимую цитотоксическую активность (ADCC) и рекрутинг лейкоцитов на уровне зон воспаления.

Размеры нуклеотидных последовательностей, кодирующих известные GM-CSF различных видов, изменяются от 381 до 432 нуклеотидов. Нуклеотидные последовательности человека и мыши имеют степень гомологии 69%. На уровне аминокислотной последовательности степень гомологии составляет 54% (Cantrell et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:6250-6254). Идентифицирован GM-CSF лошади, который имеет размер 144 аминокислоты (US 7250161). В US 5702919 и US 5606024 идентифицированы два GM-CSF собачьих, которые имеют 127 аминокислот и 174 аминокислоты, соответственно.

Введение гетерологичного GM-CSF не дает возможности получить оптимальный полезный эффект, в частности, стимуляцию активности кроветворных клеток и существенное возрастание иммунной реакции.

Таким образом, существует общая потребность в улучшении эффективности и безопасности CDV-вакцин и в более эффективной защите в полевых условиях.

Изобретение предлагает решение для оптимизации иммунологического действия caGM-CSF при сохранении в то же время высокой безопасности для вакцинированных собак.

Сущность изобретения

Предметом данного изобретения могут быть любой один или все рекомбинантные векторы или вирусы, а также способы получения таких векторов и композиции и/или вакцины, а также способы лечения и профилактики заражения CDV и другим вирусом собачьих.

Изобретение относится к рекомбинантному вектору, такому как рекомбинантный вирус, который содержит и экспрессирует по меньшей мере одну молекулу экзогенной нуклеиновой кислоты и по меньшей мере одна молекула экзогенной нуклеиновой кислоты может включать молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей представляющий интерес иммуноген или эпитоп из CDV, такой как CDV НА.

Изобретение относится к рекомбинантному вектору, такому как рекомбинантный поксвирус, который содержит первый полинуклеотид, кодирующий полипептид CDV НА и/или его вариант или фрагмент, и второй полинуклеотид, кодирующий полипептид GM-CSF собачьих и/или его вариант или фрагмент.

Изобретение также относится к композициям или вакцинам, содержащим такой экспрессирующий вектор или продукт(ы) экспрессии такого экспрессирующего вектора.

Изобретение также относится к способам индукции иммунологической (или иммуногенной) или защитной реакции против CDV и другого вируса собачьих, а также к способам предупреждения или лечения от CDV и другого вируса собачьих или болезненного(ых) состояния(ий), вызванного(ых) CDV и другим вирусом собачьих, включающим введение экспрессирующего вектора или продукта экспрессии экспрессирующего вектора или композиции, содержащей экспрессирующий вектор, или композиции, содержащей продукт экспрессии экспрессирующего вектора.

Изобретение также относится к продуктам экспрессии из вируса, а также антителам, генерированным из продуктов экспрессии, или их экспрессии in vivo, и использованию таких продуктов и антител, например, в применениях при диагностике.

Такие и другие воплощения раскрываются или становятся очевидными из последующего подробного описания и охватываются им.

Краткое описание чертежей

Последующее подробное описание, данное как примеры конкретных описанных воплощений, не предназначенных для ограничения изобретения, можно лучше всего понять в сочетании с прилагаемыми чертежами.

Фигура 1 представляет таблицу, идентифицирующую SEQ ID NO, приписанные нуклеотидным и белковым последовательностям.

Фигура 2 представляет выравнивание последовательностей между SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:5.

Фигура 3 отображает плазмидные карты pCXL1557.1 и pJSY2218.1.

Фигура 4 показывает саузерн-блоттинг vCP2263.

Фигура 5 показывает вестерн-блоттинг vCP2263.

Фигура 6 показывает иммунобляшковый (immunoplaque) анализ vCP2263.

Фигура 7 показывает картину вестерн-блоттинг vCP2391.

Фигура 8 показывает вестерн-блоттинг vCP2392.

Фигура 9 показывает вестерн-блоттинг vCP2391 и vCP2392 для GM-CSF.

Фигура 10 показывает вестерн-блоттинг vCP2392 для белка CDV НА.

Фигура 11 представляет результаты серологии vCP2392 и vCP2263 с использованием гетерологического теста SN.

Фигура 12 представляет результаты серологии vCP2392 и vCP2263 с использованием гомологического теста SN.

Фигуры 13а и 13b представляют выравнивание последовательностей белков CDV НА и процент идентичности последовательностей на уровне аминокислот.

Фигура 14 представляет выравнивание последовательностей кодон-оптимизированной ДНК CDV НА и ДНК CDV НА дикого типа.

Фигуры 15а и 15b представляют выравнивание последовательностей ДНК CDV НА и процент идентичности последовательностей на уровне ДНК.

Фигура 16 представляет результат клеточной иммунной реакции.

Фигура 17 представляет результат ELISA CPV2.

Фигура 18 отображает результаты гомологического теста SN антител SN CDV.

Фигура 19 отображает результаты гетерологического теста SN антител SN CDV.

Подробное описание

Описываются композиции, содержащие экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий полипептид CDV и его фрагменты и варианты, которые выявляют иммуногенную реакцию у животного. Экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий полипептид CDV или его фрагменты и варианты, может быть включен в вакцины или фармацевтические композиции и использован для выявления или стимулирования защитной реакции у животного. В одном воплощении полипептид CDV представляет собой полипептид гемагглютинин (НА) CDV или его активный фрагмент или вариант.

Описываются композиции, содержащие экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий полипептид CDV НА или его активные фрагменты или варианты, и полинуклеотид, кодирующий полипептид GM-CSF или его активные фрагменты или варианты.

Признается, что полипептиды по изобретению могут представлять собой полноразмерные полипептиды или их активные фрагменты или варианты. Обозначения «активные фрагменты» или «активные варианты» предполагают, что фрагменты или варианты сохраняют антигенный характер полипептида. Таким образом, настоящее изобретение охватывает любой полипептид, антиген, эпитоп или иммуноген CDV, который выявляет иммуногенную реакцию у животного. Полипептид, антиген, эпитоп или иммуноген CDV могут представлять собой любой полипептид, антиген, эпитоп или иммуноген CDV, такой как, но без ограничения, белок, пептид или его фрагмент или вариант, который выявляет, индуцирует или стимулирует иммуногенную реакцию у животного.

Конкретным полипептидом CDV, представляющим интерес, является гемагглютинин (НА) CDV. CDV НА относится к типу гемагглютинина, обнаруженного на поверхности CDV. Он является антигенным гликопротеином и ответственен за связывание вируса с клеткой, которая инфицируется. Существуют различные антигены НА, ассоциированные с различными штаммами CDV, которые циркулируют в данной области, любой из которых можно использовать при практическом применении изобретения. Однако существуют различные антигены, такие как гибридный (F) гликопротеин и нуклеопротеин (NP), любой из которых можно использовать при практическом применении изобретения. Также признается, что можно использовать предшественников любых таких антигенов. Антигенные полипептиды по изобретению способны давать защиту против CDV. Иными словами, они способны стимулировать иммунную реакцию у животного.

Термин «антиген» или «иммуноген» обозначает вещество, которое вызывает специфическую иммунную реакцию у животного-реципиента. Антиген может включать весь микроорганизм убитый, аттенюировнный или живой; субъединицу или часть микроорганизма; рекомбинантный вектор, содержащий вставку с иммуногенными свойствами; отрезок или фрагмент ДНК, способной вызывать иммунную реакцию после представления животному-реципиенту; полипептид, эпитоп, гаптен или их любую комбинацию. С другой стороны, иммуноген или антиген может включать токсин или антитоксин.

Термины «белок», «пептид», «полипептид» и «фрагмент полипептида» используются в данном описании как взаимозаменяемые для обозначения полимеров из аминокислотных остатков любой длины. Полимер может быть линейным или разветвленным, он может включать модифицированные аминокислоты или аналоги аминокислот, и он может прерываться химическими группами иными, чем аминокислоты. Термины также охватывают полимер аминокислоты, который модифицирован в природе или путем вмешательства, например, за счет образования дисульфидной связи, гликозилированием, липидированием, ацетилированием, фосфорилированием или любой другой манипуляцией или модификацией, такой как конъюгирование с компонентом-меткой или биоактивным компонентом.

Термин «полипептид или полинуклеотид CDV НА» относится к любому нативному или оптимизированному полипептиду или полинуклеотиду CDV НА и их производным и вариантам.

Термин «полипептид или полинуклеотид GM-CSF» относится к любому нативному или оптимизированному полипептиду или полинуклеотиду GM-CSF и их производным и вариантам.

Термин «иммуногенный или антигенный полипептид», используемый в данном описании, включает полипептиды, которые являются иммунологически активными в том смысле, что однажды введенные реципиенту, способны вызывать иммунную реакцию гуморального и/или клеточного типа, направленную против белка. Предпочтительно белковый фрагмент является таким, что он по существу имеет такую же иммунологическую активность, как целый белок. Таким образом, белковый фрагмент по изобретению включает или по существу состоит или состоит, по меньшей мере, из эпитопа или антигенной детерминанты. «Иммуногенный» белок или полипептид, как используется в данном описании, включает полноразмерную последовательность белка, его аналога или его иммуногенных фрагментов. «Иммуногенный фрагмент» обозначает фрагмент белка, который включает один или несколько эпитопов и, таким образом, выявляет иммунологическую реакцию, описанную выше. Такие фрагменты можно идентифицировать с использованием любого ряда методов картирования эпитопов, хорошо известных в технике. См., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol.66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996). Например, линейные эпитопы можно определить, например, одновременным синтезом большого числа пептидов на твердых носителях, причем пептиды соответствуют частям молекулы белка, и взаимодействием пептидов с антителами в то время как пептиды все еще присоединены к носителям. Такие методы известны в технике и описаны, например, в пат. США №4708871; Geysen et al., 1984; Geysen et al., 1986. Подобным образом конформационные эпитопы легко идентифицируются путем определения пространственной конформации аминокислот, например, с помощью рентгеновской кристалллографии и 2-мерного ядерного магнитного резонанса. См., например, Epitope Mapping Protocols, цит. выше.

Как обсуждалось в данном описании, изобретение охватывает активные фрагменты и варианты антигенного полипептида. Таким образом, термин «иммуногенный или антигенный полипептид» также предполагает делеции, добавления и замены в последовательности до тех пор, пока полипептид функционирует для выработки иммунологической реакции как определено в данном описании.

Термин «консервативная вариация» обозначает замену аминокислотного остатка другим биологически схожим остатком или такую замену нуклеотида в нуклеотидной последовательности, что кодированный аминокислотный остаток не изменяется или представляет собой биологически схожий остаток. С учетом этого особенно предпочтительные замены, как правило, будут консервативными по природе, т.е., такими заменами, которые имеют место в пределах семейства аминокислот. Например, аминокислоты вообще делятся на четыре семейства: (1) кислотные - аспартат и глутамат; (2) основные - лизин, аргинин, гистидин; (3) неполярные - аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан; и (4) незаряженные полярные - глицин, аспарагин, глутамин, цистин, серии, треонин, тирозин. Фенилаланин, триптофан и тирозин иногда классифицируют как ароматические аминокислоты. Примеры консервативных вариаций включают замену одного гидрофобного остатка, такого как изолейцин, валин, лейцин или метионин, на другой гидрофобный остаток, или замену одного полярного остатка на другой полярный остаток, например, замену аргинина на лизин, глутаминовой кислоты на аспарагиновую кислоту или глутамина на аспарагин, и т.п.; или подобную консервативную замену аминокислоты на структурно родственную аминокислоту, которая не будет оказывать существенного влияния на биологическую активность. Белки, имеющие, по существу, такую же аминокислотную последовательность как эталонная молекула, но имеющие минорные аминокислотные замены, которые, по существу, не влияют на иммуногенность белка, поэтому входят в определение эталонного полипептида. Все полипептиды, полученные такими модификациями, включаются в данное изобретение. Термин «консервативная вариация» также включает использование замещенной аминокислоты вместо незамещенной исходной аминокислоты при условии, что антитела, вырабатываемые к замещенному полипептиду, также вступают в иммунную реакцию с незамещенным полипептидом.

Термин «эпитоп» относится к участку антигена или гаптена, с которым реагируют специфические В-клетки и/или Т-клетки. Термин также используется как взаимозаменяемый с термином «антигенная детерминанта» или «участок антигенной детерминанты». Антитела, которые узнают один и тот же эпитоп, могут быть идентифицированы в простом иммуноанализе, показывающем способность антитела блокировать связывание другого антитела с антигеном-мишенью.

«Иммунологическая реакция» на композицию или вакцину представляет собой развитие у реципиента клеточной и/или антителоопосредованной иммунной реакции на композицию или вакцину, представляющую интерес.Обычно «иммунологическая реакция» включает, но не ограничивается, один или несколько следующих эффектов: выработка антител, В-клеток, хелперных Т-клеток и/или цитотоксических Т-клеток, направленных специфически на антиген или антигены, включенные в композицию или вакцину, представляющую интерес. Предпочтительно реципиент будет показывать или лечебную или защитную иммунологическую реакцию, так что будет усиливаться сопротивление новой инфекции и/или будет уменьшаться клиническая тяжесть заболевания. Такая защита будет демонстрироваться или ослаблением или отсутствием симптомов, обычно отображаемых инфицированным хозяином, более коротким временем излечения и/или пониженным вирусным титром у инфицированного хозяина.

Под «животным» подразумеваются млекопитающие, птицы и т.п. Животное или хозяин (реципиент) в данном описании включает млекопитающих и человека. Животное может быть выбрано из группы, включающей лошадей (например, лошадь), собачьих (например, собаку, волка, лису, койота, шакала), кошачьих (например, льва, тигра, домашних кошек, диких кошек, других крупных кошек и других кошачьих, включая гепардов и рысей), овец (например, овцу), коров (например, крупный рогатый скот), свиней (например, свинью), птичьих (например, курицу, утку, гуся, индейку, перепела, мелких птиц, сокола, ворону, страуса, эму и казуара), приматов (например, лемура, долгопята, мартышку, гиббона, обезьяну), хорьков, тюленей и рыб. Термин «животное» также включает отдельное животное на всех стадиях развития, включая эмбриональную и плодную стадии.

Если не поясняется иное, все технические и научные термины, используемые в данном описании, имеют те же значения, какие обычно понимаются специалистами в области техники, к которой принадлежит данное описание. Термины в единственном числе включают соответствующие множественные формы, если контекст не указывает прямо на иное. Подобным образом, предполагается, что слово «или» включает «и», если контекст не указывает прямо на иное.

Как замечание, в данном описании и, особенно, в формуле изобретения и/или разделах такие термины, как «содержит», «содержащийся», «содержащий» и т.п. могут иметь значение, приписываемое им патентным законом США; например, они могут означать «включает», «включенный», «включающий» и т.п.; и что термины, такие как «состоящий по существу из» и «состоит по существу из» имеют значение, приписываемое им патентным законом США; например, они допускают элементы, не перечисленные открыто, но исключают элементы, которые найдены на известном уровне техники или которые затрагивают основной или новый признак изобретения.

Композиции

Настоящее изобретение относится к вакцине против CDV или композиции, которые могут включать рекомбинантный или экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий полипептид, антиген, эпитоп или иммуноген CDV и фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель, эксципиент, адъювант или среду. Полипептид, антиген, эпитоп или иммуноген CDV могут представлять собой любой полипептид, антиген, эпитоп или иммуноген CDV, такой как, но без ограничения, белок, пептид или его фрагмент, который выявляет, индуцирует или стимулирует реакцию у животного.

Настоящее изобретение относится к вакцине против CDV или композиции, которые могут включать рекомбинантный или экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий полипептид CDV НА, и фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель, эксципиент, адъювант или среду. В одном воплощении экспрессирующий вектор может дополнительно включать полинуклеотид, кодирующий полипептид GM-CSF.

В другом воплощении фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель, эксципиент, адъювант или среда может представлять собой эмульсию «вода в масле». В еще одном воплощении эмульсия «вода в масле» может представлять собой тройную эмульсию вода/масло/вода (W/O/W). В еще одном воплощении фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель, эксципиент, адъювант или среда может представлять собой эмульсию «масло в воде».

В одном воплощении полипептид CDV, его антиген или фрагмент или вариант может представлять собой полипептид CDV НА или его фрагмент или вариант. В аспекте такого воплощения полипептид CDV НА или его фрагмент или вариант представляет собой рекомбинантный полипептид, продуцируемый геном CDV НА. В другом аспекте такого воплощения ген CDV НА имеет по меньшей мере 70% идентичность с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:1, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 или 49. В другом аспекте такого воплощения полипептид CDV НА или его фрагмент или вариант имеет по меньшей мере 80% идентичность с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:2, 5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 или 34.

В другом воплощении полипептид GM-CSF или его фрагмент или вариант представляет собой рекомбинантный полипептид, продуцируемый геном GM-CSF. В другом аспекте такого воплощения ген GM-CSF имеет по меньшей мере 70% идентичность с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:3. В другом аспекте такого воплощения полипептид GM-CSF или его фрагмент или вариант имеет по меньшей мере 80% идентичность с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:4.

Синтетические антигены также включены в определение, например, полиэпитопы, фланкирующие эпитопы и другие рекомбинантно или синтетически полученные антигены. См., например, Bergmann et al., 1993; Bergmann et al., 1996; Suhrbier, 1997; Gardner et al., 1998. Иммуногенные фрагменты для целей настоящего изобретения обычно будут включать по меньшей мере примерно 3 аминокислоты, по меньшей мере примерно 5 аминокислот, по меньшей мере примерно 10-15 аминокислот или примерно 15-25 аминокислот или больше аминокислот молекулы. Не существует критического верхнего предела длины фрагмента, который может включать почти всю длину белковой последовательности или даже гибридный белок, включающий по меньшей мере один эпитоп белка.

Соответственно, минимальная структура полинуклеотда, экспрессирующего эпитоп, является такой, что она включает или состоит по существу или состоит из нуклеотидов, кодирующих эпитоп или антигенную детерминанту полипептида CDV. Полинуклеотид, кодирующий фрагмент полипептида CDV, может включать или состоять по существу или состоять из минимум 15 нуклеотидов, примерно 30-45 нуклеотидов, примерно 45-75 нуклеотидов, или по меньшей мере 75, 87 или 150 последовательных или смежных нуклеотидов последовательности, кодирующей полпептид. Процедуры определения эпитопов, такие как получение библиотек перекрывающихся пептидов (Hemmer et al., 1998), Pepscan (Geysen et al., 1984; Geysen et al., 1985; Van der Zee R. et al., 1989; Geysen, 1990; Multipin.RTM. Peptide Synthesis Kits de Chiron) и алгоритмы (De Groot et al., 1999; PCT/US2004/022605), можно использовать при осуществлении изобретения.

Термины «нуклеиновая кислота» и «полинуклеотид» относятся к РНК или ДНК, которая является линейной или разветвленной, одно- или двухцепочечной или их гибридом. Термины также охватывают гибриды РНК/ДНК. Неограничительными примерами полнуклеотидов являются ген или фрагмент гена, экзоны, интроны, мРНК, тРНК, рРНК, рибозимы, кДНК, рекомбинантные полинуклеотиды, разветвленные полинуклеотиды, плазмиды, векторы, изолированная ДНК любой последовательности, изолированная РНК любой последовательности, нуклеотидные зонды и праймеры. Полинуклеотид может включать модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды, и аналоги нуклеотидов, урацил, другие сахара и соединяющие группы, такие как флуорорибоза и тиолат, и нуклеотидные ответвления. Последовательность нуклеотидов может быть дополнительно модифицирована после полимеризации, например, конъюгацией с компонентом-меткой. Другими типами модификаций, включенных в такое определение, являются кэпы, замена одного или нескольких встречающихся в природе нуклеотидов аналогом и введение средств для присоединения полинуклеотида к белкам, ионам металлов, компонентам-меткам, другим полинуклеотидам или твердому носителю. Полинуклеотиды можно получить химическим синтезом или получить из микроорганизмов.

Термин «ген» широко используется как относящийся к любому сегменту полинуклеотида, связанного с биологической функцией. Так, гены включают интроны и экзоны, как в геномной последовательности или только кодирующие последовательности, как в кДНК, и/или регуляторные последовательности, требуемые для их экспрессии. Например, «ген» также относится к фрагменту нуклеиновой кислоты, который экспрессирует мРНК или функциональную РНК или кодирует специфический белок, и который включает регуляторные последовательности.

Изобретение также относится к комплементарной цепи к полинуклеотиду, кодирующему антиген, эпитоп или иммуноген CDV, или полинуклеотиду, кодирующему антиген, эпитоп или иммуноген GM-CSF. Комплементарная цепь может быть полимерной и любой длины и может содержать дезоксирибонуклеотиды, рибонуклеотиды и аналоги в любой комбинации.

Определение «изолированный» биологический компонент (такой как нуклеиновая кислота или белок или органелла) относится к компоненту, который по существу отделен или очищен от других биологических компонентов в клетке организма, в которой компонент встречается в природе, например, других хромосомной и внехромосомной ДНК и РНК, белков и органелл. Нуклеиновые кислоты и белки, которые «изолированы», включают нуклеиновые кислоты и белки, выделенные в чистом виде стандартными методами очистки. Термин также включает нуклеиновые кислоты и белки, полученные рекомбинантной технологией, а также химическим синтезом.

Термин «очищенный», используемый в данном описании, не требует абсолютной чистоты; скорее предполагается, что он является условным термином. Так, например, препарат частично очищенного полипептида представляет собой препарат, в котором полипептида больше, чем в его природном окружении. Иными словами, полипептид отделен от клеточных компонентов. Под «по существу чистым» подразумевается, что удалено по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или, по меньшей мере 98% или больше клеточных компонентов или материалов. Подобным образом, полипептид может быть частично очищенным. Под «частично очищенным» подразумевается, что удалено менее 60% клеточных компонентов или материала. То же применимо к полинуклеотидам. Полинуклелотиды, раскрываемые в данном описании, могут быть очищены любым из способов, известных в технике.

Кроме того, предполагается, что в объем настоящего изобретения входят гомологи полипептидов CDV НА и гомологи полипептидов GM-CSF. Используемый в данном описании термин «гомологи» включает ортологи, аналоги и паралоги. Термин «аналоги» относится к двум полинуклеотидам или полипептидам, которые имеют одну и ту же или схожие функции, но которые развивались раздельно в неродственных организмах. Термин «ортологи» относится к двум полинуклеотидам или полипептидам от различных видов, но которые развивались из общего предкового гена вследствие видообразования. Обычно ортологи кодируют полипептиды, имеющие одну и ту же или схожие функции. Термин «паралоги» относится к двум полинуклеотидам или полипептидам, которые связаны дупликацией в пределах генома. Паралоги обычно имеют различные функции, но такие функции могут быть родственными. Например, аналоги, ортологи и паралоги полипептида CDV дикого типа могут отличаться от полипептида CDV дикого типа посттрансляционными модификациями, различиями в аминокислотных последовательностях или тем и другим. В частности, гомологи по изобретению обычно будут показывать по меньшей мере 80-85%, 85-90%, 90-95% или 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичность последовательностей со всем или частью полипептида CDV дикого типа или нуклеотидных последовательностей и будут проявлять схожие функции.

В одном воплощении настоящее изобретение относится к экспрессирующему вектору, содержащему один или несколько полинуклеотидов, кодирующих один или несколько полипептидов, имеющих по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность последовательностей с полипептидом, имеющим последовательность, представленную в SEQ ID NO:2, 4, 5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 или 34. В другом воплощении настоящее изобретение относится к фрагментам и вариантам полипептидов CDV или GM-CSF, идентифицированных выше (SEQ ID NO:2, 4, 5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 или 34), которые могут быть легко получены специалистом в данной области техники с использованием хорошо известных методов молекулярной биологии. Варианты представляют собой гомологичные полипептиды, имеющие аминокислотные последовательности с по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью с последовательностями, представленными в SEQ ID NO:2, 4, 5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 или 34.

Варианты включают аллельные варианты. Термин «аллельный вариант» относится к полинуклеотиду или полипептиду, содержащему полиморфизмы, которые ведут к изменениям в аминокислотных последовательностях белка, и которые существуют в природной популяции (например, видах или разновидности вируса). Такие природные аллельные вариации могут типично приводить к 1-5% варианте в полинуклеотиде или полипептиде. Аллельные варианты могут быть идентифицированы секвенированием нуклеотидной последовательности, представляющей интерес, в ряде различных видов, которое можно легко осуществить путем использования гибридизирующих зондов для идентификации одного и того же генетического локуса генов в таких видах. Предполагается, что любые и все такие вариации нуклеиновых кислот и получающиеся аминокислотные полиморфизмы или вариации, которые являются результатом природной аллельной вариации, и которые не изменяют функциональной активности гена, представляющего интерес, входят в объем изобретения.

Используемый в данном описании термин «производное», или «вариант», относится к полипептиду или нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид, которые имеют одну или несколько консервативных вариаций аминокислот или других минорных модификаций, таких что (1) соответствующий полипептид имеет, по существу, эквивалентную функцию при сравнении с полипептидом дикого типа, или (2) антитело, возникшее против полипептида, является иммунореактивным в отношении полипептида дикого типа. Такие варианты или производные включают полипептиды, имеющие минорные модификации полипептида CDV или первичных аминокислотных последовательностей GM-CSF, которые могут привести к пептидам, которые имеют, по существу, эквивалентную активность при сравнении с немодифицированным аналогичным полипептидом. Такие модификации могут быть преднамеренными, например с помощью сайт-направленного мутагенеза, или могут быть спонтанными. Термин «вариант» также предполагает делеции, добавления и замены в последовательности до тех пор, пока полипептид функционирует, продуцируя иммунологическую реакцию, как определено в данном описании.

Иммуногенный фрагмент полипептида CDV или полипептида GM-CSF включает по меньшей мере 8, 10, 13, 14, 15 или 20 последовательных аминокислот, по меньшей мере 21 аминокислоту, по меньшей мере 23 аминокислоты, по меньшей мере 25 аминокислот или по меньшей мере 30 аминокислот полипептида CDV НА, имеющего последовательность, представленную в SEQ ID NO:2, 5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 или 34 или ее вариантах, или полипептида GM-CSF, имеющего последовательность, представленную в SEQ ID NO:4 или ее вариантах.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к экспрессирующему вектору, содержащему полинуклеотид, кодирующий полипептид CDV НА, такой как полинуклеотид, кодирующий полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:2, 5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 или 34. В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к экспрессирующему вектору, содержащему полинуклеотид, кодирующий полипептид, имеющий по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность последовательностей с полипептидом, имеющим последовательность, представленную в SEQ ID NO:2, 5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 или 34, или консервативный вариант, аллельный вариант, гомолог или иммуногенный фрагмент, содержащий по меньшей мере восемь или по меньшей мере десять последовательных аминокислот одного из таких полипептидов, или комбинацию таких полипептидов.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к экспрессирующему вектору, содержащему полинуклеотид, кодирующий полипептид GM-CSF, такой как полинуклеотид, кодирующий полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:4. В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к экспрессирующему вектору, содержащему полинуклеотид, кодирующий полипептид, имеющий по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность последовательностей с полипептидом, имеющим последовательность, представленную в SEQ ID NO:4, или консервативный вариант, аллельный вариант, гомолог или иммуногенный фрагмент, содержащий по меньшей мере восемь или по меньшей мере десять последовательных аминокислот одного из таких полипептидов, или комбинацию таких полипептидов.

В одном воплощении полинуклеотид по настоящему изобретению включает полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 19, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 или 49,или его вариант. В другом воплощении полинуклеотид по настоящему изобретению включает полинуклеотид, имеющий по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность последовательностей с одним из полинуклеотидов, имеющим последовательность, представленную в SEQ ID NO:1, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 19, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 или 49, или его вариант.

Полинуклеотиды из описания включают последовательности, которые являются вырожденными как результат вырожденности генетического кода, например, в которых использовались оптимизированные кодоны для специфического хозяина. Используемое в данном описании определение «оптимизированный» относится к полинуклеотиду, который создан генной инженерией для усиления его экспрессии в данном виде. Для того, чтобы предоставить оптимизированные полинуклеотиды, кодирующие полипептиды CDV НА или полипептиды GM-CSF, последовательность ДНК гена CDV НА или гена GM-CSF можно модифицировать для 1) включения ко донов, предпочитаемых генами с высокой экспрессией в определенном виде; 2) включения доли А+Т или G+C в композиции пар оснований, которая по существу обнаружена в указанном виде; 3) образования инициирующей последовательности указанного вида; или 4) устранения последовательностей, которые вызывают дестабилизацию, несоответствующее полиаденелирование, деградацию и терминацию РНК, или которые образуют вторичные структурные «шпильки» или сайты сплайсинга. Повышенной экспрессии белка CDV НА или белка GM-CSF в указанном виде можно достичь путем использования частоты распределения использования кодонов в эукариотах и прокариотах или в определенном виде. Термин «частота использования предпочтительного кодона» относится к предпочтению, обнаруживаемому определенной клеткой-хозяином в использовании нуклеотидных кодонов для определения данной аминокислоты. Существует 20 природных аминокислот, большинство из которых определяется более чем одним кодоном. Следовательно, все вырожденные нуклеотидные последовательности включаются в описание до тех пор, пока аминокислотная последовательность полипептида CDV