Антитела против vegf и их применения

Антитела против vegf и их применения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

1. ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ И ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Эта заявка испрашивает приоритет согласно §119(е) 35 U.S.С. (Свод федеральных законов США) предварительной заявки на патент США №61/218005, поданной 17 июня 2009 года, содержание которой включено сюда посредством ссылки во всей ее полноте.

Рассматриваемая в данный момент заявка содержит перечень последовательностей, который был представлен на рассмотрение через EFS-Web и тем самым является включенным во всей его полноте посредством ссылки. Указанная копия ASCII (американский стандартный код для обмена информацией) создана 15 июня 2010 года и названа 381493PC.txt и имеет размер 141482 байта.

2. ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к антителам против VEGF, фармацевтическим композициям, содержащим антитела против VEGF, и терапевтическим применениям таких антител.

3. ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Ангиогенез оказался привлекательной терапевтической мишенью из-за его вовлеченности в целый ряд патологических состояний, включая рост опухолей, пролиферативные ретинопатии, возрастную дегенерацию желтого пятна, ревматоидный артрит (RA) и псориаз (Folkman et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:10931-10934). Первое указание на специфичные молекулярные ангиогенные факторы было основано на наблюдении сильного неоваскулярного ответа, индуцированного пересаженными опухолями. Теперь известно, что ангиогенез является существенным для роста большинства первичных опухолей и их последующих метастазов. Многие молекулы с того момента связывали с позитивной регуляцией ангиогенеза, включая трансформирующий фактор роста (TGF)-α, TGF-β, фактор роста гепатоцитов (HGF), фактор некроза опухолей-а, ангиогенин, интерлейкин (IL)-8 и фактор роста эндотелия сосудов (VEGF, также именуемый VEGFA или фактор проницаемости сосудов (VPF)) (Ferrara et al., 2003, Nature Medicine 9:669-676).

Белки VEGF являются важными сигнальными белками, участвующими как в нормальном эмбриональном образовании и развитии сосудов (образование cte novo эмбриональной системы кровообращения), так и в аномальном ангиогенезе (рост кровеносных сосудов из предсуществующей сосудистой системы) (Ferrara et al., 1996, Nature 380:439-442; Dvorak etal., 1995, Am. J. Pathol. 146:1029-1039). VEGF ассоциирован с солидными опухолями и гематологическими злокачественными образованиями, внутриглазными неоваскулярными синдромами, воспалением, отеком мозга и патологией женских половых путей (Ferrara et al., 2003, Nature Medicine 9:669-676). мРНК VEGF сверхэкспрессируется во многих человеческих опухолях, включая опухоли легкого, молочной железы, желудочно-кишечного тракта, почки, поджелудочной железы и яичника (Berkman et al., 1993, J. Clin. Invest. 91:153-159). Увеличения уровня VEGF во внутриглазной жидкости и стекловидном теле глаз связывали с разными ретинопатиями (Aiello et al., 1994, N. Engl. J. Med. 331:1480-1487). Возрастная дегенерация желтого пятна (AMD), главная причина потери зрения у пожилых людей, обусловлена неоваскуляризацией и выпотом из сосудов. Была показана локализация VEGF в хориоидальных неоваскулярных оболочках у пациентов, пораженных AMD (Lopez et al., 1996, Invest. Ophtalmo. Vis. Sci. 37:855-868).

Семейство генов VEGF включает прототипный элемент VEGFA, а также VEGFB, VEGFC, VEGFD и плацентарый фактор роста (PLGF). Человеческий ген VEGFA организован как восемь экзонов, разделенных семью интронами. Существуют по меньшей мере шесть разных изоформ VEGF: VEGF₁₂₁, VEGF₁₄₅, VEGF₁₆₂, VEGF₁₆₅, VEGF_165b, VEGF₁₈₃, VEGF₁₈₉ и VEGF₂₀₆, где подстрочные символы относятся к числу аминокислот, остающихся после отщепления сигнального пептида. Нативный VEGF представляет собой 45 кДа гомодимерный гепаринсвязывающий гликопротеин (Ferrara et al., 2003, Nature Medicine 9:669-676). VEGF (конкретно VEGFA) связывается с двумя родственными рецепторными тирозинкиназами, VEGFR-1 (также именуемый Flt-1) и VEGFR-2 (также именуемый Flk-1 или область киназного домена (KDR) или CD309). Каждый рецептор имеет семь внеклеточных и одну трансмембранную область. VEGF также связывается с нейрофилинами NRP1 (также именуемыми рецептор фактора роста клеток эндотелия сосудов 165 (VEGF165R) или CD304) и NRP2, также именуемым рецептор 2 фактора роста клеток эндотелия сосудов 165 (VEGF165R2)).

Принимая во внимание его центральную роль в регуляции ангиогенеза, VEGF является привлекательной мишенью для терапевтического вмешательства. Действительно, множество терапевтических стратегий, нацеленных на блокирование VEGF или системы сигнализации его рецептора, разрабатывается в настоящее время для лечения неопластических заболеваний. Антитело против VEGF бевацизумаб, также именуемое rhuMAb VEGF или Avastin®, представляет собой рекомбинантное гуманизированное моноклональное антитело против VEGF, созданное и продаваемое на рынке Genentech (Presta et al., 1997, Cancer Res. 57:4593-4599). Для того чтобы сконструировать бевацизумаб, гипервариабельные участки (CDR) мышиного моноклонального антитела против VEGF А.4.6.1 пересадили на человеческие каркасы и константную область IgG. Для улучшения связывания затем в молекулы были введены дополнительные мутации вне CDR с получением антитела, в котором примерно 93% аминокислотной последовательности происходит из человеческого IgG₁, и примерно 7% последовательности происходит из мышиного антитела А.4.6.1. Бевацизумаб имеет молекулярную массу примерно 149000 Дальтон и является гликозилированным.

Ранибизумаб представляет собой фрагмент Fab с созревшей аффинностью, происходящий из бевацизумаба. Ранибизумаб имеет более высокую аффинность в отношении VEGF и также меньше по размеру, обеспечивая его лучшее проникновение в сетчатку и, таким образом, лечение глазных неоваскуляризаций, ассоциированных с AMD (Lien and Lowman, In: Chernajovsky, 2008, Therapeutic Antibodies. Handbook of Experimental Pharmacology 181, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg 131-150). Ранибизумаб был разработан и продается на рынке Genentech под торговым названием Lucentis®.

Лечение раковых пациентов с применением схемы, которая включает Avastin®, может приводить к побочным эффектам, включая гипертензию, протеинурию, тромбоэмболические события, кровотечение и токсичность для сердца (Blowers & Hall, 2009, Br. J. Nurs. 18(6):351-6, 358). Бевацизумаб также может вызывать иммунный ответ при введении людям, несмотря на то, что он является гуманизированным антителом. Такой иммунный ответ может приводить к опосредованному иммунным комплексом клиренсу антител или фрагментов из кровообращения, и делает повторное введение неподходящим для терапии, снижая, посредством этого, терапевтическую пользу для пациента и ограничивая повторное введение антитела.

Соответственно, существует потребность в предложении улучшенных антител против VEGF или фрагментов, которые преодолевают одну или более чем одну из этих проблем, например, путем генерации вариантов с более высокой аффинностью, чем бевацизумаб, которые можно вводить в пониженных дозировках, или вариантов с пониженной иммуногенностью и другими побочными эффектами по сравнению с бевацизумабом.

Цитирование или указание на любую ссылку в этом разделе или в любом другом разделе данной заявки не следует истолковывать как признание того, что такая ссылка доступна в качестве предшествующего уровня техники по отношению к настоящему изобретению.

4. КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к вариантам бевацизумаба, антитела против VEGF, с пониженной иммуногенностью и/или улучшенной аффинностью к VEGF по сравнению с бевацизумабом или ранибизумабом. Бевацизумаб имеет три CDR (гипервариабельный участок) тяжелой цепи, именуемых здесь (в порядке от амино- до карбоксиконца) как CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, и три CDR легкой цепи, именуемых здесь (в порядке от амино- до карбоксиконца) как CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3. Последовательности CDR бевацизумаба показаны на Фиг.1А и 1Б, и их нумерация изложена в Таблице 1 (для CDR тяжелой цепи) и Таблице 2 (для CDR легкой цепи). Родственное антитело, ранибизумаб, было получено созреванием аффинности бевацизумаба. Ранибизумаб имеет последовательности CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 и CDR-H2, идентичные бевацизумабу, но отличается по своим последовательностям CDR-H1 и CDR-H3 от последовательностей бевацизумаба. Последовательности тяжелой и легкой цепи ранибизумаба показаны на Фиг.1В, и CDR изложены на Фиг.1Г.

Антитела по изобретению обычно имеют по меньшей мере одну аминокислотную замену в по меньшей мере одном CDR тяжелой цепи по сравнению с бевацизумабом и ранибизумабом.

В определенных аспектах антитела против VEGF включают по меньшей мере одну замену по сравнению с бевацизумабом или ранибизумабом, выбранную из N31F в CDR-H1; K64S в CDR-H2; K64Q в CDR-H2; Y53F в CDR-Н2; Н97Е в CDR-H3; H97D в CDR-H3; Н97Р в CDR-H3; Y98F в CDR-H3; Y99E в CDR-H3; Y99D в CDR-H3; S100aG в CDR-H3 и Т51А в CDR-L2. В других аспектах антитела против VEGF включают по меньшей мере одну замену, выбранную из Таблиц 8 и 9. Дополнительные мутации, которые могут быть включены в варианты антител с улучшенной аффинностью, могут быть деиммунизирующими заменами-кандидатами, такими как замены, описанные в Таблице 6, а также другими мутациями, например, заменами, которые не нарушают способность антител связываться с VEGF, включая, но не ограничиваясь, мутации, описанные в Таблицах 10 и 11, или известные мутации, такие как мутации, описанные в Таблицах от 12-1 до 12-9 и 13. Кроме того, дополнительные мутации, которые могут быть включены, включают, но не ограничены, мутации, описанные в Таблицах 14-16.

В конкретных воплощениях антитела против VEGF по изобретению включают комбинацию замен, выбранных из Таблицы 7, и возможно одну или более чем одну дополнительную мутацию, например, деиммунизирующие замены-кандидаты, такие как замены, описанные в Таблице 6, а также другие мутации, например, замены, которые не нарушают способность антител связываться с VEGF, включая, но не ограничиваясь, мутации, описанные в Таблицах 10 и 11, или известные мутации, такие как мутации, описанные в Таблицах от 12-1 до 12-9 и 13. Кроме того, дополнительные мутации, которые могут быть включены в антитела против VEGF по изобретению, включают, но не ограничиваются, мутации, описанные в Таблицах 14-16.

В других воплощениях антитела против VEGF по изобретению включают одну или более чем одну из следующих замен в CDR: K64S (CDR-H2), K64Q (CDR-H2), Y53F и K64Q (CDR-H2), Н97Е и Y98F (CDR-H3) или Т51А (CDR-L2). Антитела против VEGF также возможно могут включать одну или более чем одну дополнительную мутацию или комбинацию мутаций, выбранных из одной или более чем одной из Таблиц 6, 7, 8, 9, 10, 11, от 12-1 до 12-9 или 13-16.

Дополнительные замены в CDR могут включать N31 F (CDR-H1), Н97Е (CDR-H3), H97D (CDR-H3), Н97Р (CDR-H3), Y99E (CDR-H3), Y99D (CDR-H3), SIOOaG (CDR-H3), где положение 3 в CDR-H3 возможно не представляет собой тирозин, Т28Р, N31F, N31G и N31M (CDR-H1), Н97А, H97Q, H97S, Н97Т, S100aD, S100aE, и SIOOAv (CDR-H3), T30W, T30R или T30Q (CDR-H1), Y53F, T58F, A61G, А61К, A61R, А61Н, A61Y, K64G, К64Е, R65L, R65T, R65A, R65E и R65D (CDR-H2), и Y98F, и YIOOeF (CDR-H3). Данные CDR возможно содержат одну или более чем одну дополнительную мутацию или комбинации мутаций, выбранных из одной или более чем одной из Таблиц 6, 7, 8, 9, 10, 11, от 12-1 до 12-9 и 13.

Кроме того, дополнительные замены могут включать замены в CDR тяжелой цепи, включающие комбинацию замен, выбранных из: (а) N31F в CDR-H1, H97D в CDR-H3, Y99D в CDR-H3 и SIOOaG в CDR-H3; (б) N31F в CDR-H1, Н97Р в CDR-H3, Y99D в CDR-H3 и SIOOaG в CDR-H3; (в) N31F в CDR-H1, Н97Р в CDR-H3 и Y99E в CDR-H3; (г) N31F в CDR-H1, Н97Е в CDR-H3 и Y99E в CDR-H3; (д) N31F в CDR-H1, H97D в CDR-H3 и Y99E в CDR-H3; (е) N31F в CDR-H1, Н97Е в CDR-H3, Y99D в CDR-H3 и S100aG в CDR-H3; (ж) N31F в CDR-H1, Y99D в CDR-H3 и SIOOaG в CDR-H3; (з) N31F в CDR-H1, Н97Р в CDR-H3 и Y99D в CDR-H3; (и) N31F в CDR-H1, H97D в CDR-H3 и S100aG в CDR-H3; (к) N31F в CDR-H1 и SIOOaG в CDR-H3 или (л) N31F в CDR-H1, Н97Р в CDR-H3 и S100aG в CDR-H3. Дополнительные возможные замены могут включать одну или более чем одну дополнительную мутацию или комбинацию мутаций, выбранных из одной или более чем одной из Таблиц 6, 7, 8, 9, 10, 11, от 12-1 до 12-9 и 13.

Кроме того, дополнительные замены тяжелой цепи могут включать по меньшей мере одну замену, выбранную из A61F в CDR-H2, А61Е в CDR-H2, A61D в CDR-H2, D62L в CDR-H2, D62G в CDR-H2, D62Q в CDR-H2, D62T в CDR-H2, D62K в CDR-H2, D62R в CDR-H2, D62E в CDR-H2, D62H в CDR-H2, K64S в CDR-H2, K64V в CDR-H2, K64Q в CDR-H2, R65V в CDR-H2, R65F в CDR-H2, R65H в CDR-H2, R65N в CDR-H2, R65S в CDR-H2, R65Q в CDR-H2, R65K в CDR-H2, R65I в CDR-H2 и Y98H в CDR-H3. Возможно, может быть включена одна или более чем одна дополнительная мутация или комбинация мутаций, выбранных из одной или более чем одной из Таблиц 7, 8, 9, 10, 11, от 12-1 до 12-9 и 13.

В определенных аспектах антитела по изобретению имеют последовательности VH и VL, имеющие по меньшей мере 80%-ную идентичность последовательности (и в определенных воплощениях по меньшей мере 85%-ную, по меньшей мере 90%-ную, по меньшей мере 95%-ную, по меньшей мере 98%-ную или по меньшей мере 99%-ную идентичность последовательности) с последовательностями VH и VL бевацизумаба или ранибизумаба и включают по меньшей мере одну аминокислотную замену в по меньшей мере одном CDR по сравнению с бевацизумабом или ранибизумабом. В других аспектах антитела по изобретению имеют последовательности VH и VL, имеющие по меньшей мере 80%-ную идентичность последовательности (и в определенных воплощениях по меньшей мере 85%-ную, по меньшей мере 90%-ную, по меньшей мере 95%-ную, по меньшей мере 98%-ную или по меньшей мере 99%-ную идентичность последовательности) с последовательностями VH и VL бевацизумаба или ранибизумаба, и включают по меньшей мере одну аминокислотную замену в по меньшей мере одной каркасной области по сравнению с бевацизумабом или ранибизумабом. В конкретных воплощениях процентная доля идентичности последовательности для тяжелой цепи и легкой цепи по сравнению с последовательностями VH и VL бевацизумаба или ранибизумаба независимо выбрана из по меньшей мере 80%-ной, по меньшей мере 85%-ной, по меньшей мере 90%-ной, по меньшей мере 95%-ной идентичности последовательности или по меньшей мере 99%-ной идентичности последовательности. В определенных аспектах антитела по изобретению имеют последовательности VH и/или VL, имеющие по меньшей мере 95%-ную, по меньшей мере 98%-ную или по меньшей мере 99%-ную идентичность последовательности с последовательностями VH и/или VL бевацизумаба или ранибизумаба.

В определенных аспектах антитела по изобретению имеют вплоть до 17 аминокислотных замен в их CDR по сравнению с бевацизумабом или ранибизумабом. Варианты антител с 17 аминокислотными заменами, которые сохраняют их способность к связыванию с мишенью, были получены Bostrom et al., 2009, Science 323:1610-14.

В конкретных воплощениях антитело против VEGF по изобретению имеет, независимо:

- вплоть до одной, вплоть до двух, вплоть до трех, вплоть до четырех, вплоть до пяти, вплоть до шести, вплоть до семи, вплоть до восьми, вплоть до девяти или вплоть до десяти замен в CDR-H1 по сравнению с соответствующим CDR бевацизумаба или ранибизумаба;

- вплоть до одной, вплоть до двух, вплоть до трех, вплоть до четырех, вплоть до пяти, вплоть до шести, вплоть до семи, вплоть до восьми, вплоть до девяти, вплоть до десяти, вплоть до одиннадцати, вплоть до двенадцати, вплоть до тринадцати, вплоть до четырнадцати, вплоть до пятнадцати, вплоть до шестнадцати или вплоть до семнадцати замен в CDR-H2 по сравнению с соответствующим CDR бевацизумаба или ранибизумаба;

- вплоть до одной, вплоть до двух, вплоть до трех, вплоть до четырех, вплоть до пяти, вплоть до шести, вплоть до семи, вплоть до восьми, вплоть до девяти, вплоть до десяти, вплоть до одиннадцати, вплоть до двенадцати, вплоть до тринадцати или вплоть до четырнадцати замен в CDR-H3 по сравнению с соответствующим CDR бевацизумаба или ранибизумаба;

- вплоть до одной, вплоть до двух, вплоть до трех, вплоть до четырех, вплоть до пяти, вплоть до шести, вплоть до семи, вплоть до восьми, вплоть до девяти, вплоть до десяти или вплоть до одиннадцати замен в CDR-L1 по сравнению с соответствующим CDR бевацизумаба или ранибизумаба;

- вплоть до одной, вплоть до двух, вплоть до трех, вплоть до четырех, вплоть до пяти, вплоть до шести или вплоть до семи замен в CDR-L2 по сравнению с соответствующим CDR бевацизумаба или ранибизумаба; и

- вплоть до одной, вплоть до двух, вплоть до трех, вплоть до четырех, вплоть до пяти, вплоть до шести, вплоть до семи, вплоть до восьми или вплоть до девяти замен в CDR-L3 по сравнению с соответствующим CDR бевацизумаба или ранибизумаба.

Согласно настоящему изобретению дополнительно предложены фармацевтические композиции, содержащие модифицированные антитела против VEGF. В некоторых аспектах фармацевтические композиции имеют повышенную аффинность к VEGF и/или пониженную иммуногенность по сравнению с бевацизумабом или ранибизумабом.

В изобретении предложены нуклеиновые кислоты, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие антитела против VEGF по изобретению, а также векторы, содержащие нуклеиновые кислоты. Дополнительно в изобретении предложены прокариотические и эукариотические клетки-хозяева, трансформированные вектором, содержащим нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело против VEGF, а также эукариотические (такие как клетки млекопитающих) клетки-хозяева, модифицированные методами генной инженерии для экспрессии нуклеотидных последовательностей. Также предложены способы получения антител против VEGF путем культивирования клеток-хозяев.

Антитела против VEGF по изобретению являются полезными при лечении раковых заболеваний (например, карциномы толстой кишки, карциномы прямой кишки, немелкоклеточного рака легкого и рака молочной железы), заболеваний сетчатки (например, возрастной дегенерации желтого пятна ("AMD")) и иммунных расстройств (например, ревматоидного артрита).

В определенных аспектах антитела против VEGF по изобретению можно использовать в пониженных дозировках по сравнению с бевацизумабом или ранибизумабом, например, в дозировках, меньших по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80% или по меньшей мере на 90%.

Следует отметить, что формы единственного и множественного числа, используются в настоящей заявке, как обычно в патентных заявках, для обозначения одного или более чем одного, если контекст ясно не диктует иное. Дополнительно, термин «или» используется в настоящей заявке, как обычно в патентных заявках, для обозначения разделительного «или» или связывающего «и».

Все публикации, упомянутые в этом описании изобретения, включены сюда посредством ссылки. Любое обсуждение документов, актов, веществ, устройств, предметов или тому подобного, которые были включены в данное описание изобретения, имеет единственную цель предоставления контекста для настоящего изобретения. Не следует делать допущения того, что любой или все эти предметы образуют часть основы предшествующего уровня техники или представляли уровень обычных общих знаний в данной области, релевантных в отношении настоящего изобретения, в том виде, в котором они существовали когда-либо до даты приоритета данной заявки.

Отличительные признаки и преимущества изобретения станут более очевидными из следующего подробного описания его воплощений.

5. КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ТАБЛИЦ И ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

В Таблице 1 показана нумерация аминокислот в CDR тяжелой цепи бевацизумаба. CDR 1-3 раскрыты в SEQ ID NO:3-5, соответственно.

В Таблице 2 показана нумерация аминокислот в CDR легкой цепи бевацизумаба. CDR 1-3 раскрыты в SEQ ID NO:6-8, соответственно.

В Таблице 3 показаны пептиды VL бевацизумаба, которые протестировали на иммуногенность.

В Таблице 4 показаны пептиды VH. бевацизумаба, которые протестировали на иммуногенность.

В Таблице 5 показаны идентифицированные области эпитопов Т-клеток CD4⁺ в бевацизумабе. Области CDR подчеркнуты.

В Таблице 6 показаны мутации-кандидаты в CDR-H2 и CDR-H3 для снижения иммуногенности бевацизумаба. Нумерация аминокислот в Таблице 6 соответствует нумерации по Kabat в тяжелой цепи бевацизумаба.

В Таблице 7 показаны аминокислотные замены в CDR тяжелой цепи в бевацизумабе, приводящие к улучшенной K_D, как проанализировано поверхностным плазменным резонансом. Δk_on относится к кратности улучшения k_on (мутант/дикий тип). Δk_off относится к кратности улучшения k_off (мутант/дикий тип). ΔK_D относится к улучшению K_D у мутанта относительно дикого типа. Нумерация аминокислот в Таблице 7 соответствует нумерации по Kabat в тяжелой цепи бевацизумаба.

В Таблице 8 показаны мутации в CDR тяжелой цепи бевацизумаба, которые, как показывают предварительные исследования по связыванию, увеличивают аффинность к VEGF (данные не показаны). Нумерация аминокислот в Таблице 8 соответствует нумерации по Kabat в тяжелой цепи бевацизумаба.

В Таблице 9 показаны мутации в CDR тяжелой цепи бевацизумаба, которые, как показывают предварительные исследования, увеличивают аффинность в отношении VEGF (данные не показаны). Нумерация аминокислот в Таблице 9 соответствует нумерации по Kabat в тяжелой цепи бевацизумаба.

В Таблице 10 показаны мутации в CDR тяжелой цепи бевацизумаба, которые не влияют на связывание и могут быть включены в антитела по изобретению. Нумерация аминокислот в Таблице 10 соответствует нумерации по Kabat в тяжелой цепи бевацизумаба.

В Таблице 11 показаны мутации в CDR легкой цепи бевацизумаба, которые не влияют на связывание и могут быть включены в антитела по изобретению. Нумерация аминокислот в Таблице 11 соответствует нумерации по Kabat в легкой цепи бевацизумаба.

В Таблицах от 12-1 до 12-9 показаны известные мутации в CDR тяжелой цепи бевацизумаба, которые можно включать в антитела по изобретению. Каждая строка в Таблицах от 12-1 до 12-9 включает отличный известный вариант. Для каждого варианта известные последовательности CDR выделены более темным фоном. Идентификаторы последовательности для каждого варианта, идентифицированного в Таблицах от 12-1 до 12-9, изложены в Таблицах от 20-1 до 20-9, соответственно. В колонке CDR-H1 дана частичная последовательность CDR-H1. Последний аспарагин в CDR-H1 не показан. Эта частичная последовательность соответствует SEQ ID NO:411. Несмотря на то, что известные мутации в CDR-H1 показаны в контексте этой частичной последовательности, отмечается, что существуют мутации в контексте полноразмерной CDR.

В Таблице 13 показаны известные мутации в CDR легкой цепи бевацизумаба, которые можно включать в антитела по изобретению. Каждая строка в Таблице 13 включает отличный известный вариант. Для каждого варианта известные последовательности CDR выделены более темным фоном. Идентификаторы последовательности для каждого варианта, идентифицированного в Таблице 13, изложены в Таблице 20-10.

В Таблице 14 показаны пептиды CDR2 VH, которые протестировали на иммуногенность, где неизменные остатки из SEQ ID NO:62 указаны пустой ячейкой. Также приведены результаты анализа Т-клеток CD4+.

В Таблице 15 показаны пептиды CDR3 VH бевацизумаба, которые протестировали на иммуногенность, где неизменные остатки из SEQ ID NO:74 указаны пустой ячейкой. Также приведены результаты анализа Т-клеток CD4+.

В Таблице 16 показаны пептиды CDR2 VL, которые протестировали на иммуногенность, где неизменные остатки из SEQ ID NO:25 указаны пустой ячейкой. Также приведены результаты анализа Т-клеток CD4+.

В Таблице 17 показаны избранные модификации эпитопов для трех эпитопов Т-клеток CD4+в бевацизумабе.

В Таблице 18 показаны мутанты единичной вариабельной области и ассоциированный с ними средний показатель интенсивности флуоресценции (MFI).

В Таблице 19 показаны мутанты объединенной вариабельной области и ассоциированные с ними EC₅₀.

В Таблицах от 20-1 до 20-10 показаны SEQ ID NO, когда они известны, соответствующие CDR вариантов бевацизумаба, перечисленных в Таблицах от 12-1 до 12-9 и в Таблице 13, соответственно. N/A указывает неизвестную последовательность CDR.

Фиг.1А-1Г. На Фиг.1А показаны аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепи бевацизумаба, SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2, соответственно, причем области CDR выделены жирным подчеркнутым текстом. На Фиг.1Б показаны последовательности CDR и соответствующие идентификаторы последовательности бевацизумаба. На Фиг.1 В показаны аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепей ранибизумаба, SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:10, соответственно, причем области CDR выделены жирным подчеркнутым текстом. На Фиг.1Г показаны последовательности CDR и соответствующие идентификаторы последовательности ранибизумаба.

На Фиг.2А-2Б показаны ответы на пептиды VL бевацизумаба. На Фиг.2А показаны проценты ответов доноров на каждый пептид VL с индексом стимуляции 2,95 или выше. N=99 доноров. На Фиг.2Б показан средний индекс стимуляции для всех 99 доноров для каждого пептида плюс или минус стандартная ошибка.

На Фиг.3А-3Б показаны ответы на пептиды VH бевацизумаба. На Фиг.3А показаны проценты ответов доноров на каждый пептид VH с индексом стимуляции 2,95 или выше. N=99 доноров. На Фиг.3Б показан средний индекс стимуляции для всех 99 доноров для каждого пептида плюс или минус стандартная ошибка.

На Фиг.4А-4В показаны ответы Т-клеток CD4+ на пептиды эпитопов мутантного бевацизумаба. Средние ответы на немодифицированные последовательности родительского эпитопа указаны незакрашенными значками. Большие кружки указывают избранные изменения, приведенные в Таблице 17. Фиг.4А относится к пептидам CDR2 VH; Фиг.4Б относится к пептидам CDR3 VH; и Фиг.4В относится к пептидам CDR2 VL.

6. ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

6.1 АНТИТЕЛА ПРОТИВ VEGF

Согласно настоящему изобретению предложены антитела против VEGF. Если не указано иное, термин «антитело» (Ab) относится к молекуле иммуноглобулина, которая специфично связывается или является иммунологически реактивной с конкретным антигеном и включает поликлональные, моноклональные, модифицированные методами генной инженерии и модифицированные иными способами формы антител, включая, но не ограничиваясь, химерные антитела, гуманизированные антитела, гетероконъюгатные антитела (например, биспецифичные антитела, диатела, триатела и тетратела) и антигенсвязывающие фрагменты антител, включающие, например, фрагменты Fab', F(ab')₂, Fab, Fv, rIgG и scFv. Кроме того, если не указано иное, подразумевается, что термин «моноклональное антитело» (mAb) включает как интактные молекулы, так и фрагменты антитела (такие как, например, фрагменты Fab и F(ab')₂), которые способны специфично связываться с белком. Фрагменты Fab и F(ab')₂ не имеют фрагмента Fc интактного антитела, быстрее подвергаются клиренсу из кровообращения животного и могут иметь меньшее неспецифичное связывание в ткани, чем интактное антитело (Wahl et al., 1983, J. Nucl. Med. 24:316).

Термин "scFv" относится к одноцепочечному Fv антителу, в котором вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи из традиционного антитела были связаны с образованием одной цепи.

Ссылки на "VH" относятся к вариабельной области иммуноглобулиновой тяжелой цепи антитела, включая тяжелую цепь Fv, scFv или Fab. Ссылки на "VL" относятся к вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина, включая легкую цепь Fv, scFv, dsFv или Fab. Антитела (Ab) и иммуноглобулины (Ig) представляют собой гликопротеины, имеющие такие же структурные характеристики. В то время как антитела демонстрируют специфичность связывания в отношении конкретной мишени, иммуноглобулины включают как антитела, так и другие молекулы, подобные антителам, которые не имеют специфичности в отношении мишени. Нативные антитела и иммуноглобулины обычно представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины (с молекулярной массой) приблизительно 150000 Дальтон, составленные из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (Н) цепей. Каждая тяжелая цепь имеет на амино конце вариабельный домен (VH) с последующим рядом константных доменов. Каждая легкая цепь имеет вариабельный домен на амино конце (VL) и константный домен на карбокси конце.

Антитела против VEGF по изобретению связываются с человеческим VEGF и ингибируют активность рецептора VEGF в клетке.

Антитела против VEGF по изобретению содержат области, определяющие комплементарность (CDR), которые являются родственными по последовательности CDR антитела бевацизумаб (также известного как Avastin®) и/или ранибизумаб (также известного как Lucentis®).

CDR также известны как гипервариабельные участки в вариабельных доменах как легкой цепи, так и тяжелой цепи. Более высококонсервативные части вариабельных доменов называются каркас (FR). Как известно в данной области, положение аминокислоты/граница, очерчивающая гипервариабельный участок антитела, может варьировать, в зависимости от контекста и разных определений, известных в данной области. Некоторые положения в пределах вариабельного домена могут рассматриваться как гибридные гипервариабельные положения в том, что эти положения могут считаться находящимися в пределах гипервариабельного участка при одном наборе критериев, в то время как могут считаться находящимися вне гипервариабельного участка при другом наборе критериев. Одно или более чем одно из этих положений также может находиться в расширенных гипервариабельных участках. Согласно изобретению предложены антитела, содержащие модификации в этих гибридных гипервариабельных положениях. Каждый из вариабельных доменов нативной тяжелой и легкой цепи содержит четыре FR области, главным образом, принимающие конфигурацию β-складчатого слоя, соединенные тремя CDR, которые образуют петли, соединяющие и в некоторых случаях образующие часть β-складчатой структуры. CDR в каждой цепи удерживаются в тесной близости друг с другом областями FR в порядке FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 и с CDR из другой цепи, содействуя образованию сайта связывания мишени антител (смотри Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, Md. 1987). Нумерация аминокислотных остатков иммуноглобулинов в том виде, как она здесь используется, осуществляется согласно системе нумерации аминокислотных остатков иммуноглобулинов Kabat et al., если не указано иное.

Последовательности вариабельных участков тяжелой и легкой цепи бевацизумаба представлены SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2, соответственно. Последовательности вариабельных участков тяжелой и легкой цепи также описаны на Фиг.1А. Последовательности CDR бевацизумаба и их соответствующие идентификаторы представлены на Фиг.1Б. Любые нуклеотидные последовательности, кодирующие SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2, можно использовать в композициях и способах по настоящему изобретению.

Последовательности тяжелой и легкой цепей ранибизумаба представлены SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:10, соответственно. Последовательности тяжелой и легкой цепей также описаны на Фиг.1В. Последовательности CDR ранибизумаба и их соответствующие идентификаторы представлены на Фиг.1Г. Любые нуклеотидные последовательности, кодирующие SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10, можно использовать в композициях и способах по настоящему изобретению.

Согласно настоящему изобретению дополнительно предложены фрагменты антитела против VEGF, содержащие последовательности CDR, которые являются родственными последовательностям CDR бевацизумаба и ранибизумаба. Термин «фрагмент антитела» относится к части полноразмерного антитела, обычно к области, связывающей мишень, или к вариабельному участку. Примеры фрагментов антитела включают фрагменты Fab, Fab', F(ab')₂ и Fv. Фрагмент "Fv" представляет собой минимальный фрагмент антитела, который содержит полный сайт распознавания и связывания мишени. Эта область состоит из димера вариабельного домена одной тяжелой и одной легкой цепи в тесной нековалентной ассоциации (димер VH-VL). Именно в этой конфигурации три CDR каждого вариабельного домена взаимодействуют с определением сайта связывания мишени на поверхности димера VH-VL. Часто шесть CDR придают антителу специфичность связывания мишени. Однако в некоторых случаях даже один вариабельный домен (или половина Fv, содержащая только три CDR, специфичные в отношении мишени) может иметь способность распознавать и связывать мишень. Фрагменты антитела «одноцепочечная Fv» или "scFv" содержат домены VH и VL антитела в одной полипептидной цепи. Обычно полипептид Fv дополнительно содержит полипептидный линкер между доменами VH и VL, который обеспечивает образование scFv желательной структуры для связывания мишени. «Однодоменные антитела» состоят из одного домена VH или VL, которые демонстрируют достаточную аффинность в отношении мишени. В конкретном воплощении однодоменное антитело представляет собой антитело Camelid (смотри, например, Riechman, 1999, Journal of Immunological Methods 231:25-38).

Fab фрагмент содержит константный домен легкой цепи и первый константный домен (СН₁) тяжелой цепи. Fab' фрагменты отличаются от Fab фрагментов добавлением нескольких остатков на карбоксильном конце домена CH₁ тяжелой цепи, включая один или более чем один цистеин из шарнирной области антитела. F(ab') фрагменты продуцируются расщеплением дисульфидной связи на шарнирных цистеинах продукта расщепления F(ab')₂ пепсином. Дополнительные химические связывания фрагментов антитела известны обычным специалистам в данной области.

В определенных воплощениях антитела против VEGF по изобретению представляют собой моноклональные антитела. Термин «моноклональное антитело» в том виде, как он здесь используется, не ограничивается антителами, полученными посредством технологии гибридомы. Термин «моноклональное антитело» относится к антителу, которое происходит из одного клона, включая любой эукариотический, прокариотический или фаговый клон, а не к способу, посредством которого оно получено. Моноклональные антитела, полезные в связи с настоящим изобретением, могут быть получены с использованием широкого спектра методик, известных в данной области, включая применение гибридомы, рекомбинантных методик и методик фагового дисплея или их комбинацию. Антитела против VEGF по изобретению включают химерные, приматизированные, гуманизированные или человеческие антитела.

Антитела против VEGF по изобретению могут быть химерными антителами. Термин «химерное» антитело в том виде, как он здесь используется, относится к антителу, имеющему вариабельные последовательности, происходящие из иммуноглобулина, не являющегося человеческим, такого как крысиное или мышиное антитело, и константные области человеческого иммуноглобулина, типично выбранные из матрицы человеческого иммуноглобулина. Способы получения химерных антител известны в данной области. Смотри, например, Morrison, 1985, Science 229(4719):1202-7; Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214-221; Gillies et al., 1985, J. Immunol. Methods 125:191-202; патенты США №5807715; 4816567 и 4816397, которые включены сюда посредством ссылки во всей их полноте.

Антитела против VEGF по изобретению могут быть гуманизированными. «Гуманизированные» формы антител, не являющихся человеческими (например, мышиных), представляют собой химерные иммуноглобулины, цепи иммуноглобулинов или их фрагменты (такие как Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ или другие субдомены антител, связывающие мишень), которые содержат минимальные последовательности, происходящие из иммуноглобулина, не являющегося человеческим. В общем, гуманизированное антитело будет содержать по существу все из по меньшей мере одного и типично двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все участки CDR соответствуют участкам иммуноглобулина, не являющегося человеческим, и все или по существу все области FR представляют собой области последовательности человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело также может содержать по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), типично константную область консенсусной последовательности человеческого иммуноглобулина. Способы гуманизации антител известны в данной области. Смотри, например, Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-7; патенты США №:5530101; 5585089; 5693761; 5693762 и 6180370, выданные Queen et al.; EP 239400; публикацию PCT WO 91/09967; патент США №5225539; ЕР 592106; ЕР 519596; Padlan, 1991, Mol. Immunol., 28:489-498; Studnicka et al., 1994, Prot. Eng. 7:805-814; Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91:969-973 и патент США №5565332, которые все включены сюда посредством ссылки во всей их полноте.

Антитела против VEGF по изобретению могут быть человеческими антителами. Полностью «человеческие» антитела против VEGF могут быть желательными для терапевтического лечения человеческих пациентов. Термин «человеческие антитела» в том виде, как он здесь используется, включает антитела, имеющие аминокислотную последовательность человеческого иммуноглобулина, и включает антитела, выделенные из библиотек человеческих иммуноглобулинов, или из животных, трансгенных в отношении одного или более чем одного человеческого иммуноглобулина, и которые не экспрессируют эндогенные иммуноглобулины. Человеческие антитела могут быть получены множеством способов, известных в данной области, включая способы фагового дисплея с использованием библиотек антител, происходящих из последовательностей человеческих иммуноглобулинов. Смотри патенты США №4444887 и 4716111 и публикации РСТ WO 98/46645; WO 98/50433; WO 98/24893; WO 98/16654; WO 96/34096; WO 96/33735; и WO 91/10741, каждая из которых включена сюда посредством ссылки во всей ее полноте. Человеческие антитела также можно получать с использованием трансгенных мыше