Основанные на notch3 человека гибридные белки в качестве ловушек-ингибиторов передачи сигнала notch3

Основанные на notch3 человека гибридные белки в качестве ловушек-ингибиторов передачи сигнала notch3

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Описываемое здесь изобретение было создано при финансовой поддержке Правительства Соединенных Штатов в рамках номера гранта R01 HL62454, предоставленного Национальным Институтом Здравоохранения, и номера гранта DAMRDCW81XWH-04-1-054, предоставленного Министерством Обороны США. Соответственно, Правительство Соединенных Штатов имеет определенные права на это изобретение.

По всей этой заявке для ссылок на различные публикации используются арабские числа в круглых скобках или имя автора и дата публикации в круглых скобках. Полные ссылки на эти публикации можно найти в конце описания настоящего изобретения. Таким образом, описания этих публикаций включены посредством ссылки в эту заявку для более полного описания области техники, к которой относится это изобретение.

Предпосылки создания изобретения

Развитие сосудов

Во время эмбриогенеза у млекопитающих формирование сосудистой системы является ранним и весьма важным процессом. У эмбриона развитие сосудов начинается с плюрипотентного гемангиобласта, возникающего из параксиальной мезодермы и мезодермы боковых пластинок. Гемангиобласт обладает способностью к дифференцировке либо в гемопоэтический предшественник, либо в предшественник эндотелиальных клеток, известный как ангиобласт.

Развитие сосудов начинается с процесса, известного как васкулогенез, посредством чего ангиобласты подвергаются дифференцировке в эндотелиальные клетки и перемещаются вместе с образованием недифференцированного сосудистого сплетения. Эта первоначальная сосудистая сеть состоит из сосудов, которые являются однородными по размеру и целиком состоят из эндотелиальных клеток. Сосудистое сплетение затем подвергается ремоделированию благодаря ангиогенезу.

Ангиогенез включает спраутинг (разрастание) новых сосудов, перемещение этих сосудов в лишенные сосудов области и привлечение дополнительных клеток, перицитов и гладкомышечных клеток (Gale and Yancopoulos, 1999). Гладкомышечные клетки, которые подвергаются дифференцировке и образуют сокращающиеся сосудистые стенки, возникают из множества предшественников, включающих клетки нервного гребешка, мезенхимные клетки и даже эндотелиальные клетки (Owens, 1995). У взрослых ангиогенез вовлечен в фолликулярное развитие, заживление ран и патологические процессы, такие как ангиогенез в опухоли и болезнь сердца.

Семейство Notch и лиганды для Notch

Исследования Drosophila, C. elegans, данио и млекопитающих показали, что путь с участием Notch является эволюционно консервативным механизмом передачи сигнала, который функционирует для модуляции многочисленных выборов судьбы клетки. Для передачи сигнала Notch необходима надлежащая картина (структурирование) клеток, возникающих из всех трех зародышевых листков. В зависимости от клеточного окружения передача сигнала Notch может как ингибировать, так и индуцировать дифференциацию, индуцировать пролиферацию и способствовать выживанию клеток (Artavanis-Tsakonas et al., 1995; Lewis, 1998; Weinmaster, 1997). У Drosophila единственный белок Notch активируется двумя лигандами, Serrate и Delta. У млекопитающих эти семейства расширены до четырех генов Notch (Notch1, Notch2, Notch3 и Notch4) и пяти лигандов, 2 Serrate-подобных белков (Jagged1-2) и 3 Delta (Dl1, 3, 4) (Bettenhausen et al., 1995; Dunwoodie et al., 1997; Gallahan and Callahan, 1997; Lardelli et al., 1994; Lindsell et al., 1995; Shawber et al., 1996a; Shutter et al., 2000a; Uyttendaele et al., 1996; Weinmaster et al., 1992; Weinmaster et al., 1991). Во время эмбриогенеза картины экспрессии рецепторов и лигандов Notch являются динамическими в пространстве и времени. Однако неизвестно, всякие ли лиганды активируют всякие рецепторы.

Сигнализация и функция Notch

Передача сигнала Notch оказывает влияние на множество различных типов выборов судьбы клетки благодаря обеспечению ингибирующих, индукционных или пролиферативных сигналов, зависящих от внешнего окружения (проанализированных в Artavanis-Tsakonas et al., 1995; Greenwald, 1998; Robey, 1997; Vervoort et al., 1997). Эта плейотропная функция означает, что Notch модулирует множество путей передачи сигналов пространственно-временным образом.

В соответствии с регулированием Notch выборов судьбы клетки, как рецепторы, так и лиганды являются белками клеточной поверхности с единичными трансмембранными доменами (фиг.1). Регуляторный внеклеточный домен белков Notch в основном состоит из последовательно расположенных EGF-подобных повторов, которые требуются для связывания лигандов (Artavanis-Tsakonas et al., 1995; Weinmaster, 1998). В С-концевом направлении от EGF-подобных повторов находятся три дополнительных, богатых цистеином повтора, названные LIN12/Notch-повторами (LNR) (Greenwald, 1994). После LNR находится последовательность протеолитического расщепления (RXRR), которую распознает фуриноподобная конвертаза. В случае Notch1 расщепление в этом сайте дает внеклеточный пептид с М.м. 180 килодальтон и внутриклеточный пептид с М.м. 120 килодальтон, которые удерживаются вместе с образованием гетеродимерного рецептора на клеточной поверхности (Blaumueller et al., 1997; Kopan et al., 1996; Logeat et al., 1998).

Внутриклеточный домен Notch (NotchICD, фиг.1) восстанавливает фенотипы Notch, связанные с потерей функции, означая, что эта форма Notch передает сигнал коститутивно (Fortini and Artavanis-Tsakonas, 1993; Lyman and Young, 1993; Rebay et al., 1993; Struhl et al., 1993).

Цитоплазматический домен Notch содержит три идентифицируемых домена: RAM-домен, содержащий анкириновые повторы домен и С-концевой PEST-домен (фиг.1). В результате активации под действием лигандов Notch подвергается двум дополнительным протеолитическим расщеплениям, которые приводят к освобождению цитоплазматического домена (Weinmaster, 1998). Этот пептид Notch перемещается в ядро и взаимодействует с репрессором транскрипции, известным как CSL (CBF, Su (H), Lag-2) и превращает его в активатор транскрипции. Взаимодействие CSL/Notch зависит от присутствия RAM-домена Notch; в то время как для транскрипционной активности требуется также присутствие анкириновых повторов (Hsieh et al., 1996; Hsieh et al., 1997; Roehl et al., 1996; Tamura et al., 1995; Wettstein et al., 1997). И in vivo, и in vitro исследования показывают, что гены HES и Hey являются прямыми мишенями Notch/CSL-зависимой сигнализации (Bailey and Posakony, 1995; Eastman et al., 1997; Henderson et al., 2001; Jarriault et al., 1995; Nakagawa et al., 2000; Wettstein et al., 1997). Продукты генов HES и Hey являются репрессорами транскрипции bHLH, которые связываются с ДНК в N-боксах (Nakagawa et al., 2000; Sasai et al., 1992; Tietze et al., 1992). Было высказано предположение, что Notch также передает сигнал с помощью CSL-независимого пути. В действительности, экспрессия лишь содержащего анкириновые повторы домена необходима и достаточна для некоторых форм передачи сигнала Notch (Lieber et al., 1993; Matsuno et al., 1997; Shawber et al., 1996b).

Наконец, установлено, что PEST-домен вовлечен в белковый обмен с использованием SEL-10/убиквитин-зависимого пути (Greenwald, 1994; Oberg et al., 2001; Rogers et al., 1986; Wu et al., 1998; Wu et al., 2001). Так же как и в рецепторах, внеклеточный домен лигандов Notch также в основном состоит из последовательно расположенных EGF-подобных повторов (фиг.1). Перед этими повторами находится отличный EGF-подобный повтор, известный как DSL (Delta, Serrate, Lag-2), который требуется для связывания лигандов и активации рецепторов (Artavanis-Tsakonas et al., 1995).

Передача сигнала Notch и развитие сосудов

Хотя многие из генов, которые функционируют с индукцией васкулогенеза и ангиогенеза, были идентифицированы, мало известно о том, каким образом определяются выборы судьбы клетки во время развития сосудов. Ряд наблюдений наводит на мысль, что путь передачи сигнала с участием Notch играет роль в определении судьбы клетки и в структурировании сосудистой системы.

Все из Notch1, Notch4, Jagged1 и Dll4 экспрессируются при развитии сосудистой сети, в то время как Notch3 экспрессируется во вспомогательных гладкомышечных клетках (Krebs et al., 2000; Shutter et al., 2000b; Uyttendaele et al., 1996; Villa et al., 2001; Xue et al., 1999). Мыши, у которых отсутствует Jagged1, имеют смертельный исход на эмбриональной стадии и имеют тяжелые пороки развития сосудов (Xue et al., 1999). Нуль-зиготные по Notch1 мыши имеют смертельный исход на эмбриональной стадии и умирают от тяжелых нейрональных дефектов, но также имеют недостатки ангиогенеза (Krebs et al., 2000; Swiatek et al., 1994). Мыши, у которых отсутствует Notch4, рождаются и кажутся нормальными, но эмбрионы, у которых отсутствуют как Notch1, так и Notch4, умирают на E9,5 от значительного кровоизлияния и пороков сосудистого структурирования, что означает, что Notch1 и Notch4 могут быть функционально дублирующими во время развития сосудов (Krebs et al., 2000). Экзогенная экспрессия активированной формы Notch4 в эндотелии также приводила к порокам развития сосудов, схожим с теми, которые наблюдались в случае нуль-зиготных и по Notch1, и по Notch4 мышей, наводя на мысль, что соответствующие уровни передачи сигнала Notch важны для надлежащего развития сосудистой сети на эмбриональной стадии (Uyttendaele et al., 2001).

Вместе взятые, данные, полученные на основе мутантных по Notch/компонентам передачи сигнала Notch мышей, выявляют несколько зависимых от Notch процессов, включающих ремоделирование сосудов, определение эндотелиальных клеток в качестве артериальных/венозных, привлечение гладкомышечных клеток к сосудам и развитие сосудов сердца/оттока от сердца.

Недавние эксперименты показали вовлеченность передачи сигнала Notch в определение эндотелиальных клеток в качестве артериальных/венозных. In situ анализ эмбрионов на E13,5 показал, что экспрессия Notch1, Notch3, Notch4, Dl4, Jagged1 и Jagged2 ограничена артериями и отсутствует в венах (Villa et al., 2001). В соответствии с данными по экспрессии была установлена связь нарушения передачи сигнала Notch у данио с утратой маркера артериальной эндотелиальной клетки эфрина B2; в то время как эктопическая экспрессия активированной формы Notch приводит к утрате маркера венозной эндотелиальной клетки EphB4 в дорсальной аорте (Lawson et al., 2001). Эти данные говорят о том, что передача сигнала Notch может помочь в определении судеб клеток в качестве клеток артерий и вен во время ангиогенеза.

Вместе взятые, данные, полученные на основе мутантных по Notch/компонентам передачи сигнала Notch мышей, выявляют несколько зависимых от Notch процессов, включающих ремоделирование сосудов, определение эндотелиальных клеток в качестве артериальных/венозных, привлечение гладкомышечных клеток к сосудам и развитие сосудов сердца/оттока от сердца.

Также было высказано предположение, что передача сигнала Notch функционирует в сосудистой системе взрослого. У людей имеется связь миссенс-мутаций во внеклеточном домене Notch3 с развитием дегенеративного заболевания сосудов, CADASIL (Caronti et al., 1998; Desmond et al., 1998; Joutel et al., 2000; Joutel et al., 1996). В модели заживления раны увеличение экспрессии Jagged1 наблюдалось в крае раны с регенерацией эндотелия, что говорит о том, что передача сигнала Notch может функционировать во время процессов ангиогенеза у взрослых (Lindner et al., 2001). Вместе взятые, эти данные подтверждают функционирования передачи сигналов Notch в ряде важных стадий во время развития сосудов: при васкулогенезе, структурировании сосудов/ангиогенезе и определении эндотелиальных клеток в качестве артериальных/венозных. Однако молекулярный механизм(ы), посредством которого пути передачи сигнала с участием Notch оказывают влияние на эти различные стадии, все еще не уяснен.

Значение

Shimizu и др. (J. Biol. Chem. 274(46): 32961-32969 (1999)) описывают использование Notch1ECD/Fc, Notch2ECD/Fc и Notch3ECD/Fc в исследованиях связывания. Однако Shimizu и др. не указывают на применение таких белков для ингибирования ангиогенеза.

В патенте США с № 6379925, выданном Kitajewski и др. 30 апреля 2002 года, описывается Notch4 мыши. Однако в нем не описываются основанные на Notch гибридные белки, изложенные в связанной заявке.

Белки Notch играют важную роль в выборах развития, затрагивающих сосудистую сеть, гемопоэтическую систему и нервную систему. Как таковое, понимание их функционирования является ключом к пониманию того, каким образом выборы судьбы клетки и коммитирование контролируются во время развития и в тканях взрослых. На данное число фенотипы сосудов были описаны в нескольких сообщениях о нарушениях генов Notch или лигандов Notch, в которых подчеркивается, что этот путь является основной частью механизма, который определяет развитие сосудов. Была установлена связь аберрантной активности Notch с патологиями у людей, включающими как рак, так и сосудистые нарушения (CADASIL). Исследование Notch при ангиогенезе в опухоли было начато лишь недавно; однако обнаружение авторами настоящего изобретения возможных, находящихся в прямом направлении передачи сигнала мишеней Notch говорит о роли в патологических процессах, связанных с ангиогенезом. Например, была установлена связь VEGFR-3 как с ангиогенезом в опухоли, так и с лимфоангиогенезом в опухоли. С ангиогенезом в опухоли также была связана экспрессия или функционирование нескольких других возможных мишеней Notch, в том числе эфрина B2, Id3, ангиопоэтина 1 и PDGF-B. Понимание роли этих мишеней в функционировании генов Notch будет, несомненно, способствовать дальнейшему исследованию Notch при патологиях у людей.

Краткое изложение сущности изобретения

Этим изобретением предоставляется гибридный белок, включающий сигнальный пептид, EGF-повторы 1-Х внеклеточного домена белка рецептора Notch3 человека, причем X является любым целым числом от 12 до 34, и Fc-часть антитела, связанную с ними.

Этим изобретением предоставляется гибридный белок, включающий сигнальный пептид, EGF-повторы 1-Х внеклеточного домена белка рецептора Notch3 человека, причем X является любым целым числом от 1 до 10, и Fc-часть антитела, связанную с ними.

Этим изобретением предоставляется гибридный белок, включающий сигнальный пептид, по меньшей мере 12 EGF-повторов внеклеточного домена белка рецептора Notch3 человека и Fc-часть антитела, связанную с ними.

Этим изобретением предоставляется гибридный белок, включающий сигнальный пептид, EGF-повторы внеклеточного домена белка рецептора Notch3 человека, причем присутствуют по меньшей мере 12 EGF-повторов, и Fc-часть антитела, связанную с ними.

Этим изобретением предоставляется способ лечения имеющего опухоль субъекта, включающий введение субъекту количества указанного выше гибридного белка, эффективного для лечения субъекта, осуществляя тем самым лечение субъекта, имеющего опухоль.

Этим изобретением предоставляется способ ингибирования ангиогенеза у субъекта, включающий введение субъекту количества указанного выше гибридного белка, эффективного для ингибирования ангиогенеза у субъекта, ингибируя тем самым ангиогенез у субъекта.

Этим изобретением предоставляется способ лечения имеющего рак яичника субъекта, включающий введение субъекту количества указанного выше гибридного белка, эффективного для лечения субъекта, осуществляя тем самым лечение субъекта, имеющего рак яичника.

Этим изобретением предоставляется применение указанного выше гибридного белка для приготовления фармацевтической композиции для лечения имеющего опухоль субъекта.

Этим изобретением предоставляется применение указанного выше гибридного белка для приготовления фармацевтической композиции для ингибирования ангиогенеза у субъекта.

Этим изобретением предоставляется применение указанного выше гибридного белка для приготовления фармацевтической композиции для лечения имеющего рак яичника субъекта.

Этим изобретением предоставляется применение указанного выше гибридного белка для приготовления фармацевтической композиции для лечения субъекта, имеющего нарушение обмена веществ.

Этим изобретением предоставляется способ ингибирования физиологического лимфоангиогенеза или патологического лимфоангиогенеза у субъекта, включающий введение субъекту количества указанного выше гибридного белка, эффективного для ингибирования физиологического лимфоангиогенеза или патологического лимфоангиогенеза у субъекта.

Этим изобретением предоставляется способ ингибирования метастазирования опухоли у субъекта, включающий введение субъекту количества указанного выше гибридного белка, эффективного для ингибирования метастазирования опухоли у субъекта.

Этим изобретением предоставляется способ ингибирования роста вторичной опухоли у субъекта, включающий введение субъекту количества указанного выше гибридного белка, эффективного для ингибирования роста вторичной опухоли у субъекта.

Этим изобретением предоставляется способ ингибирования использования опухолью для своих собственных целей кровеносных сосудов у субъекта, включающий введение субъекту количества указанного выше гибридного белка, эффективного для ингибирования использования опухолью для своих собственных целей кровеносных сосудов у субъекта.

Этим изобретением предоставляется способ лечения рака у субъекта, включающий введение субъекту указанного выше гибридного белка и ингибитора фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF) в количестве каждого из них, эффективном для лечения рака у субъекта.

Этим изобретением предоставляется способ лечения рака у субъекта, включающий введение субъекту указанного выше гибридного белка и ингибитора рецептора VEGF в количестве каждого из них, эффективном для лечения рака у субъекта.

Этим изобретением предоставляется способ лечения рака у субъекта, включающий введение субъекту указанного выше гибридного белка и ингибитора тромбоцитарного фактора роста (PDGF) в количестве каждого из них, эффективном для лечения рака у субъекта.

Этим изобретением предоставляется способ лечения рака у субъекта, включающий введение субъекту указанного выше гибридного белка и антагониста рецептора PDGF в количестве каждого из них, эффективном для лечения рака у субъекта.

Этим изобретением предоставляется способ лечения рака у субъекта, включающий введение субъекту указанного выше гибридного белка и ингибитора HER2/neu в количестве каждого из них, эффективном для лечения рака у субъекта.

Этим изобретением предоставляется способ лечения рака молочной железы у субъекта, включающий введение субъекту количества указанного выше гибридного белка, эффективного для лечения рака молочной железы у субъекта.

Этим изобретением предоставляется применение указанного выше гибридного белка для приготовления фармацевтической композиции для лечения имеющего рак молочной железы субъекта.

Краткое описание чертежей

Фиг.1

На этой фигуре демонстрируется схематическая структура Notch и лигандов Notch: Notch1, Notch2, Notch3, Notch4, Jagged-1, Jagged-2, Delta-подобного белка 1, Delta-подобного белка 3, Delta-подобного белка 4.

Фиг.2

На этой фигуре демонстрируется схематическая конструкция основанных на Notch гибридных белков (NotchECD/Fc). Внеклеточный домен (ECD) Notch1, Notch2, Notch3 или Notch4, содержащий EGF-повторы, слит с Fc-частью антитела.

Фиг.3

На этой фигуре демонстрируется анализ сокультивирования для проверки активности основанных на Notch гибридных белков. Notch и реагирующие на Notch транскрипционные факторы-репортеры экспрессируются в «Notch-реагирующей» клетке, HeLa. Лиганды Notch, Jagged-1, Delta-подобный белок 1 или Delta-подобный белок 4, экспрессируются в «лигандпрезентирующей» клетке, 293. Экспрессии добиваются при помощи трансфекции отдельных клеточных популяций, клетки подвергают сокультивированию, а затем анализируют на Notch-зависимую активность репортера.

Фиг.4

На этой фигуре демонстрируется ингибиторная в отношении активации передачи сигнала Notch при взаимодействии между Notch и лигандом Notch активность основанного на Notch гибридного белка. Индукция передачи сигнала Notch была выявлена при сокультивировании экспрессирующих и Notch1, и 3 типа лигандов Notch клеток, и эти индукции были ингибированы при котрансфенции экспрессирующего основанный на Notch гибридный белок вектора в Notch1-экспрессирующие клетки. Следовательно, основанные на Notch гибридные белки могут использоваться в качестве ингибитора Notch на основе ингибирования взаимодействия между Notch и лигандом Notch.

Фиг.5

На этой фигуре демонстрируется экспрессия основанного на Notch1 гибридного белка (Notch1ECD/Fc) в клетках 293. Панель A: экспрессия в клеточном лизате (Lys) или с секрецией в среды (Sup). Панель B: экспрессия перечисленных NECD/Fc в лизатах клеток 293.

Фиг.6

На этой фигуре демонстрируется активация передачи сигнала Notch в HUVEC, инфицированных аденовирусным вектором, кодирующим VEGF-165. Активацию передачи сигнала Notch можно обнаружить посредством использования активности промотора CBF1. Транскрипционная активность промотора CBF1 повышается при связывании Notch-IC с CBF1. Активность промотора CBF1 определяли в HUVEC, которые были инфицированы аденовирусом, кодирующим VEGF-165, при различных множественностях инфицирования (MOI). Индукция промотора CBF1 была однозначно обнаружена в Ad-VEGF-инфицированных HUVEC по сравнению с Ad-LacZ-инфицированными клетками, зависимым от множественности заражения образом. Эти данные показали, что сверхэкспрессия VEGF может активировать передачу сигнала Notch в HUVEC.

Фиг.7

На этой фигуре демонстрируется эффект основанных на Notch гибридных белков на VEGF-индуцируемую активацию передачи сигнала Notch. Коинфицирование аденовирусным вектором, кодирующим основанный на Notch гибридный белок, и аденовирусом, кодирующим VEGF, отчетливо снижало повышение активности промотора CBF1, индуцируемое при инфицировании только Ad-VEGF. В случае инфицирования с составляющей 40 множественностью инфицирования для каждого аденовируса на панели A было обнаружено ингибирование на 60% через 24 ч и ингибирование на 90% через 48 ч после трансфекции гена-репортера. Эта ингибиторная активность Notch-ловушки зависела от множественности инфицирования аденовирусным вектором, кодирующим основанный на Notch гибридный белок.

Фиг.8

На этой фигуре демонстрируется эксперимент, в котором оценивался эффект основанных на Notch гибридных белков на индукцию под действием сверхэкспрессируемого VEGF-165 образования выступов у HUVEC. После подвергания Ad-VEGF-инфицированных HUVEC культивированию на коллагеновом (типа I) геле в течение 8 дней индуцировалось образование выступов в коллагеновый гель. Эта индукция образования выступов под действием сверхэкспрессируемого VEGF была явно ингибирована при коинфицировании аденовирусами, кодирующими основанные на Notch гибридные белки. Сам по себе аденовирус, кодирующий основанный на Notch гибридный белок, оказывал меньший эффект на морфологию.

Фиг.9

На этой фигуре демонстрируется результат подсчета выступов в каждом поле под микроскопом. Инфицирование Ad-VEGF клеток HUVEC увеличило число выступов, зависящее от используемой множественности инфицирования (MOI). Несмотря на то, что в случае аденовирусного вектора для основанного на Notch гибридного белка была использована множественность инфицирования, составляющая половину от таковой в случае Ad-VEGF, Ad-VEGF-индуцируемое образование выступов было явно ингибировано. Эти данные говорят о том, что VEGF индуцировал образование выступов у HUVEC благодаря активации передачи сигнала Notch, и что основанный на Notch гибридный белок мог ингибировать VEGF-индуцируемое образование выступов.

Фиг.10

На этой фигуре демонстрируется аминокислотная последовательность внеклеточного домена белка Notch1 крысы (SEQ ID NO: 1) и последовательность линкера (SEQ ID NO: 2).

Фиг.11

На этой фигуре демонстрируется аминокислотная последовательность внеклеточного домена белка Notch2 крысы (SEQ ID NO: 3) и последовательность линкера (SEQ ID NO: 2).

Фиг.12

На этой фигуре демонстрируется аминокислотная последовательность внеклеточного домена белка Notch3 мыши (SEQ ID NO: 4).

Фиг.13

На этой фигуре демонстрируется аминокислотная последовательность внеклеточного домена белка Notch4 мыши (SEQ ID NO: 5) и последовательность линкера (SEQ ID NO: 2).

Фиг.14A и 14B

На этой фигуре демонстрируется последовательность нуклеиновой кислоты внеклеточного домена гена Notch1 крысы (SEQ ID NO: 6).

Фиг.15A и 15B

На этой фигуре демонстрируется последовательность нуклеиновой кислоты внеклеточного домена гена Notch2 крысы (SEQ ID NO: 7).

Фиг.16A и 16B

На этой фигуре демонстрируется последовательность нуклеиновой кислоты внеклеточного домена гена Notch3 мыши (SEQ ID NO: 8).

Фиг.17A и 17B

На этой фигуре демонстрируется последовательность нуклеиновой кислоты внеклеточного домена гена Notch4 мыши (SEQ ID NO: 9), а также последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 10) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 2) линкерной последовательности.

Фиг.18A и 18B

На этой фигуре демонстрируется последовательность нуклеиновой кислоты внеклеточного домена гена Notch1 человека (SEQ ID NO: 11).

Фиг.19A и 19B

На этой фигуре демонстрируется последовательность нуклеиновой кислоты внеклеточного домена гена Notch2 человека (SEQ ID NO: 12).

Фиг.20A и 20B

На этой фигуре демонстрируется последовательность нуклеиновой кислоты внеклеточного домена гена Notch3 человека (SEQ ID NO: 13).

Фиг.21A и 21B

На этой фигуре демонстрируется последовательность нуклеиновой кислоты внеклеточного домена гена Notch4 человека (SEQ ID NO: 14).

Фиг.22A-22I

На этих фигурах демонстрируется, что VEGF активирует передачу сигнала Notch с индукцией образования выступов у HUVEC. HUVEC подвергали трансдукции с помощью Ad-VEGF с множественностью инфицирования (MOI) - 40 (фиг.22A, 22H, 22I) или 20 (фиг.22C, 22G). Ad-LacZ был котрансдуцирован в HUVEC с получением одного и того же общего количества аденовируса - с 60 MOI (фиг.22G), 80 MOI (фиг.22A) и 100 MOI (фиг.22H, 22I). На фиг.22А демонстрируется анализ с использованием ОТ-ПЦР экспрессии Notch и лигандов Notch. Числа означают число циклов ПЦР. На фиг.22В демонстрируется эффект трансдуцированного гена VEGF на активность регулируемого CSL промотора гена-репортера. На фиг.22С демонстрируется эффект SU5416 на активность регулируемого CSL промотора гена-репортера, трансактивируемого Ad-VEGF. На фиг.22D демонстрируется конструкция Notch-ловушки (N1ECDFc). На фиг.22E демонстрируется секреция N1ECDFc из HUVEC, трансдуцированных с помощью Ad-N1ECDFc. На фиг.22F демонстрируется действие N1ECDFc, направленное против лиганд-индуцируемой активности регулируемого CSL промотора гена-репортера, в анализе сокультивирования (□: (-); ■: 0,33 нг pHyTC-N1ECDFc; ■: 0,67 нг pHyTC-N1ECDFc). На фиг.22G-I демонстрируется действие N1ECDFc, направленное против Ad-VEGF-трансдуцированных HUVEC. Передачу сигнала Notch активировали с помощью трансдукции Ad-VEGF в HUVEC в отсутствие или при осуществлении котрансдукции Ad-N1ECDFc в указанной дозе. На фиг.22G демонстрируется эффект N1ECDFc на активность регулируемого CSL промотора гена-репортера, трансактивируемого Ad-VEGF. На фиг.22H демонстрируется ингибирование образования выступов у Ad-VEGF-трансдуцированных HUVEC с помощью котрансдукции Ad-N1ECDFc с составляющей 40 множественностью инфицирования. На фиг.22I демонстрируется количественный анализ эффекта N1ECDFc на образование выступов у Ad-VEGF-трансдуцированных HUVEC (□: выступ; ■: число клеток).

Фиг.23A-23J

На этих фигурах демонстрируется, что передача сигнала Notch увеличивает экспрессию Flt1 с индукцией образования выступов у HUVEC. HUVEC подвергали трансдукции с помощью либо Ad-LacZ, либо Ad-N1IC с множественностью инфицирования (MOI), составляющей 40. На фиг.23A-23C демонстрируется эффект ингибиторов рецепторных тирозинкиназ на Notch-индуцируемое образование выступов у HUVEC. Фиг.23A является фотографией образования выступов у Ad-N1IC-трансдуцированных HUVEC, подвергнутых обработке PD166866, ZD1893 в концентрации 1 мкМ и SU5416 в концентрации 0,5 мкМ. На фиг.23B демонстрируется количественный анализ эффекта ингибиторов в концентрации 1 мкМ (□: выступ; ■: количество клеток). На фиг.23C демонстрируется зависимость от дозы эффекта SU5416 (□: выступ; ■: количество клеток). На фиг.23D-E демонстрируется индукция экспрессии Flt-1 в Ad-N1IC-трансдуцированных HUVEC. На фиг.23D демонстрируется анализ с использованием ОТ-ПЦР экспрессии мРНК Flt-1. На фиг.23E демонстрируется анализ с использованием Вестерн-блоттинга экспрессии белка Flt-1. На фиг.23F-G демонстрируется активация Notch-индуцируемого образования выступов у HUVEC при стимуляции PlGF. Ad-N1IC-трансдуцированные HUVEC культивировали на коллагеновом геле с SFM, вместо полной среды, в отсутствие или в присутствии 50 нг/мл PlGF. На фиг.23F демонстрируется PlGF-индуцируемое образование выступов у Ad-N1IC-трансдуцированных HUVEC (острие стрелки: выступы с одной филоподией; стрелка: выступы с множеством филоподий). На фиг.23G демонстрируется количественный анализ эффекта PlGF на образование выступов у Ad-N1IC-трансдуцированных HUVEC (□: выступы с множеством филоподий; ■: все выступы). На фиг.23H-I демонстрируется эффект трансфекции siRNA для Flt-1 на экспрессию Flt1. Ad-N1IC-трансдуцированные HUVEC подвергали трансфекции 200 пмоль либо контрольной siRNA (CT), либо siRNA для Flt-1. На фиг.23H демонстрируется уменьшение экспрессии мРНК Flt-1. На фиг.23I демонстрируется уменьшение экспрессии белка Flt-1. На фиг.23J демонстрируется эффект трансфекции siRNA для Flt-1 на Notch-индуцируемое образование выступов у HUVEC. Ad-N1IC-трансдуцированные HUVEC подвергали трансфекции либо 100, либо 200 пмоль siRNA и культивировали на коллагеновом геле в течение 2 дней.

Фиг.24A-24E

На этих фигурах демонстрируется, что VEGF регулирует желатиназную активность через передачу сигнала Notch посредством увеличения экспрессии как MMP-9, так и MT1-MMP. На фиг.24A-B демонстрируется зимографический анализ с использованием желатина активности MMP-9 и MMP-2, стимулируемой под действием VEGF, в HUVEC. На фиг.24A демонстрируется эффект N1ECDFc на активность MMP-9. Трансдуцированные HUVEC культивировали на фибриновом геле в указанный день (т.е. D2, D4, D6, D8). Схожие результаты были также получены при использовании коллагенового геля, хотя индукция MMP-9 была более сильной на фибриновом геле, чем на коллагеновом геле (непредставленные данные). На фиг.24B демонстрируется эффект N1ECDFc на активность MMP-2. HUVEC были подвергнуты трансдукции с помощью Ad-N1ECDFc в указанных дозах, и кондиционированные среды собирали от HUVEC, подвергнутых культивированию на коллагеновом геле, в день 4. На фиг.24C-D демонстрируется увеличение экспрессии MMP-9 и MT1-MMP с помощью передачи сигнала Notch. HUVEC были подвергнуты трансдукции с помощью либо Ad-LacZ, либо Ad-N1IC с множественностью инфицирования (MOI), составляющей 40. Числа означают число циклов ПЦР. На фиг.24C демонстрируется анализ с использованием ОТ-ПЦР эффекта передачи сигнала Notch на экспрессию MMP-9 и MMP-2. На фиг.24D демонстрируется индукция экспрессии MT1-MMP и на транскрипционном уровне, и на уровне белка с помощью передачи сигнала Notch. На фиг.24E демонстрируется анализ с использованием ОТ-ПЦР экспрессии MMP-9 и MT1-MMP в Ad-VEGF-HUVEC, котрансдуцированных с помощью Ad-N1ECDFc. HUVEC были подвергнуты трансдукции с помощью Ad-VEGF в отсутствие или при осуществлении котрансдукции Ad-N1ECDFc с множественность инфицирования (MOI) - 40 для каждого вектора. Ad-LacZ котрансдуцировали с получением одного и того же общего количества аденовируса - с 80 MOI.

Фиг.25A-25D

На этих фигурах демонстрируется роль передачи сигнала Notch в VEGF-зависимом in vivo ангиогенезе. На фиг.25A-25D демонстрируется ингибирование VEGF-индуцируемого ангиогенеза с помощью N1ECDFc в исследовании дорсальных альвеолярных мешочков (DAS) у мыши. Представлены репрезентативные фотографии. На фиг.25A демонстрируется ангиогенез в подкожной основе, индуцированный трансфектантом клеток 293, сверхэкспрессирующим VEGF121, (293/VEGF) в сравнение с 293/VEGF, также экспрессирующим Notch-ловушку (основанный на Notch гибридный белок) - N1ECDFc. На фиг.25B демонстрируется количественное определение степени васкуляризации, индуцированной 293/VEGF, в контроле в сравнение с 293, экспрессирующими Notch-ловушку (основанный на Notch гибридный белок) - N1ECDFc. На фиг.25C демонстрируется ангиогенез в подкожной основе, индуцированный Ad-LacZ-инфицированными клетками MDA-MB-231 в сравнение с инфицированными Ad-N1ECDFc (аденовирусом, кодирующим основанный на Notch гибридный белок) клетками MDA-MB-231. Клетки рака молочной железы MDA-MB-231 продуцируют VEGF (непредставленные данные). На фиг.25D демонстрируется количественное определение степени васкуляризации, индуцированной Ad-LacZ-инфицированными клетками MDA-MB-231 в сравнение с инфицированными Ad-N1ECDFc (аденовирусом, кодирующим основанный на Notch гибридный белок) клетками MDA-MB-231.

Фиг.26A и 26B

На этих фигурах демонстрируется пролиферация Ad-VEGF165-трансдуцированых HUVEC. HUVEC подвергали трансдукции с помощью Ad-VEGF165 в указанных дозах. Также осуществляли коинфицирование Ad-LacZ с получением одного и того же общего количества аденовируса - с множественностью инфицирования (MOI), составляющей 40 бляшкообразующих единиц/клетку. HUVEC суспендировали в SFM, дополненной 1% FBS, и затем засевали в количестве 1×10⁴ клеток/лунку в 24-луночные планшеты с 0,4 мл среды. Через 4 дня определяли количества клеток, используя набор CCK-8, и результаты представлены в виде отношения определенных количеств клеток к количеству контрольных клеток, которые были подвергнуты трансдукции с помощью Ad-GFP с множественностью инфицирования (MOI), составляющей 40 бляшкообразующих единиц/клетку. На фиг.26A демонстрируется эффект трансдуцированного гена VEGF на пролиферацию. На фиг.26B демонстрируется ингибиторный эффект SU5416. Ad-VEGF-трансдуцированные HUVEC обрабатывали SU5416 в указанных дозах.

Фиг.27A и 27B

На этих фигурах демонстрируется индукция образования выступов у HUVEC на коллагеновом (типа I) геле. HUVEC подвергали трансдукции с помощью либо Ad-VEGF165, либо AD-N1IC в указанных дозах. Также осуществляли коинфицирование Ad-LacZ с получением одного и того же общего количества аденовируса - с множественностью инфицирования (MOI), составляющей 40 бляшкообразующих единиц/клетку. Трансдуцированные HUVEC культивировали на коллагеновом геле с использованием полной среды. Число выступов определяли под микроскопом в день 7.

Фиг.28A и 28B

На этих фигурах демонстрируется эффект изменения передачи сигнала Notch на пролиферацию клеток. Клетки подвергали трансдукции с помощью указанных аденовирусов. Также осуществляли коинфицирование Ad-GFP с получением одного и того же общего количества аденовируса - с множественностью инфицирования (MOI), составляющей 60 бляшкообразующих единиц/клетку. Через 4 дня определяли количества клеток, используя набор CCK-8, и результаты представлены в виде отношения определенных количеств клеток к количеству контрольных клеток, которые были подвергнуты трансдукции с помощью AD-GFP с множественностью инфицирования (MOI), составляющей 60 бляшкообразующих единиц/клетку. На фиг.28A демонстрируется эффект трансдуцированного N1IC и основанного на Notch гибридного белка на пролиферацию HUVEC. Трансдуцированные HUVEC суспендировали в полной среде и затем засевали в количестве 1×10⁴ клеток/лунку в 24-луночные планшеты с 0,4 мл указанной среды (□: Ad-N1IC; ■: Ad-N1ECDFc). На фиг.28B демонстрируется эффект основанного на Notch гибридного белка на пролиферацию трансфектантов KP1/VEGF. Подвергнутые трансдукции трансфектанты KP1/VEGF суспендировали в среде RPMI1640 и затем засевали в количестве 2×10⁴ клеток/лунку в 24-луночные планшеты с 0,5 мл среды.

Фиг.29

На этой фигуре демонстрируется анализ с использованием ОТ-ПЦР индукции экспрессии PIGF в Ad-N1IC-трансдуцированных HUVEC. HUVEC инфицировали либо Ad-LacZ, либо Ad-N1IC со множественностью инфицирования (MOI), составляющей 40 бляшкообразующих единиц/клетку. Тотальную РНК выделяли из трансдуцированных HUVEC, подвергнутых культивированию на коллагеновом геле в течение 5 дней с использованием полной среды.

Фиг.30A-30C

На этих фигурах демонстрируется ингибирование образования выступов у либо Ad-N1IC-, либо Ad-VEGF-трансдуцированных HUVEC с помощью трансфекции siRNA для Flk-1. На фиг.30А демонстрируется уменьшение экспрессии мРНК и белка Flk-1 в Ad-VEGF-HUVEC с помощью трансфекции 200 пмоль siRNA для Flk-1. Ad-VEGF-HUVEC с множественностью инфицирования (MOI), составляющей 40 бляшкообразующих единиц/клетку, подвергали трансфекции 200 пмоль либо контрольной siRNA (CT), либо siRNA для Flk-1. Через 48 часов после трансфекции выделяли тотальную РНК. Через 48 часов после трансфекции собирали тотальный клеточный лизат от страдающих от недостатка сыворотки при использовании SFM клеток. На фиг.30B и 30C демонстрируется ингибиторный эффект трансфекции siRNA для Flk-1 на либо VEGF-, либо Notch-индуцируемое образование выступов у HUVEC. Либо Ad-N1IC-, либо Ad-VEGF-HUVEC с множественностью инфицирования (MOI), составляющей 40 бляшкообразующих единиц/клетку, подвергали трансфекции 200 пмоль указанной siRNA и культивировали на коллагеновом геле в течение 5 дней. На фиг.30В демонстрируется эффект трансфекции siRNA для Flk-1 на образование выступов у HUVEC (□: Ad-VEGF; ■: Ad-N1IC). На фиг.30C демонстрируется количественный анализ ингибиторного эффекта трансфекции siRNA для Flk-1.

Фиг.31A и 31B

На этих фигурах демонстрируется ингибирование образования выступов у Ad-N1IC-трансдуцированных HUVEC с помощью обработки ингибитором матриксных металлопротеиназ GM6001. Либо Ad-LacZ-, либо Ad-N1IC-HUVEC с множественностью инфицирования (MOI), составляющей 40 бляшкообразующих единиц/клетку, культивировали на коллагеновом геле в