Конъюгаты для введения биологически активных соединений

Конъюгаты для введения биологически активных соединений

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники изобретения

Изобретение относится к способам для стабилизации и адресной доставки соединений, представляющих терапевтический интерес, конкретным образом к тканям-мишеням. Изобретение, в частности, основано на способности аполипопротеина A нацеливать соединения, представляющие терапевтический интерес, на все те ткани, которые имеют на своей поверхности высокоаффинные участки связывания указанного белка.

Предпосылки изобретения

Развитие новых форм терапии c использованием макромолекул в качестве активных ингредиентов создало потребность в разработке эффективных способов стабилизации и адресной доставки этих молекул к соответствующим клеточным мишеням. Примеры терапии, которая требует конкретной адресной доставки к ткани-мишени, включают использование специфических факторов роста или использование генов, которые применяются для замещения утерянных или дефектных генов в ткани-мишени. Тканеспецифические системы, которые не основаны на вирусных векторах, часто страдают проблемой низкой или отсутствующей клеточной специфичности.

Описаны различные системы для адресной доставки терапевтических соединений к клеткам печени на основе липидных везикул, которые содержат внутри терапевтическое соединение, и чья адресная доставка обусловлена присутствием на поверхности везикул молекул, имеющих сродство к мембранам клеток печени.

Например, WO07130873 описывает способы адресной доставки микровезикул к клеткам печени за счет инкорпорации в поверхность указанных капсул соединения, которое специфически распознается сиаловыми гликопротеинами, гиалуроновой кислотой, N-ацетилгалактозамином или рецепторами маннозы, присутствующими на клетках печени. WO02086091 описывает способы адресной доставки нановезикул к клеткам печени за счет инкорпорации внутрь указанных везикул оболочечного белка гепатита В. WO200473684 описывает способ для адресной доставки частично гидрофобных соединений к клеткам печени, на основе дискообразных фосфолипидных частиц, содержащих ApoA-I на своей поверхности. Lou et al (World J. Gastroenterol., 2005, 1 1:954-959) описали способ для адресной доставки липофильного противоопухолевого соединения к клеткам печеночноклеточной карциномы с использованием в качестве специфического носителя липопротеина высокой плотности (ЛПВП), основываясь на способности ЛПВП вмещать гидрофобные соединения, такие как холестерин.

Наконец, Kim et al. (Molecular Therapy, 2007, 15:1145-1152) описывают способ для адресной доставки интерферирующей РНК к клеткам печени на основе липосом, которые включают в себя интерферирующую РНК и содержат ApoA-I на своей поверхности. Однако эти способы имеют тот недостаток, что они позволяют переносить только гидрофобные соединения, поскольку указанные соединения размещаются внутри везикул или искусственных мембран в контакте с гидрофобной фракцией фосфолипидов.

Альтернативно, возможна доставка гидрофильных соединений в печень за счет использования конъюгатов указанных соединений с веществами, которые специфически захватываются печенью. Например, Kramer et al (J.Biol.Chem., 1992,267:18598-18604) описали способы для адресной доставки терапевтических соединений (цитостатика хлорамбуцила и ингибитора пролил-4 гидроксилaзы I-нитро-2-оксa-1,3-диазол-β-Ala-Phe-5-оксапролин-Gly) к клеткам печени посредством конъюгации указанных соединений с желчными кислотами. Однако такой тип конъюгации позволяет осуществлять доставку только в печень, что исключает его использование для введения соединений к другим тканям, представляющим терапевтический интерес.

WO04082720 описывает способы для адресной доставки терапевтических соединений к клеткам печени за счет инкорпорации указанных соединений в псевдовирусные частицы, сформированные оболочечным белком гепатита В. Однако, эти носители имеют проблему, связанную с укороченным периодом полувыведения из плазмы, что требует постоянного введения или введения в высоких дозах для достижения устойчивых терапевтических уровней в плазме. Кроме того, вирусные белки, из которых сформированы псевдовирусные частицы, вызывают гуморальный иммунный ответ.

WO8702061A описывает способы для адресной доставки соединений к тканям, экспресирующим рецептор ЛПНП, за счет использования слитых белков, образованных участком аполипопротеина В или Е, который связывается с рецептором, и активным компонентом.

Проблема короткого времени полужизни интерферона была рассмотрена в WO07021494, который описывает слитые белки, образованные альбумином и интерфероном. Время полужизни таких белков в плазме достигает приблизительно 14 дней.

Таким образом, существует потребность в удобных носителях для специфической адресной доставки терапевтических соединений к клеткам печени, которые позволяют достигать длительного времени полужизни конъюгатов в плазме.

Сущность изобретения

В первом аспекте, изобретение относится к конъюгату, который содержит

(i) молекулу Apo A или ее функционально эквивалентный вариант и

(ii) соединение, представляющее терапевтический интерес,

где компоненты (i) и (ii) ковалентно связаны.

Во втором аспекте, изобретение относится к полинуклеотиду или генной конструкции, содержащей полинуклеотид, кодирующий конъюгат по изобретению, где соединение, представляющее терапевтический интерес (ii), является полипептидом, который формирует единую цепь с компонентом (i).

В целом ряде аспектов, изобретение относится к вектору, содержащему полинуклеотид или генную конструкцию по изобретению, и к клетке-хозяину, содержащей полинуклеотид, генную конструкцию или вектор по изобретению, или нанолипочастицу, содержащую конъюгат по изобретению.

В другом аспекте изобретение относится к конъюгату, полинуклеотиду, генной конструкции, вектору, клетке-хозяину или нанолипочастице по изобретению для применения в медицине.

В другом аспекте изобретение относится к конъюгату, полинуклеотиду, генной конструкции, вектору, клетке-хозяину или нанолипочастице по изобретению для лечения заболеваний печени или заболеваний, связанных с иммунной системой.

В другом аспекте изобретение относится к композиции, которая содержит:

(a) первый компонент, выбранный из группы, состоящей из конъюгата, полинуклеотида, генной конструкции, вектора, клетки-хозяина, нанолипочастицы или фармацевтического препарата по изобретению, где компонент (ii) является ингибиторным пептидом TGF-β1, и

(b) второй компонент, выбранный из группы, состоящей из иммуностимулирующего цитокина, полинуклеотида, кодирующего указанный цитокин, вектора, содержащего указанный полинуклеотид, ингибиторного пептида TGF-β1, цитотоксического средства или их сочетания.

В другом аспекте изобретение относится к комбинации по изобретению для применения в медицине и, в частности, при лечении рака.

Краткое описание чертежей

Фигура 1. Кинетика экспрессии IFNα. Мышам BALB/c делали гидродинамическую инъекцию с плазмидами, экспресирующими ApoA1 (Apo), IFNα (IFN), Apo-IFN (AF) или IFN-Apo (IA). Через 6 часов и на 1, 3, 6 и 9 дни делали забор крови и анализировали сывороточные уровни IFNα методом ELISA. Представлены среднее и стандартная ошибка среднего для типичного эксперимента с четырьмя животными в группе. Результаты анализировали дисперсионным анализом для многократных измерений с последующим тестом Бонферрони. Наблюдали достоверные различия между уровнями IFNα, индуцированными плазмидами AF и IA, и уровнями, индуцированными плазмидным IFN, на 1 и 3 дни (p<0,001).

Фигура 2. Количественная ОТ-ПЦР печеночной мРНК IFNα1. Делали гидродинамические инъекции, используя трех мышей BALB/c для каждой плазмиды и дня исследования. На 1, 3 и 6 дни животных забивали и выделяли печень. Выделяли печеночную мРНК и проводили количественную ОТ-ПЦР для гена IFNα1. Показаны среднее и стандартная ошибка среднего для типичного эксперимента. Результаты анализировали дисперсионным анализом для многократных измерений с последующим тестом Бонферрони. Не было достоверных различий между уровнями мРНК, индуцированными плазмидами IFNα1, AF и IA.

Фигура 3. Температура тела и уровни неоптерина в сыворотке. Мышам BALB/c вводили плазмиды, кодирующие конструкции с IFNα. На 3 день делали забор крови и измеряли уровни неоптерина (A) в сыворотке методом твердофазного иммуноферментного анализа. Одновременно измеряли температуру тела (B). Показаны среднее и стандартная ошибка среднего для двух независимых экспериментов (N=6 мышей). Данные анализировали с помощью дисперсионного анализа с последующим тестом Даннетта, сравнивая группы с IFNα с контрольной группой с ApoAI. *** p<0,0001.

Фигура 4. Количественная ОТ-ПЦР печеночной мРНК генов, индуцируемых IFNα1. Мышам BALB/c делали гидродинамическую инъекцию с плазмидами, экспрессирующими конструкции с IFNα1. На 3 день животных забивали и выделяли печень. Выделяли печеночную мРНК и проводили количественную ОТ-ПЦР для генов 2'-5'OAS (A), USP18 (B), ISG15 (C) и IRF1 (D). Показаны среднее и стандартная ошибка среднего для двух независимых экспериментов (N=6 мышей). Данные анализировали с помощью дисперсионного анализа с последующим тестом Даннетта, сравнивая группы с IFNα с контрольной группой с ApoAI. * р<0,05, *** p<0,0001.

Фигура 5. Увеличение количества и активации спленоцитов. Мышам BALB/c гидродинамическим путем вводили различные конструкции с IFNα, шесть дней спустя мышей забивали и выделяли селезенки. Анализировали число спленоцитов (A) и экспрессию маркера ранней активации CD69 на CD4+ T-клетках (B), CD8+ T-клетках (C), B-клетках (D) и NK клетках (E). Показаны среднее и стандартная ошибка среднего для типичного эксперимента с 7 животными в группе. Данные анализировали с помощью дисперсионного анализа с последующим тестом Даннетта, сравнивая группы с IFNα с контрольной группой с ApoAI. * p<0,05, ** p<0,001, *** p<0,0001.

Фигура 6. Увеличение специфического лизиса, индуцированного генетической вакцинацией в присутствии конструкций, экспрессирующих IFNα. Мышей BALB/c иммунизировали посредством гидродинамической инъекции плазмидой, экспрессирующей β-галактозидазу, и плазмидами, экспрессирующими различные конструкции с IFNα. Плазмиды вводили совместно с адъювантом. Через 7 дней вводили внутривенно клетки-мишени с высокой концентрацией CFSE, нагруженные цитотоксическим пептидом, и контрольные клетки с низкой концентрацией CFSE. Через 24 часа животных забивали и анализировали соотношение клеток-мишеней и контрольных клеток для расчета процента специфического лизиса. Показана гистограмма, отражающая каждую группу, (A) среднее и стандартная ошибка среднего для типичного эксперимента с тремя животными в группе (B). Данные анализировали с помощью дисперсионного анализа с последующим тестом Даннетта, сравнивая группы Apo-IFN и IFN-Apo с группой IFNα. ** p<0,001.

Фигура 7. Экспрессия SR-BI в различных популяциях клеток иммунной системы. Выделяли спленоциты из селезенки мышей BALB/c и метили анти-SR-BI антителами и антителами для распознавания CD4+ Т-клеток (анти-CD4) (A), CD8+ лимфоцитов (анти-CD8) (B), NK клеток (анти-CD49b) (C), моноцитов/макрофагов (анти-CD11b) (D) или дендритных клеток (анти-CD11c) (E).

Фигура 8. Действие адъювантного эффекта на модели противоопухолевой вакцинации. Каждая обрабатываемая группа, состоящая из 11-17 мышей BALB/c, получала гидродинамическую инъекцию плазмид, экспрессирующих ApoAI (Apo), IFNα (IFN) или IFN-Apo (IA). Через 24 часа мышей вакцинировали цитотоксическим пептидом AH1 в неполном адъюванте Фрейнда. Девять дней спустя, подкожно прививали 5×10⁶ клеток CT26 и с течением времени наблюдали появление опухоли. Показан процент мышей, у которых не развилась опухоль с течением времени. Экспериментальные группы сравнивали с контрольной группой по среднему значению с помощью логарифмического рангового критерия. ** p<0,01.

Фигура 9. Кинетика циркулирующих лейкоцитов и тромбоцитов. Мышам BALB/c вводили плазмиды, кодирующие конструкции с IFNα. Делали забор крови у одной группы на 1 день, у другой группы на 3 день и у последней группы на 6 день после гидродинамической инъекции. Производили подсчет лейкоцитов (A) и тромбоцитов (B) при помощи Z1 Coulter Particle Counter согласно инструкциям производителя. Показаны среднее и стандартная ошибка среднего для двух независимых экспериментов (N=4 мыши/день и в группе). Данные анализировали с помощью дисперсионного анализа с последующим тестом Даннетта, сравнивая группы с IFN-Apo и группу с IFN. ** p<0,01.

Фигура 10. Количественная ОТ-ПЦР мРНК генов, индуцируемых IFNα, в головном мозге. Мышам BALB/c делали гидродинамическую инъекцию с плазмидами, экспрессирующими конструкции с IFNα. На 1 день животных забивали и выделяли головной мозг. Выделяли мРНК головного мозга и проводили количественную ОТ-ПЦР для генов USP18 (A), ISG15 (B), 2'-5'OAS (C), Mx1 (D) и IRF1 (D). Представлены среднее и стандартная ошибка среднего для двух независимых экспериментов (N=5 мышей/группа). Данные анализировали с помощью дисперсионного анализа с последующим тестом Даннетта, сравнивая группы с IFN-Apo с группой с IFN. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001. Это один эксперимент, который представляет собой два.

Фигура 11. Инкорпорация слитых белков в циркулирующие липопротеины высокой плотности (ЛПВП). Мышам BALB/c вводили плазмиды, кодирующие конструкции с IFNα. Через 24 часа делали забор крови и выделяли сыворотку, из которой экстрагировали ЛПВП методом дифференциального центрифугирования в градиенте NaBr. Присутствие IFNα в ЛПВП различных групп анализировали посредством интерферонового биотеста, анализа защиты против цитопатического эффекта (A). Для того чтобы определить наличие аполипопротеина A1, проводили вестерн-блоттинг с образцами сыворотки без ЛПВП (ЛПВП-) и фракцией, содержащей ЛПВП (ЛПВП+) (B).

Фигура 12. Гематологические эффекты введения ЛПВП, содержащих IFN-Apo. Мышам BALB/c вводили эквивалент 10000 IU IFN в виде ЛПВП, содержащих IFN-Apo, 10000 IU рекомбинантного IFN или PBS. Через 3 дня производили подсчет лейкоцитов (A) и тромбоцитов (B) с использованием Z1 Coulter Particle Counter согласно инструкциям производителя. Представлены среднее и стандартная ошибка среднего для двух независимых экспериментов (N=4-6 мышей/группа). Данные анализировали с помощью дисперсионного анализа с последующим тестом Даннетта, сравнивая группы с IFN-Apo с группой с IFN. ** p<0,01, *** p<0,001.

Фигура 13. Увеличение индукции IFNγ, вызванной IL12. Посредством гидродинамической инъекции вводили плазмиду, экспрессирующую IL12 под контролем промотора, индуцируемого доксициклином, и другую плазмиду, экспрессирующую контрольную конструкцию или одну из конструкций с ингибитором TGFβ p17 (A) или с ингибитором TGFβ p144 (B.) Через четыре дня, концентрации IFNγ в сыворотке оценивали методом твердофазного иммуноферментного анализа. Представлены среднее и стандартная ошибка среднего для типичного эксперимента с тремя животными в группе. Данные анализировали с помощью дисперсионного анализа с последующим тестом Даннетта, сравнивая экспериментальные группы с контрольной группой. ** p<0,001.

Фигура 14. Защита от развития опухолей CT26. Мышей BALB/c вакцинировали цитотоксическим пептидом AH1 в неполном адъюванте Фрейнда. Через 7 дней делали гидродинамическую инъекцию с конструкциями, экспрессирующими ингибиторы TGFβ или с ApoA-I в качестве контроля. Еще через 7 дней прививали подкожно 5×10⁵ CT26 клеток и наблюдали со временем появление опухоли. Представлен процент мышей, у которых с течением времени не развилась опухоль. Экспериментальные группы сравнивали с контрольной группой по средним с помощью логарифмического рангового критерия. * p<0,05, ** p<0,001.

Фигура 15. Инкорпорация слитых белков Apo-линкер-P144 в циркулирующие липопротеины высокой плотности (ЛПВП). Мышам BALB/c вводили плазмиды, кодирующие конструкции с Apo или Apo-линкер-P144. Через 24 часа производили забор крови и выделяли сыворотку, из которой экстрагировали ЛПВП методом дифференциального центрифугирования в градиенте NaBr. Для того чтобы определить наличие аполипопротеина AI проводили Вестерн-блоттинг с фракциями, содержащими ЛПВП.

Фигура 16. Повышение индукции IFNγ, вызванной IL12, после введения ЛПВП, содержащих Apo-линкер-P144. Посредством гидродинамической инъекции вводили плазмиду, экспрессирующую IL12 под контролем промотора, индуцируемого доксициклином, и другую плазмиду, экспрессирующую контрольную конструкцию (Apo) или Apo-линкер-P144. Последней группе вводили плазмиду IL12 и делали интраперитонеальную инъекцию ЛПВП, содержащих Apo-линкер-P144 (14 мкг/мышь). Через четыре дня измеряли концентрации IFNγ в сыворотке методом твердофазного иммуноферментного анализа. Представлены среднее и стандартная ошибка среднего для типичного эксперимента с тремя животными в группе. Данные анализировали с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим тестом Даннетта для сравнения экспериментальных групп с контрольной группой. ** P<0,01.

Подробное описание изобретения

1. Конъюгат по изобретению

Авторы по настоящему изобретению обнаружили, что конъюгаты, сформированные белком Apo A или его функционально эквивалентным вариантом и молекулой, представляющей терапевтический интерес, после их введения пациентам демонстрируют более длительное время полужизни в сыворотке, чем наблюдаемое у пациентов, которым вводили молекулу, представляющую терапевтический интерес, без конъюгата. Дополнительно, конъюгаты Apo A и молекулы, представляющей терапевтический интерес, доставляются точно в печень пациента, что значительно способствует лечению заболеваний печени и снижению побочных эффектов, возникающих за счет действия терапевтической молекулы на другие ткани.

Таким образом, в первом аспекте, изобретение относится к конъюгату, который содержит

(i) молекулу Apo A или ее функционально эквивалентный вариант и

(ii) соединение, представляющее терапевтический интерес,

где компоненты (i) и (ii) ковалентно связаны.

Без намерения быть связанными с какой-либо теорией, считают, что сродство конъюгатов к ткани печени обусловлено тем фактом, что указанная ткань имеет специфические рецепторы для белков Apo A, естественной функцией которых является захват ЛПВП, имеющих ApoA-I на своей поверхности. С другой стороны, более длительное время полужизни конъюгатов, видимо, связано с долгим временем полужизни молекул Apo A в организме (приблизительно 35 часов у людей или 10 часов у мышей в случае Apo AI). Кроме того, существуют другие клетки, экспрессирующие специфические рецепторы для ApoA-I на своей поверхности, которые дают возможность осуществлять доставку к другим тканям.

1.1 Молекула Apo A

В контексте настоящего изобретения под термином "белок Apo A" подразумевают любой член семейства Apo A, формирующий часть липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) и способный специфически взаимодействовать с рецепторами на поверхности клеток печени, таким образом, обеспечивая свою способность переносить молекулы, прелставляющие интерес и спаренные с указанным белком Apo A, к данному органу.

Предпочтительно, молекулы Apo A, которые можно применять по настоящему изобретению, выбраны из группы, состоящей из ApoA-I, ApoA-II, ApoA-III, ApoA-IV и ApoA-V или их функциональных эквивалентных вариантов.

В предпочтительном варианте осуществления белок Apo A, использованный в настоящем изобретении, является белком ApoA-I. В контексте настоящего изобретения под ApoA-I подразумевают зрелую форму белка пре-проApoA-I, формирующую часть липопротеинов высокой плотности (ЛПВП). ApoAI синтезируется в виде предшественника (пре-проApoA-I), содержащего сигнальную последовательность для секреции, которая элиминируется, приводя к образованию предшественника. Сигнальная последовательность состоит из 18 аминокислот, пропептид из 6 аминокислот и зрелая форма белка из 243 аминокислот. Предпочтительно применение зрелой формы белка, у которой отсутствует сигнальный пептид и которая процессируется. В предпочтительном варианте осуществления белок ApoA-I человеческого происхождения и его аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO:1 (access number P02647 UniProt). В другом предпочтительном варианте осуществления белок ApoA-I мышиного или крысиного происхождения, в частности, от мыши, и его аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO:2 (access number Q00623 UniProt). В другом предпочтительном варианте осуществления белок ApoA-I мышиного или крысиного происхождения, в частности, от крысы, и его аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO:3 (access number P04639 UniProt).

Под функционально эквивалентным вариантом ApoA-I понимают все те полипептиды, которые образуются в результате вставки, замены или делеции одной или более аминокислот упомянутой ранее человеческой, мышиной или крысиной последовательности ApoA-I и по существу сохраняющие нетронутой способность взаимодействовать с так называемым "скэвенджер-рецептором класса B типа I” (SR-BI), который формирует рецептор ЛПВП, присутствующий на клетках печени. Способность взаимодействовать с рецептором ЛПВП определяется главным образом как описано Monaco et al. (EMBO J., 1987, 6:3253-3260) или посредством исследований связывания ApoA-I с мембраной гепатоцитов или посредством определения способности ApoA-I или варианта ингибировать связывание ЛПВП с рецепторами на мембранах гепатоцитов. Предпочтительно, константа диссоциации связывания варианта ApoA-I с мембранами гепатоцитов, по меньшей мере, 10^-8 M, 10^-7 M, 10^-6 M, 10^-5 M или 10^-4 M.

Варианты ApoA-I, предусмотренные в контексте настоящего изобретения, включают пеполипептиды, показывающие, по меньшей мере, 60%, 65%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 90% или 95% сходства или идентичности с полипептидами ApoA-I. Степень идентичности между двумя полипептидами определяют с использованием компьютерных алгоритмов и способов, которые хорошо известны специалистам в данной области. Идентичность между двумя аминокислотными последовательностями предпочтительно определять с использованием алгоритма BLASTP (BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul S., et al., J., 1990, Mol. Biol.215:403-410).

Варианты ApoA-I, применяемые в контексте изобретения, предпочтительно имеют длительное время полужизни в сыворотке по отношению к нативному ApoA-I, что позволяет достичь более высоких уровней ApoA-I в сыворотке, чем наблюдаемые с ApoA-I. Способы для определения времени полужизни белка в сыворотке, в частности ApoA-I, известны в данной области и включают, среди прочих, использование способов, основанных на метаболическом мечении с помощью меченых белков, описанных Eisenberg, S. et al. (J.Lipid Res 1973, 14:446-458), by Blum et al. (J. Clin. Invest, 1977, 60:795-807) и Graversen et al. (J Cardiovasc Pharmacol., 2008, 51:170-177). Примером указанных вариантов, которые демонстрируют более длительное время полужизни, является, например, вариант под названием Milano (который содержит мутацию R173C).

1.2 Соединения, представляющие терапевтический интерес

В контексте настоящего изобретения "соединения, представляющие терапевтический интерес" следует понимать как любое соединение, которое способно предупреждать или устранять симптомы заболевания. Изобретение изначально предусматривает использование любого терапевтического соединения, которое предрасположено к ковалентной модификации без существенной потери своей биологической активности, так что оно может быть конъюгировано с ApoA-I или его функционально эквивалентным вариантом. Таким образом, изобретение предусматривает применение маленьких органических молекул, пептидов, пептидомиметиков, пептоидов, белков, полипептидов, гликопротеинов, олигосахаров, нуклеиновых кислот и т.п. в качестве терапевтически эффективного компонента.

Например, соединения, которые могут быть конъюгированы с ApoA-I или его функционально эквивалентным вариантом, включают антибиотики, холинэстеразные средства, атропин, скополамин, симпатомиметические перпараты, гипнотики, седативные препараты, антиконвульсанты, опиоиды, анальгетики, противовоспалительные лекарственные средства, гистамины, производные липидов, антиастматические лекарственные средства, жаропонижающие-анальгетические лекарственные средства, ксантины, осмотические диуретики, соединения ртути, тиазиды и сульфонамиды, ингибиторы карбоангидразы, органические нитраты, противогипертонические средства, сердечные гликозиды, антиаритмические препараты, окситоцин, простагландины, алкалоиды, вещества, снижающие родовую деятельность, противоглистные препараты, противопротозойные препараты, антималярийные препараты, амебициды, сульфонамиды, пенициллины, триметропин, цефалоспорины, сульфометоксазол, противогрибковые препараты, фторхинолоны, противовирусные препараты, антибиотики, аминогликозиды, тетрациклины, хлорамфеникол, эритромицин, алкилирующие средства, гормоны, антиметаболиты, антибиотики, радиоактивные изотопы, азатиоприн, хлорамбуцил, циклофосфамид, метотрексат, противосвертывающие препараты, тромболитики, антиагрегантные препараты, гормоны аденогипофиза, гормоны щитовидной железы и противотиреоидные гормоны, эстроген и прогестерон, андрогены, адренокортикотропин, инсулин, паратиреоидный гормон, стероидные производные витамина D, витамины (водорастворимые витамины, такие как комплекс витаминов группы В и аскорбиновая кислота, или жирорастворимые витамины, такие как витамины A, D, K или E), антигистаминные препараты, противоопухолевые лекарственные средства, противовирусные, противогрибковые соединения. Предпочтительно использовать соединения, которые применяют для лечения заболеваний, поражающих печень, или заболеваний печеночного генеза.

В предпочтительном варианте осуществления компонент (ii) конъюгатов по изобретению содержит полипептидную цепь. В предпочтительном варианте осуществления полипептид ApoA-I и полипептид, образующий компонент (ii), формируют единую полипептидную цепь. Настоящее изобретение предусматривает две взаимные ориентации обоих полипептидов. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления C-конец компонента (i) связан с N-концом компонента (ii). В другом предпочтительном варианте осуществления N-конец компонента (i) связан с C-концом компонента (ii). Предпочтительно, когда конъюгаты ApoA-I формируются единой полипептидной цепью, они не формируются посредством

(i) белка A S.aureus, связанного через его C-конец с N-концом белка ApoA-I.

(ii) ApoA-I белка, связанного через его C-конец с N-концом вазоинтестинального пептида (VIP-I)

(iii) компонента (ii), который является тяжелой цепью иммуноглобулина или фрагментом плазминогена.

(iv) домена тримеризации тетранектина (TTSE), связанного через его C-конец с N-концом белка ApoA-I.

Полипептиды, которые могут быть доставлены в печень с использованием конъюгатов по изобретению, включают эритропоэтин (EPO), лептины, адренокортикотропин-высвобождающий гормон (CRH), соматолиберин (GHRH), гонадотропин-высвобождающий гормон (GnRH), тиреотропин-высвобождающий гормон (TRH), пролактин-высвобождающий гормон (PRH), мелатонин-высвобождающий гормон (MRH), пролактин-ингибирующий гормон (PIH), соматостатин, адренокортикотропный гормон (ACTH), соматотропный гормон или гормон роста (GH), лютеинизирующий гормон (LH), фолликулостимулирующий гормон (FSH), тиреотропин (TSH или тиреотропный гормон), пролактин, окситоцин, антидиуретический гормон (ADH или вазопрессин), мелатонин, мюллерова ингибирующая субстанция, кальцитонин, паратиреоидный гормон, гастрин, холецистокинин (CCK), Arg-вазопрессин, тиреоидные гормоны, азоксиметан, трийодтиронин, LIF, амфирегулин, растворимый тромбомодулин, SCF, остеогенный белок 1, BMP, FGM, MGSA, херегулин, меланотропин, секретин, инсулиноподобный фактор роста-I (IGF-I), инсулиноподобный фактор роста-II (IGF-II), предсердный натрийуретический пептид (ANP), хорионический гонадотропин человека (hCG), инсулин, глюкагон, соматостатин, панкреатический полипептид (PP), лептин, нейропептид Y, ренин, ангиотензин I, ангиотензин II, фактор VIII, фактор IX, тканевой фактор, фактор VII, фактор X, тромбин, фактор V, фактор XI, фактор XIII, интерлейкин 1 (IL-1), интерлейкин 2 (IL-2), интерлейкин 3 ( IL-3), интерлейкин 4 (IL-4), интерлейкин 5 (IL-5), интерлейкин 6 (IL-6), интерлейкин 7 (IL-7), интерлейкин 8 (IL-8), интерлейкин 9 (IL-9), интерлейкин 10 (IL-10), интерлейкин 11 (IL-11), интерлейкин 12 (IL-12), интерлейкин 13 (IL-13), интерлейкин 14 (IL-14), интерлейкин 15 (IL-15) интерлейкин 16 (IL-16), интерлейкин 24 (IL-24), фактор некроза опухоли альфа (TNF-α), интерферон альфа, бета, гамма, CD3, CD134, CD137, ICAM-I, LFA-1, LFA-3, хемокины, включая RANTES 1α, MIP-1α, MIP-1β, фактор роста нервов (NGF), белок WT1, который кодируется геном-супрессором опухоли Вилмса, тромбоцитарный фактор роста (PDGF), трансформирующий фактор роста бета (TGF-бета), костные морфогенетические белки (BMP), факторы роста фибробластов (FGF и KGF), эпидермальный фактор роста (EGF и родственные), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) колониестимулирующий фактор гранулоцитов (GM-CSF), глиальный фактор роста, фактор роста кератиноцитов, фактор роста эндотелия сосудов, глиальный нейротрофический фактор (GDNF), альфа-1 антитрипсин, фактор некроза опухоли, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), кардиотропин 1 (CT-1), онкостатин M (OSM), серпин (A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10, A11, A12, A13, B1, B2, B3, B4, B5, B6, B7, B8, B9, B10, B11, B12, B13, C1, D1, E1, E2, F1, F2, G1, H1, I1 и I2), циклоспорин, фибриноген, EDA домен фибронектина, лактоферрин, тканевой активатор плазминогена (tPA), химотрипсин, иммуноглобулины, гирудин, супероксиддисмутаза, имиглюцераза, β-глюкоцереброзидаза, альглюкозидаза-α, α-L-идуронидаза, идуронат-2-сульфатаза, галсульфаза, α-галактозидаза А человека, ингибитор протеиназы α-1, лактазы, ферменты поджелудочной железы (липаза, амилаза, протеаза), аденозиндеаминаза, иммуноглобулины, альбумин, токсины ботулизма типа A и B, коллагеназа, дезоксирибонуклеаза I человека, гиалуронидаза, папаин, L-аспарагиназа, лепирудин, стрептокиназа, порфобилиногендеаминаза (PBGD), пептидные ингибиторы клеточного трансформирующего фактора бета (TGF-β), ингибиторы IL10, ингибиторы FoxP3, ингибиторы TNFα, ингибиторы VEGF, ингибиторы PD-1I и ингибиторы CD152.

В предпочтительном варианте осуществления компонент (ii) конъюгата по изобретению является интерфероном (IFN). Интерфероны классифицируются как интерферон типа I, типа II и типа III. Интерфероны типа I представляют собой семейство полипептидов с цитокиновой активностью, которые изначально были открыты в результате их ингибирующей активности при вирусной инфекции на клеточных линиях in vitro (Pestka, S., Krause, CD. And Walter, MR 2004. Immunol Rev. 202:8-32) и которые характеризуются тем, что связываются с так называемым рецептором IFN-α (IFNAR). В зависимости от гомологии их последовательностей, интерфероны типа I классифицируют как интерферон-α (IFN-α), интерферон-β (IFN-β) и интерферон-ω (IFN-ω). IFN-α и IFN-β делят один димерный рецептор, который экспресируется на поверхности большинства ядросодержащих клеток. Функция этих цитокинов очень важна для иммунного ответа против различных типов вирусных инфекций, с учетом того, что они запускают механизмы гибели инфицированных клеток посредством апоптоза и ингибирование вирусной репликации, в то же самое время они способствуют презентации антигена. Недавно было экспериментально зафиксировано, что они также выполняют свои функции посредством прямой активации деятельности T, B и NK клеток, а также дендритных клеток при иммунном ответе (Le Bon A. et al., 2003. Nat Immunol. 4: 1009-1015; Le Bon A. et al., 2006. J. Immunol. 176:4682-4689; Le Bon A. et al., 2006. J Immunol. 176:2074-8). Интерфероны типа II характеризуются связыванием с рецептором интерферона гамма (IFNGR) и включают IFN-γ в качестве единственного члена. Интерфероны типа III передают свой сигнал через комплекс, сформированный рецептором 2 IL-10 (IL10R2) и рецептором IFN лямбда 1 (IFNLR1), и включают в себя три интерферона лямбда, именуемых IFN- λ1, IFN-λ2 и IFN-λ3.

В предпочтительном варианте осуществления компонент (ii) является интерфероном типа I, таким как IFN-α, IFN-β, IFN-δ, IFN-ε, IFN-k, IFN-τ и IFN-ω. В конкретном варианте осуществления, по меньшей мере, один интерферон типа I, включенный в композицию по изобретению, выбран из группы, состоящей из интерферона-альфа (IFN-α) и интерферона-бета (IFN-β). Когда интерферон типа I представляет собой IFN-α, последний может соответствовать любому интерферону, который кодируется любым геном семейства человеческих генов IFN-α. В конкретном варианте осуществления, по меньшей мере, один интерферон типа I является IFN-α, выбранным из группы, состоящей из IFN-α2a, IFN-α2b, IFN-α4, IFN-α5, IFN-α8 и их сочетаний, включая их комбинации с остальными веществами в фармацевтических составах. В более конкретном варианте осуществления, интерферон является IFN-α1, предпочтительно человеческого происхождения. В предпочтительном варианте осуществления интерферон является IFN-α5.

Список видов интерферона типа I, в частности IFN-α и IFN-β, которые можно использовать по изобретению, можно найти у Bekisz et al. (Growth Factors, 2004, 22: 243-251) и Petska et al. (Immunological Reviews, 2004, 202: 8-32). Дополнительно, изобретение относится к применению комбинаций конъюгатов, содержащих более чем один тип интерферона, таких как, например, IFN-αn1 (производное лимфобластов) или IFN-α3 (комбинация интерферонов, произведенных лимфоцитами человека, после стимуляции вирусом Сендаи (или другим вирусом) или частицами вируса).

Происхождение применяемого интерферона типа I не является критическим аспектом изобретения. Он может быть природного происхождения, экстрагированный и очищенный из биологических жидкостей или тканей, или произведенный посредством обычной рекомбинантной генетической инженерии и методов, таких как описанные в Sambrook и Russel (“Molecular Cloning: Laboratory Manual" by J. Sambrook, Russel DW Eds. 2001, third edition, Cold Spring Harbor, New York), с помощью синтеза или при помощи любого другого общепринятого способа, описанного в данной области.

В конкретном варианте осуществления изобретения, по меньшей мере, один интерферон типа I, включенный в композицию по изобретению, находится в пегилированной форме. Некоторые примеры приготовления пегилированных форм интерферона можно найти в US5762923 и US5766582. Дополнительно, также возможно использовать некоторые из форм интерферона, которые уже являются коммерчески доступными в пегилированной или непегилированной форме. Они включают, без каких-либо ограничений, Roferon-A (рекомбинантный IFN-α2a человека) и PEGASYS (пегилированный IFN-α) от Hoffmann La Roche Inc., INTRON-A (рекомбинантный IFN-α2b человека) и PEG-INTRON (пегилированный IFN-α2b) от Schering Corp., Alferon-N (IFN-α3n, комбинация интерферонов природного происхождения) от Interferon Sciences, или IFNERGEN (IFN-αcon1) от InterMune Pharmaceuticals Inc., последовательность которого представляет собой консенсусную последовательность, не полностью соответствующую природной последовательности. Также включены составы IFN-β, такие как, например AVONEX (IFN-β1a) от Biogen Idee, Rebif (IFN-β1a) от EMD Serano, Inc. и Betaseron (IFN-β1b) от Bayer Health Care.

В предпочтительном варианте осуществления конъюгат по изобретению образован ApoA-I, слитым своим C-концом посредством гибкого линкера с N-концом молекулы интерферона α1. В другом предпочтительном варианте осуществления конъюгат по изобретению образован молекулой интерферона α1, слитой своим C-концом посредством гибкого линкера с N-концом молекулы ApoA-I.

В другом предпочтительном варианте осуществления компонент (ii) является ингибитором TGF-бета. Ингибиторы TGF-бета, которые могут образовывать часть конъюгатов по изобретению, включают пептидные ингибиторы, выбранные из последовательностей рецептора TGF-бета 1, которые связываются с рецептор-связывающим сайтом в TGF-β1, таким образом, блокируя связывание с рецептором. Такие типы пептидов описаны в WO200031135, содержание которого в полном объеме включено в качестве ссылки. В предпочтительном варианте осуществления ингибиторный пептид TGF-β1 является производным TGF-β1 рецептора типа III. В более предпочтительном варианте осуществления ингибиторный пептид является пептидом p144 с последовательностью TSLDASIIWAMMQN (SEQ ID NO:4).

Изобретение также относится к применению пептидов, ингибирующих взаимодействие между TGFβ1 и рецептором TGFβ1 и передачу сигнала, происходящую в ответ на указанное взаимодействие, выявленные по генетической библиотеке фагового дисплея, как описано в WO200519244, содержание которого в полном объеме включено в качестве ссылки. В предпочтительном варианте осуществления ингибиторный пептид является пептидом p17 с последовательностью KRIWFIPRSSWYERA (SEQ ID NO:5), а также его усеченными вариантами, которые по существу сохраняют способность ингибировать взаимодействие между TGFβ1 и его рецептором, и которые описаны в WO2007048857, содержание которого в полном объеме включено в настоящее изобретение.

1.3. Линкерный элемент между компонентом ApoA и терапевтически активным соединением

Конъюгаты по изобретению, включающие белок Apo A и второй компонент пептидной природы, могут содержать связь, напрямую соединяющую белок Apo A и указанный второй компонент, или, альтернативно, могут содержат