Способ двухфазного получения липосом и способы их применения при изготовлении диагностических реагентов

Способ двухфазного получения липосом и способы их применения при изготовлении диагностических реагентов

Реферат

Изобретение относится к способу двухфазного получения липосом, в ходе которого неполярная органическая фаза, содержащая определенную смесь природных и синтетических фосфолипидов, и несмешивающаяся с ней полярная водная (буферная) фаза смешиваются при помощи технически простой механической процедуры. Липосомная эмульсия уникальной структуры, полученная предлагаемым способом, может предпочтительно применяться in vitro, когда активный компонент прикрепляется к поверхности липосомных мембран.

Кроме того, возможные примеры осуществления изобретения относятся к получению диагностических реагентов для исследования свертывания крови in vitro. В группе примеров осуществления изобретения упомянутый реагент состоит из предлагаемой липосомной эмульсии уникальной структуры, обеспечивающей мембранную поверхность для активных компонентов, и активных компонентов белкового типа, а именно природного или рекомбинантного тканевого фактора. В возможном примере из этой группы прикрепление белка к поверхности мембраны осуществляется на предварительно полученных липосомах. В другом возможном примере из этой группы прикрепление белка происходит одновременно со сборкой поверхности липосомной мембраны. В другой группе примеров осуществления изобретения упомянутый реагент состоит из предлагаемой липосомной эмульсии уникальной структуры и растворимых активных компонентов небелкового типа, добавленных к упомянутой эмульсии путем простого механического смешивания. Растворимые активные компоненты небелкового типа могут представлять собой либо органическую(ие) кислоту(ы), либо неорганическое(ие) соединение(ия) (например: эллаговая кислота, дубильная кислота, рутин, кверцетин или неорганический диоксид кремния).

Объектом изобретения является способ, при осуществлении которого приготавливаются диагностические реагенты для исследования свертывания крови in vitro. Диагностические реагенты для исследования свертывания крови in vitro, полученные с помощью предлагаемого способа, пригодны для измерения протромбинового времени и активированного частичного тромбопластинового времени. Еще одним объектом описания изобретения является возможность промышленной реализации вышеупомянутого способа.

Наиболее часто выполняемые измерения в диагностике свертывания крови предназначены для определения протромбинового времени (РТ) и активированного частичного тромбопластинового времени (АРТТ). Обе диагностические процедуры обеспечивают мониторинг ферментативных процессов в системе свертывания крови для указания гемостатического состояния обследуемого организма.

Свертывание крови - это ферментативная цепная реакция каскадного типа, состоящая из комплексных биохимических стадий сгущения и разжижения. Определяющее большинство ферментативных реакций системы свертывания крови представляет собой мембраносвязанные процессы, включающие молекулы белкового и небелкового типа (ферменты и кофакторы) и мембранные компоненты. Основными составляющими мембранных компонентов являются полярные и неполярные липиды, играющие основную структурную (прикрепление) и функциональную (например, кофермент активности фермента) роль. Для моделирования мембраносвязанных процессов in vivo в системе in vitro мембранные функции могут поддерживаться специальной процедурой липидизации, обеспечивающей систему in vitro соответствующими липидными компонентами.

В соответствии с настоящим изобретением липидосодержащие компоненты диагностических реагентов для исследования свертывания крови in vitro представляют собой липосомы, то есть липидные везикулы диаметром меньше микрометра, которые образуют устойчивую эмульсию с водными растворами соответствующих составов. Упомянутые липосомы обеспечивают мембранную поверхность, как среду, необходимую для диагностических реакций свертывания крови in vitro, то есть они пригодны для прикрепления органических соединений (например, природных или рекомбинантных белков, имеющих соответствующую аминокислотную последовательность) и для связывания органических или неорганических соединений, имеющих соответствующие структуры. Кроме того, поверхность липосомных мембран выполняет функцию кофактора в поверхностно-активных реакциях прикрепленных активных белков или растворимых активных неорганических соединений.

Целью измерений протромбинового времени (РТ) и активированного частичного тромбопластинового времени (АРТТ) является определение времени полимеризации фибриногена плазмы крови как результат основного этапа системы свертывания крови, то есть превращение неактивного протромбина в активный тромбин.

При измерениях протромбинового времени (РТ) используется эффект начала коагуляции так называемого тромбопластина, то есть начала так называемого внешнего пути свертывания крови [Mackman H. et al. (2007): Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol. 27:1687-1693]. Тромбопластин содержит тканевой фактор (TF, фактор свертывания крови III), встроенный в фосфолипидную мембрану. Тканевой фактор представляет собой трансмембранный гликопротеин, перекрывающий клеточные мембраны [Bazan J.F.(1990): PNAS 87, 6934-6938]. Несмотря на то что обнаруживаемый уровень тканевого фактора в циркулирующей крови здоровых людей проблема спорная [Monroe D.M., Key N.S.(2007): J.Thromb.Haemost. 5:1097-1105], после повреждения сосудистого русла мембраносвязанный тканевой фактор высвобождается из клеток вдоль раны (например, эндотелиальные клетки, белые кровяные клетки), что инициирует каскад свертывания крови.

Высвобожденный мембраносвязанный тканевой фактор связывает и активирует фактор свертывания крови VII, таким образом, мембраносвязанный тканевой фактор действует как кофактор и рецептор активированного фактора свертывания Vila. Мембраносвязанный тканевой фактор и активированный фактор свертывания Vila способствуют активации фактора свертывания X в присутствии ионов Са²⁺. Превращение протромбина в тромбин вызвано протромбиназным комплексом, который собран из активированного X фактора свертывания (то есть фактор Xa) и активированного фактора свертывания V (то есть фактора Va), последний выполняет функцию регулирующего белка. Тромбин расщепляет белковую цепочку фибриногена до получения мономеров фибрина. Тромбин также активирует фактор XIII; активированные формы фактора XIIIa, фермент лигазы из семейства трансглутаминазы, действующий как стабилизирующий фактор фибрина. Стабильная фибриновая сеть, фибрин-полимер создается из фибриновых мономеров путем ковалентной перекрестной сшивки под влиянием активированного стабилизирующего фибрин фактора XIIIa [Edgington T.S. et al. (1991): The Structural Biology of Expression and Function of Tissue Factor, Thrombosis and Haemostasis, 66: 67-79].

Как описано выше, тромбопластин представляет собой содержащий мембранный комплекс тканевой фактор, прикрепленный к липидной мембране соответствующего состава. Кроме того, наличие белка в сочетании с окружающей липидной мембраной играет важнейшую роль в инициировании каскада свертывания крови в пространстве и времени. Решающее большинство существующих РТ реагентов производится путем гомогенизации богатых липидами животных или человеческих эндотелиальных тканей в водных растворах. Тем не менее, в некоторых новейших продуктах применяется содержащий тромбопластин рекомбинантный тканевой фактор в сочетании с искусственными липидными структурами.

При измерениях активированного частичного тромбопластинового времени [АРТТ] каскад активации начинается без компонента тканевого фактора (частичный тромбопластин), но запускается активными компонентами с результирующим отрицательным зарядом (диоксид кремния, органические кислоты) и липидными мембранами.

Известные растворы для производства диагностических реагентов для исследования свертывания крови отличаются друг от друга методом получения мембранных компонентов, то есть липосом. Во всех методах, применяемых для производства РТ реагентов, тромбопластин получают путем смешивания хранящегося в растворе тканевого фактора при помощи поверхностно-активного вещества (детергента) и подготовленной липосомной дисперсии [такие растворы описаны в патенте US 5625036, патенте US 5314695, патенте US 6124110, в патенте US 6733985, патенте US 7049087 и в патенте US 7148067]. Затем поверхностно-активные вещества удаляют из системы с помощью соответствующих процессов разделения, а именно путем диализа [см., например, патент US 5314695, патент US 4622188, патент US 6124110 и патент US 6733985], путем ультрафильтрации [патент US 5625036; и патент US 5314695] или путем адсорбционных способов [как описано в патенте US 7049087; и патенте US 7148067], так как присутствие детергентов в количестве свыше 0,05% ингибирует реакции свертывания крови. Процесс удаления детергента, то есть когда концентрация детергентов достигает своего конечного значения, необходимо проверять путем проведения нескольких измерений в процессе производства. Большим недостатком использования детергентов, помимо увеличения этапов способа, является высокая стоимость собственно детергента и/или используемой для его удаления технологии.

В известных способах методы получения липосом [например, в патенте US 4622188] основаны на том явлении, что в растворах соответствующей полярности поверхностно-активные вещества, имеющие как полярные, так и неполярные части молекулы, образуют однослойные или многослойные везикулы, в зависимости от физико-химических условий.

"A" - Наиболее часто используемый классический способ производства липосом представляет собой так называемый сухой метод [описан в патенте US 4438052, патенте US 5556637 и патенте US 7169410]. В этом способе первым этапом является растворение липидов в органическом растворителе. Затем растворитель полностью испаряется из раствора, с помощью вакуума или инертного газа. Сухая липидная пленка, образовавшаяся на стенке сосуда, окончательно диспергируется в соответствующем водном растворе. Конечную липосомную эмульсию из этой дисперсии получают путем интенсивного перемешивания [такой раствор описан в патенте US 6296870] и/или с помощью ультразвукового измельчения [см. патент US 5234634]. Эти известные способы в основном дают в результате многослойные липосомы с довольно широким распределением по размеру. Соответствующего распределения по размеру и подходящей слоистости можно достичь путем экструзии вышеупомянутой грубой дисперсии на оборудовании высокого давления, обеспечивающим узкое распределение по размеру и однослойные или двухслойные везикулы. Метод экструзии стал широко использоваться в девяностые годы [примеры такого раствора описаны в патенте US 4529561, патенте US 5204112 и патенте US 6926905].

В зависимости от смешиваемости с водой растворителя, содержащего липиды, способы смешивания с растворителем можно разделить на две группы.

В случае использования растворителя, смешиваемого с водой, способ называется однофазным способом [примером является патент US 6261792].

"B" - В однофазных способах липиды растворяются в полярных органических растворителях, как правило, в спиртах, и липидный раствор смешивается с водным растворителем. Полученные липосомы, как правило, содержат два или более слоев, во внутренней полости липосом содержится смесь водного раствора и спирта. В целях снижения многослойности липосом и сужения распределения по размеру используются методы, перечисленные в случае технологии сухой пленки.

"C" - Частный случай однофазных способов, когда липидная смесь растворяется в водном растворе при использовании молекул детергента, добавляемых в относительно высокой концентрации (1-2%). Детергент удаляется с помощью ультрафильтрации, диализа или с помощью абсорбирующей прокладки. При этом известном решении могут образовываться как однослойные, так и многослойные липосомы, теоретически пропорцию их получения можно регулировать до определенной степени скоростью удаления детергента и соответствующим ионным составом водного раствора.

В случае использования растворителя, не смешиваемого с водой, способ называется двухфазным способом [см., например, патент US 5723147]. В случае двухфазных способов дополнительное разграничение возможно на основе объемного соотношения растворителей.

"D" - Традиционно, липосомы, полученные из липидов, растворенных в небольшом количестве неполярного органического растворителя и смешанных с существенно большим количеством водного (полярного) растворителя, называются эмульсией типа «масло-в-воде».

"E" - Липосомы, полученные из липидов, растворенных в большом количестве неполярного растворителя и смешанных с небольшим количеством воды, называются эмульсиями типа «вода-в-масле».

В большинстве известных двухфазных способов фазу меньшего объема впрыскивают в фазу большего объема и в течение всего процесса осуществляется интенсивное вихревое перемешивание. Для сужения распределения липосом по размеру после выполнения этих способов также может применяться экструзия, либо впрыскивание и экструзия могут выполняться в один этап на одном и том же оборудовании.

Предполагая получение монослоя в случае эмульсии типа «масло-в-воде», поверхности липосом образуются полярным концом липидной молекулы (головка), в то время как неполярный конец молекулы (хвост) указывает на неполярный растворитель, помещенный в везикулу. В случае эмульсий типа «вода-в-масле» ситуация противоположная. В соответствии с теоретическими соображениями в случае полного исключения растворителей липосомы расположены в псевдо-гексагональных решетках, строение которых называется гекса I (H_I) структурой в случае эмульсий типа «масло-в-воде» и гекса II (H_II) структурой в случае эмульсий типа «вода-в-масле».

Специалистам в данной области ясно, что в технологиях, основанных на прикреплении активных молекул к липидной мембране, когда активные молекулы (например, белки) проявляют свое действие по отношению к водной фазе (например, диагностические реагенты), собранные монослои должны формироваться исключительно в Hi структуре. То есть, эмульсия типа «масло-в-воде» может применяться как модель клеточной мембраны. Кроме того, в случае многослойных липосом везикулы с таким внешним поверхностным слоем, в котором только головки липидов направлены на водную фазу, способны нести вышеуказанные функции.

При проведении критического анализа известных способов, которые могут быть приняты во внимание, авторы рассматривают только способы, пригодные для производства диагностических реагентов, поэтому методы из группы E не являются предметом для сравнения.

В основном, методы, относящиеся к группам A, B и C, дают в результате эмульсии многослойных липосом с широким диапазоном размера, требующих дополнительной физической обработки. Способы из группы D по большей части дают в результате более узкое распределение по размеру и однослойные липосомы.

Еще одним недостатком сухих методов, включенных в группу A, является то, что получение липосом может быть реализовано с помощью относительно большого числа этапов (растворение липидов, сушка, смешивание в водном растворе, интенсивное перемешивание/ультразвуковое измельчение). Несмотря на то, что эти этапы можно выполнять при помощи доступных для приобретения и относительно простых устройств, фактическое распределение по размеру может регулироваться только экструзией, для которой требуется дорогостоящее оборудование. На рынке диагностических реагентов отсутствуют продукты, полученные исключительно таким образом.

Способ B может выполняться в два основных этапа (растворение липидов, смешивание в водном растворе) при помощи простейших приспособлений, но, как и в методах из группы A, требуется дополнительная физическая обработка полученных таким образом липосом. То есть, для регулирования размера рекомендуется использование экструдера. В продукционной эмульсии и полостях липосом содержится неполярный органический растворитель, который необходимо удалять, если это требуется согласно применяемой технологии. На рынке диагностических реагентов отсутствуют продукты, полученные таким образом.

Способ C также может выполняться в два основных этапа (растворение липидов в растворе детергента, удаление детергента), но удаление детергента представляет собой длительный и дорогостоящий процесс с применением любого из известных методов (абсорбционный прокладочный материал, ультрафильтрующая или диализная мембрана) и требует дорогостоящего и уникального оборудования (диализатор, ультрафильтрационное оборудование/центрифуга, хроматографическая колонка и система). Полученные липосомы представляют собой однослойные или многослойные везикулы, хотя слоистость может регулироваться путем корректировки соответствующего химического состава растворителя. В полостях липосом конечного продукта может содержаться некоторое количество детергента, для удаления которого может понадобиться дополнительный этап, если это требуется согласно применяемой технологии. Для обеспечения распределения по размеру рекомендуется использование экструдера. На рынке диагностических реагентов имеются продукты, полученные исключительно таким образом [Морриссей и Смит. Тромбопластиновые Реагенты, согласно патенту US 7148067].

Способ D может выполняться в два этапа (растворение липидов, смешивание в водном растворе). Однако для смешивания фаз используются специально разработанные инжекторы и смесительное оборудование, что повышает затраты на данный способ. Липосомы, созданные традиционным образом, представляют собой однослойные везикулы, их размер находится в пределах относительно узкого диапазона, но в полостях липосом находится органический растворитель, для удаления которого может понадобиться дополнительный этап, если это требуется согласно применяемой технологии. Для обеспечения распределения по размеру рекомендуется использовать экструдер. На рынке диагностических реагентов отсутствуют продукты, полученные таким образом.

В методе C, который хорошо зарекомендовал себя и применяется исключительно для изготовления липосом, используемых в диагностических реагентах, применяемая добавка (детергент) дорогостояща сама по себе, для ее удаления требуется длительный и сложный процесс, который еще больше повышает стоимость способа. Во время процесса удаления добавки необходимо проверять концентрацию детергента путем выполнения нескольких измерений в течение процесса производства, поскольку наличие остаточного детергента может нарушить диагностическую реакцию. Несмотря на то, что распределение по размеру полученного продукта можно до некоторой степени контролировать, для получения конечного продукта используется экструдер (гомогенизатор), что делает продукт еще дороже.

Среди известных решений для методов A, B и D дорогие добавки не требуются, но в результате выполнения способов A и B получаются многослойные липосомы с широким распределением по размеру, что делает неизбежной последующую гомогенизацию, и, следовательно, затраты на производство конечного продукта повышаются.

Целью способа, разработанного авторами настоящего изобретения, является исключение недостатков известных методов и разработка способа, который технически упрощает получение липосомных эмульсий и снижает затраты на их изготовление.

Применяя метод D без использования дорогостоящего инжектора/смесительного оборудования, даже без дополнительных операций по обработке, можно получить липидную эмульсию пригодного состава. Поскольку содержимое липосом вряд ли когда-либо попадет в реакционное пространство в диагностических технологиях, органические растворители, помещенные в везикулы, не вызывают проблему, поэтому удаление растворителя не требуется. Общая схема изобретения удовлетворяет требованию метода D.

Известные решения, в соответствии с их физической реализацией, дают в результате липосомы с широким распределением по размеру и слоистостью. Липосомы, пригодные для диагностических реагентов, имеющие наружный диаметр 50-100 нм и собранные с одним или двумя слоями мембраны (монослой и бислой), получают путем выполнения последовательных этапов обработки на дорогостоящем оборудовании (ультразвуковое измельчение, фильтрация, экструдирование, центрифугирование) и/или используя поверхностно-активные вещества. В этом случае также необходимо удалять детергент, при всех других недостатках, присущих этому дополнительному этапу.

Предлагаемый способ основан на том явлении, что граница не смешивающихся друг с другом фаз выполняет функцию поверхности для размещения поверхностно-активных веществ в виде отдельного слоя молекул (монослоя), подобно слою фосфолипидов в описываемом случае. Так как целью изобретения является получение водной эмульсии липосом, специалистам в данной области ясно, что липиды, растворенные в неполярном органическом растворителе, нацелены своими полярными головками на водную фазу, а их неполярный хвост направлен на органическую фазу. При смешивании фаз молекулярный слой, который может характеризоваться нулевой кривизной до этой точки, закрывается до образования сферы (везикулы). В большом объеме водного раствора полярные головки липидов нацелены на водную фазу, а неполярный хвост липидных молекул нацелен на неполярный растворитель, захваченный внутрь везикул. При соответствующей пропорции растворителей и соответствующем составе и концентрации липидов, можно добиться того, чтобы все количество органических растворителей могло быть захвачено внутрь липосом. Учитывая, что при выполнении диагностических измерений содержимое липосом вряд ли когда-либо попадет в реакционное пространство, органический растворитель, находящийся внутри везикул, не вызывает никаких проблем при выполнении диагностических измерений, так что удалять растворитель не нужно. Если согласно применяемой технологии требуется, то захваченный липосомами органический растворитель может быть полностью удален путем вакуумного испарения или лиофилизации липосомной эмульсии, и высушенную эмульсию можно снова растворить в водном растворе [см. способ авторов Джанофф и др. в соответствии с патентом US 4880635; патентом US 5578320 и патентом US 5922350].

На основании своего опыта авторы выяснили, что сборка липосом происходит за счет простого смешивания (шейкером, вихревым смесителем, мешалкой) фаз, то есть требуется меньший объем неполярной органической фазы с соответствующим липидным составом, расслоенным под большим объемом верхней полярной водной (буферной) фазы, таким образом, специальный инжекторный смеситель не требуется.

Авторами установлено, что для получения однослойных липосом с оптимальным распределением по размеру важное значение имеет специальная смесь липидных молекул, представляющая положительную или нулевую кривизну. Кроме того, путем изменения пропорции липидных молекул, представляющих положительную или нулевую кривизну, диаметр липосом можно задавать факультативно в определенных пределах, таким образом, обеспечивается соответствующий липидный состав, что дает в результате воспроизводимый метод получения стабильных эмульсий с требуемым распределением по размеру.

Авторами экспериментально установлено, что мембранная поверхность липосомной эмульсии уникальной структуры, созданная с помощью вышеописанного способа, пригодна для мониторинга поверхностно-активных процессов (например, реакций свертывания крови) путем прикрепления к ней активного(ых) компонента(ов) или просто путем взаимодействия с активными молекулами в растворе.

Опыт авторов показал, что для прикрепления активных молекул к поверхности мембраны липосомной эмульсии уникальной структуры не требуются никакие дополнительные молекулы (например, детергент) или физическая обработка. Следовательно, предлагаемая липосомная эмульсия уникальной структуры, полученная с помощью вышеупомянутого способа, обеспечивает соответствующий компонент мембраны для диагностических реагентов, предназначенных для исследования свертывания крови in vitro, наряду с тем, что предлагаемый способ может также распространяться и на другие профессиональные области за счет привлечения других дополнительных активных компонентов.

Авторами также установлено, что молекулы тканевого фактора, несущие соответствующие части якорной молекулы неполярной мембраны, внедряются в мембрану предлагаемой липосомной эмульсии уникальной структуры в процессе, результатом которого является реагент для определения протромбинового времени (РТ), таким образом, конечный реагент-продукт можно производить в течение одного и того же процесса, что и получение липосом, за один единственный этап. Специалистам в данной области ясно, что основным условием для одноэтапного производства является то, что активная молекула, несущая части якорной молекулы неполярной мембраны, должна содержаться в водной фазе в начале процесса, когда развивающийся липидный монослой имеет нулевую кривизну. Таким образом, активные молекулы, настроенные на требуемую ориентацию (то есть, направленные к мембране своим «якорным» концом, а к водной фазе активной головкой), внедряются в развивающийся липидный монослой на границе фаз. Если бы активные молекулы были растворены в органической фазе, во время сборки липосомы активная головка была бы расположена преимущественно внутри липосомы, таким образом, активный компонент не смог бы оказывать свое действие.

Согласно исследованиям авторов, для обеспечения соответствующей концентрации тканевого фактора, необходимой для его прикрепления к поверхности липосомной мембраны, детергент не нужен. На основании опыта авторов, прикрепление может быть реализовано путем примешивания раствора тканевого фактора соответствующего состава к предварительно полученным липосомам или к одновременно собираемой поверхности липосомной мембраны. Кроме того, было установлено, что в диагностических тест-системах, требующих использования активированных мембранных поверхностей, диагностические реагенты можно изготавливать простым смешиванием водного раствора активных компонентов [например, органическая(ие) кислота(ы), неорганическое(ие) соединение(ия)] соответствующего состава с предлагаемой липосомной эмульсией уникальной структуры.

Данное изобретение относится к двухфазному способу получения липосом. Двухфазный метод, описанный в настоящем изобретении, предполагает технически простое и дешевое механическое смешивание неполярной органической фазы, содержащей отдельную смесь природных и синтетических фосфолипидов, с полярной водной (буферной) фазой, несмешивающейся с первой, в результате чего получается липосомная эмульсия уникальной структуры. Предлагаемая липосомная эмульсия уникальной структуры, обеспечивающая мембранную поверхность для активных компонентов, прикрепляемых к ней, может быть успешно включена в технологии in vitro для тестирования поверхностно-активных реакций.

Среди возможных примеров осуществления изобретения выделяется получение диагностических реагентов для исследования свертывания крови in vitro. В группе примеров осуществления изобретения упомянутый реагент состоит из предлагаемой липосомной эмульсии уникальной структуры и активных компонентов белкового типа, то есть природный или рекомбинантный тканевой фактор. Прикрепление белка к поверхности мембраны осуществляется на предварительно полученных липосомах уникальной структуры или выполняется одновременно со сборкой поверхности липосомной мембраны. В другой группе примеров осуществления изобретения упомянутый реагент состоит из предлагаемой липосомной эмульсии уникальной структуры и растворимых активных компонентов небелкового типа; их соединение осуществляется путем простого механического смешивания. В качестве вышеупомянутых растворимых активных компонентов небелкового типа может выступать, например, эллаговая кислота, дубильная кислота, рутин, кверцетин или неорганический диоксид кремния.

Общим признаком диагностических реагентов in vitro, полученных с помощью описанного в изобретении способа, является размер частиц (везикул) стабильной липосомной эмульсии уникальной структуры в диапазоне 50-100 нм. Неполярная органическая фаза в предлагаемом способе - это отдельная смесь липидных молекул, представляющих положительную или нулевую кривизну, как например фосфатидилхолин, фосфатидилсерин, фосфатидилэтаноламин, лизофосфатидная кислота, лизофосфатидилхолин, и меньшего количества других фосфолипидов природного происхождения, растворенных в органической фазе, с концентрацией в диапазоне 0,5-1,5 г/мл и при условиях реакции, включающих температуру 55°C и pH=2.

Вышеупомянутая полярная водная (буферная) фаза в предлагаемом способе содержит неорганические ионы соответственно низкой концентрации и буферизованный показатель pH, предпочтительно в диапазоне между 6,0 и 7,4, наиболее предпочтителен показатель pH=6,6, органическими соединениями, например, с 0,025 М трицином и добавленнным антибактериальным консервантом, например, 0,05 М NaN₃. Конечное значение pH водной фазы устанавливается с помощью раствора 5 М NaOH.

Липосомную эмульсию уникальной структуры получают путем простого механического смешивания двух фаз, как описано выше, таким образом, что неполярная органическая фаза меньшего объема добавляется в полярную водную (буферную) фазу большего объема. Объемное соотношение фаз составляет значение в диапазоне от 5 до 50, наиболее предпочтительно двадцать.

Простое механическое смешивание полярной водной (буферной) фазы и неполярной органической фазы, причем последняя располагается слоями под первой, может осуществляться просто их встряхиванием вместе при комнатной температуре (25°C). Смешивание также можно выполнять таким образом, чтобы в результате вращательного движения смесительного(ых) элемента(ов) или эксцентричного вращения смесителя фаза большего объема приводилась в вихревое движение, затем фаза меньшего объема впрыскивается, распыляется или наиболее предпочтительно вводится по каплям в вихрь при комнатной температуре.

Во время двухфазного получения липосомного компонента предлагаемого реагента для определения протромбинового времени (РТ) неполярная органическая фаза, содержащая отдельную смесь фосфолипидов, и полярная водная (буферная) фаза механически смешиваются, как описано выше, а затем активный компонент РТ реагента, природный или рекомбинантный тканевой фактор, прикрепляется к поверхности мембраны полученных липосом. Этого можно добиться, например, путем примешивания активного компонента (природного или рекомбинантного тканевого фактора) предпочтительно при концентрации 0,5-1,0 µМ, наиболее предпочтительно при концентрации 0,8 µМ, к поверхности мембраны липосом, полученных в результате простого и дешевого механического смешивания, а затем липосомную систему, содержащую якорный тканевой фактор, оставляют на некоторое время в покое.

В другом примере осуществления изобретения раствор тканевого фактора соответствующей концентрации добавляется к полярной водной (буферной) фазе, используемой при сборке липосом, в результате прикрепление белка осуществляется одновременно со сборкой липосомной мембраны.

Во время двухфазного получения липосомного компонента предлагаемого реагента для определения активированного частичного тромбопластинового времени (АРТТ) неполярная органическая фаза, содержащая отдельную смесь фосфолипидов, и полярная водная (буферная) фаза смешиваются механически, как описано выше. Водный раствор активных компонентов АРТТ реагента - органическая(ие) кислота(ы), неорганическое(ие) соединение(ия) - соответствующей концентрации примешивается к предлагаемой липосомной эмульсии уникальной структуры, полученной в результате простого и дешевого механического смешивания, а затем липосомную систему, содержащую активное соединение, оставляют на некоторое время в покое. В данном способе в качестве активных компонентов могут использоваться, например, эллаговая кислота, дубильная кислота, рутин, кверцетин, SiO₂ в соответственно выбранной концентрации (например эллаговая кислота: 0,5-1 мМ, дубильная кислота: 1-2%, SiO₂: 2-4 г/л).

Для получения окончательной композиции РТ и АРТТ реагентов полученные и оставленные на некоторое время в покое продукты, как описано выше, разбавляют буферными растворами, состав и концентрация которых пригодны для соответствующего теста оценки свертывания крови, и которые имеют предпочтительное значение pH, в пропорции 3:1. В случае применения РТ реагента, в качестве разбавляющего раствора может использоваться буферный раствор, содержащий 0,025 М трицина, 0,25 М глицина, 0,11 М NaCl, 0,02 М CaCl₂, 0,025 М NaN₃, 16 г/л ПЭГ 4000 и 0,0024 М Полибрена, предпочтительно значение рН берется в диапазоне 7,0-7,8, в данном примере pH=7,4. В случае применения АРТТ реагента, в качестве примера может выступать буферный раствор, содержащий 0,25 М глицина, 0,01 М хепеса, 0,001 М NiSO₄, 0,2 мМ тимеросала, при предпочтительном значении pH в диапазоне 6,8-7,8, в данном примере pH=7,0.

Оба предлагаемых способа характеризуются возможностью дополнительной стабилизации реагентов с помощью сублимационной сушки (лиофилизации). Перед лиофилизацией используются образующие матрицу добавки, например, в следующих концентрациях: маннит 1-3%, сахароза 1-3%, бычий сывороточный альбумин 0,1 мМ. Перед применением лиофилизированные реагенты необходимо восстановить с помощью водного раствора.

Ниже приводится подробное описание способа в соответствии с настоящим изобретением.

1. Изготовление реагентов с липосомами, полученными на предварительной стадии изготовления

Получение липосом

Состав и концентрация липидного раствора

Липидный состав: Специалистам в данной области ясно, что на форму и слоистость липосом может влиять изменение пропорции фосфолипидов, представляющих отрицательную, нулевую или положительную кривизну поверхности в зависимости от формы их молекул. Безусловно, доминирование фосфолипидов, представляющих нулевую или отрицательную кривизну поверхности, способствует формированию больших плоских поверхностей, когда в водном растворе минимизация поверхностной энергии может реализовываться путем складывания в слои, поэтому фосфолипидные смеси такого состава дают в результате большие многослойные липосомы или слоистые ламинарные липидные агрегаты без закрытого внутреннего пространства. Легко понять, что полезная поверхность таких липосом, то есть поверхность, которая дает возможность встраивания активных молекул по мере необходимости (направленных к водному раствору), является небольшой по сравнению с количеством агрегированных липидов. Следовательно, фосфолипиды, представляющие положительную или нулевую кривизну поверхности, наиболее пригодны для получения липосом в целях диагностических реагентов, так как они дают в результате липосомные везикулы с размером и формой (сферические) в требуемом диапазоне. Таким образом, определяющая пропорция липидной смеси должна предпочтительно устанавливаться при помощи фосфатидилхолина, представляющего нулевую кривизну поверхности, и фосфатидилсерина, представляющего небольшую положительную кривизну. На размер липосом может предпочтительно влиять добавление небольшого количества лизоформных молекул, то есть молекул, содержащих только один единственный сложный эфир жирной кислоты с глицериновым скелетом, предпочтительно лизофосфатидилхолиная и/или лизофосфатидная кислота, представляющие положительную кривизну. Необходимо избегать высокой концентрации холестерина или фосфатидилэтаноламина, представляющего отрицательную кривизну поверхности. Для получения липосом могут использоваться фосфолипиды, выделенные из искусственных или природных источников. Специалистам в данной области ясно, что фосфолипидный состав изолятов клеточных мембран обеспечивает требуемую пропорцию, но фосфолипидный состав источников растительного или животного происхождения колеблется в очень широком диапазоне. Тогда как для получения рекомбинантных диагностических реагентов изоляты мембранных липидов из мозга кролика могут использоваться без изменений или добавок, извлеченный из сои экстракт можно использовать для получения таких липосом только