Применение расар для лечения вирусных инфекций у водных организмов

Применение расар для лечения вирусных инфекций у водных организмов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области водной биотехнологии, в частности, к применению композиций, содержащих PACAP, и PACAP, для лечения вирусных инфекций или инфекционных заболеваний, вызываемых вирусами, у водных организмов. Оно также относится к применению PACAP в комбинации с противовирусными средствами для лечения инфекций, вызываемых вирусом.

Уровень техники, предшествующий изобретению

В настоящее время ежегодный вклад культуры водных видов в общей объем производства рыбы и моллюсков увеличился. Однако более высокие плотности приводят к тому, что эти животные обитают в условиях стресса, и в основном они являются более восприимчивыми к инфекциям. Вспышки вызываемых патогенами заболеваний в аквакультуре приводят к крупным экономическим потерям и даже иногда приводят к удалению определенной культуры из конкретного региона.

Поражения, вызываемые вирусом инфекционного панкреатического некроза (IPNV), вирусом вирусной геморрагической септицемии (VHSV), вирусом инфекционной анемии лососевых (ISAV) и вирусом инфекционного гематопоэтического некроза (IHNV), у лососевых являются основной причиной вспышек заболеваний в их культуре (Marroqui et al. (2008) Antiviral Research 80:332-338). Например, предполагают, что производство чилийского лосося к концу 2010 года упадет на 38,7% (с 403000 тонн в 2009 году до 245000 тонн в 2010 году) в результате смертности, вызванной ISAV (http://www.aqua.cl).

Кроме того, ракообразные являются одним из наиболее важных экономических секторов в мировой аквакультуре, привнося вклад более 10 миллиардов ежегодно. Креветки в культуре восприимчивы к широкому спектру патогенов, включая вирусы. По оценке, в середине 90-х годов приблизительно 40% мирового производства (эквивалентного 3 миллиардам долларов США) было потеряно вследствие заболеваний. Пять вирусов являются основными факторами этих потерь: вирус синдрома белых пятен (WSSV), вирус синдрома желтой головы (YHV), вирус синдрома Таура (TSV), вирус инфекционного гематопоэтического некроза (IHNNV) и монодон-бакуловирус (MBV) (описано Johnson et al. (2008) Vaccine 26:4885-4992).

Двустворчатые моллюски являются важной частью мирового производства моллюсков. Эти организмы, характеризующиеся тем, что являются фильтратами, являются основными резервуарами вирусов, таким образом, их культура может переживать эпизоотии, которые угрожают их производству. Описана массовая гибель взрослых устриц Crassostrea angulata, ассоциированная с вирусными инфекциями, сходными с иридовирусами. Кроме того, другие вирусы семейств Herpesviridae, Papovaviridae, Togaviridae, Retroviridae, Reoviridae, Birnaviridae и Picornaviridae способны инфицировать культуры двустворчатых моллюсков. Однако вследствие отсутствия клеточных линий, полученных у моллюска, и ограничивающих существующих средств молекулярной биологии для этих организмов, вирусология двустворчатых моллюсков все еще остается примитивной наукой, основанной преимущественно на морфологических исследованиях и незначительном количестве экспериментальных исследования (описано T. Renault and B. Novoa (2004) Aquat. Living Resour. 17:397-409).

Противовирусные лекарственные средства представляют собой химические соединения, используемые для лечения инфекций, вызываемых вирусами. Первые экспериментальные противовирусные средства были описаны в начале 60-х годов. Они были получены на основе метода "проб" и "ошибок". Однако после середины 80-х годов наука существенно изменилась, и в последние годы получено и зарегистрировано много новых противовирусных лекарственных средств, главным образом для лечения вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). Однако вследствие того, что эти соединения не всегда являются эффективными или хорошо переносимыми, существует много аспектов, которые необходимо улучшать. Дополнительными причинами для совершенствования разработки и применения этих лекарственных средств является возникновение устойчивости вирусов или ассоциированных с ней побочных эффектов (De Clercq (2002) Nature Reviews Drug Discovery 1:13-25). При разработке противовирусного лекарственного средства в качестве основных мишеней выступают вирусные белки или белки клетки-хозяина. Первая стратегия приводит к более специфичным и менее токсичным соединениям, но с более узким спектром противовирусной активности и более высокой вероятностью развития устойчивости. Вторая стратегия приводит к открытию противовирусных соединений с более широким спектром активности, меньшей вероятностью развития устойчивости, но более высокой вероятностью оказания токсического действия на клетки. Выбор стратегии зависит от природы вируса и потенциальных мишеней в вирусе или в клетках-хозяевах (De Clercq (2002) Nature Reviews Drug Discovery 1:13-25).

Рибавирин представляет собой противовирусное соединение широкого спектра действия с активностью против широкого диапазона ДНК- и РНК-вирусов. Он представляет собой нуклеозидный аналог, который после внутриклеточного фосфорилирования становится конкурентным ингибитором инозинмонофосфатдегидрогеназы (IMPDH), клеточного фермента вовлеченного в синтез гуанозинмонофосфата (GMP) (Graci and Cameron, (2006) обзор в Medical Virology 16:49-63, Parker, (2005) Virus Research 107:165-171). В дополнение к ингибированию этого фермента существует три других механизма, которые были предложены для объяснения противовирусной активности этого соединения: прямым ингибированием вирусной РНК-полимеразы (Toltzis et al. (1988) Antimicrobial Agents and Chemotherapy 32:492-497), ингибированием добавления кэпа на 5'-конце вирусной матричной РНК (мРНК) (Goswami et al. (1979) Biochemical and Biophysical Research Communications 89:830-836) и накоплением мутаций (Graci y Cameron, (2002) Virology 298:175-180).

К настоящему времени не существует специфических противовирусных лекарственных средств, одобренных для лечения вирусных заболеваний у водных организмов. В Чили дочерняя компания Diagnotec SA, именуемая Andromaco, разработала новое противовирусное соединение, называемое VIROTOP, для лечения вирусных заболеваний у рыб. Это противовирусное средство рассматривают для утверждения "Servicio Agricola y Ganadero" (SAG) (http://www.aqua.cl). Однако значительное количество соединений оценивали in vitro и in vivo (Hudson et al. (1988) Antiviral Research 9:379-385, Jasher et al. (2000) Antiviral Research 45:9-17, Kamei and Aoki, (2007) Archives of Virology 152:861-869, LaPatra et al. (1998) Fish and Shellfish Immunology 8:435-446, Mas et al. (2006) Antiviral Research 72:107-115, Micol et al. (2005) Antiviral Research 66:129-136, Moya et al. (2000) Antiviral Research 48:125-130), для которых показаны различные степени эффективности.

На личинках кижуча (Oncorhynchus kisutch) и радужной форели (Oncorhynchus mykiss), экспериментально инфицированных IPNV, оценивали in vivo введение аналога рибавирина, 5-этинил-1-β-D-рибофуранозилимидазолкарбоксамида (EICAR) (Moya et al. (2000) Antiviral Research 48:125-130). Лечение состояло из ежесуточных погружений в ванны с раствором 0,4 и 0,8 мкг/мл EICAR в течение двух часов на протяжении 20 суток. Результаты указывают на то, что выживаемость инфицированных и получавших лечение EICAR групп являлась сходной с выживаемостью в не инфицированных вирусом группах. Анализ вирусной нагрузки в печени и селезенки проводили с применением способа полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Этим анализом было продемонстрировано снижение вирусной нагрузки у животных, получавших лечение противовирусным средством. Из этого исследования сделали вывод, что EICAR является ингибитором репликации IPNV, таким образом, его применение для снижения вирусной нагрузки и предотвращения смертности рыб является полезным средством для увеличения продуктивности культур. Однако противовирусное лечение не пригодно для селекционного отбора, т.к. инфицированная и получавшая лечение рыба все еще несет вирус и может передавать его потомству. С другой стороны, выявлено, что одним из нарушений, вызываемых некоторыми вирусными инфекциями, является потеря массы инфицированной рыбы (Wolf (1986) The fish viruses. In: Espinosa de los Monteros, J. Labarta U. (Eds.), Patologia en Acuicultura. Industrias graficas, Espana, SL, pp. 93-95, Moya et al. (2000) Antiviral Research 48:125-130).

Дополнительное преимущество использования противовирусных средств заключается в том, что такая потеря массы является намного ниже у получавшей лечение рыбы. Этот эффект был наиболее заметен у форели, чем у кижуча (Moya et al. (2000) Antiviral Research 48:125-130).

Активирующий аденилатциклазу гипофиза полипептид (PACAP) принадлежит к суперсемейству секретин/глюкагон/вазоактивному интестинальному пептиду. Этот пептид впервые был выделен из гипоталамуса быка в 1989 году. Была показана его способность стимулировать выделение гормона роста посредством активации аденилатциклазы и последующей стимуляции продукции аденозинмонофосфата (цАМФ) (Miyata et al (1989) Biochem. Biophys. Res. Commun. 164:567-574). PACAP представляет собой многофункциональный нейропептид, который играет важную роль в качестве нейромедиатора, нейротрансмиттера и вазодилататора у млекопитающих (Arimura A. (1998) Japanese Journal of Physiology 48:301-31). Была показана его функция в регуляции клеточного деления, дифференцировке и гибели клеток (Sherwood et al. (2000) Endocrine Review 21:619-670). Этот пептид существует в двух различных молекулярных формах: 27 а/к (PACAP27) и 38 а/к (PACAP38) (Miyata et al. (1990) Biochemical and Biophysical Research Communications 170:643-8). Эффекты PACAP проявляются через семейство трех рецепторов VIP/PACAP, которые принадлежат к связанному с G-белком рецептору типа секретина. Рецепторы VPAC-1 и VPAC-2 обладают сходными аффинностями к двум нейропептидам VIP и PACAP, тогда как рецептор PACAP (PAC-1) обладает более высокой аффинностью к PACAP, чем к VIP (Vaudry et al. (2000) Pharmacol. Rev. 52:269-324).

PACAP широко распространен в головном мозге млекопитающих, в основном в гипоталамусе, паравентрикулярном и дорсомедиальном ядрах таламуса, в перегородке, коре головного мозга, миндалевидном теле, гиппокампе и мозжечке (Montero et al. (2000) Journal of Molecular Endocrinology 25:157-168). Наиболее широко распространенной формой в центральной нервной системе и периферических тканях является PACAP38. В проведенных на млекопитающих исследованиях показано содержание PACAP также в половых железах (Shioda et al. (1994) Endocrinology 135:818-825), надпочечниках (Arimura et al. (1991) Endocrinology 129:2787-2789), паращитовидных железах (Vaudry et al. (2000) Pharmacol. Rev. 2000;52:269-324), эндокринной поджелудочной железе (Arimura and Shioda (1995) Neuroendocrinology 16:53-88) и желудочно-кишечном тракте (Arimura et al. (1991) Endocrinology 129:2787-2789, Vaudry et al. (2000) Pharmacol. Rev. 52:269-324, Hannibal et al. (1998) Cell Tissue Res. 291: 65-79).

PACAP и экспрессия его рецепторов в иммунных клетках выявлена только частично (Gaytan et al. (1994) Cell Tissue Res. 276:223-7, Abad et al. (2002) NeuroImmunoModulation 10:177-86). У млекопитающих выявлена конститутивная экспрессия рецептора VPAC-1 в лимфоцитах периферической крови людей и в лимфоцитах и макрофагах мышей, тогда как экспрессия VPAC-2 является индуцируемой в этих клетках. Кроме того, выявлена конститутивная экспрессия рецептора PAC-1 в перитонеальных макрофагах крысы и в клеточной линии миеломоноцитов человека THP-1. Кроме того, опубликована экспрессия PACAP в тимоцитах, различных подтипах T-клеток, B-клеток, спленоцитах и лимфоузлах у крыс (Delgado et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:369-80, Pozo et al. (2003) Trends Mol. Med. 9:211-7).

PACAP описан в центральной нервной системе (в частности, в гипоталамусе, головном мозге и спинном мозге) и периферической нервной системе, иннервированных глазах, гипофизе, дыхательных путях, слюнных железах, желудочно-кишечном тракте, половом пути, поджелудочной железе и мочевыводящих путях у рыб (Sherwood et al. (2000) Endocrine Review 21:619-670).

PACAP ингибирует спонтанный апоптоз тимоцитов у крыс (Delgado (1996) Blood 87:5152-5161). Тот факт, что PACAP регулирует пролиферацию тимоцитов позволяет предположить, что этот пептид является важным регулятором созревания иммунных клеток (Delgado (1996) Blood 87:5152-5161).

Этот пептид оказывает опосредованное действие на созревание лимфоцитов посредством стимуляции высвобождения интерлейкина 6 (IL-6) фолликулярными клетками в гипофизе. IL-6 стимулирует рост и дифференцировку B-клеток и промотирует синтез и секрецию иммуноглобулинов этими клетками (Tatsuno et al. (1991) Endocrinology 129:1797-1804, Yada et al. (1993) Peptides 14:235-239). Кроме того, PACAP активирует и подавляет воспалительный ответ посредством регуляции IL-6 и IL-10 (Martinez et al. (1996) J. Immunol. 156(11):4128-36, Martinez et al. (1998) J. Neuroimmunol. 85(2):155-67), Martinez et al. (1998) J. Leukoc. Biol. 63(5):591-601). В активированных макрофагах PACAP ингибирует провоспалительные цитокины и стимулирует продукцию противовоспалительных цитокинов, обеспечивая гомеостаз иммунной системы. Кроме того, PACAP уменьшает экспрессию ко-стимулирующих молекул B7.1/B7.2 и последующую активацию T-хелперов (Th). С другой стороны, PACAP ингибирует продукцию IL-6 через свой рецептор PAC-1 в активированных макрофагах, подавляя воспаление (Martinez et al. (1998) J. Neuroimmunol. 85(2):155-67, Martinez et al. (1998) J. Leukoc. Biol. 1998 May, 63(5):591-601). Ингибиторное действие PACAP на транскрипцию IL-6 в ответ на значительные воспалительные стимулы или интоксикацию способствуют защите тканей и гомеостазу иммунной системы (Martinez et al. (1998) J. Neuroimmunol. 85(2):155-67, Martinez et al. (1998) J. Leukoc. Biol. 1998 May, 63(5):591-601). Наоборот, PACAP индуцирует экспрессию B7.2 и промотирует клеточную дифференцировку до Th2 в неактивированных макрофагах (Delgado and Ganea (2001) Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz) 49(2):101-10).

В основном, функция PACAP в модуляции иммунной системы млекопитающего только частично была выявлена в последние годы. Этими исследованиями продемонстрировано, что PACAP регулирует врожденный и приобретенный иммунный ответ и модулирует про- и противовоспалительный ответ. Однако имеется недостаточно информации об эффекте этого пептида на противовирусный ответ. В последние годы было показано увеличение в плазме уровней PACAP-38 у пациентов с хроническим гепатитом B при устранении виремии вследствие лечения ламивудином (Elefsiniotis et al. (2003) European Journal of Gastroenterology and Hepatology 15:1209-1216). Это открытие позволяет предполагать действие на T-клеточный иммунный ответ, которое приводит к биохимической и гистологической ремиссии заболевания в печени пациента.

Опубликованные до настоящего времени исследования in vivo биологической функции PACAP у рыб в основном связаны с размножением (Canosa et al. (2008) American Journal of Physiology (Regul. Integr. Comp. Physiol.) 295:1815-21), развитием головного мозга (Sherwood et al. (2007) Peptides 28:1680-7) и аппетитом (Matsuda et al. (2005) Peptides 26:1611-6, Maruyama et al. (2006) Peptides 27:1820-6). В последние годы была показана биологическая функция этого нейропептида в росте и развитии личинок различных видов костистых рыб (Lugo et al. (2008) Journal of Endocrinology 197:583-97).

Знания о функции PACAP в модулировании иммунного ответа рыб ограничены исследованиями, проводимыми исследовательской группой авторов изобретения. Авторы продемонстрировали, что введение рекомбинантного PACAP Clarias gariepinus посредством погружения в ванны или инъекции не только способствует росту, а также стимулирует параметры врожденного иммунного ответа (лизоцим, производные оксида азота метаболиты и антиоксидантную защиту) и приобретенного иммунитета (IgM) у получавших лечение личинок и молоди (Carpio et al. (2008) Fish and Shellfish Immunology 25:439-45, Lugo et al. (2010) Fish and Shellfish Immunology 29:513-520). Эти новые свойства были описаны в патентной заявке "Neuropeptidos para el cultivo de organismos acuaticos" (WO2007/059714).

Одной из первых линий защиты против вирусных инфекций у позвоночных является система интерферона (IFN) I типа. Эта система активируется индукцией вирусом интерферонов I типа (IFNα и IFNβ) через рецептор IFN-α/β, который инициирует передачу опосредованного JAK-STAT сигнала. Индуцированные цитокины вызывают противовирусное состояние клетки, вызывая экспрессию белков с противовирусной активностью, таких как 2',5'-олигоаденилатсинтетаза, киназа R и ГТФазы Mx (Goodbourn et al. (2000) Journal of General Virology 81:2341- 2364). По полученным в последние годы сведениям установлено, что рыбы обладают системой IFN, аналогичной млекопитающим (Robertsen (2006) Fish and Shellfish Immunology 20:172-191, Robertsen (2008) Fish and Shellfish Immunology 25:351-357). Клонированы интерфероны некоторых видов рыб, таких как данио рерио (Danio rerio), североамериканский канальный сом (Ictalurus punctatus) и атлантический лосось (Salmo salar) (Altmann et al. (2003) Journal of Virology 77:1992-2002, Lutfalla et al. (2003) BMC Genomics 4:29, Robertsen et al. (2003) Journal of Interferon and Citokine Research 23:601-612, Long et al. (2006) Fish and Shellfish Immunology 21:42-59). Кроме того, установлены некоторые регуляторные факторы IFN, молекулы пути передачи сигнала JAK-STAT, белки Mx и другие гены, активируемые IFN у различных видов рыб. Сообщается о противовирусной активности, опосредованной белками Mx у Salmo salar и Paralichtys olivaceus (описано Robertsen (2006) Fish and Shellfish Immunology 20: 172-191).

Несмотря на то, что еще не открыты IFN-подобные гены у ракообразных, выявлена отрицательная регуляция молекул STAT (они представляют собой молекулы, которые активируются при IFN-ответе у позвоночных) в ответ на инфекцию WSSV. Отрицательная регуляция STAT при вирусной инфекции противоположна IFN-ответу I типа у млекопитающих (описано Johnson et al. (2008) Vaccine 26:4885-4992). Знания о противовирусном ответе у двустворчатых моллюсков еще меньше. Существуют данные о противовирусной активности в гемолимфе этих организмов, и высказано предположение о существовании IFN-подобного механизма (Olicarda et al. (2005) Antiviral Research 66(2-3):147-152, Defer et al. (2009) Aquaculture 293(1-2):1-7).

Для аквакультуры чрезвычайный интерес представляет получение новых соединений или композиций, которые можно использовать в борьбе с вирусными инфекциями, вследствие ущерба, который они вызывают в этом виде деятельности.

Описание изобретения

Настоящее изобретение относится к решению описанной выше задачи, предоставляя новую альтернативу борьбе с вирусными инфекциями в аквакультуре путем использования PACAP при получении композиций для лечения вирусных инфекций и вызываемых вирусом инфекционных заболеваний у водных организмов.

Термин "лечение" в контексте настоящего изобретения относится к любому положительному эффекту на ремиссию заболевания, которая включает ослабление, снижение или уменьшение патологического развития после начала заболевания.

Термин "противовирусное средство" в настоящем изобретении включает любую молекулу, определяемую как противовирусное средство в предшествующем уровне техники, или ее аналоги, функциональные производные или активные фрагменты.

Термин "активирующий аденилатциклазу гипофиза полипептид (PACAP)" в настоящем изобретении включает такую молекулу в любой форме (PACAP27 или PACAP38), как выделенную из природного источника, так и синтетическую, или полученную посредством технологии рекомбинантных ДНК.

В одном из вариантов осуществления изобретения виды нейропептида PACAP вводят отдельно или в комбинации с известной противовирусной молекулой рыбам, ракообразным и двустворчатым моллюскам посредством погружения в ванны с интервалом 2-3 суток. PACAP также вводят в виде пищевой добавки отдельно или в комбинации с известной противовирусной молекулой.

В настоящем изобретении продемонстрировано, что содержащие PACAP композиции, вводимые посредством погружения в ванны, инъекции или пероральным путем являлись эффективными, увеличивая выживаемость водного организма, инфицированного вирусом и получавшего лечение такими композициями. Не наблюдали снижение массы получавших лечение рыб. В некоторых случаях получали увеличение общей массы у инфицированных и получавших лечение животных по сравнению с инфицированными и не получавшими лечение. Анализом образцов ткани и восприимчивых органов ОТ-ПЦР показано снижение вирусной нагрузки у инфицированных и получавших лечение животных.

До настоящего изобретения не существовало знаний о том, модулирует или нет PACAP противовирусный ответ у рыб, ракообразных и двустворчатых моллюсков, и о вовлеченных механизмах. В настоящем изобретении впервые показана in vitro и in vivo взаимосвязь между PACAP и ответом на вирус у рыб, ракообразных и двустворчатых моллюсков. Кроме того, авторы изобретения впервые описывают неожиданное положительно действие на PACAP участвующих в противовирусном ответе молекул, таких как белок Mx, интерферон-гамма (IFN-γ) и Toll-подобный рецептор 9 (TLR9), а также регуляцию на дифференцировку этого пептида и его рецепторов в клетках иммунной системы рыб, обработанных вирусом и/или поли(I:C) in vitro и in vivo.

Лечение вирусных инфекций у рыб, ракообразных и двустворчатых моллюсков введением PACAP или комбинацией PACAP и молекулы с известным противовирусным действием у рыб ранее не описывали или не предполагали в существующем уровне техники.

В контексте настоящего изобретения введение PACAP и противовирусной молекулы может быть одновременным (в одном составе), последовательным или разделенным во времени. Препараты вводят водным организмам пероральным путем, посредством инъекции или погружения в ванны.

В настоящем изобретении рыб, ракообразных и двустворчатых моллюсков обрабатывают PACAP и препаратами, содержащими противовирусные молекулы, объединенные с PACAP. Неожиданно наблюдали, что нейропептид PACAP обладает противовирусным действием у рыб, ракообразных и двустворчатых моллюсков. С другой стороны, показано, что комбинация PACAP с веществами с известным противовирусным действие вызывает более высокий противовирусный ответ (синергическое действие) по сравнению с одним PACAP in vitro и in vivo. До настоящего времени не были определены биологические функции PACAP в противовирусном ответе у рыб. Кроме того, до настоящего времени ни PACAP, ни другой пептид, принадлежащий к суперсемейству секретина и глюкагона, не были выделены у креветки или моллюска. Современные знания об этих пептидах у этих таксомических групп основаны только на экспериментальных данных стимуляции роста креветок посредством экзогенного введения рекомбинантного PACAP рыбы (международная публикация патентной заявки номер WO2007/059714). Таким образом, до настоящего изобретения не существует знаний о его возможной взаимосвязи с ответом на вирус у ракообразных и двустворчатых моллюсков.

Другой целью настоящего изобретения является композиция для лечения вирусных и инфекционных заболеваний, вызываемых вирусами, у водных организмов, которая содержит "активирующий аденилатциклазу гипофиза полипептид" (PACAP). В одном из вариантов осуществления изобретения PACAP в виде части композиции получают выделением из природного источника, синтетически или посредством технологии рекомбинантных ДНК. Его вводят перорально, посредством инъекции или погружения в ванны. В одном из вариантов осуществления изобретения PACAP представляет собой полипептидную последовательность, выделяемую у рыб.

Настоящее изобретение также относится к ветеринарной комбинации, которая содержит "активирующий аденилатциклазу гипофиза полипептид" (PACAP) и противовирусную молекулу. В одном из вариантов осуществления изобретения противовирусная молекула представляет собой рибавирин или аналог рибавирина. Элементы, которые являются частью смеси, противовирусную молекулу и PACAP вводят одновременно, раздельно или последовательно во время одного и того же лечения. В одном из вариантов осуществления изобретения смесь используют при лечении вирусных и инфекционных заболеваний, вызываемых вирусами, у водных организмов. При этом PACAP и противовирусное средство вводят перорально, посредством инъекции или погружением в ванны.

В одном из вариантов осуществления изобретения PACAP используют в виде рецептированного корма в концентрации 50-750 мг/кг корма и противовирусную молекулу в концентрации от 100 до 2000 мг/кг корма. Во втором варианте осуществления изобретения PACAP используют в качестве части ветеринарной комбинации у рыб посредством инъекции в концентрации 0,1-10 мкг на грамм массы тела и противовирусное средство в концентрации 1-50 мкг/г. В другом варианте осуществления изобретения в таком составе PACAP используют у рыб или ракообразных посредством погружения в ванны в концентрации 50-1000 мкг на литр воды, и концентрация противовирусного средства составляет 100-2000 мкг/л. В изобретении PACAP, когда его используют в качестве противовирусного средства или в комбинации с известной противовирусной молекулой, используют у ряда водных организмов. Например, они включают лососевых, жгутиковых креветок и двустворчатых моллюсков.

Композиция, содержащая PACAP, и состав с противовирусной молекулой являются пригодными для терапевтического лечения вирусных инфекций, вызываемых вирусами, семейств Herpesviridae, Papovaviridae, Togaviridae, Retroviridae, Reoviridae, Birnaviridae и Picornaviridae.

В изобретении PACAP, когда его используют в качестве противовирусного средства, и состав с противовирусной молекулой используют для борьбы с инфекциями, вызванными IPNV, VHSV и ISAV. Также их используют при терапевтическом лечении вирусных инфекций, вызываемых WSSV, YHV, TSV, IHNNV и MBV.

Также частью настоящего изобретения является способ борьбы с вирусными инфекциями в управлении аквакультуры, включающему введение PACAP или содержащих PACAP ветеринарных комбинаций водным организмам в культуре.

Краткое описание чертежей

Фиг.1. Анализ экспрессии ПЦР в реальном времени рецептора PAC-1 в лейкоцитах предпочки у радужной форели (Oncorhynchus mykiss), обработанных поли(I:C) (30 мкг/мл) или инфицированных IPNV (множественность заражения, m.o.i. 0,1), через 4, 24 и 48 часов после начала эксперимента. Культуру лейкоцитов обрабатывали в двух повторениях, и анализировали уровни экспрессии кПЦР в трех повторениях. Данные представлены в виде среднего значения относительной экспрессии PAC-1 относительно эндогенного фактора элонгации EF1α ± стандартное отклонение (SD). *(p<0,05).

Фиг.2. Анализ экспрессии ПЦР в реальном времени рецептора PAC-1 в клеточной линии макрофагов O. mykiss RTS-11, инфицированных in vitro VHSV (m.o.i 0,1), через 1, 4 и 8 ч после начала эксперимента. Эксперимент проводили в двух повторениях, и уровни экспрессии анализировали кПЦР в трех повторениях. Данные представлены в виде среднего значения относительной экспрессии PAC-1 относительно эндогенного фактора элонгации EF1α ± стандартное отклонение (SD). *(p<0,05).

Фиг.3. Анализ экспрессии ПЦР в реальном времени рецептора VPAC-1 в лейкоцитах предпочки у радужной форели (O. mykiss), обработанных поли(I:C) (30 мкг/мл) или инфицированных IPNV (множественность заражения, m.o.i. 0,1), через 4, 24 и 48 часов после начала эксперимента. Культуру лейкоцитов обрабатывали в двух повторениях, и анализировали уровни экспрессии кПЦР в трех повторениях. Данные представлены в виде среднего значения относительной экспрессии VPAC-1 относительно эндогенного фактора элонгации EF1α ± стандартное отклонение (SD). *(p<0,05).

Фиг.4. Анализ экспрессии ПЦР в реальном времени рецептора PAC-1 в лейкоцитах предпочки (A) и селезенки (B) у радужной форели (O. mykiss), экспериментально инфицированных in vivo VHSV (100 мкл 1×10⁷ TCID50 (титр вируса в супернатанте культуры/мл на рыбу)). В случайном порядке отбирали образцы из пяти совокупностей тотальной РНК из предпочки и селезенки 5 рыб через 3, 7 и 10 суток после вирусной инфекции. Уровни экспрессии анализировали кПЦР в трех повторениях. Данные представлены в виде среднего значения относительной экспрессии PAC-1 относительно эндогенного фактора элонгации EF1α ± стандартное отклонение (SD). *(p<0,05).

Фиг.5. Анализ экспрессии ПЦР в реальном времени рецептора VPAC-1 в лейкоцитах предпочки (A) и селезенки (B) у радужной форели (O. mykiss), экспериментально инфицированной in vivo VHSV (100 мкл 1×10⁷ TCID50 (титр вируса в супернатанте культуры/мл на рыбу)). В случайном порядке отбирали образцы из пяти совокупностей тотальной РНК из предпочки и селезенки 5 рыб через 3, 7 и 10 суток после вирусной инфекции. Уровни экспрессии анализировали кПЦР в трех повторениях. Данные представлены в виде среднего значения относительной экспрессии VPAC-1 относительно эндогенного фактора элонгации EF1α ± стандартное отклонение (SD). *(p<0,05).

Фиг.6. Анализ экспрессии ПЦР в реальном времени PACAP в лейкоцитах селезенки у радужной форели (O. mykiss), экспериментально инфицированной in vivo VHSV (100 мкл 1×10⁷ TCID50/мл на рыбу). В случайном порядке отбирали образцы из пяти совокупностей тотальной РНК из селезенки 5 рыб через 3, 7 и 10 суток после вирусной инфекции. Уровни экспрессии анализировали кПЦР в трех повторениях. Данные представлены в виде среднего значения относительной экспрессии PACAP относительно эндогенного фактора элонгации EF1α ± стандартное отклонение (SD). *(p<0,05).

Фиг.7. Анализ экспрессии ПЦР в реальном времени эффекта in vitro PACAP38 на транскрипцию кодирующего белок Mx гена в лейкоцитах периферической крови (A) и предпочки (B) здоровой радужной форели. Эффекты введения PACAP в концентрации 10^-10, 10^-9 и 10^-8 M оценивали через 48 часов после обработки. Эксперимент повторяли 4 раза. Культуру лейкоцитов обрабатывали в двух повторениях, и кПЦР проводили в трех повторениях. Данные представлены в виде среднего значения относительной экспрессии Mx относительно эндогенного фактора элонгации EF1α ± стандартное отклонение (SD). *(p<0,05).

Фиг.8. Анализ экспрессии ПЦР в реальном времени эффекта in vitro PACAP38 на транскрипцию кодирующего IFN-γ гена в лейкоцитах периферической крови (A) и предпочки (B) здоровой радужной форели. Эффекты введения PACAP в концентрации 10^-10, 10^-9 и 10^-8 M оценивали через 48 часов после обработки. Эксперимент повторяли 4 раза. Культуру лейкоцитов обрабатывали в двух повторениях, и кПЦР проводили в трех повторениях. Данные представлены в виде среднего значения относительной экспрессии IFN-γ относительно эндогенного фактора элонгации EF1α ± стандартное отклонение (SD). *(p<0,05).

Фиг.9. Анализ экспрессии ПЦР в реальном времени эффекта in vitro PACAP38 на транскрипцию кодирующего TLR9 гена в лейкоцитах периферической крови (A) и предпочки (B) здоровой радужной форели. Эффекты введения PACAP в концентрации 10^-10, 10^-9 и 10^-8 M оценивали через 48 часов после обработки. Эксперимент повторяли 4 раза. Культуру лейкоцитов обрабатывали в двух повторениях, и кПЦР проводили в трех повторениях. Данные представлены в виде среднего значения относительной экспрессии TLR9 относительно эндогенного фактора элонгации EF1α ± стандартное отклонение (SD). *(p<0,05).

Фиг.10. Анализы in vitro для определения противовирусного действия комбинаций PACAP-рибавирин (Rib-PACAP). За 24 часа до вирусной инфекции клетки обрабатывали "противовирусным средством" или комбинациями PACAP-противовирусные средства. Положительный контроль (c+): инфицированные вирусом клетки без противовирусной обработки. Отрицательный контроль (c-): неинфицированные необрабатываемые клетки. Клетки инфицировали вирусом в течение 30 минут для обеспечения адсорбции. Затем их отмывали PBS и добавляли различные виды средств лечения. Ингибирование цитопатического действия (CPE) оценивали с применением окрашивания кристаллическим фиолетовым (оптическая плотность при 550 нм).

Примеры

Пример 1. Экспрессия рецептора PAC-1 в лейкоцитах из предпочки клеток радужной форели (O. mykiss), обработанных поли(I:C) и IPNV, и в клеточной линии макрофагов радужной форели (O. mykiss) RTS-11, инфицированных in vitro VHSV

Авторы использовали молодь радужной форели (O. mykiss) от 9 до 12 грамм и в возрасте 7 месяцев, не инфицированную VHSV и IPNV. Рыб содержали при 14°C при циркуляции воды. Корм давали дважды в сутки неограниченно. Вирус VHSV (штамм 0771) и IPNV (штамм Sp) выращивали на клеточной линии половых желез радужной форели RTG-2 (Sena and Rio (1975) Infect. Immun. 11:815-22). Клетки выращивали на минимальной питательной среде (MEM, Invitrogen, USA) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS, Invitrogen), содержащей 100 мкг/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Вирусы инокулировали в клетки RTG-2, растущие на MEM с антибиотиками и 2% FCS при 14°C. Когда наблюдали выраженное цитопатическое действие, собирали супернатанты культур и центрифугировали для удаления продуктов распада клеток. Для экспериментов авторы использовали осветленные супернатанты культур. Титры вирусов определяли в 96-луночных планшетах, как описано Reed and Muench (Reed and Muench (1998) J. Hyg. 27:280-9).

Лейкоциты предпочки выделяли у 4 форелей следующим ниже способом, описанным Graham and Secombes (Graham and Secombe (1998) Immunology 65:293-7). В кратком изложении, в стерильных условиях удаляли переднюю почку и пропускали через нейлоновое сито с размером ячеек 100 мкм с использованием среды Лейбовитца (L-15, Gibco, UK) с добавлением пенициллина 100 мкг/мл, стрептомицина (100 мг/мл), гепарина (10 единиц/мл) и 2% FCS. Получаемую клеточную суспензию аккуратно помещали в градиент перколла до 51%. Кольцо клеток, соответствующих лейкоцитам, аккуратно удаляли, дважды промывали в L-15, содержащей 0,1% FCS. Клетки ресуспендировали в L-15 с 5% FCS в концентрации 5×10⁶ клеток на мл и разливали в 24-луночные планшеты по 1 мл на лунку. Инфицированные лейкоциты экспонировали 30 мкг/мл поли(I:C) (Sigma) или инфицировали IPNV при MOI 0,1 и инкубировали при 14°C в течение 4 часов, 24 часов и 48 часов.

В заключении тотальную РНК выделяли из культур лейкоцитов способом, описанным Chomczynski and Sacchi (Chomczynski and Sacchi (1987) Anal. Biochem. 162:156-9), для оценки уровней экспрессии рецептора PAC-1 на лейкоцитах, не обработанных и обработанных поли(I:C) или инфицированных вирусами. Образцы обрабатывали RQ1 RNase-free DNase (Promega) для удаления содержащейся в образцах геномной ДНК. Для синтеза комплементарной ДНК (кДНК) использовали коммерческий реагент SuperScript III (Invitrogen) на основе обратной транскриптазы. Для реакций количественной ПЦР (кПЦР) использовали смесь ПЦР из коммерческих источников: Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). Результаты кПЦР нормализовали на конститутивную экспрессию эндогенного гена, специфического фактора элонгации 1α (EF1α), и проводили в трех повторениях. Результаты выражали в виде 2^-ΔCt, где ΔCt равно разности значения Ct гена минус вычисленное значение Ct гена нормализации (EF1α).

Результат представлял собой такой, что уровни PAC-1 являлись сверхэкспрессированными в культивируемых лейкоцитах, обрабатываемых поли(I:C) через 4, 24 и 48 часов эксперимента, свидетельствуя о том, что рецептор PAC-1 вовлечен в ответ на вирус у рыб, учитывая что поли(I:C) представляет собой молекулу, которая структурно является аналогичной двухцепочечной РНК, сходный с вирусной инфекцией эффект (многие вирусы обладают РНК-геномами). Эти результаты представлены на фиг.1. Поли(I:C) взаимодействует с Toll-подобным рецептором 3 (TLR3), который экспрессируется во внутриклеточных компартментах B-клеток и дендритных клеток. В природе вирусы стимулируют TLR-3.

Кроме того, уровни экспрессии PAC-1 становились детектируемыми значениями для лейкоцитов в необрабатываемых культурах до недетектируемых уровней в культурах лейкоцитов, инфицированных IPNV, через 4, 24 и 48 часов после инфекции, подтверждая участие этого рецептора, который специфически связывается с PACAP, в противовирусном ответе у рыб (фиг.1). Различия, наблюдаемые между эффектами вирусного миметика поли(I:C) и вируса IPNV, могут быть ассоциированы со специфическим действием вируса в инфицированных клетках, вероятно, с его преимуществом.

Кроме того, авторы оценивали уровни экспрессии PAC-1 в клеточной линии макрофагов форели (O. mykiss) RTS-11, инфицированных VHSV, способ инфекции вирусом линии RTS-11 являлся аналогичным тому, который описан выше для линии RTG-2. Аналогично, авторы наблюдали снижение уровней экспрессии PAC-1 через 4 и 8 суток после инфицекции VHSV (фиг.2).

Пример 2. Экспрессия рецептора VPAC-1 в лейкоцитах из передней почки клеток радужной форели (Oncorhynchus mykiss), обработанных поли(I:C) и VHSV

Для оценки уровней экспрессии рецептора VPAC-1 составляли план эксперимента, аналогичный тому, который описан в примере 1.

Результат представлял собой такой, что уровни VPAC-1 являются сверхэкспрессированными в культивируемых лейкоцитах, обрабатываемых поли(I:C), через 4, 24 и 48 часов эксперимента, свидетельствуя о том, что рецептор VPAC-1, как и PAC-1, вовлечен в ответ на вирус у рыб, учитывая то, что поли(I:C) считают молекулой-вирусным миметиком (фиг.3).

Кроме того, уровни экспрессии VPAC-1 являлись недетектируемыми в культурах лейкоцитов, инфицированных VHSV, через 4, 24 и 48 часов после инфекции, подтверждая участие этого рецептора, который связывается с PACAP и VIP с одинаковой аффинностью, в противовирусном ответе у рыб (фиг.3).

Как наблюдали для рецептора PAC-1 в культивируемых лейкоцитах передней почки, инфицированных IPNV, наблюдаемые различия в регуляции VPAC-1 при обработке лейкоцитов in vitro поли(I:C) и инфицированных VHSV, могут быть ассоциированы со специфическим действием вируса как биологического организма, оказываемым в инфицированных клетки, вероятно, с его преимуществом.

Пример 3. Экспрессия PACAP и рецепторов PAC-1 и VPAC-1 в лейкоцитах из селезенки и передней почки радужной форели (Oncorhynchus mykiss), инфицированных in vivo VHSV

VHSV (штамм 0771) выращивали на клеточной линии RTG-2 (Sena and Rio (1975) Infect. Immun. 11:815-22). В кратком изложении, вирусы инокулировали на клеточной линии RTG-2, растущей на MEM с антибиотиками (100 МЕ/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина) и 2% FCS при 14°C. Когда наблюдали выраженное цитопатическое действие, собирали супернатанты культуры и центрифугировали для удаления продуктов распада клеток. Для инфицирования форели использовали осветленные супернатанты культур. Титры вирусов определяли в 96-луночных планшетах, как описано Reed and Muench (Reed and Muench (1998) J. Hyg. 27:280-9).

Авторы использовали молодь радужной форели (O. mykiss) от 9 до 12 грамм и в возрасте 7 месяцев и не инфицированную VHSV и IPNV. Рыб содержали при 14°C при циркуляции воды. Корм давали дважды в сутки неограниченно. Формировали две экспериментальны