Вакцина для защиты птицы от qх-подобного вируса инфекционного бронхита и способ ее использования

Вакцина для защиты птицы от qх-подобного вируса инфекционного бронхита и способ ее использования

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ С РОДСТВЕННЫМИ ЗАЯВКАМИ

По данной заявке, согласно 35 S.U.S.C. 119(e), испрашивается приоритет предварительной заявки 61/087228, поданной 8 августа 2008 года, полное описание которой включено в настоящий документ в виде ссылки.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к области вакцин против инфекционных заболеваний птиц. В частности, изобретение относится к новейшим вакцинам против вируса инфекционного бронхита (IB).

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Вирус инфекционного бронхита (IB) является коронавирусом, который вызывает респираторное заболевание у домашних птиц (например, куриц). Симптомы заболевания IB включают, например, дыхательную недостаточность, сниженный вес, сниженную яйценоскость, повышенную частоту образования аномальных яиц и повышенную смертность.

Было идентифицировано некоторое количество различных генотипов и серотипов вирусов IB. Генотипирование вирусов IB обычно проводят путем секвенирования всего или части гена, кодирующего белок S1 (образующего выступы) вируса. Белок S1 представляет собой N-концевой продукт расщепления большего по размеру гликопротеина S, кодируемого геномом вирусов IB. С-концевой продукт расщепления гликопротеина S называют белком S2. Белок S1 отвечает за клеточное прикрепление и является основной антигенной детерминантой вирусов IB. Иллюстративные генотипы (или «штаммы») вируса IB включают 793В, Massachusetts, Italy02, D274, Arkansas, B1648 и D1466. (Смотри, например, Worthington et al. (June 2008), Avian Pathology 37:247-257).

Новый генотип вируса IB, обозначаемый «QX» (также называемый «QXIBV»), был впервые идентифицирован в Китае в конце 1990-х. (Смотри Liu et al. (2006), Archives of Virology 151:1133-1148). После идентификации исходного генотипа QX многочисленные генотипы вируса IB с высокой степенью схожести/идентичности QX на уровне нуклеотидной последовательности S1 были идентифицированы во всем мире. Эти «IB-QX-подобные» вирусы (как далее определено в настоящем документе) были идентифицированы, например, во Франции, Германии, Нидерландах, Бельгии, Англии, Италии и Польше.

Представляется совершенно очевидным, что IB-QX-подобные вирусы представляют серьезную угрозу для птицеводства. Несмотря на стремительно обнаруживаемую значимость данного типа вируса IB, до настоящего момента никакие вакцины, специфичные к IB-QX-подобным вирусам, не были доступны или описаны в данной области техники. Коммерчески доступные вакцины против IB (живые, аттенуированные штаммы) оказались неэффективными в защите кур от IB-QX-подобных вирусов. Таким образом, в данной области техники существует необходимость в новых вакцинных композициях и способах вакцинации, которые обеспечивают специфическую защиту от IB-QX и IB-QX-подобных вирусов.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение выполняет вышеупомянутое требование в данной области техники путем предоставления вирусов IB, которые пригодны, в числе прочего, в качестве антигенных компонентов в вакцинных композициях, которые защищают от инфекции, вызванной IB-QX и IB-QX-подобными вирусами. Изобретение включает живые, аттенуированные варианты IB-QX-подобных вирусов. Такие живые, аттенуированные штаммы могут быть получены, например, путем многократного пассирования IB-QX-подобных вирусов до тех пор, пока не будет получено соответствующее требованиям ослабление вирулентности вирусов. Настоящее изобретение также включает инактивированные варианты IB-QX-подобных вирусов. IB-QX-подобные вирусы для использования в рамках настоящего изобретения могут быть получены, например, из зарегистрированных IB-QX-подобных вирусов, внелабораторных случаев IB-QX-подобной вирусной инфекции или путем создания рекомбинантных вирусов IB, экспрессирующих определенные, заранее заданные сегменты гена, как, например, отдельно взятую последовательность гена S1.

Настоящее изобретение также представляет вакцинные композиции, включающие живые, аттенуированные или убитые штаммы IB-QX-подобных вирусов, а также способы создания живых, аттенуированных и/или убитых штаммов IB-QX-подобных вирусов. Настоящее изобретение также представляет способы вакцинации птицы от инфекционного бронхита путем введения птице вакцинной композиции, включающей живые, аттенуированные или убитые штаммы IB-QX-подобных вирусов. Другие аспекты настоящего изобретения будут ясны из подробного описания изобретения и примеров, излагаемых в данном документе ниже.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение представляет изолированные вирусы IB, полученные из IB-QX-подобных вирусов.

Термин «IB-QX-подобные вирусы» в том смысле, в котором он здесь используется, означает любой вирус с белком S1, кодируемым нуклеотидной последовательностью, которая, как минимум, на 95% идентична нуклеотидной последовательности, кодирующей белок S1 исходного штамма IB-QX. Нуклеотидная последовательность, которая кодирует белок S1 исходного штамма IB-QX, представлена в виде SEQ ID NO:1 (смотри таблицу 1) и доступна под идентификационным номером AF193423 в NCBI Genbank.

Таблица 1Нуклеотидная последовательность гена S1 штамма IB-QX

Таким образом, любой вирус с белком S1, кодируемым нуклеотидной последовательностью, которая, как минимум, на 95% идентична SEQ ID NO:1, является «IB-QX-подобным» вирусом, представляющим собой предмет настоящего изобретения. Примеры IB-QX-подобных вирусов изложены в Worthington et al. (June 2008), Avian Pathology 37:247-257, включая генотипы вируса IB, обозначенные L-1148 (также называемый в Worthington et al. «NL/L-1148/04»), 1449-2 (также называемый в Worthington et al. «NL/L-1449T/04») и Roberton (также называемый в Worthington et al. FR/L-1450T/05). Иллюстративные IB-QX-подобные штаммы, из которых могут быть получены вирусы IB по настоящему изобретению, приведены в таблице 2, ниже.

В целях настоящего изобретения термин IB-QX-подобный вирус включает, в числе прочего, исходный вирус QX IB.

Таблица 2Иллюстративные IB-QX-подобные вирусы

Помимо сравнительного анализа кодирующих S1 последовательностей другие методы могут быть использованы для идентификации IB-QX-подобных вирусов. Могут быть использованы такие методы, как, например, предварительные методы отбора с целью идентификации кандидатов на роль IB-QX-подобных вирусов из огромного пула вирусных образцов. Если вирус оказывается положительным по признаку IB-QX-подобный с помощью этих предварительных методов отбора, генотип такого вируса может быть затем подтвержден с помощью нуклеотидного секвенирования гена S1 и сравнительного анализа, как описано в настоящем документе. Типичным «предварительным» методом идентификации IB-QX-подобных вирусов (или предполагаемых IB-QX-подобных вирусов) является нейтрализация сыворотки, где антисыворотка от животного, инфицированного IB-QX или IB-QX-подобным вирусом, тестируется на ее способность нейтрализовывать вирус-кандидата. По положительным результатам нейтрализации можно предположить, что вирус-кандидат является IB-QX-подобным вирусом.

Другим иллюстративным, предварительным методом отбора для IB-QX-подобных вирусов является полиморфизм длины фрагментов рестрикции (RFLP). В настоящем документе копию ДНК гена S1 из вируса-кандидата получают методом ОТ-ПЦР. Копию ДНК затем подвергают действию рестриктазы, о которой известно, что она расщепляет ген S1 IB-QX-подобных штаммов в позициях, не расщепляемых в гене S1 штаммов, не являющихся IB-QX-подобными (или наоборот). Различия в расщеплении фрагментов рестрикции могут быть визуализированы путем фракционирования по размеру образованной расщепленной ДНК, например, путем электрофореза в геле.

Изолированные вирусы IB по настоящему изобретению могут быть получены из любых IB-QX-подобных вирусов, упомянутых в настоящем документе, а также из любых других IB-QX-подобных вирусов, которые могут быть выделены в полевых условиях. Дополнительные IB-QX-подобные вирусы могут быть получены методами, известными специалистам в данной области техники. Например, IB-QX-подобные вирусы могут быть получены путем скрининга образцов (например, ротоглоточных мазков), взятых у кур с подозрением на зараженность вирусом IB, или в других случаях с проявлением одного или нескольких симптомов инфекционного бронхита. Выделяют РНК из таких образцов и получают копию ДНК гена S1 или его части методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Затем секвенируют копию ДНК S1, и полученную таким образом нуклеотидную последовательность сравнивают с нуклеотидной последовательностью S1-гена IB QX (SEQ ID NO:1), и определяют процент идентичности между двумя последовательностями.

В определенных иллюстративных вариантах осуществления настоящее изобретение включает изолированные вирусы IB, полученные из IB-QX-подобного вируса, имеющие белок S1 с такой же аминокислотной последовательностью, как белок S1 IB-QX-подобных вирусов L-1148 (SEQ ID NO:2), 1449-2 (SEQ ID NO:3) или 1449-10 (SEQ ID NO:4). Аминокислотные последовательности белков S1 из этих штаммов показаны в таблице 3:

Изолированные вирусы IB по настоящему изобретению могут также быть получены специалистами в данной области техники, используя рекомбинантные методы или методы «обратной генетики». Например, Casais et al. (2003) J. Virol. 77:9084-9089 описывают конструкцию рекомбинантного вируса IB, экспрессирующего гетерологичный ген белка, образующего выступ на поверхности вируса. (Смотри также Hodgson et al. (2004) J. Virol. 78:13804-13811). Эта система включает использование инфекционного клона вируса IB, т.е. полноразмерную кДНК вируса IB, клонированную в вектор, такой как, например, вектор вируса осповакцины. (Смотри, например, Casais et al. (2001) J. Virol. 75:12359-12369). Начиная с инфекционного клона вируса IB, могут быть сконструированы рекомбинантные вирусы IB, экспрессирующие белок S1 любого другого вируса IB. Таким образом, используя систему Casais et al. или ее разновидности, могут быть легко созданы рекомбинантные вирусы IB, которые экспрессируют белок S1 из любого IB-QX-подобного вируса (т.е. белок S1, кодируемый полинуклеотидной последовательностью, которая, как минимум, на 95% идентична SEQ ID NO:1), тем самым образуя рекомбинантные IB-QX-подобные вирусы. Образованные таким образом рекомбинантные IB-QX-подобные вирусы могут быть использованы в рамках настоящего изобретения так же, как используются естественным образом полученные IB-QX-подобные вирусы (например, полевые изоляты), как подробно описано в настоящем документе.

«Процент идентичности» в том смысле, в котором он здесь используется, означает, что процент нуклеотидов в контрольной нуклеотидной последовательности идентичен нуклеотидам в исследуемой последовательности (или определенной ее части) после совмещения последовательностей и внесения пропусков, в случае необходимости, для достижения максимального процента идентичности последовательностей, как, например, получаемого путем использования программы WU-BLAST-2.0a19 (Altschul et al. (1997) J. Mol. Biol. 215:403-410; в дальнейшем в настоящем документе обозначаемой «BLAST») со значениями всех исследуемых параметров, установленных по умолчанию. Значение процента идентичности нуклеотидных последовательностей определяется числом соответствий идентичных нуклеотидов, деленным на длину последовательности, для которой регистрируется процент идентичности.

Несмотря на то, что IB-QX-подобные вирусы известны в данной области техники, вирусы IB, получаемые из IB-QX-подобных вирусов, не были описаны или предложены в данной области техники и, таким образом, являются предметом настоящего изобретения. Термин «полученный из» в том смысле, в котором он здесь используется, в отношении вируса IB, означает, что вирус IB является либо: (1) последовательно пассированным потомком IB-QX-подобного вируса; либо (2) IB-QX-подобным вирусом, который был подвержен условиям, инактивирующим вирус или придающим ему меньшую вирулентность. В связи с этим, вирус, «полученный из» IB-QX-подобного вируса, может быть либо живым/аттенуированным, либо инактивированным/убитым.

Как отмечено выше, вирус IB, полученный из IB-QX-подобного вируса, в определенных вариантах осуществления изобретения, является последовательно пассированным потомком IB-QX-подобного вируса. «Последовательно пассированный потомок IB-QX-подобного вируса» определяют в настоящем документе как вирус, получаемый после того, как IB-QX-подобный вирус будет размножен в среде, благоприятной для репликации вируса, удален из указанной среды и затем размножен, как минимум, один дополнительный раз в той же или подобной среде. Каждый цикл размножения и удаления рассматривается как одно «пассирование». Последовательно пассированный потомок IB-QX-подобного вируса предпочтительно является аттенуированным; например, аттенуация является результатом последовательного пассирования.

Иллюстративный метод последовательного пассирования вирусов IB (включая IB-QX-подобные вирусы) заключается в использовании яиц с развивающимися эмбрионами домашней птицы (например, курицы) в качестве среды, благоприятной для репликации вируса. Например, яйца с развивающимися эмбрионами курицы заражают количеством IB-QX-подобного вируса через аллантоисную полость. Зараженные яйца инкубируют, например, при 37°С в течение 24 часов (или при других подходящих условиях инкубации, времени и температурах). Аллантоисная жидкость отбирается из яиц. На этой стадии вирус был пассирован «1Х». Собранной аллантоисной жидкостью из первого пассирования, при подходящем разведении, заражают новые яйца с развивающимися эмбрионами, которые инкубируют, например, при 37°С в течение 24 часов, и аллантоисная жидкость отбирается из этого второго набора яиц. На этой стадии вирус был пассирован «2Х». Непрерывное пассирование таким способом может продолжаться в течение неопределенного времени. Альтернативные среды, благоприятные для репликации вируса, которые можно использовать для пассирования вирусов IB, включают, например, клеточные культуры, такие как клеточные культуры почки курицы или эмбриональные фибробластные культуры курицы.

Несмотря на то, что инкубация при 37°С в течение 24 часов приведена в настоящем документе в качестве иллюстративного этапа инкубации для пассирования вирусов IB, специалист в данной области техники понимает, что другие температуры и/или времена инкубации могут быть использованы. Например, яйца с развивающимися эмбрионами могут быть инкубированы при температурах, находящихся в диапазоне от 20°С до 42°С. Время инкубации для пассирования вируса может находиться в диапазоне от 4 часов до 4 дней и более предпочтительно от 16 до 36 часов.

Образцы вируса могут быть протестированы после каждого пассирования (или после каждого 2-го, 4-го, 5-го, 10-го и т.д. пассирования) на степень вирулентности. Степень вирулентности может быть определена, например, введением пассированного вируса в цыплят и оценкой различных параметров, указывающих на инфекционный бронхит. Типичные параметры включают: (i) цилиарную активность эксплантатов трахеи; (ii) клинические признаки, такие как, например, водянистые экссудаты из глаза или носа, затрудненное дыхание или диарея; (iii) общее анатомо-патологическое исследование, например, верхних дыхательных путей, почек, селезенки и/или кишечника; и (iv) гистологию трахеи, легкого и почки. Типичные измерения каждого из этих параметров представлены в примере 2, ниже. Вирус IB, полученный из IB-QX-подобного вируса путем последовательного пассирования, считается «аттенуированным», если один или несколько параметров, указывающих на инфекционный бронхит, снижен, устранен или улучшен относительно соответствующих параметров, наблюдаемых у цыплят, инфицированных исходным (непассированным) IB-QX-подобным вирусом. Сравнительный анализ может быть также проведен у цыплят, инфицированных другими известными вирулентными штаммами вируса IB.

Неограниченный, типичный метод оценки вирулентности последовательно пассированного вируса IB, полученного из IB-QX-подобного вируса, проиллюстрирован в примере 2. Вкратце, цыплят, зараженных последовательно пассированным вирусом IB, полученным из IB-QX-подобного вируса, подвергают балльной оценке, отражающей (i) цилиарную активность эксплантатов трахеи, (ii) клинические признаки и (iii) анатомо-патологическое исследование. Определяют общий балл [(i)+(ii)+(iii)]. Классификация вирулентности составлена следующим образом:

«Невирулентный», если общий балл меньше или равен общему баллу незараженной контрольной группы.

«Слабо выраженная вирулентность», если общий балл больше общего балла незараженной контрольной группы, но меньше или равен общему баллу для группы, зараженной известным слабым штаммом вируса IB (например, POULVAC IB H120 (Massachusetts strain), Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, IA).

«Умеренно выраженная вирулентность», если общий балл выше общего балла для группы, зараженной известным слабым штаммом вируса IB, но меньше или равен общему баллу для группы, зараженной известным вирулентным штаммом вируса IB (например, исходным IB-QX-подобным штаммом или другим известным вирулентным штаммом, таким как штамм IB-M41).

«Вирулентный», если общий балл равен или выше общего балла для группы, зараженной известным вирулентным штаммом вируса IB.

Вирус IB, классифицируемый как «невирулентный» или «со слабо выраженной вирулентностью» в соответствии с вышеизложенной схемой классификации, пригоден в качестве живого аттенуированного вакцинного штамма. При определенных обстоятельствах вирус IB «умеренно выраженной вирулентности» может быть также пригоден в качестве живого аттенуированного штамма.

Альтернативные методы оценки пригодности последовательно пассированного IB-QX-подобного вируса в качестве вакцинного штамма известны в данной области техники и проиллюстрированы в настоящем документе, например, в примере 3. Как показано в примере 3, балльная оценка ресничек и морфология почек и трахеи используются для определения степени аттенуации после многократного пассирования. Эти параметры могут, в свою очередь, быть использованы для определения, пригоден ли данный штамм (например, в достаточной степени безопасен) для вакцинальных целей.

Как отмечалось выше, другая категория вируса IB, которая «получена из» IB-QX-подобного вируса, представляет собой IB-QX-подобный вирус, который был подвергнут условиям, инактивирующим вирус или придающим ему меньшую вирулентность. В отличие от последовательно пассированных вирусов IB, которые, как правило, живые и аттенуированные, вирусы IB из этой второй категории, как правило, рассматриваются как инактивированные или убитые. Методы инактивации вирусов, включая вирусы IB, известны в данной области техники.

Таким образом, как проиллюстрировано в вышеизложенном материале, вирус IB по настоящему изобретению, который получен из IB-QX-подобного вируса, может быть инактивированным или аттенуированным. Вирусы IB по настоящему изобретению, если они являются инактивированными, могут быть инактивированы путем взаимодействия вирусов с инактивирующим веществом, таким как, например, β-пропиолактон или формалин. Вирусы IB по настоящему изобретению, если они являются аттенуированными, могут быть аттенуированы последовательным пассированием, начиная с исходного пассирования IB-QX-подобного вируса. Вирусы IB могут быть пассированы в любой среде, благоприятной для репликации вируса. Такие среды включают, например, яйца домашней птицы с развивающимися эмбрионами. Яйца домашней птицы с развивающимися эмбрионами включают, например, яйца с развивающимися эмбрионами цыплят, такие как яйца цыплят, свободные от специфического патогена (SPF). Другие пригодные среды включают, например, клеточные культуры.

С целью аттенуации вирусов IB по настоящему изобретению вирусы могут быть пассированы любое число раз. В определенных вариантах осуществления изобретения вирусы пассируют, как минимум, достаточное число раз таким образом, чтобы образующиеся вирусы характеризовались как либо «невирулентные», «со слабо выраженной вирулентностью», либо (при определенных обстоятельствах) «с умеренно выраженной вирулентностью», используя принцип классификации, упоминаемый в настоящем документе. В определенных иллюстративных вариантах осуществления изобретения, вирусы IB по настоящему изобретению пассируют от 5 до 400 раз. Например, вирусы IB могут быть пассированы 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400 раз или более, по мере необходимости или желанию.

Вирусы IB по настоящему изобретению предпочтительно являются изолированными. Термин «изолированный» в том смысле, в котором он здесь используется, означает, что вирусы не содержатся в ткани живого животного.

Настоящее изобретение включает несколько неограничивающих демонстрационных примеров изолированных вирусов, вызывающих инфекционный бронхит, полученных из IB-QX-подобных вирусов. Например, IB-QX-подобный вирус L-1148 был пассирован 64 раза на 10-11 дневных яйцах с развивающимися эмбрионами кур, свободных от специфического патогена (SPF). Для 65-го пассажа SPF-яйца были инокулированы 0,2 мл 1000-кратного разведения аллантоисной жидкости, собранной на этапе 64 пассажа. После 24 часов инкубации при 37°С аллантоисная жидкость была собрана в пулы. 65-й пассированный материал обозначен в настоящем документе как L-1148(p65) (смотри пример 3). Стерильные пулы L-1148(p65) были отобраны, объединены, смешаны со стабилизатором, налиты в 3-мл флаконы (1 мл на флакон) и лиофилизированы для получения исходного вакцинного вируса IB QX L1148 MSV65. Были выполнены дополнительные 15 пассажей, в общей сложности 80 пассажей, для получения L-1148(p80) (смотри пример 3). Как и с 65-м пассированным материалом, аллантоисная жидкость, собранная на этапе 80-го пассажа, была собрана в пулы. Стерильные пулы были отобраны, объединены, смешаны со стабилизатором, налиты в 3-мл флаконы (1 мл на флакон) и лиофилизированы для получения исходного вакцинного вируса IB QX L1148A MSV80. IB QX L1148 MSV65 и IB QX L1148A MSV80 были пассированы каждый в отдельности дополнительные пять раз с получением IB QX L1148 MSV65 Х+5 и IB QX L1148A MSV80 Х+5, соответственно.

IB QX L1148 MSV65 был сдан на хранение в Европейскую Коллекцию Клеточных Культур, Porton Down, UK (ECACC) 10 июня 2009 года от имени Fort Dodge Animal Health и ему был присвоен предварительный идентификационный номер 09061002.

IB QX L1148A MSV80 был сдан на хранение в Европейскую Коллекцию Клеточных Культур, Porton Down, UK (ECACC) 10 июня 2009 года от имени Fort Dodge Animal Health и ему был присвоен предварительный идентификационный номер 09061004.

IB QX L1148A MSV65 х+5 был сдан на хранение в Европейскую Коллекцию Клеточных Культур, Porton Down, UK (ECACC) 10 июня 2009 года от имени Fort Dodge Animal Health и ему был присвоен предварительный идентификационный номер 09061003.

IB QX L1148A MSV80 х+5 был сдан на хранение в Европейскую Коллекцию Клеточных Культур, Porton Down, UK (ECACC) 10 июня 2009 года от имени Fort Dodge Animal Health и ему был присвоен предварительный идентификационный номер 09061001.

Дополнительные неограничивающие примеры вирусов IB, полученных из IB-QX-подобных вирусов, описаны в настоящем документе.

Настоящее изобретение включает вакцинные композиции, включающие: (i) изолированный вирус IB, полученный из IB-QX-подобного вируса; и (ii) фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтически приемлемый носитель может быть, например, водой, стабилизатором, консервантом, культуральной средой или буфером или любой комбинацией вышеупомянутого. Вакцинные композиции по изобретению могут быть приготовлены в форме суспензии или лиофилизированной форме или, альтернативно, в замороженной форме. В случае замороженной формы глицерин или другие подобные вещества могут быть добавлены для повышения стабильности при замораживании.

Вакцинные композиции по изобретению могут включать адъювант, в частности, если вирус IB, содержащийся в композиции, инактивирован (т.е. убит). Адъювантом может быть акриловый полимер, диметил диоктадецил бромид аммония (DDA) или комбинация акрилового полимера и DDA. Акриловым полимером в том смысле, в котором он здесь используется, является любой полимер или сополимер, который содержит акриловую группу. Иллюстративные акриловые полимеры включают, например, полиакриловую кислоту, метакриловую кислоту, метакрилат, акриламид, акрилат, акрилонитрил и алкиловые эфиры полиакриловой кислоты. Примеры акриловых сополимеров включают, например, поли(акриламид-собутил, метакрилат), акриловую-метакриловую кислоту, акриловую кислоту-акриламид и поли(метакрилат). Примеры коммерчески доступных акриловых полимеров включают карбопол (B. F. Goodrich Co., Cleveland, Ohio), Carboset (B. F. Goodrich Co., Cleveland, Ohio), Neocryl (Avecia, Inc., Wilmington, Del.) и Eudragit (Rohm Tech, Inc., Malden, Mass.). Особенно предпочтительным акриловым полимером для использования в эмульсиях по настоящему изобретению является карбопол, который также называется водорастворимым полимером акриловой кислоты, сшитым с полиаллилсахарозой. Адъювант может представлять собой водорастворимый или диспергируемый в воде адъювант. Адъювант может представлять собой масляную эмульсию, например, эмульсию типа вода в масле, масло в воде или вода в масле в воде. Эмульсия типа вода в масле может дополнительно включать один или несколько жирорастворимых поверхностно-активных веществ, один или несколько водорастворимых поверхностно-активных веществ, дополнительные адъюванты, дополнительные компоненты водной фазы, стабилизаторы эмульсии или комбинации вышеперечисленного.

Вакцинные композиции по настоящему изобретению могут включать, помимо вируса IB, полученного из IB-QX-подобного вируса, другие антигенные компоненты. Другие антигенные компоненты, включенные в вакцинные композиции, могут быть получены из инфекционных агентов, например, инфекционных агентов кур. Например, вакцинные композиции по настоящему изобретению могут дополнительно включать, как минимум, один дополнительный живой аттенуированный вирус IB, полученный из вируса, не являющегося IB-QX-подобным. «Вирус, не являющийся IB-QX-подобным» в том смысле, в котором он здесь используется, означает любой вирус IB с белком S1, кодируемым нуклеотидной последовательностью, которая менее чем на 95% идентична нуклеотидной последовательности, кодирующей белок S1 исходного штамма IB-QX. Нуклеотидная последовательность, кодирующая белок S1 исходного штамма IB-QX, представлена в виде SEQ ID NO:1 и доступна в NCBI Genbank под идентификационным номером AF193423. Таким образом, любой вирус с белком S1, кодируемым нуклеотидной последовательностью, которая менее чем на 95% идентична SEQ ID NO:1, представляет собой вирус «не являющийся IB-QX-подобным» в рамках настоящего изобретения. Иллюстративные вирусы, не являющиеся IB-QX-подобными, включают штаммы, такие как Massachusetts, Arkansas, Georgia-98, Italy-02, 793-B, D274, D1466, или штаммы, имеющие генотип S1 любого из вышеуказанных вирусов, не являющихся IB-QX-подобными. Вакцинные композиции по настоящему изобретению могут содержать один или несколько коммерчески доступных вакцинных штаммов IB помимо вируса IB, полученного из IB-QX-подобного вируса.

В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения вакцинная композиция может содержать дополнительный антигенный компонент, полученный из инфекционного агента, не являющегося вирусом IB. Например, вакцинные композиции по настоящему изобретению могут дополнительно включать живой аттенуированный или инактивированный птичий вирус, такой как вирус ньюкаслской болезни, вирус болезни Марека, вирус инфекционного бурсита, реовирус, вирус птичьего гриппа, вирус анемии кур или вирус энцефаломиелита птиц.

Настоящее изобретение также включает методы приготовления живых аттенуированных вирусов IB. Живые аттенуированные вирусы, приготовленные по данному аспекту изобретения, пригодны, в числе прочего, для вакцинации кур против вируса IB. Методы по данному аспекту изобретения включают пассирование IB-QX-подобного вируса. Например, IB-QX-подобный вирус может быть пассирован на яйцах домашних птиц с развивающимися эмбрионами (например, яйцах кур с развивающимися эмбрионами) или в клеточной культуре (например, клеточных культурах почки курицы). Число раз, которое должен быть пассирован IB-QX-подобный вирус, чтобы превратить его в аттенуированный, может быть определено, руководствуясь сведениями, излагаемыми в настоящем документе. Например, после пассирования IB-QX-подобного вируса образуемый вирус IB может быть введен курам, и затем проводят оценку кур, например, по цилиарной активности эксплантатов трахеи, клиническим признакам, общему анатомо-патологическому исследованию и/или гистологическим признакам инфекционного бронхита. Пассированный вирус IB, который вызывает облегченные или менее тяжелые симптомы IB по сравнению с исходным IB-QX-подобным вирусом, из которого он был получен, (или по сравнению с другими известными контрольными штаммами, вызывающими IB), считается аттенуированным штаммом в рамках настоящего изобретения. В соответствии с определенными вариантами осуществления методы изобретения включают пассирование IB-QX-подобного вируса до тех пор, пока образующийся вирус не попадет под категорию «невирулентный» или «со слабо выраженной вирулентностью» в соответствии с принципами классификации, изложенными в настоящем документе.

Настоящее изобретение также включает способы вакцинации птицы против инфекционного бронхита. Способы по данному аспекту изобретения включают введение птице вируса IB, полученного из IB-QX-подобного вируса. Способы по данному аспекту изобретения могут включать введение любой вакцинной композиции, включающей любой вирус IB, полученный из IB-QX-подобного вируса, как описано в настоящем документе. Вакцинные композиции по настоящему изобретению могут быть введены любым способом таким образом, чтобы активные или антигенные компоненты моментально или с течением времени провзаимодействовали с мембранами слизистой оболочки дыхательных путей птицы. Таким образом, вакцинные композиции могут быть введены птицам, например, интраназально, перорально и/или внутрь глаза. Вакцинные композиции для введения птицам могут быть составлены, как описано выше, и/или в форме, пригодной для введения с помощью спрея, включая аэрозоль (для интраназального применения), или в питьевой воде (для перорального применения). Вакцинные композиции по настоящему изобретению могут быть также введены подкожно, внутримышечно или внутрь эмбриона. (Смотри патент США № 7208164). По данному аспекту изобретения вакцинные композиции, включающие вирус IB, полученный из IB-QX-подобного вируса, могут быть введены птице в возрасте от 1 дня до 18 недель. В случае введения в эмбрион вакцинная композиция может быть введена, например, во второй половине инкубационного периода. Например, в случае кур, яйца, как правило, инокулируют в период приблизительно от 14 дня до приблизительно 19 дня. Более предпочтительна инокуляция куриных яиц приблизительно на 15-18 день.

Нижеследующие примеры являются иллюстративными, но не исчерпывающими, касательно способа и композиций по настоящему изобретению. Другие подходящие модификации и приспособления множества условий и параметров, обычно встречающихся в молекулярной биологии и химии, которые очевидны специалистам в данной области техники с точки зрения настоящего описания изобретения, находятся в рамках сущности и объема изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: ИДЕНТИФИКАЦИЯ IB-QX-ПОДОБНЫХ ВИРУСОВ

Этот пример представляет метод идентификации, если вирусом-кандидатом IB является IB-QX-подобный вирус. Вирусы-кандидаты IB могут быть получены из большого разнообразия источников, включая, например, соскобы тканей, полученных от животных, у которых проявляется один или несколько симптомов инфекционного бронхита, или из общедоступного банка-хранилища.

«IB-QX-подобный вирус» в том смысле, в котором он здесь используется, представляет собой вирус, вызывающий инфекционный бронхит, с нуклеотидной последовательностью S1, которая, как минимум, на 95% идентична нуклеотидной последовательности S1 исходно идентифицированного штамма IB-QX. Нуклеотидная последовательность S1 исходного штамма IB-QX представляет собой SEQ ID NO:1 и может быть найдена в NCBI Genbank под идентификационным номером AF193423.

Чтобы выяснить, является ли вирус-кандидат IB-QX-подобным вирусом, выделяют РНК из образца, содержащего вирусные частицы кандидата (например, соскобы тканей), используя стандартные способы выделения РНК. Например, РНК может быть выделена, используя способ с использованием изотиоцианата гуанидиния, фенол-хлороформа. (Chomcznski and Sacchi (1987), Analytical Biochemistry 162:156-159; Li et al. (1993), Avian Pathology 22:771-783). Кроме того, несколько наборов для выделения РНК коммерчески доступно и пригодно для этой цели. Затем РНК используют в полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) для получения амплифицированной копии ДНК целого гена S1 или так называемого «гипервариабельного участка» гена S1. Праймеры, используемые в ОТ-ПЦР, предпочтительно те, которые являются общими для большинства известных штаммов вируса IB. Иллюстративные праймеры наряду с соответствующими способами ОТ-ПЦР, которые могут быть использованы для амплификации гипервариабельного участка гена S1 вирусов-кандидатов IB, опубликованы, например, в Worthington et al. (June 2008), Avian Pathology 37:247-257 и Jones et al. (2005), Veterinary Record 156:646-647. В статье Worthington et al. вслед за реакцией ОТ выполняют «вложенную» ПЦР с целью получения копии ДНК гипервариабельного участка S1 длиной приблизительно 393 пар оснований. Секвенирование полноразмерной S1 может быть выполнено, используя метод Adzhar et al. (1996), Avian Pathology 25:817-836. Альтернативные праймеры и условия ОТ-ПЦР, пригодные для амплификации гена S1 или его частей, могут быть без труда созданы специалистами в данной области техники, используя общедоступную информацию о последовательностях вирусов IB.

После того как определена нуклеотидная последовательность целого гена S1, или его части (например, гипервариабельного участка), вируса-кандидата IB, данную последовательность сравнивают с последовательностью гена S1 для штамма IB-QX (SEQ ID NO:1) для определения процента идентичности. В случае, если нуклеотидная последовательность гена S1, или его гипервариабельного участка, вируса-кандидата IB, как минимум, на 95% идентична нуклеотидной последовательности гена S1 IB-QX (SEQ ID NO:1), тогда вирус-кандидат IB считают IB-QX-подобным вирусом.

Иллюстративные методы определения, является ли вирус-кандидат IB IB-QX-подобным вирусом, также описаны, например, в статье Gough et al. (2008), Veterinary Record 162:99-100 и статье Domanska-Blicharz et al. (2006), Veterinary Record 158:808, обе из которых полностью включены в настоящий документ в качестве ссылки.

Пример 2: АТТЕНУАЦИЯ IB-QX-ПОДОБНЫХ ВИРУСОВ

ВВЕДЕНИЕ

Этот пример обобщает эксперименты, в которых IB-QX-подобные вирусы были пассированы многократно на куриные яйца с развивающимися эмбрионами, и аттенуация образующихся вирусов была продемонстрирована на курицах.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Вирусы, вызывающие инфекционный бронхит

Три штамма IB-QX-подобных вирусов, обозначенные L-1148, 1449-2 и 1449-10, были использованы в данном примере. Все три этих штамма были идентифицированы как IB-QX-подобные путем секвенирования гена S1 и нуклеотидного сравнительного анализа с IB-QX и другими IB-QX-подобными вирусами. (Смотри Worthington et al. (June 2008), Avian Pathology 37:247-257).

Каждый из штаммов L-1148 и 1449-10 были пассированы 50 раз на куриных яйцах с развивающимися эмбрионами; штамм 1449-2 был пассирован 5 раз на куриных яйцах с развивающимися эмбрионами. Штаммы, полученные в результате этих многократных пассажей, были обозначены L-1148(p50), 1449-10(p50) и 1449-2(p5), соответственно. Таким образом, L-1148(p50) был получен из L-1148; 1449-10(p50) был получен из 1449-10; и 1449-2(p5) был получен из 1449-2.

План исследования

Цыплята были заражены вирусами L-1148(p50), 1449-10(p50) и 1449-2(p5) наряду с известным штаммом IB со слабо выраженной вирулентностью (IB-H120, вакцинный штамм) и вирулентным штаммом IB (IB-M41). Незараженная контрольная группа была также включена в исследование. План исследования сведен в таблицу 4:

Таблица 4План Исследования
Группа	Количество цыплят	Штамм для заражения
1	10	L-1148(p50)
2	10	1449-10(p50)

3	10	1449-2(p5)
4	10	IB-H120
5	10	IB-M41
Контроль	10	Не зараженный

Животные и уход за ними

Шестьдесят SPF-цыпля