Способы улучшения эффективности белков

Способы улучшения эффективности белков

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По настоящей заявке испрашивается приоритет Предварительных заявок на патент США с порядковыми номерами 60/933307, 60/933331 и 60/933312, поданных 6 июня 2007 года, включенных в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Данное изобретение относится к способам конструирования белков для оптимизации их эффективности при определенных представляющих интерес условиях окружающей среды. В некоторых вариантах осуществления, данное изобретение относится к способам конструирования ферментов для оптимизации их каталитической активности при конкретных условиях окружающей среды. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, данное изобретение относится к способам изменения суммарного заряда поверхности и/или распределения заряда поверхности ферментов (например, металлопротеаз или сериновых протеаз) для получения вариантов ферментов, которые обладают улучшенной эффективностью в детергентных составах в сравнении с первоначальным или исходным ферментом.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Свойства белков, функционирующих вне их природной среды, часто являются субоптимальными. Например, ферменты (например, протеазы, липазы, амилазы, целлюлазы и т.д.) часто используются для очистки от пятен в ткани в детергентах (моющих средствах) для стирки, которые обычно включают комплексную комбинацию активных ингредиентов. Фактически, большинство очищающих продуктов включают систему поверхностно-активных веществ, отбеливающие агенты, модифицирующие добавки, подавители мыльной пены, суспендирующие грязь агенты, высвобождающие грязь агенты, оптические отбеливатели, смягчающие агенты, диспергирующие агенты, ингибирующие перенос красителя агенты, абразивы, бактерициды и ароматизаторы, а также ферменты для очистки. Таким образом, несмотря на сложность существующих детергентов, имеются многочисленные пятна, которые трудно удалить полностью вследствие частично субоптимальной эффективности ферментов. Несмотря на многочисленные исследования в развитии ферментов, в данной области остается потребность в способах конструирования белков для конкретных применений и условий. В действительности, в данной области сохраняется потребность в способах быстрого и системного приспособления электростатических свойств для оптимизации их эффективности в коммерческих применениях. В частности, в данной области остается потребность в способах конструирования промышленно применимых ферментов, в том числе но не только, липаз, амилаз, кутиназ, маннаназ, оксидоредуктаз, целлюлаз, пектиназ, протеаз и других ферментов, для обеспечения улучшенной активности, стабильности и растворимости в очищающих растворах.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение относится к способам конструирования белков для оптимизации их эффективности при определенных представляющих интерес условиях окружающей среды. В некоторых вариантах осуществления, данное изобретение относится к способам конструирования ферментов для оптимизации их каталитической активности при конкретных условиях окружающей среды. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, данное изобретение относится к способам изменения суммарного заряда поверхности и/или распределения заряда поверхности ферментов (например, металлопротеаз или сериновых протеаз) для получения вариантов ферментов, которые демонстрируют улучшенную эффективность в детергентных составах в сравнении с первоначальным или исходным ферментом.

В некоторых вариантах осуществления, данное изобретение относится к способам замены заряда в белках, в частности ферментах. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, данное изобретение относится к способам получения ферментов с улучшенной моющей способностью. Данное изобретение находит применение в конструировании различных ферментов, а также других белков. В частности, данное изобретение находит применение в развитии улучшенных ферментов, которые находят применение в промышленности, в том числе, но не только, для очистки (например, белья, посуды, твердой поверхности и т.д.). Однако авторы изобретения не имеют в виду, что это изобретение ограничивается каким-либо конкретным ферментом или белком.

Данное изобретение относится к способам получения нейтрального варианта металлопротеазы с улучшенной моющей эффективностью в сравнении с исходной нейтральной металлопротеазой, предусматривающим: замену аминокислотного остатка в одном или нескольких положениях в исходной нейтральной металлопротеазе с получением варианта нейтральной металлопротеазы, имеющего более положительный заряд или более отрицательный заряд в сравнении с исходным ферментом. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления, эти способы дополнительно предусматривают тестирование моющей эффективности этого варианта сравнением способности исходного фермента и этого варианта удалять пятно, причем моющая эффективность исходного фермента принимается за величину 1,0, а вариант с улучшенной моющей эффективностью достигает величины более 1,0. В дополнительных вариантах осуществления, данное изобретение относится к способам получения варианта, имеющего улучшенную моющую эффективность. В некоторых вариантах осуществления, исходной нейтральной металлопротеазой является зрелая форма дикого типа нейтральной металлопротеазы. В некоторых других вариантах осуществления, этот вариант получен из нейтральной металлопротеазы Bacillaceae. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, этот вариант получен из нейтральной металлопротеазы Bacillus. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления, моющую эффективность тестируют в порошкообразной или жидкой детергентной композиции, имеющей рН от 6,5 до 12,0. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, моющую эффективность тестируют в жидком детергенте (моющем средстве) для стирки, имеющем основный рН. В некоторых альтернативных предпочтительных вариантах осуществления, одно или несколько положений в исходной нейтральной металлопротеазе являются положениями, имеющими доступную для растворителя поверхность (SAS), большую чем приблизительно 50%. В некоторых дополнительных предпочтительных вариантах осуществления, одно или несколько положений в исходной нейтральной металлопротеазе являются положениями, имеющими доступную для растворителя поверхность (SAS), большую чем приблизительно 65%.

Данное изобретение также относится к способам получения варианта нейтральной металлопротеазы с улучшенной моющей эффективностью в сравнении с исходной нейтральной металлопротеазой, предусматривающим: замену аминокислотного остатка в одном или нескольких положениях в исходной нейтральной металлопротеазе с получением варианта нейтральной металлопротеазы, имеющего более положительный заряд или менее отрицательный заряд в сравнении с исходным ферментом; и замену аминокислотного остатка в одном или нескольких положениях в исходной нейтральной металлопротеазе с получением варианта нейтральной металлопротеазы, имеющего более отрицательный заряд или менее положительный заряд в сравнении с исходным ферментом. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, эти способы дополнительно предусматривают тестирование моющей эффективности этого варианта сравнением способности исходного фермента и этого варианта удалять пятно, причем моющая эффективность исходного фермента принимается за величину 1,0, а вариант с улучшенной моющей эффективностью достигает величины более 1,0. В дополнительных вариантах осуществления, эти способы предусматривают получение варианта, имеющего улучшенную моющую эффективность. Предполагается, что эти стадии проводятся в любом удобном порядке. В некоторых вариантах осуществления, исходной нейтральной металлопротеазой является зрелая форма дикого типа нейтральной металлопротеазы. В некоторых других вариантах осуществления, этот вариант получен из нейтральной металлопротеазы Bacillaceae. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, этот вариант получен из нейтральной металлопротеазы Bacillus. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления, моющую эффективность тестируют в порошкообразной или жидкой детергентной композиции, имеющей рН от 6,5 до 12,0. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, моющую эффективность тестируют в жидком детергенте (моющем средстве) для стирки, имеющем основный рН. В некоторых альтернативных предпочтительных вариантах осуществления, одно или несколько положений в исходной нейтральной металлопротеазе являются положениями, имеющими доступную для растворителя поверхность (SAS), большую чем приблизительно 50%. В некоторых дополнительных предпочтительных вариантах осуществления, одно или несколько положений в исходной нейтральной металлопротеазе являются положениями, имеющими доступную для растворителя поверхность (SAS), большую чем приблизительно 65%. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления по меньшей мере один кислый аминокислотный остаток заменен по меньшей мере одним основным аминокислотным остатком, тогда как в других вариантах осуществления, по меньшей мере один кислый аминокислотный остаток заменен по меньшей мере одним нейтральным аминокислотным остатком и, в некоторых дополнительных вариантах осуществления, по меньшей мере один нейтральный аминокислотный остаток заменен основным аминокислотным остатком. В некоторых вариантах осуществления, обеспечены различные комбинации замен. В дополнительных вариантах осуществления, по меньшей мере один основный аминокислотный остаток заменен по меньшей мере одним кислым аминокислотным остатком, тогда как в других вариантах осуществления по меньшей мере один основный аминокислотный остаток заменен по меньшей мере одним нейтральным аминокислотным остатком, и в других вариантах осуществления по меньшей мере один нейтральный аминокислотный остаток заменен по меньшей мере одной кислой аминокислотой. В дополнительных вариантах осуществления, по меньшей мере один нейтральный аминокислотный остаток в исходной нейтральной металлопротеазе заменен по меньшей мере одним нейтральным аминокислотным остатком с получением варианта нейтральной металлопротеазы, имеющего тот же самый заряд в сравнении с исходным ферментом. Авторы изобретения не предполагают ограничения данного изобретения какими-либо конкретными комбинациями замен. Они также не предполагают, что эти замены должны выполняться в каком-либо конкретном порядке.

Данное изобретение относится к способам получения варианта сериновой протеазы с улучшенной моющей эффективностью в сравнении с исходной сериновой протеазой, предусматривающим: замену аминокислотного остатка в одном или нескольких положениях в исходной сериновой протеазе с получением варианта сериновой протеазы, имеющего более положительный заряд или более отрицательный заряд в сравнении с исходным ферментом. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления, эти способы дополнительно предусматривают тестирование моющей эффективности этого варианта сравнением способности исходного фермента и этого варианта удалять пятно, причем моющая эффективность исходного фермента принимается за величину 1,0, а вариант с улучшенной моющей эффективностью достигает величины более 1,0. В дополнительных вариантах осуществления, данное изобретение относится к способам получения варианта, имеющего улучшенную моющую эффективность. В некоторых вариантах осуществления, исходной сериновой протеазой является зрелая форма дикого типа сериновой протеазы. В некоторых других вариантах осуществления, этот вариант получен из сериновой протеазы Bacillaceae. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, этот вариант получен из сериновой протеазы Bacillus. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления, моющую эффективность тестируют в порошкообразной или жидкой детергентной композиции, имеющей рН от 6,5 до 12,0. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, моющую эффективность тестируют в жидком детергенте (моющем средстве) для стирки, имеющем основный рН. В некоторых альтернативных предпочтительных вариантах осуществления, одно или несколько положений в исходной сериновой протеазе являются положениями, имеющими доступную для растворителя поверхность (SAS), большую чем приблизительно 50%. В некоторых дополнительных предпочтительных вариантах осуществления, одно или несколько положений в исходной сериновой протеазе являются положениями, имеющими доступную для растворителя поверхность (SAS), большую чем приблизительно 65%.

Данное изобретение также относится к способам получения варианта сериновой протеазы с улучшенной моющей эффективностью в сравнении с исходной сериновой протеазой, предусматривающим: замену аминокислотного остатка в одном или нескольких положениях в исходной сериновой протеазе с получением варианта сериновой протеазы, имеющего более положительный заряд или менее отрицательный заряд в сравнении с исходным ферментом; и замену аминокислотного остатка в одном или нескольких положениях в исходной сериновой протеазе с получением варианта сериновой протеазы, имеющего более отрицательный заряд или менее положительный заряд в сравнении с исходным ферментом. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, эти способы дополнительно предусматривают тестирование моющей эффективности этого варианта сравнением способности исходного фермента и этого варианта удалять пятно, причем моющая эффективность исходного фермента принимается за величину 1,0, а вариант с улучшенной моющей эффективностью достигает величины более 1,0. В дополнительных вариантах осуществления, эти способы предусматривают получение варианта, имеющего улучшенную моющую эффективность. Предполагается, что эти стадии проводятся в любом удобном порядке. В некоторых вариантах осуществления, исходной сериновой протеазой является зрелая форма дикого типа сериновой протеазы. В некоторых других вариантах осуществления, этот вариант получен из сериновой протеазы Micrococcineae. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, этот вариант получен из сериновой протеазы Cellulomonas. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления, моющую эффективность тестируют в порошкообразной или жидкой детергентной композиции, имеющей рН от 6,5 до 12,0. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, моющую эффективность тестируют в жидком детергенте (моющем средстве) для стирки, имеющем основный рН. В некоторых альтернативных предпочтительных вариантах осуществления, одно или несколько положений в исходной сериновой протеазе являются положениями, имеющими доступную для растворителя поверхность (SAS), большую чем приблизительно 50%. В некоторых дополнительных предпочтительных вариантах осуществления, одно или несколько положений в исходной сериновой протеазе являются положениями, имеющими доступную для растворителя поверхность (SAS), большую чем приблизительно 65%. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, по меньшей мере один кислый аминокислотный остаток заменен по меньшей мере одним основным аминокислотным остатком, тогда как в других вариантах осуществления по меньшей мере один кислый аминокислотный остаток заменен по меньшей мере одним нейтральным аминокислотным остатком и, в некоторых дополнительных вариантах осуществления, по меньшей мере один нейтральный аминокислотный остаток заменен основным аминокислотным остатком. В некоторых вариантах осуществления, обеспечены различные комбинации замен. В дополнительных вариантах осуществления, по меньшей мере один основный аминокислотный остаток заменен по меньшей мере одним кислым аминокислотным остатком, тогда как в других вариантах осуществления по меньшей мере один основный аминокислотный остаток заменен по меньшей мере одним нейтральным аминокислотным остатком и, в других вариантах осуществления, по меньшей мере один нейтральный аминокислотный остаток заменен по меньшей мере одной кислой аминокислотой. В дополнительных вариантах осуществления, по меньшей мере один нейтральный аминокислотный остаток в исходной сериновой протеазе заменен по меньшей мере одним нейтральным аминокислотным остатком с получением варианта нейтральной металлопротеазы, имеющего тот же самый заряд в сравнении с исходным ферментом. Авторы изобретения не предполагают ограничения данного изобретения какими-либо конкретными комбинациями замен. Они также не предполагают, что эти замены должны выполняться в каком-либо конкретном порядке.

Данное изобретение также относится к способам получения варианта сериновой протеазы с улучшенной моющей эффективностью в сравнении с исходной сериновой протеазой, предусматривающим: замену аминокислотного остатка в одном или нескольких положениях в исходной сериновой протеазе с получением варианта сериновой протеазы, имеющего более положительный заряд или менее отрицательный заряд в сравнении с исходным ферментом; замену аминокислотного остатка в одном или нескольких положениях в исходной сериновой протеазе с получением варианта сериновой протеазы, имеющего более отрицательный заряд или менее положительный заряд в сравнении с исходным ферментом, и получение варианта сериновой протеазы, полученного при помощи этих стадий. В дополнительных вариантах осуществления, эти способы предусматривают тестирование моющей эффективности этого варианта сравнением способности исходного фермента и этого варианта удалять пятно, причем моющая эффективность исходного фермента принимается за величину 1,0, а вариант с улучшенной моющей эффективностью достигает величины более 1,0. В дополнительных вариантах осуществления, эти способы предусматривают получение варианта, имеющего улучшенную моющую эффективность. Предполагается, что эти стадии проводятся в любом удобном порядке. В некоторых вариантах осуществления, исходной сериновой протеазой является зрелая форма дикого типа сериновой протеазы. В некоторых других вариантах осуществления, этот вариант получен из сериновой протеазы Micrococcineae. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, этот вариант получен из сериновой протеазы Cellulomonas. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления, моющую эффективность тестируют в порошкообразной или жидкой детергентной композиции, имеющей рН от 6,5 до 12,0. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, моющую эффективность тестируют в жидком детергенте (моющем средстве) для стирки, имеющем основный рН. В некоторых альтернативных предпочтительных вариантах осуществления, одно или несколько положений в исходной сериновой протеазе являются положениями, имеющими доступную для растворителя поверхность (SAS), большую чем приблизительно 50%. В некоторых дополнительных предпочтительных вариантах осуществления, одно или несколько положений в исходной сериновой протеазе являются положениями, имеющими доступную для растворителя поверхность (SAS), большую чем приблизительно 65%. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, по меньшей мере один кислый аминокислотный остаток заменен по меньшей мере одним основным аминокислотным остатком, тогда как в других вариантах осуществления по меньшей мере один кислый аминокислотный остаток заменен по меньшей мере одним нейтральным аминокислотным остатком и, в некоторых дополнительных вариантах осуществления, по меньшей мере один нейтральный аминокислотный остаток заменен основным аминокислотным остатком. В некоторых вариантах осуществления, обеспечены различные комбинации замен. В дополнительных вариантах осуществления, по меньшей мере один основный аминокислотный остаток заменен по меньшей мере одним кислым аминокислотным остатком, тогда как в других вариантах осуществления по меньшей мере один основный аминокислотный остаток заменен по меньшей мере одним нейтральным аминокислотным остатком и, в других вариантах осуществления, по меньшей мере один нейтральный аминокислотный остаток заменен по меньшей мере одной кислой аминокислотой. В дополнительных вариантах осуществления, по меньшей мере один нейтральный аминокислотный остаток в исходной нейтральной металлопротеазе заменен по меньшей мере одним нейтральным аминокислотным остатком с получением варианта нейтральной металлопротеазы, имеющего тот же самый заряд в сравнении с исходным ферментом. Авторы изобретения не предполагают ограничения данного изобретения какими-либо конкретными комбинациями замен. Они также не предполагают, что эти замены должны выполняться в каком-либо конкретном порядке.

Данное изобретение относится к способам получения по меньшей мере одного варианта белка с улучшенной эффективностью в сравнении с исходным белком, предусматривающим модификацию по меньшей мере одного аминокислотного остатка в одном или нескольких положениях в исходном белке с получением по меньшей мере одного варианта белка, имеющего более положительный, более отрицательный, менее положительный или менее отрицательный заряд в сравнении с исходным белком. В некоторых вариантах осуществления, эта модификация предусматривает замену, добавление и/или делецию, тогда как в других вариантах осуществления модификация включает химическую модификацию. В некоторых вариантах осуществления, этот белок является ферментом. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления, этим белком является протеаза, амилаза, целлюлаза, полиэстераза, эстераза, липаза, кутиназа, пектиназа, оксидаза, трансфераза, алкалаза или каталаза. В некоторых дополнительных особенно предпочтительных вариантах осуществления, эта протеаза является сериновой протеазой или нейтральной металлопротеазой. В некоторых дополнительных вариантах осуществления, эффективность по меньшей мере одного варианта белка оценивают с использованием по меньшей мере одного представляющего интерес теста. В некоторых дополнительных вариантах осуществления, этот по меньшей мере один представляющий интерес тест предусматривает измерение связывания субстрата, ингибирования фермента, уровней экспрессии, стабильности детергента, термостабильности, скорости реакции, степени реакции, термальной активности, разжижения крахмала, гидролиза сложных эфиров, ферментативного отбеливания, моющей эффективности, деградации биомассы, растворимости, стабильности к хелаторам и/или осахаривания. В некоторых дополнительных вариантах осуществления, по меньшей мере один вариант белка проявляет улучшенную эффективность по меньшей мере в одном представляющем интерес тесте в сравнении с исходным белком.

Данное изобретение также относится к способам получения по меньшей мере одного варианта фермента с улучшенной моющей эффективностью в сравнении с исходным ферментом, предусматривающим модификацию по меньшей мере одного аминокислотного остатка в одном или нескольких положениях исходного фермента для получения по меньшей мере одного варианта фермента, имеющего более положительный, более отрицательный, менее положительный или менее отрицательный заряд в сравнении с исходным ферментом. В некоторых вариантах осуществления, эта модификация включает замену, добавление и/или делецию, тогда как в альтернативных вариантах осуществления, модификация включает химическую модификацию. В некоторых дополнительных вариантах осуществления, эти способы дополнительно предусматривают тестирование моющей эффективности этого варианта фермента и исходного фермента для получения показателей эффективности для этого варианта фермента и исходного фермента. В некоторых вариантах осуществления, показатель эффективности этого варианта фермента имеет величину, большую чем 1,0, а моющая эффективность исходного фермента имеет показатель эффективности 1,0. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления, эти способы дополнительно предусматривают получение вариантного фермента, имеющего улучшенную моющую эффективность. В некоторых дополнительных вариантах осуществления, этим ферментом является протеаза, амилаза, целлюлаза, полиэстераза, эстераза, липаза, кутиназа, пектиназа, оксидаза, трансфераза, алкалаза или каталаза. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, эта протеаза является сериновой протеазой или нейтральной металлопротеазой. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления, исходным ферментом является протеаза Bacillus. В некоторых вариантах осуществления, моющую эффективность тестируют в порошкообразной или жидкой детергентной композиции, имеющей рН между 5 и 12,0. В некоторых вариантах осуществления, моющую эффективность тестируют в жидком детергенте (моющем средстве) для стирки, имеющем основный рН, тогда как в некоторых других вариантах осуществления моющую эффективность тестируют в жидком детергенте для холодной воды, имеющем основный рН. В некоторых вариантах осуществления, эти замены находятся в положениях в исходном ферменте, имеющих доступную для растворителя поверхность (SAS), большую чем приблизительно 25%. В некоторых дополнительных вариантах осуществления, эти замены находятся в положениях в исходном ферменте, имеющих доступную для растворителя поверхность (SAS), большую чем приблизительно 50%, или большую чем приблизительно 65%.

Данное изобретение также относится к способам получения вариантов ферментов с улучшенной моющей эффективностью в сравнении с исходным ферментом, предусматривающим: а) модификацию по меньшей мере одного аминокислотного остатка в одном или нескольких положениях в исходном ферменте для получения первого варианта фермента, имеющего более положительный, более отрицательный, менее положительный или менее отрицательный заряд в сравнении с исходным ферментом; и b) модификацию по меньшей мере одного аминокислотного остатка в одном или нескольких положениях в исходном ферменте для получения второго варианта фермента, имеющего более положительный, более отрицательный, менее положительный или менее отрицательный заряд в сравнении с исходным ферментом. В некоторых вариантах осуществления, эта модификация включает замену, добавление и/или делецию, тогда как в некоторых альтернативных вариантах осуществления, эта модификация включает химическую модификацию. В некоторых дополнительных вариантах осуществления, эти стадии повторяют для получения множества вариантов фермента. В некоторых дополнительных вариантах осуществления, этим исходным ферментом является протеаза, амилаза, целлюлаза, полиэстераза, эстераза, липаза, кутиназа, пектиназа, оксидаза, трансфераза, алкалаза или каталаза. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, эта протеаза является нейтральной металлопротеазой или сериновой протеазой. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления, исходным ферментом является протеаза Bacillus. В некоторых дополнительных вариантах осуществления, эти способы дополнительно предусматривают тестирование моющей эффективности вариантных ферментов и исходного фермента и сравнение способности исходного фермента и вариантных ферментов удалять пятно в тестировании моющей эффективности, причем моющая эффективность исходного фермента принимается за величину 1,0, а вариант с улучшенной моющей эффективностью достигает величины, большей чем 1,0. В некоторых вариантах осуществления, эти способы дополнительно предусматривают получение варианта, имеющего улучшенную моющую эффективность в сравнении с исходным ферментом. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, этим исходным ферментом является сериновая протеаза. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления, этой сериновой протеазой является сериновая протеаза Bacillus или сериновая протеаза Cellulomonas. В некоторых дополнительных вариантах осуществления, моющую эффективность тестируют в порошкообразной или жидкой детергентной композиции, имеющей рН между 5 и 12,0. В некоторых дополнительных вариантах осуществления, моющую эффективность тестируют в жидком детергенте (моющем средстве) для стирки, имеющем основный рН. В других дополнительных вариантах осуществления, моющую эффективность тестируют в жидком детергенте для холодной воды, имеющем основный рН. В некоторых альтернативных вариантах осуществления, эти замены находятся в положениях в исходном ферменте, имеющих доступную для растворителя поверхность (SAS), большую чем приблизительно 25%, тогда как в некоторых других вариантах осуществления эти замены находятся в положениях в исходном ферменте, имеющих доступную для растворителя поверхность (SAS), большую чем приблизительно 50%, или большую чем приблизительно 65%. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере один кислый аминокислотный остаток заменен по меньшей мере одним основным аминокислотным остатком, тогда как в других вариантах осуществления по меньшей мере один кислый аминокислотный остаток заменен по меньшей мере одним нейтральным аминокислотным остатком, по меньшей мере один нейтральный аминокислотный остаток заменен по меньшей мере одним основным аминокислотным остатком, по меньшей мере один основный аминокислотный остаток заменен по меньшей мере одним кислым аминокислотным остатком, по меньшей мере один основный аминокислотный остаток заменен по меньшей мере одним нейтральным аминокислотным остатком, по меньшей мере один нейтральный аминокислотный остаток заменен по меньшей мере одной кислой аминокислотой и/или по меньшей мере один нейтральный аминокислотный остаток в исходном ферменте заменен по меньшей мере одним нейтральным аминокислотным остатком с получением варианта фермента, имеющего один и тот же заряд в сравнении с исходным ферментом. Предполагается, что любая подходящая комбинация замен найдет применение в данном изобретении, если желательно.

Данное изобретение также относится к способам получения по меньшей мере одного варианта белка с улучшенной эффективностью в сравнении с исходным белком, предусматривающим модификацию по меньшей мере одного аминокислотного остатка в одном или нескольких положениях в исходном белке для получения по меньшей мере одного варианта белка, имеющего более положительный, более отрицательный, менее положительный или менее отрицательный заряд в сравнении с исходным белком, причем эти одно или несколько положений имеют доступную для растворителя поверхность (SAS), большую чем приблизительно 25%. В некоторых вариантах осуществления, эти одно или несколько положений не являются консервативными в выравниваниях аминокислот гомологичных белковых последовательностей, содержащих исходный белок и по меньшей мере один дополнительный белок. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, этот исходный белок является ферментом. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления, этим ферментом является протеаза, амилаза, целлюлаза, полиэстераза, эстераза, липаза, кутиназа, пектиназа, оксидаза, трансфераза, алкалаза или каталаза. В некоторых дополнительных вариантах осуществления, эта улучшенная эффективность включает увеличение одного или нескольких свойств, выбранных из связывания субстрата, ингибирования фермента, экспрессии, стабильности в детергенте, термостабильности, скорости реакции, степени реакции, термальной активности, разжижения крахмала, деградации биомассы, осахаривания, гидролиза сложных эфиров, ферментативного отбеливания, моющей эффективности, растворимости, стабильности к хелаторам и/или модификации текстиля. В некоторых дополнительных вариантах осуществления, эта модификация включает замену, добавление и/или делецию, тогда как в других вариантах осуществления модификация предусматривает химическую модификацию. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере одна замена включает изменение суммарного заряда 0, -1 или -2 относительно исходного белка, в то время как в других вариантах осуществления по меньшей мере одна замена включает изменение суммарного заряда +1 или +2 относительно исходного белка. В некоторых дополнительных вариантах осуществления, по меньшей мере одна из замен в исходном белке включает изменение суммарного заряда 0, -1 или -2 относительно исходного белка, причем по меньшей мере одна дополнительная замена в исходном белке включает изменение заряда +1 или +2 относительно исходного белка. В некоторых дополнительных вариантах осуществления, этот вариант белка имеет изменение суммарного заряда +1 или +2 относительно исходного белка, в то время как в других вариантах осуществления этот вариант белка имеет изменение суммарного заряда 0, -1 или -2 относительно исходного белка. В некоторых дополнительных вариантах осуществления, эти замены находятся в положениях в исходном белке, имеющих доступную для растворителя поверхность (SAS), большую чем приблизительно 50%, или большую чем приблизительно 65%.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ чертежей

Фиг.1A изображает относительную активность в микролоскутках (маленьких образцах ткани) с кровью, молоком, чернилами (BMI) (нормализованную относительно наилучшего моющего агента) вариантов ASP как функцию изменения суммарного заряда относительно ASP дикого типа, измеренную в жидком детергенте AATCC (черные треугольники) и буфере (белые кружки) с одинаковыми рН и проводимостью (5 мМ HEPES pH 8,0, 2,5 мМ NaCl). Подобным образом, фиг.1B изображает относительную активность в микролоскутках BMI как функцию изменения заряда относительно дикого типа для комбинаторной библиотеки зарядов ASP (CCL).

Фиг.2 изображает относительную активность в микролоскутках (маленьких образцах ткани) BMI (нормализованную относительно наилучшего моющего агента) вариантов ASP как функцию изменения суммарного заряда относительно ASP дикого типа, измеренную в 5 мМ HEPES рН 8,0 с варьирующейся концентрацией NaCl: 2,5 мМ (белые кружки), 16 мМ (серые кружки) и 100 мМ (черные кружки).

Фиг.3A изображает очищающую BMI эффективность FNA CCL в Североамериканском детергенте (моющем средстве) для стирки как функцию изменения заряда. Подобным образом, фиг.3B изображает очищающую BMI эффективность GG36 CCL в Североамериканском детергенте (моющем средстве) для стирки как функцию изменения заряда.

Фиг.4A изображает очищающую BMI эффективность FNA CCL в Западноевропейском детергенте (моющем средстве) как функцию изменения заряда. Подобным образом, фиг.4В изображает очищающую BMI эффективность GG36 CCL в Западноевропейском жидком детергенте (моющем средстве) как функцию изменения заряда.

Фиг.5A изображает очищающую BMI эффективность FNA CCL в Японском порошкообразном детергенте (моющем средстве) как функцию изменения заряда. Подобным образом, фиг.5В изображает очищающую BMI эффективность GG36 CCL в Японском порошкообразном детергенте (моющем средстве) как функцию изменения заряда.

Фиг.6A изображает очищающую от сваренного яичного желтка эффективность FNA CCL в детергенте для автоматической мойки посуды как функцию изменения заряда. Подобным образом, фиг.6В изображает очищающую от сваренного яичного желтка эффективность GG36 CCL в детергенте для автоматической мойки посуды как функцию изменения заряда.

Фиг.7A изображает удельную ферментативную активность на крахмале BODIPY для AmyS-S242Q CCL как функцию изменения заряда. Подобным образом, фиг.7В изображает вязкость после разжижения кукурузного крахмала для вариантов поверхности заряда AmyS, охватывающих «лестницу» (лэддер) изменения заряда -12 - +4 относительно исходного фермента AmyS enzyme.

Фиг.8 изображает уровни экспрессии вариантов ASP в Bacillus subtilis как функцию изменения суммарного заряда относительно ASP дикого типа.

Фиг.9 изображает стабильность к LAS/EDTA вариантов FNA как функцию изменения суммарного заряда относительно исходного FNA.

Фиг.10 изображает термостабильность первой лестницы (лэддера) зарядов вариантов ASP как функцию изменения суммарного заряда относительно ASP дикого типа.

Фиг.11 изображает термостабильность первой лестницы (лэддера) зарядов вариантов AmyS как функцию изменения суммарного заряда относительно AmyS дикого типа.

Фиг.12 обеспечивает очищающую от рисового крах