Новая постоянная линия клеток человека

Новая постоянная линия клеток человека

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Заявленное изобретение относится к постоянной линии клеток человека, включающей полинуклеотидную последовательность для функций генов аденовируса Е1А и Е1В и полинуклеотидную последовательность для большого SV40 Т-антигена или ядерного антигена 1 (EBNA-1) вируса Эпштейна-Барра (ВЭБ). Кроме того, заявленное изобретение относится к способу транзиторной экспрессии рекомбинантных полипептидов и белков в упомянутой постоянной линии клеток человека.

Помимо бактерий, дрожжевых и растительных клеток, для получения рекомбинантных полипептидов и белков используют, в частности, животные клетки. В настоящее время, примерно 60-70% всех лечебных белков получают в клетках млекопитающих (Wurm, Nat. Biotechnology 22, 1393-1398, 2004). Получение рекомбинантных полипептидов или белков в клеточной культуре, т.е. в лабораторных условиях, для терапевтических, диагностических или технических целей могут осуществлять двумя различными способами. В стабильных, устойчивых или постоянных установившихся линиях клеток, нуклеиновая кислота, кодирующая заданный полипептид или белок, интегрирована в хромосомный ДНК клетки с, как минимум, одной копией и переносится вместе с набором клеточных хромосом дочерним клеткам при клеточном делении (так называемая стабильная экспрессия при получении линий клеток). Для получения данных стабильных продуктивных линий клеток необходимо, чтобы как минимум одна из нуклеиновых кислот, введенных в клетку путем трансфекции, несла бы такой генный фактор, который обладал бы преимуществами относительно селекции в клеточной культуре во время роста. Нуклеиновая кислота с таким генным фактором, с необязательным расположением на той же самой молекуле, что и кассета экспрессии для требуемого полипептида или белка. Упомянутый генный фактор представляет собой либо ген устойчивости к антибиотикам, либо ген устойчивости к химиотерапевтическим веществам (например, к тем, которые часто используют в клетках млекопитающих; Wurm, Nat. Biotechnology 22, 1393-1398, 2004), ген с генным продуктом с комплементарным действием в отношении дефектного метаболического пути (например, в дрожжевых клетках), или с трансформирующим генным фактором (для клеток-амниоцитов человека; Schiedner et al., BMC Biotechnology 8, 13, 2008). В данном случае гарантируют, что такие клетки со стабильной интеграцией трансфицированной нуклеиновой кислоты в хромосомную ДНК клетки и производящие упомянутый генный продукт, опережают в росте прочие клетки, не обладающие такой интеграцией, и селективны. При получении продуктивных клеток путем трансфекции в так называемой линии клеток-хозяев, с одной стороны, переносят нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинантный полипептид (так называемый трансген) вместе с необходимыми транскрипционными регуляторными элементами, а, с другой стороны, переносят вторую кассету экспрессии, в которой есть ген, кодирующий маркер выделения, чей генный продукт представляет определенное преимущество по параметрам селекции.

Несколькими днями позднее после переноса гена, во время которого культивируют клетки, например, в культуральной среде без реагента селекции, к среде добавляют подходящий реагент селекции. В присутствии упомянутого реагента селекции, выживают и растут только те клетки, которые интегрировали нуклеиновые кислоты, применяемые для трансфекции и экспрессии маркера. Традиционно используемыми маркерами выделения являются ген устойчивости к неомицину, ген устойчивости к гидромицину и дигидрофолатредуктазе (ДГФР) (Wurm, Nat. Biotechnology 22, 1393-1398, 2004; Wurm and Jordan, 309-333 in: Makrides (Hrsg.), Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, Elsevier, Amsterdam, 2003). Соответственно, селекцию осуществляют на культуральной среде с реагентами селекции, как, например, антибиотики неомицин или гидромицин и синтетический глюкокортикоидный метотрексат, соответственно. Обычно, клетки с маркером выделения и трансгеном, прошедшие процесс селекции и пролиферирующие (так называемые трансформанты), впоследствии выделяют (клонируют) для обеспечения генетической идентичности всех клеток в культуре, и разделения требуемых продуктивных линий клеток с наилучшими показателями (скоростью) произведения от менее продуктивных клеточных линий.

Как отличие, в случае так называемой транзиентной экспрессии, нуклеиновая кислота, введенная в клетку путем трансфекции и кодирующая требуемый полипептид или белок, не интегрирована в хромосомную ДНК клетки и, соответственно, не подвергается селекции по данному результату. Таким образом, концентрация введенной нуклеиновой кислоты, как правило, уменьшается и вовсе «размывается» в процессе деления клеток во время роста в культуре, что предполагает временный, переходный характер данного способа экспрессии. Выбор стабильных продуктивных линий клеток с хорошими параметрами эффективности экспрессии занимает несколько месяцев и является высокозатратным процессом, в то время, как при помощи транзиентной экспрессии в течение нескольких дней можно получить количества в объеме нескольких миллиграммов требуемого полипептида или белка. Скорость и затратность технического процесса являются важными факторами промышленного внедрения биофармацевтических и диагностических продуктов. Таким образом, транзиентную экспрессию белков в малых объемах или в различных вариативных сочетаниях белков осуществляют одновременно с проведением фундаментальных НИР с целью получения результатов ранних опытных и доклинических исследований, например, для целевой идентификации, количественного анализа, получения биохимических характеристик генных продуктов, с целью проведения последующих токсикологических и фармакокинетических (фармакодинамических) опытов (Baldi et al., Biotechnol. Lett. 29, 677-684, 2007; Pham et al., Molecular Biotechnology 34, 225-237, 2006). В отличие от этого, промышленное производство белков в объемах от нескольких граммов до килограммов с целью использования в дальнейших, более широкомасштабных клинических исследований и поставок на рынок в коммерческих объемах, фактически осуществляют с применением стабильных продуктивных линий клетох.

Например, в патенте ЕР 1948789 описан способ получения постоянной линии клеток-амниоцитов человека путем трансфекции клеточного трансформирующего фактора без применения маркера выделения.

Таким образом, секретируемые, мембраносвязанные и внутриклеточные белки могут получать при помощи способа транзиентной экспрессии генов. В настоящее время клетки млекопитающих традиционно применяют в качестве систем экспрессии при получении множества комплексных белков, в частности, в случае, когда упомянутые белки предназначены для использования в терапевтических целях, поскольку прокариотические и простые эукариотические клеточные системы (например, дрожжи) явно уступают по своим характеристикам по сравнению с посттрансляционными модификациями. На настоящий момент для транзиентной экспрессии белков, как правило, используют четыре линии клеток млекопитающих: COS-1 и COS-7 клетки, соответственно, производные от линии клеток CV-1, полученных из клеток почек африканской зеленой макаки; клетки ВНК, полученные из клеток почек детенышей хомяка; клетки СНО, полученные из яйцеклеток китайского хомяка; и клетки НЕК293, линия клеток, полученная из клеток почек человеческого эмбриона с нейронными характеристиками (Pham et al., Molecular Biotechnology 34, 225-237, 2006; Wurm et Bernard, Current Opinion in Biotechnology 10, 156-159, 1999). Транзиентная экспрессия в линиях клеток млекопитающих обычно основана на трансфекции плазмидного вектора, включающего кассету экспрессии с последовательностью, кодирующей требуемый генный продукт. Также, могут быть использованы вирусные экспрессирующие векторы, как, например, вирус леса Семлики или аденовирус, но, в то же время, данные вирусы имеют редкое применение вследствие их высокой затратности во временном плане и повышенных требований к технике безопасности при работе с ними (при одновременной несомненной эффективности). Разработан комплекс физических и химических способов исследований для передачи ДНК в культивируемые клетки млекопитающих. Физические методы генного переноса включают электропорацию, нуклеофекцию и микроинъекцию. При способах химической трансфекции, применяют неорганические вещества (например, одновременную преципитацию с фосфатом кальция/ДНК), катионные полимеры (например, полиэтиленимин, способ с диэтиламиноэтилдекстраном) или катионные липиды (так называемая липофекция). Наиболее часто используемыми реагентами для трансфекции переноса нуклеиновых кислот в больших объемах (до нескольких литров) являются фосфат кальция и полиэтиленимин (Baldi et al., Biotechnol. Lett. 29, 677-684, 2007).

Описанные способы транзиентной экспрессии полипептидов и белков, основанные на линиях клеток, широко известных в мировой практике, обладают рядом недостатков. Низкие показатели эффективности экспрессии представляют определенную проблему в сочетании со способами транзиентной (экспрессии). Для улучшения показателей эффективности выхода клеточной экспрессии, применяют различные генные системы, которые способствуют повышению числа (количества) генных копий в расчете на клетку путем эписомальной репликации введенной нуклеиновой кислоты. Клетки COS экспрессируют большой Т-антиген вируса обезьяны 40 (SV40), фактор репликации, оказывающий влияние на эписомальную репликацию на большом количестве плазмидных копий с точкой начала репликации SV40 (SV40 on). Начальной стадией упомянутой репликации является связывание Т-антигена с точкой начала репликации SV40 (SV40 ori), при котором факторы клеточной репликации привязаны к ДНК/Т-антигенному комплексу, а репликация индуцируется (вызывается) клеточной ДНК-полимеразой. Описаны два генетических варианта линии клеток НЕК293, полученной в ходе проведения испытания примерно 30 лет назад по трансформации клеток почек человеческого эмбриона с ослабленным типом аденовируса 5 ДНК, и показавшей приемлемые параметры по трансфицируемости. Упомянутые варианты также экспрессируют вышеуказанные большой Т-антиген SV40 (НЕК293Т) и ядерный антиген 1 (EBNA-1) (HEK293E or 293EBNA-1) вируса Эпштейна-Барра (ВЭБ), соответственно. Упомянутая линия клеток должна предоставлять эписомальную репликацию или амплификацию плазмид с SV40-ori и EBV-oriP, соответственно. Фактор репликации EBNA-1 взаимодействует в последнем случае с точкой начала репликации oriP EBV. Как минимум, в случае с клетками HEK293E, наблюдали повышение выхода экспрессии гена при помощи oriP, содержащего плазмиды экспрессии. В сравнении с использованием EBNA-1 в сочетании с точкой начала репликации oriP, некоторые исследования показывают, что в клетках НЕК293Т не наблюдается какой-либо значительной репликации плазмид с SV40-ori (Durocher et al. Nucleic Acid Research 30, e9, 2002). Был получен стабильный вариант клеток СНО, который экспрессирует большой Т-антиген (LT) полиомавируса (Epi-CHO) и который можно использовать в сочетании с плазмидой, несущей точку начала репликации полиомавируса (PyOri) (Kunaparaju et al„ Biotechnology and Bioengineering 91, 670-677, 2005). Значения выходов, определенные в пределах примерно 10-20 мг/литр, получены при помощи упомянутого способа транзиентной экспрессии рекомбинантных белков с использованием вышеуказанных систем клеток млекопитающих (Baldi et al., Biotechnol. Lett. 29, 677-684, 2007). В отличие от этого, выходы в пределах нескольких граммов на литр вполне достижимы с использованием стабильных, постоянных продуктивных линий клеток, как и упомянуто выше, тем не менее, при достаточно высоких временных и финансовых затратах.

Еще одним недостатком систем клеток, используемых для экспрессии рекомбинантных белков, является то, что некоторые линии клеток на самом деле подходят для транзиентной экспрессии, вследствие их способности легко подвергаться трансфекции и делать возможной амплификацию эписомальной плазмиды (например, клетки НЕК293Т или НЕК293Е), но для получения стабильных линий клеток, вследствие их свойств в культивировании и выходе (например, клетки СНО), более предпочтительно используют другие линии клеток. Тем не менее, поскольку системы клеток различаются друг от друга по некоторых аспектам посттрансляционной модификации, информация по структуре и функциям (свойствам) упомянутых генных продуктов, полученных для специфической клеточной системы после транзиентной экспрессии (в большинстве случаев, в раннюю фазу развития терапевтического белкового продукта) может передаваться только в очень ограниченном объеме в структуру и свойства упомянутых генных продуктов после экспрессии в стабильных линиях клеток четкой системы клеток (в большинстве случаев, в поздней стадии развития, в клинических испытаниях и промышленных объемах). Посттрансляционные модификации, как, например, гликозилирование, фосфорилирование, карбоксилирование, пальмитоилирование или специфические деградации имеют первостепенное значение для различных свойств продуктов экспрессии, применяемых в дальнейшем в качестве терапевтических продуктов. Они могут оказывать влияние на активность, растворимость, время полужизни, стабильность или иммуногенность. Таким образом, системы клеток человека играют все более существенную роль в получении терапевтических белков; только клетки человека в качестве продуктивного механизма представляют аутентичную, подобную человеческим клеткам, модификацию продуктов экспрессии и уменьшают вследствие этого риск ухудшения качества продукта или возникновения нежелательных побочных эффектов. К примеру, известно, что рекомбинантный эритропоэтин применяется в лечебных дозах при лечении заболеваний у человека, и то, что белок, производимый в клетках СНО (Эпоэтин Альфа, Epoetin Alpha) показывает по углеводородным концам цепочек фрагменты N-гликолилнейраминовой кислоты, в то время, как белок, производимый в клетках человека (Эпоэтин Дельта, Epoetin Delta) - как и натуральный эритропоэтин человека - не содержит таких сахарных компонентов. Исходя из того, что человеческий организм вырабатывает антитела к упомянутым «чужеродным» сахарным структурам, использование систем экспрессии на человеческих клетках представляется предпочтительным решением (Varki, Am. J. Phys. Anthropol. 33, 54-69, 2001). На настоящий момент, еще не разработаны системы клеток человека с идеальными параметрами для транзиентной экспрессии и получения стабильных продуктивных линий клеток, что, в свою очередь, позволяет получить повторяемый стабильный профиль конечного продукта в течение всего периода разработки терапевтического препарата на основе получаемого белка.

Клетки человека особенно хорошо подходят для получения биотерапевтических препаратов вследствие способности к экспрессии комплексных белков - в отличие от клеток других млекопитающих или клеток прочих животных - с аутентичной структурой посттрансляционной модификации. Структура гликолизирования комплексных рекомбинантных белков, а также структура и расположение сахарных остатков в молекуле, намного полнее воспроизводят структуру аутентичного полипептида человека в процессе получения в системах клеток человека, чем в системах с клетками не-человека. Упомянутая структура гликолизирования часто играет важнейшую роль для получения критически необходимых свойств полипептидов, таких, как биологическая активность, стабильность, растворимость и иммуногенность.

Таким образом, целью заявленного изобретения является предоставление системы клеток человека со сравнительно более подходящими параметрами для транзиентной экспрессии полипептидов и получения стабильных продуктивных клеточных линий.

Упомянутой цели достигают, придерживаясь способа, раскрытого в формуле заявленного изобретения.

Следующие фигуры иллюстрируют заявленное изобретение.

Фиг.1 представляет в схематическом виде сборку плазмид для постоянной экспрессии Т-антигена. В pGS158 (Фиг.1а) экспрессируют Т-антиген под контролем промотора человеческого ЦАГ (цитозин-аденин-гуанин) (гибридный промотор предраннего энхансера человеческого ЦМВ (цитомегаловируса) и модифицированного куриного D активного промотора с первым интроном) (Niwa et al., Gene 108: 193-199, 1991), в pGS159 (Фиг.16) под контролем промотора ВСР (вируса саркомы Рауса) (Makrides, 9-26 in: Makrides (Hrsg.), Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, Elsevier, Amsterdam, 2003) и в pGS161 (Фиг.1в) под контролем промотора ЦМВ человека (цитомегаловируса) (Makrides, 9-26 in: Makrides (Hrsg.), Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, Elsevier, Amsterdam, 2003).

Фиг.2 представляет в схематическом виде сборку плазмид для транзиентной экспрессии человеческого альфа-1-антитрипсина (чАТ) и человеческого эритропоэтина (ЭПО), соответственно, в каждом случае под контролем промотора человеческого ЦМВ. Плазмида pGS116 (Фиг.2а) и pGS151 (Фиг.2б) содержит идентичные кассеты экспрессии для чАТ, а pGS151 дополнительно содержит точку начала репликации ДНК вируса обезьяны 40 (SV40 ori). К тому же, pGS177 содержит точку начала репликации SV40, в дополнение к кассете экспрессии ЭПО.

Фиг.3 представляет в схематическом виде количество чАТ в супернатанте культуры, транзиентно экспрессируемой в различных линиях клеток-амниоцитов, экспрессирующих Т-антиген (САР-Т Z582, Z583 и Z597) в сравнении с родительской линией клеток-амниоцитов (CAP) без экспрессии Т-антигена. В Z582 экспрессируют Т-антиген под контролем промотора CAG (Niwa et al., Gene 108: 193-199, 1991), в Z583 под контролем промотора RSV (вируса саркомы Рауса) (Makrides, 9-26 in: Makrides (Hrsg.), Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, Elsevier, Amsterdam, 2003) и в Z597 под контролем промотора ЦМВ (Makrides, 9-26 in: Makrides (Hrsg.), Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, Elsevier, Amsterdam, 2003).

Фиг.4 представляет в схематическом виде количество транзиентно экспрессируемого чАТ (обозначено столбиками) в супернатанте культуры и количество живых клеток (обозначено линиями) в различные моменты времени после трансфекции плазмиды без точки начала репликации SV40 on (чАТ/количество клеток - ori, плазмида pGS116) и с точкой начала репликации SV40 ori (чАТ/количество клеток + ori, pGS151), соответственно.

Фиг.5 представляет в схематическом виде количество транзиентно экспрессируемого чАТ (обозначено столбиками) в супернатанте культуры и количество живых клеток (обозначено линиями) в различные моменты времени после трансфекции pGS151 (с SV40 ori) с клетками САР-Т и НЕК293Т.

Фиг.6 представляет в схематическом виде внутриклеточную копийность плазмид pGS116 (без SV40 ori) и pGS151 (с SV40 ori), соответственно, в различные моменты времени после трансфекции в клетках САР-Т и НЕК293-Т.

Фиг.7 представляет в схематическом виде количество транзиентно экспрессируемых чАТ (обозначено столбиками) в супернатанте культуры и количество живых клеток (обозначено линиями) в различные моменты времени после трансфекции pGS151 (с SV40 ori) в САР-Т с полиэтиленимином (ПЭИ) в качестве реагента трансфекции.

Термин «амниоциты», в том значении, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится в самом широком смысле ко всем клеткам, которые присутствуют в амниотической жидкости, и могут быть изъяты путем амниоцентеза. Эти клетки происходят либо из амниона, либо тканей плода, соприкасающихся с амниотической жидкостью. По морфологическому признаку, амниоциты подразделяют на три основных класса: фибробластоподобные клетки (Ф-клетки), эпителиоидные клетки (Э-клетки) и клетки амниотической жидкости (АЖ-клетки) (Hohn et al., Pediat. Res. 8: 746-754, 1974). АЖ-клетки являются доминирующим классом.

Термин «кассета экспрессии», в частности, относится к молекуле нуклеиновой кислоты и области около молекулы нуклеиновой кислоты, соответственно, содержащие регуляторный элемент или промотор с расположением впереди кодирующей области, кодирующую область и открытую рамку считывания, соответственно, а также терминирующий элемент транскрипции с расположением позади кодирующей области. Регуляторный элемент и промотор, располагаясь, соответственно, впереди кодирующей области, могут быть конститутивными, т.е., промотер, перманентно активирующий транскрипцию (например, ЦМВ промотор), или регулируемый промотор, т.е.. промотор, который можно включать и/или выключать (например, регулируемый промотор тетрациклина). Кодирующая область кассеты экспрессии может представлять собой непрерывную открытую рамку считывания, как в случае с кДНК с инициирующим кодоном в 5' конце и стоп-кодоном в 3' конце. Кодирующая область также может состоять из геномной или заново комбинированного расположения кодирующих экзонов и рассеянных некодирующих интронов. Тем не менее, кодирующая область кассеты экспрессии может состоять из нескольких открытых рамок считывания, разделенных так называемыми УВПР (участки внутренней посадки рибосомы).

Термин «постоянные линии клеток», в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к клеткам, подвергнутым генетической модификации таким образом, что они могут продолжать расти перманентно в клеточной культуре при стабильных условиях культуры. Такие клетки также получили название «иммортализованных».

Термин «полипептид» или «рекомбинантный полипептид», в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к пептидам, состоящим как минимум из 2 аминокислот. Полипептид можно модифицировать как во время, так и после трансляции, например, путем присоединения сахарных остатков или модификацией аминокислотных остатков. Полипептид может быть линейным, кольцевым или разветвленным. Более того, полипептид может состоять из более чем одной аминокислотной цепочки, причем цепи могут присоединять более или менее комплексные трехмерные структуры при помощи внутри- и/или or межмолекулярных связей (например, вторичные, третичные, четвертичные структуры). Если полипептид состоит из одной аминокислотной цепи, он может присоединять более или менее комплексные трехмерные структуры также при помощи внутримолекулярных связей. Полипептиды могут представлять собой фармакологически или иммунологически активные полипептиды или полипептиды, используемые в диагностических целях.

Термин «зародышевые клетки», в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к клеткам, которые были получены путем прямого изъятия (удаления) из организма или ткани и помещены в культуру. Зародышевые клетки имеют очень ограниченную продолжительность жизни.

Термин «продуктивные линии клеток», в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к постоянным линиям клеток, подвергнутых генетически стабильной модификации путем введения трансгена, кодирующего требуемый полипептид.

Термин «метилированный кэп» («CAP»), в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к постоянной линии амниоцитов человека, полученной путем иммортализации зародышевых амниоцитов человека с факторами гена аденовируса Е1А и Е1В.

Термин «метилированный кэп-Т» («САР-Т»), в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к CAP-клеткам, которые в дополнение были подвергнуты стабильной трансфекции с молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность большого SV40 Т-антигена.

Термин «трансфекция», в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к любому способу, подходящему для введения упомянутой нуклеиновой кислоты (кислот) в клетки. В качестве примеров традиционного практического применения (в т.ч., в сочетании) можно привести способ кальциево-фосфатный, электропорацию, липосомальные системы различных типов.

Термин «транзиентная экспрессия», в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к любому способу, при котором нуклеиновую кислоту (кислоты) вводят в клетку путем трансфекции без выбора (селекции) стабильных линий клеток при помощи приемлемого метода выбора, причем упомянутые стабильные линии клеток можно впоследствии постоянно культивировать в клеточной среде.

Термин «стабильная экспрессия», в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к экспрессии трансгена в продуктивных линиях клеток.

Термин «трансген», в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей рекомбинантный полипептид.

Объект заявленного изобретения относится к способу получения постоянной линии клеток человека, который включает следующие этапы:

а) трансфекцию зародышевых клеток-амниоцитов человека с молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую функции генов аденовирусов Е1А и Е1В; так называемая 1. трансфекция, и

б) последующую трансфекцию постоянной линии клеток-амниоцитов человека, полученной в этапе а), с молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую большой SV40 Т-антиген, так называемая 2. трансфекция.

Более предпочтительно, упомянутая молекула нуклеиновой кислоты в этапе б) способа получения постоянной линии клеток человека в соответствии с заявленным изобретением содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей несекретирующую форму большого SV40 Т-антигена.

В течение этапа трансфекции б) способа в соответствии с заявленным изобретением, постоянную линию клеток человека подвергают альтернативной трансфекции с молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую ядерный антиген 1 (EBNA-1) вируса Эпштейна-Барра (ВЭБ), так называемая 2. трансфекция. Более предпочтительно, упомянутая молекула нуклеиновой кислоты включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую несекретирующую форму ядерного антигена 1 (EBNA-1) вируса Эпштейна-Барра (ВЭБ).

Путем трансфекции, осуществляемой в соответствии со способом согласно заявленному изобретению, упомянутые зародышевые клетки человека более предпочтительно стабильно трансфицируют, т.е. трансфицированную ДНК интегрируют (встраивают) в геном клетки. Клетки иммортализуют путем трансфекции упомянутых зародышевых клеток человека с молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие Е1А и Е1В. Молекула нуклеиновой кислоты, используемая для иммортализации упомянутых зародышевых клеток человека, содержит последовательности нуклеиновых кислот для Е1А и Е1В, более предпочтительно получаемые из аденовирусов человека, в частности, серотипа 5 человеческого аденовируса. В более предпочтительном варианте практического воплощения заявленного изобретения, молекула нуклеиновой кислоты, используемая для иммортализации, содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фактор (функцию) pIX гена аденовируса, в дополнение к последовательностям нуклеиновых кислот, кодирующих Е1А и Е1В. Полипептид pIX, вирусный структурный белок, выполняет роль транскрипционного активатора на различных вирусных и клеточных промоторах, как, например, тимидинкиназа и промотор бета-глобина. Типовую последовательность можно найти в GenBank асе. no. X02996. В частности, молекулы нуклеиновых кислот содержат нуклеотиды с 1 по 4344 (SEQ ID NO:1 содержит последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие Е1А, Е1В и pIX), с 505 по 3522 (SEQ ID NO:2 содержит последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие Е1А и Е1В) или нуклеотиды с 505 по 4079 (SEQ ID NO:3 последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие Е1А, Е1В and pIX) серотипа 5 аденовируса человека.

В частности, клетки человека трансфицируют (трансфектируют) с последовательностями нуклеиновых кислот, кодирующими требуемый генный фактор (функцию гена), который необходимо экспрессировать, в форме кассеты экспрессии. Упомянутая кассета экспрессии содержит молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую регуляторный элемент или промотор, располагаемый впереди кодирующей области, кодирующую область и открытую рамку считывания, соответственно, а также терминирующий элемент транскрипции, расположенный позади кодирующей области.

В частности, в одном из вариантов практического воплощения заявленного изобретения, кассета экспрессии или молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты для большого SV40 Т-антигена (SEQ ID NO: 4), последовательность нуклеиновой кислоты для промотора, выбираемого из групп ЦМВ промотора (SEQ ID NO:5), ЦАГ промотора (Niwa et al., Gene 108: 193-199, 1991) и ВСР промотора (GenBank acc. no. DQ075935), последовательность для SV40 SD/SA (интрон) (SEQ ID NO:6) и последовательность нуклеиновой кислоты для SV40 polyA (SEQ ID NO:7).

В еще одном из вариантов практического воплощения заявленного изобретения, кассета экспрессии или молекула нуклеиновой кислоты содержит, в частности, последовательность нуклеиновой кислоты для ядерного антигена 1 (EBNA-1) вируса Эпштейна-Барра (ВЭБ) (SEQ ID NO:8), последовательность нуклеиновой кислоты для промотора, выбираемого из группы ЦМВ промотора (SEQ ID NO:5), ЦАГ промотора (Niwa et al., Gene 108: 193-199, 1991) и ВСР промотора (GenBank асе. по. DQ075935), последовательность нуклеиновой кислоты для SV40 SD/SA (интрон) (SEQ ID NO:6) и последовательность нуклеиновой кислоты для SV40 polyA (SEQ ID NO:7).

Зародышевые клетки человека получают путем прямого изъятия (удаления) из организма или ткани, изъятой из организма и помещенной в культуральную среду. Более предпочтительными являются такие зародышевые клетки организма, которые можно эффективно превратить в постоянные линии клеток человека путем экспрессии аденовирусных Е1А и Е1В, в частности, например, клетки-амниоциты, клетки сетчатки эмбрионов и эмбрионные клетки нейронного происхождения.

Более предпочтительно, постоянные линии клеток-амниоцитов человека получают согласно способу в соответствии с заявленным изобретением.

Способ в соответствии с заявленным изобретением также можно осуществить с использованием традиционных иммортализованных линий клеток вместо этапа а), в частности, с уже имеющимимся иммортализованными линиями клеток-амниоцитов человека, с последовательностями нуклеиновых кислот для функций генов аденовирусов Е1А и Е1В в своем геноме. Более предпочтительно, иммортализованные линии клеток содержат последовательности нуклеиновых кислот для функций генов аденовирусов Е1А, Е1В и pIX в своем геноме. Уже существующие иммортализованные линии клеток человека, в частности, иммортализованные линии клеток-амниоцитов человека, трансфицируют по мере надобности с вышеупомянутой молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей кассету экспрессии, кодирующую большой SV40 Т-антиген или ядерный антиген 1 (EBNA-1) вируса Эпштейна-Барра (ВЭБ). Специалисту в данной области техники понятно, что 2. трансфекция, относительно временного параметра, зависит от 1. трансфекции зародышевой клетки человека только в том, что ее необходимо осуществить после 1. трансфекции. Не является обязательным тот факт, что 2. трансфекция проводится синхронно после 1. трансфекции. Так, например, также иммортализованные линии клеток человека, подвергнутые иммортализации с Е1А и/или Е1В и стабилизированные по истечении нескольких лет, можно трансфицировать по мере надобности с вышеупомянутой молекулой нуклеиновой кислоты в этапе 2. трансфекции. Более предпочтительно, с данной целью используют иммортализованные клетки-амниоциты человека, иммортализованные клетки сетчатки эмбриона человека, в частности клетки PER.C6, или иммортализованные клетки человеческого эмбриона нейронного происхождения, в частности, клетки НЕК 293.

Объект заявленного изобретения относится к постоянной линии клеток человека, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты для функций генов аденовирусов Е1А и Е1В и последовательность нуклеиновой кислоты для большого SV40 Т-антигена или ядерного антигена 1 (EBNA-1) вируса Эпштейна-Барра (ВЭБ). Предпочтительно, заявленное изобретение относится к постоянной линии клеток человека, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты для функций генов аденовирусов Е1А, Е1В и pIX и последовательность нуклеиновой кислоты для большого SV40 Т-антигена или ядерного антигена 1 (EBNA-1) вируса Эпштейна-Барра (ВЭБ). Более предпочтительно, заявленное изобретение относится к постоянной линии клеток-амниоцитов человека, содержащей последовательности нуклеиновых кислот для функций генов аденовирусов Е1А и Е1В и последовательности нуклеиновых кислот для большого SV40 Т-антигена или ядерного антигена 1 (EBNA-1) вируса Эпштейна-Барра (ВЭБ). Наиболее предпочтительно, заявленное изобретение относится к постоянной линии клеток-амниоцитов человека, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты для функций генов аденовирусов Е1А, Е1В и pIX и последовательность нуклеиновой кислоты для большого SV40 Т-антигена или ядерного антигена 1 (EBNA-1) вируса Эпштейна-Барра (ВЭБ).

В частности, также, объект заявленного изобретения относится к постоянной линии клеток человека, предпочтительно, постоянной линии клеток-амниоцитов человека, полученной с применением способа в соответствии с заявленным изобретением.

Кроме того, объект заявленного изобретения относится к способу транзиентной экспрессии рекомбинантных полипептидов или белков, с применением постоянной линии клеток человека в соответствии с заявленным изобретением, причем упомянутый способ включает следующие этапы:

а) трансфекцию упомянутой постоянной линии клеток человека с молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую требуемый рекомбинантный полипептид или белок, и сайт рестрикции (распознавания) или связывания для большого SV40 Т-антигена или ядерного антигена 1 (EBNA-1) вируса Эпштейна-Барра (ВЭБ),

б) культивирование трансфицированной постоянной линии клеток человека, полученной в этапе а) при условиях, позволяющих осуществлять экспрессию упомянутых требуемых рекомбинантных полипептида или белка, и, последующий этап

в) изолирования упомянутых требуемых рекомбинантных полипептида или белка от клеток или от супернатанта культуры.

Предпочтительный вариант практического воплощения заявленного изобретения относится к способу транзиентной экспрессии рекомбинантных полипептидов или белков, с применением постоянной линии клеток-амниоцитов человека в соответствии с заявленным изобретением, причем упомянутый способ включает следующие этапы:

а) трансфекцию упомянутой постоянной линии клеток-амниоцитов человека с молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую требуемый рекомбинантный полипептид или белок, и сайт рестрикции (распознавания) или связывания для большого SV40 Т-антигена или ядерного антигена 1 (EBNA-1) вируса Эпштейна-Барра (ВЭБ),

б) культивирование трансфицированной постоянной линии клеток-амниоцитов человека, полученной в этапе а) при условиях, позволяющих осуществлять экспрессию упомянутых требуемых рекомбинантных полипептида или белка, и, последующий этап

в) изолирования упомянутых требуемых рекомбинантных полипептида или белка от клеток или от супернатанта культуры.

В случае, если постоянная линия клеток человека в соответствии с заявленным изобретением содержит молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую большой SV40 Т-антиген, линию клеток, к примеру, трансфицируют с плазмидой экспрессии, включающим кассету экспрессии или молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую экспрессируемый трансген и точку начала репликации SV40 (SV40 ori). Большой SV40 Т-антиген, после стабильной внутриклеточной экспрессии в линии клеток, связывается с точкой начала репликации SV40 плазмиды экспрессии, вводимого путем трансфекции в линию клеток, и вызывает эписомальную репликацию плазмиды экспрессии, и, таким образом, осуществляют амплификацию числа копий экспрессируемого трансгена. Требуемый генный продукт, кодируемый трансгеном, можно получить из клеток или из супернатанта культуры, после культивирования клеток в течение нескольких дней. Таким образом, транзиентно экспрессируют упомянутый трансген.

В случае, если постоянная линия клеток человека в соответствии с заявленным изобретением содержит молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую ядерный антиген 1 (EBNA-1) вируса Эпштейна-Барра (ВЭБ), линию клеток, к примеру, трансфицируют с плазмидой экспрессии, включающим кассету экспрессии или молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую экспрессируемый трансген и точку начала репликации ВЭБ (EBV oriP) (Durocher et al., Nucleic Acids Research Vol.30 Nr. 2 e9, 2002; Tuvesson et al. Cytote