Лечение заболеваний, связанных с фактором роста эндотелия сосудов (vegf), посредством ингибирования природного антисмыслового транскрипта к vegf

Лечение заболеваний, связанных с фактором роста эндотелия сосудов (vegf), посредством ингибирования природного антисмыслового транскрипта к vegf

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестная ссылка

Настоящая заявка испрашивает приоритет предварительной заявки на патент США 61/119957, поданной 4 декабря 2008 года, которая полностью включена в настоящую заявку ссылкой.

Область техники, к которой относится изобретение

Варианты осуществления изобретения включают олигонуклеотиды, модулирующие экспрессию и/или функции VEGF и ассоциированных молекул.

Уровень техники

ДНК-РНК и РНК-РНК гибридизация важна для многих аспектов функции нуклеиновых кислот, включая репликацию ДНК, транскрипцию и трансляцию. Гибридизация также является основой для разнообразных технологий, которые направлены либо на обнаружение специфической нуклеиновой кислоты или изменение ее экспрессии. Антисмысловые нуклеотиды, например, прерывают экспрессию генов при гибридизации с РНК-мишенью, нарушая, таким образом, сплайсинг РНК, транскрипцию, трансляцию и репликацию. Антисмысловая ДНК обладает дополнительным свойством, которое состоит в том, что ДНК-РНК гибриды служат субстратом для расщепления рибонуклеазой H, которая присутствует в большинстве типов клеток. Антисмысловые молекулы можно вводить в клетки, как в случае олигодезоксинуклеотидов (ODNs), или они могут экспрессироваться с эндогенных генов в виде молекул РНК. Управление FDA недавно одобрило антисмысловое лекарственное средство VITRAVENE™ (для лечения цитомегаловирусного ретинита), что отражает то, что антисмысловые олигонуклеотиды обладают терапевтической применимостью.

Сущность изобретения

Данный раздел предоставляется в целях изложения изобретения для краткого указания сущности изобретения. Данный раздел представляется с пониманием того, что он не будет использоваться для интерпретации или ограничения объема или значения формулы изобретения.

В одном варианте осуществления изобретение обеспечивает способы ингибирования действия природного антисмыслового транскрипта посредством применения антисмыслового олигонуклеотида (олигонуклеотидов), направленного на любую область природного антисмыслового транскрипта, что приводит к апрегуляции соответствующего смыслового гена. В настоящей заявке также рассматривается, что ингибирование природного антисмыслового транскрипта может быть достигнуто с помощью миРНК, рибозимов и низкомолекулярных соединений, которые, как предполагают, включены в объем настоящего изобретения.

Один вариант осуществления обеспечивает способ модуляции функции и/или экспрессии VEGF полинуклеотида в клетках или тканях пациента, in vivo или in vitro, включающий контакт указанных клеток или тканей с антисмысловым олигонуклеотидом длиной 5-30 нуклеотидов, где указанный олигонуклеотид обладает, по меньшей мере, 50% идентичности последовательности с обратным комплементом полинуклеотида, включающего 5-30 последовательных нуклеотидов в пределах 1-643 нуклеотидов из SEQ ID NO: 2 или 1-513 нуклеотидов из SEQ ID NO: 3 (Фиг. 3), с модуляцией, таким образом, функции и/или экспрессии полинуклеотида VEGF в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro.

В другом предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид направлен на природные антисмысловые последовательности VEGF полинуклеотидов, например, нуклеотидов, приведенных в SEQ ID NO: 2 и 3, а также их любых вариантов, аллелей, гомологов, мутантов, производных, фрагментов и комплементарных последовательностей. Примеры антисмысловых олигонуклеотидов представлены как SEQ ID NO: 4-9 (Фиг. 4).

Другой вариант осуществления обеспечивает способ модуляции функции и/или экспрессии VEGF полинуклеотида в клетках или тканях пациента, in vivo или in vitro, включающий контакт указанных клеток или тканей с антисмысловым олигонуклеотидом длиной 5-30 нуклеотидов, где указанный олигонуклеотид обладает, по меньшей мере, 50% идентичности последовательности с обратным комплементом антисмыслового VEGF полинуклеотида, с модуляцией, таким образом, функции и/или экспрессии VEGF полинуклеотида в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro.

Другой вариант осуществления обеспечивает способ модуляции функции и/или экспрессии VEGF полинуклеотида в клетках или тканях пациента, in vivo или in vitro, включающий контакт указанных клеток или тканей с антисмысловым олигонуклеотидом длиной 5-30 нуклеотидов, где указанный олигонуклеотид обладает, по меньшей мере, 50% идентичности последовательности с антисмысловым олигонуклеотидом к антисмысловому VEGF полинуклеотиду, с модуляцией, таким образом, функции и/или экспрессии VEGF полинуклеотида в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro.

В предпочтительном варианте осуществления композиция включает один или более антисмысловых олигонуклеотидов, которые связываются со смысловыми и/или антисмысловыми VEGF полинуклеотидами.

В другом предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотиды включают один или более модифицированных или замещенных нуклеотидов.

В другом предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотиды включают одну или более модифицированных связей.

В еще одном варианте осуществления модифицированные нуклеотиды включают модифицированные основания, включающие фосфоротиоат, метилфосфонат, пептид-нуклеиновые кислоты, 2'-O-метил, фтор- или углерод, метилен или другие молекулы блокированных нуклеиновых кислот (LNA). Предпочтительно, модифицированные нуклеотиды представляют собой молекулы блокированной нуклеиновой кислоты, включая α-L-LNA.

В другом предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотиды вводят пациенту подкожно, внутримышечно, внутривенно или внутрибрюшинно.

В другом предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотиды вводят в фармацевтической композиции. Схема лечения включает введение пациенту антисмысловых соединений, по меньшей мере, однократно; впрочем, указанная схема лечения может быть изменена с включением нескольких доз в течение некоторого периода времени. Лечение может быть скомбинировано с одним или более другими типами терапий.

В другом предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотиды инкапсулированы в липосоме или присоединены к молекуле-носителю (например, холестерину, TAT-пептиду).

Другие аспекты описаны ниже.

Краткое описание фигур

Фиг. 1:

Фиг. 1A и 1B: является графиком результатов ПЦР в реальном времени, на котором показан уровень изменения + стандартное отклонение мРНК VEGF после обработки клеток HepG2 фосфотиоатными олигонуклеотидами, введенными с использованием Lipofectamine 2000, по сравнению с контролем. Результаты ПЦР в реальном времени показывают, что уровни мРНК VEGFA в клетках HepG2 значительно увеличивались через 48 ч после обработки с применением одной из миРНК, соданных к vegfaas (vefaas1_2, P=0,05), и, возможно со второй, vefaas1_3 (P=0,1, Фиг. 1A). В тех же образцах уровни РНК vegfaas значительно снижались после обработки с использованием vefaas1_2 или vefaas1_3, но не изменялись после обработки с использованием vefaas1_5, которая также не оказывала влияния на уровни мРНК VEGFA (Фиг. IB). Столбики, обозначенные как vegfas1_2, vegfas1_3, vegfas1_5, соответствуют образцам, обработанным с применением SEQ ID NO: 4, 5 и 6, соответственно.

Фиг. 1C: Фиг. 1 является графиком результатов ПЦР в реальном времени, на котором показан уровень изменения + стандартное отклонение мРНК VEGF после обработки клеток HepG2 фосфотиоатными олигонуклеотидами, введенными с использованием Lipofectamine 2000, по сравнению с контролем. Результаты ПЦР в реальном времени показывают, что уровни мРНК VEGFA в клетках HepG2 значительно увеличились через 48 ч после обработки двумя миРНК, созданными к vegRas (vegRas1_2, P=0,02 и vegRas1_3, P=0,06). Результаты изменения уровней РНК vegRas ожидаются. Столбики, обозначенные как vegRas1_2, vegRas1_3, vegRas1_5, соответствуют образцам, обработанным с применением SEQ ID NO: 7, 8 и 9, соответственно.

На Фиг. 2 показана SEQ ID NO: 1: Фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) Homo sapiens, вариант транскрипта 1, мРНК, (регистрационный номер NCBI NM_001025366.1) и SEQ ID NO: 1а: геномная последовательность VEGF (экзоны показаны заглавными буквами, интроны - строчными).

На Фиг. 3 показана SEQ ID NO: 2: Природная антисмысловая последовательность VEGF (регистрационный номер NCBI BI045995) SEQ ID NO: 3: Природная антисмысловая последовательность VEGR (регистрационный номер NCBI BF829784).

На Фиг. 4 показаны антисмысловые олигонуклеотиды, SEQ ID NO: 4-6, созданные к природной антисмысловой последовательности VEGF.

На Фиг. 5 показаны антисмысловые олигонуклеотиды, SEQ ID NO: 7-9, созданные к природной антисмысловой последовательности VEGR.

На Фиг. 6 показана целевая последовательность экзона 1 VEGFA (SEQ ID NO: 10); последовательности прямого праймера (SEQ ID NO: 11 и 12), последовательности обратного праймера (SEQ ID NO: 13 и 14) и репортерные последовательности (SEQ ID NO: 15 и 16) для специализированных анализов, разработанных Applied Biosystems (анализ экспрессии генов Taqman (Hs00173626_m1).

Подробное описание

Некоторые аспекты изобретения описаны ниже со ссылкой на примеры применения для иллюстрации. Следует понимать, что многочисленные конкретные детали, отношения и способы изложены в целях обеспечения полного понимания изобретения. Впрочем, средний специалист в данной области техники с легкостью сумеет понять, что изобретение может быть осуществлено без одной или более конкретных деталей или с применением других способов. Настоящее изобретение не ограничивается определением порядка действий или процессов, поскольку некоторые действия могут происходить в различном порядке и/или одновременно с другими действиями или процессами. Кроме того, не все проиллюстрированные действия или процессы требуются для осуществления методологии согласно настоящему изобретению.

Все гены, названия генов и продукты генов, раскрытые в настоящей заявке, соответствуют гомологам из любых видов, для которых являются применимыми композиции и способы, раскрытые в настоящей заявке. Таким образом, указанные термины включают, помимо прочего, гены и продукты генов людей и мышей. Необходимо понимать, что в случае, когда описывается ген или продукт гена из конкретного вида, данное описание служит исключительно в качестве примера, и не должно быть истолковано как ограничение, если из контекста, в котором оно появляется, прямо не следует иное. Таким образом, например, что касается генов, раскрытых в настоящей заявке, которые в некоторых вариантах осуществления относятся к последовательностям нуклеиновых кислот и аминокислотным последовательностям млекопитающих, они охватывают гомологичные и/или ортологичные гены и продукты генов из других животных, включая, помимо прочего, других млекопитающих, рыб, амфибий, рептилий и птиц. В предпочтительных вариантах осуществления гены или последовательности нуклеиновых кислот являются человеческими.

Определения

Терминология, используемая в настоящей заявке, служит исключительно для описания конкретных вариантов осуществления и не должна ограничивать изобретение. Используемые в тексте настоящего описания существительные единственного числа, также включают формы множественного числа, если из контекста прямо не следует иное. Кроме того, в тех случаях, когда термины "включая", "включает", "имеющий", "имеет", "с" или их варианты используются в подробном описании и/или формуле изобретения, такие термины следует рассматривать как включительные, подобно термину "включающий".

Термин "приблизительно" или "около" означает, в пределах приемлемого диапазона ошибки, конкретное значение, как определяется средним специалистом в данной области техники, которое частично будет зависеть от того, каким способом измеряют или определяют значение, то есть, от ограничений системы измерения. Например, "приблизительно" может означать диапазон в пределах 1 или более чем 1 стандартного отклонения, как принято на практике. В альтернативе, "приблизительно" может означать диапазон до 20%, предпочтительно до 10%, более предпочтительно до 5% и еще более предпочтительно до 1% от данного значения. В альтернативе, особенно в отношении биологических систем или процессов, термин может означать диапазон в пределах 10-кратного, предпочтительно в пределах 5-кратного и более предпочтительно в пределах 2-кратного значения. В тех случаях, когда в заявлении и формуле описаны конкретные значения, если не указано иное, термин "приблизительно" следует применять со значением, указывающим пределы приемлемого диапазона ошибки для конкретного значения.

Используемый в настоящей заявке термин "мРНК" означает известный в настоящий момент мРНК транскрипт(ы) целевого гена, а также любые другие транскрипты, которые могут быть выявлены.

Под "антисмысловыми олигонуклеотидами" или "антисмысловым соединением" понимается молекула РНК или ДНК, которая связывается с другой РНК или ДНК (РНК-, ДНК-мишенью). Например, если она является РНК олигонуклеотидом, она связывается с другой РНК-мишенью посредством РНК-РНК взаимодействий и изменяет активность РНК-мишени (Eguchi et al., (1991) Ann. Rev. Biochem. 60, 631-652). Антисмысловой олигонуклеотид может повышать или понижать экспрессию и/или функцию специфического полинуклеотида. Подразумевается, что данное определение включает любую чужеродную молекулу РНК или ДНК, которая является полезной с терапевтической, диагностической или другой точки зрения. Такие молекулы включают, например, молекулы антисмысловой РНК или ДНК, интерферирующие РНК (РНКи), микро-РНК, РНК молекулы-ловушки, миРНК, ферментативную РНК, терапевтическую редактирующую РНК, а также агонистическую и антагонистическую РНК, антисмысловые олигомерные соединения, антисмысловые олигонуклеотиды, олигонуклеотиды внешних вспомогательных последовательностей (EGS), альтернативные сплайсеры, праймеры, зонды и другие олигомерные соединения, которые гибридизуются, по меньшей мере, с частью целевой нуклеиновой кислоты. Таким образом, указанные соединения могут быть представлены в форме однонитевых, двунитевых, частично однонитевых или кольцевых олигомерных соединений.

В рамках настоящего изобретения термин "олигонуклеотид" относится к олигомеру или полимеру рибонуклеиновой кислоты (РНК) или дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) или их миметикам. Термин "олигонуклеотид" также включает линейные или кольцевые олигомеры природных и/или модифицированных мономеров или связей, включая дезоксирибонуклеозиды, рибонуклеозиды, их замещенные и альфа-аномерные формы, пептид-нуклеиновые кислоты (ПНК), блокированные нуклеиновые кислоты (LNA), фосфоротиоат, метилфосфонат и т.п. Олигонуклеотиды способны специфично связываться с полинуклеотидом-мишенью благодаря регулярной структуре мономер-мономерных взаимодействий, например, спариванию оснований Уотсона-Крика, спариванию оснований Хугстина или обратных пар оснований Хугстина и т.п.

Олигонуклеотид может быть "химерным", то есть, составленным из различных областей. В рамках настоящего изобретения "химерные" соединения являются олигонуклеотидами, которые содержат две или более химических областей, например, ДНК область(и), РНК область(и), ПНК область(и) и т.д. Каждая химическая область состоит, по меньшей мере, из одной мономерной единицы, то есть, нуклеотида, в случае олигонуклеотидного соединения. Указанные олигонуклеотиды обычно включают, по меньшей мере, одну область, в которой олигонуклеотид модифицирован с целью проявления одного или нескольких требуемых свойств. Требуемые свойства олигонуклеотида включают, помимо прочего, например, повышенную устойчивость к расщеплению нуклеазами, повышенный клеточный захват и/или повышенную аффинность связывания с целевой нуклеиновой кислотой. Различные области олигонуклеотида, таким образом, могут обладать различными свойствами. Химерные олигонуклеотиды настоящего изобретения могут быть сформированы в виде смешанных структур из двух или более олигонуклеотидов, модифицированных олигонуклеотидов, олигонуклеозидов и/или аналогов олигонуклеотидов, как описано выше.

Олигонуклеотид может состоять из областей, которые могут быть связаны в "регистре", то есть, когда мономеры связаны последовательно, как в нативной ДНК, или связаны через спейсеры. Спейсеры формируют ковалентный "мостик" между областями и в предпочтительных случаях имеют длину, не превышающую приблизительно 100 атомов углерода. Спейсеры могут нести различные функциональные группы, например, имеющие положительный или отрицательный заряд, обладающие специальными связывающими свойствами в отношении нуклеиновой кислоты (интеркаляторы, соединения, связывающиеся по бороздкам нуклеиновой кислоты, токсины, флуорофоры и т.д.), являющиеся липофильными, вызывающие образование специальных вторичных структур, как, например, аланинсодержащие пептиды, которые индуцируют формирование альфа-спиралей.

Используемые в настоящей заявке "VEGF" и "фактор роста эндотелия сосудов" включают всех представителей семейства, мутанты, аллели, фрагменты, виды, кодирующие и некодирующие последовательности, смысловые и антисмысловые полинуклеотидные цепи и т.д.

Используемые в настоящей заявке слова Фактор роста эндотелия сосудов A, VEGF, VEGFA используются в настоящем описании попеременно.

Используемые в настоящей заявке термины "олигонуклеотид, специфичный к" или "олигонуклеотид, направленный на", относятся к олигонуклеотиду, которые имеет последовательность: (i) способную формировать стабильный комплекс с частью целевого гена или (ii) способную формировать стабильный дуплекс с частью мРНК транскрипта целевого гена. Стабильность комплексов и дуплексов может быть определена с помощью теоретических вычислений и/или in vitro анализов. Примерные анализы для определения стабильности гибридизационных комплексов и дуплексов описаны в Примерах ниже.

Используемый в настоящей заявке термин "целевая нуклеиновая кислота" охватывает ДНК, РНК (включая пре-мРНК и мРНК), транскрибированную с такой ДНК, а также кДНК, полученную с такой РНК, кодирующие, некодирующие последовательности, смысловые или антисмысловые полинуклеотиды. Специфичная гибридизация олигомерного соединения с его целевой нуклеиновой кислотой блокирует нормальную функцию нуклеиновой кислоты. Данная модуляция функции целевой нуклеиновой кислоты соединениями, которые специфично гибридизуются с ней, обычно именуется "антисмысловой". Блокируемые функции ДНК включают, например, репликацию и транскрипцию. Блокируемые функции РНК включают все жизненные функции, такие как, например, транслокация РНК к участку трансляции белка, трансляцию белка с РНК, сплайсинг РНК с получением одного или более типов мРНК, а также каталитическая активность, в которой может быть задействована или которой способствует РНК. Полным эффектом такого воздействия на функцию целевой нуклеиновой кислоты является модуляция экспрессии кодируемого продукта или олигонуклеотидов.

РНК интерференция "РНКи" опосредована двунитевыми молекулами РНК (днРНК), которые обладают сиквенс-специфической гомологией к своим "целевым" последовательностям нуклеиновой кислоты (Caplen, N. J., et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:9742-9747). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения медиаторами являются "малые интерферирующие" РНК дуплексы (миРНК) длиной 5-25 нуклеотидов. молекулы миРНК образуются в результате процессинга днРНК ферментом РНКазой, известным как дайсер (Bernstein, E., et al. (2001) Nature 409:363-366). Образующиеся продукты дуплексной миРНК включаются в мультибелковый миРНК комплекс, называемый RISC (РНК-индуцированный комплекс сайленсинга). Не желая быть связанными с какой-либо конкретной теорией, RISC, как полагают, затем направляется к нуклеиновой кислоте-мишени (соответственно мРНК), при этом миРНК-дуплекс сиквенс-специфически опосредует каталитическое расщепление (Bernstein, E., et al. (2001) Nature 409:363-366; Boutla, A., et al. (2001) Curr. Biol. 11:1776-1780). Малые интерферирующие РНК, которые могут применяться согласно настоящему изобретению, могут быть синтезированы и применены в соответствии с методиками, известными из уровня техники, которые будут знакомы среднему специалисту в данной области. Малые интерферирующие РНК для применения в способах настоящего изобретения предпочтительно включают от приблизительно 1 до приблизительно 50 нуклеотидов (н). В примерах неограничивающих вариантов осуществления миРНК могут включать от приблизительно 5 до приблизительно 40 н, от приблизительно 5 до приблизительно 30 н, от приблизительно 10 до приблизительно 30 н, от приблизительно 15 до приблизительно 25 н или приблизительно 20-25 нуклеотидов.

Выбор подходящих олигонуклеотидов облегчается при использовании компьютерных программ, которые автоматически выравнивают последовательности нуклеиновых кислот и указывают области идентичности или гомологии. Такие программы применяются для сравнения полученных последовательностей нуклеиновых кислот, например, при поиске в базах данных, таких как GenBank, или при секвенировании ПЦР-продуктов. Сравнение последовательностей нуклеиновых кислот из ряда видов позволяет провести отбор последовательностей нуклеиновых кислот, которые проявляют подходящую степень идентичности между видами. В случае генов, которые не были секвенированы, проводят Саузерн-блоттинг с целью определения степени идентичности между генами в целевых видах и других видах. Выполняя Саузерн-блоттинг при различных степенях строгости, как известно из уровня техники, можно получать приблизительную степень идентичности. Указанные методы позволяют проводить отбор олигонуклеотидов, которые обладают высокой степенью комплементарности к целевым последовательностям нуклеиновых кислот у субъекта, подвергаемого воздействию, и более низкой степенью комплементарности к соответствующим последовательностям нуклеиновых кислот в других видах. Специалист, квалифицированный в данной области техники, поймет, что при отборе подходящих областей генов для применения в настоящем изобретении существует значительная широта.

Под "ферментативной РНК" понимается молекула РНК с ферментативной активностью (Cech, (1988) J. American. Med. Assoc. 260, 3030-3035). Ферментативные нуклеиновые кислоты (рибозимы) действуют при первоначальном связывании с РНК-мишенью. Такое связывание происходит через специфично связывающуюся часть ферментативной нуклеиновой кислоты, которая удерживается в непосредственной близости к ферментативной части молекулы, которая вызывает расщепление РНК-мишени. Таким образом, ферментативная нуклеиновая кислота сначала узнает, а затем связывает РНК-мишень в результате спаривания оснований, и, после связывания с правильным сайтом, вызывает энзиматическое расщепление РНК-мишени.

Под "РНК-ловушкой" понимается молекула РНК, которая имитирует природный связывающий домен для лиганда. Таким способом РНК-ловушка конкурирует с природной связывающей мишенью за связывание специфического лиганда. Например, было показано, что при сверхэкспрессии РНК трансактивируемого элемента (TAR) ВИЧ может действовать в качестве "ловушки" и эффективно связывает tat-белок ВИЧ, препятствуя, таким образом, его связыванию с TAR-последовательностями, кодируемыми в РНК ВИЧ (Sullenger et al. (1990) Cell, 63, 601-608). Подразумеватся, что это - конкретный пример. Специалисты в данной области осведомлены, что это - всего лишь один из примеров, и другие варианты могут быть с легкостью созданы с применением общеизвестных методов из уровня техники.

Используемый в настоящей заявке термин "мономеры" обычно обозначает мономеры, связанные фосфодиэфирными связями или их аналогами, с образованием олигонуклеотидов, имеющих различный размер - от нескольких мономерных звеньев, например, от приблизительно 3-4, до приблизительно нескольких сотен мономерных звеньев. Аналоги фосфодиэфирных связей включают: фосфоротиоат, фосфородитиоат, метилфосфонаты, фосфороселеноат, фосфорамидат и т.п., как более подробно описано ниже.

Термин "нуклеотид" охватывает природные нуклеотиды, а также неприродные нуклеотиды. Специалисту, квалифицированному в данной области, будет очевидно, что различные нуклеотиды, которые ранее считались "неприродными", впоследствии были обнаружены в природе. Таким образом, "нуклеотиды" включают не только известные молекулы, содержащие пуриновые и пиримидиновые гетероциклы, но и их гетероциклические аналоги и таутомеры. Иллюстративными примерами других типов нуклеотидов являются молекулы, содержащие аденин, гуанин, тимин, цитозин, урацил, пурин, ксантин, диаминопурин, 8-оксо-N6-метиладенин, 7-деазаксантин, 7-деазагуанин, N4,N4-этаноцитозин, N6,N6-этано-2,6-диаминопурин, 5-метилцитозин, 5-(C3-C6)-алкинилцитозин, 5-фторурацил, 5-бромурацил, псевдоизоцитозин, 2-гидрокси-5-метил-4-триазолопиридин, изоцитозин, изогуанин, инозин, а также "неприродные" нуклеотиды, описанные в патенте США 5,432,272, Benner et al. Термин "нуклеотид", как предполагают, охватывает все указанные примеры, а также соответствующие аналоги и таутомеры. Наибольший интерес представляют такие нуклеотиды, которые содержат аденин, гуанин, тимин, цитозин и урацил, которые считаются природными нуклеотидами в отношении терапевтического и диагностического применения на людях. Нуклеотиды включают природные 2'-дезокси и 2'-гидрокси сахара, например, как описано в Kornberg and Baker, DNA Replication, 2nd Ed. (Freeman, San Francisco, 1992), а также их аналоги.

"Аналоги", применительно к нуклеотидам, включают синтетические нуклеотиды, содержащие модифицированные основания и/или модифицированные сахаридные группы (см., например, обзоры Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York, 1980; Freier & Altmann, (1997) Nucl. Acid. Res., 25(22), 4429-4443, Toulmé, J.J., (2001) Nature Biotechnology 19:17-18; Manoharan M., (1999) Biochemica et Biophysica Acta 1489:117-139; Freier S. M., (1997) Nucleic Acid Research, 25:4429-4443, Uhlman, E., (2000) Drug Discovery & Development, 3:203-213, Herdewin P., (2000) Antisense & Nucleic Acid Drug Dev., 10:297-310); 2'-O, 3'-C-сцепленные [3.2.0] бициклоарабинонуклеозиды (см., например, N.K Christiensen, et al., (1998) J. Chem. Soc., 120:5458-5463; Prakash TP, Bhat B. (2007) Curr. Top Med. Chem. 7(7):641-9; Cho EJ, et al., (2009) Annual Review of Analytical Chemistry, 2, 241-264). Такие аналоги включают синтетические нуклеотиды, созданные в целях улучшения связывающих свойств, например, стабильности дуплекса или триплекса, специфичности и т.п.

Используемая в настоящей заявке "гибридизация" означает спаривание по существу комплементарных цепей олигомерных соединений. Один из механизмов спаривания включает связывание с образованием водородных связей, которое может быть водородным связыванием Уотсона-Крика, Хугстина или обратным водородным связыванием Хугстина между комплементарными нуклеозидными или нуклеотидными основаниями (нуклеотидами) цепей олигомерных соединений. Например, аденин и тимин являются комплементарными нуклеотидами, которые образуют пару посредством образования водородных связей. Гибридизация может происходить при различных обстоятельствах.

Антисмысловое соединение "способно к специфичной гибридизации", если связывание соединения с целевой нуклеиновой кислотой блокирует нормальную функцию целевой нуклеиновой кислоты, вызывая модуляцию функции и/или активности, при этом существует достаточная степень комплементарности, позволяющая избежать неспецифичного связывания антисмыслового соединения с нецелевыми последовательностями нуклеиновых кислот при условиях, в которых требуется специфичное связывание, то есть, при физиологических условиях в случае in vivo анализов или терапевтической обработки, и при условиях, в которых проводят анализы в случае in vitro анализов.

Используемая в настоящей заявке фраза "строгие условия гибридизации" или "строгие условия" относится к условиям, при которых соединение согласно изобретению будет гибридизоваться со своей целевой последовательностью, но при этом с минимальным числом других последовательностей. Строгие условия зависят от последовательности и отличаются при различных обстоятельствах, и в рамках настоящего изобретения "строгие условия", при которых олигомерные соединения гибридизуются с целевой последовательностью определяются свойствами и составом олигомерных соединений, а также анализами, в которых они исследуются. Как правило, строгие условия гибридизации включают низкие концентрации (<0,15 M) солей с неорганическими катионами, такими как Na++ или K++ (то есть, низкую ионную силу), температуру выше 20-25°C, ниже Tm комплекс олигомерного соединения:целевой последовательности и присутствие денатурирующих агентов, таких как формамид, диметилформамид, диметилсульфоксид или детергента додецилсульфата натрия (ДСН). Например, скорость гибридизации уменьшается на 1,1% с каждым 1% формамида. Примером условий гибридизации высокой строгости является 0,1× цитратно-солевой буфер (SSC)/0,1% (в/об) ДСН при 60°C в течение 30 минут.

"Комплементарный", как используется в настоящей заявке, относится к способности точного спаривания между двумя нуклеотидами в одной или двух олигомерных цепях. Например, если нуклеиновое основание в определенном положении антисмыслового соединения способно к образованию водородных связей с нуклеиновым основанием в определенном положении целевой нуклеиновой кислоты, которая является ДНК, РНК или олигонуклеотидной молекулой, то тогда положение водородного связывания между олигонуклеотидом и целевой нуклеиновой кислотой, как предполагают, является комплементарным положением. Олигомерное соединение и другая ДНК, РНК или олигонуклеотидная молекула комплементарны друг к другу, если достаточное число комплементарных положений в каждой молекуле занято нуклеотидами, которые могут образовывать друг с другом водородные связи. Таким образом, "специфично гибридизующийся" и "комплементарный" являются терминами, которые используются для обозначения достаточной степени точного спаривания или комплементарности на протяжении достаточного количества нуклеотидов, при которой между олигомерным соединением и целевой нуклеиновой кислотой происходит стабильное и специфичное связывание.

Из уровня техники известно, что последовательность олигомерного соединения не должна быть обязательно на 100% комплементарна своей целевой нуклеиновой кислоте, чтобы специфично гибридизоваться с ней. Кроме того, олигонуклеотид может гибридизоваться через один или более сегментов, таких как промежуточные или смежные сегменты, которые не участвуют в акте гибридизации (например, петлевая структура, ошибочное спаривание или шпилечная структура). Олигомерные соединения настоящего изобретения включают, по меньшей мере, приблизительно 70% или, по меньшей мере, приблизительно 75%, или, по меньшей мере, приблизительно 80%, или, по меньшей мере, приблизительно 85%, или, по меньшей мере, приблизительно 90%, или, по меньшей мере, приблизительно 95%, или, по меньшей мере, приблизительно 99% комплементарности последовательности к целевой области в пределах целевой последовательности нуклеиновой кислоты, к которой они направлены. Например, антисмысловое соединение, в котором 18 из 20 нуклеотидов комплементарны целевой области и которое, таким образом, способно к специфичной гибридизации, будет обладать 90-процентной комплементарностью. В данном примере остальные некомплементарные нуклеотиды могут быть кластеризованы или распределены между комплементарными нуклеотидами и не должны быть обязательно смежными друг с другом или с комплементарными нуклеотидами. Таким образом, антисмысловое соединение, которое имеет длину 18 нуклеотидов, содержащее 4 (четыре) некомплементарных нуклеотида, которые фланкированы двумя областями полной комплементарности с целевой нуклеиновой кислотой, будет иметь общую комплементарность 77,8% с целевой нуклеиновой кислотой и, таким образом, включено в объем настоящего изобретения. Процент комплементарности антисмыслового соединения с областью целевой нуклеиновой кислоты может быть определен стандартным методом с использованием программ BLAST (basic local alignment search tools) и программ PowerBLAST, известных в уровне техники (Altschul et al, (1990) J. MoI. Biol, 215, 403-410; Zhang and Madden, (1997) Genome Res., 7, 649-656). Процент гомологии, идентичности последовательности или комплементарности может быть определен, например, с помощью программы Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.) при использовании параметров по умолчанию, в которой используется алгоритм Смита и Ватермана (Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., (1981) 2, 482-489).

Используемый в настоящей заявке термин "температура плавления (Tm)" относится к температуре, в условиях определенной ионной силы, pH и концентрации нуклеиновой кислоты, при которой 50% олигонуклеотидов, комплементарных целевой последовательности, гибридизуются с целевой последовательностью в равновесии. Как правило, строгие условия будут такими условиями, при которых концентрация соли составляет, по меньшей мере, от приблизительно 0,01 до 1,0 М концентрации иона Na (или других солей) при pH 7,0-8,3, а температура равна, по меньшей мере, приблизительно 30°C для коротких олигонуклеотидов (например, 10-50 нуклеотидов). Строгие условия также могут быть достигнуты при добавлении дестабилизирующих агентов, таких как формамид.

Используемая в настоящей заявке "модуляция" означает повышение (стимуляцию) или понижение (ингибирование) экспрессии гена.

Термин "вариант", при использовании применительно к полинуклеотидной последовательности, может охватывать полинуклеотидную последовательность, связанную с геном дикого типа. Данное определение также может включать, например, "аллельные", "сплайсированные", "видовые" или "полиморфные" варианты. Сплайсированный вариант может обладать существенной идентичностью по отношению к референсной молекуле, но обычно содержит большее или меньшее количество полинуклеотидов вследствие альтернативного сплайсинга экзонов в ходе процессинга мРНК. Соответствующий полипептид может обладать дополнительными функциональными доменами или не иметь доменов. Видовые варианты представляют собой полинуклеотидные последовательности, которые варьируют от одного вида к другому. Наиболее применимыми в изобретении являются варианты продуктов генов дикого типа. Варианты могут возникать в результате, по меньшей мере, одной мутации в последовательности нуклеиновой кислоты и могут приводить к изменениям в мРНК или полипептидах, структура или функция которых могут быть изменены или не изменены. Тот или иной природный или рекомбинантный ген может не иметь ни одной, иметь одну или множество аллельных форм. К обыкновенным мутационным изменениям, которые приводят к возникновению вариантов, обычно причисляют природные делеции, вставки или замены нуклеотидов. Каждый из указанных типов изменений может происходить отдельно или в комбинации с другими, один или более раз в данной последовательности.

Получаемые в результате полипептиды обычно имеют существенную аминокислотную идентичность по сравнению друг с другом. Полиморфный вариант представляет собой вариацию полинуклеотидной последовательности конкретного гена у отдельных особей данного вида. Полиморфные варианты также могут охватывать "однонуклеотидные полиморфизмы" (SNP) или мутации одного основания, при которых полинуклеотидная последовательность изменяется на одно основание. Присутствие SNP может служить показателем, например, определенной популяции со склонностью к развитию заболевания, которая является восприимчивостью в отличие от устойчивости.

Производные полинуклеотидов включают нуклеиновые кислоты, подвергнутые химической модификации, например, замене водорода алкильной, ацильной или аминогруппой. Производные, например, производные олигонуклеотиды, могут включать "неприродные" части, такие как измененные сахаридные группы или межсахаридные связи. Их примером является фосфоротиоат и другие серасодержащие варианты, которые известны в уровне техники. Производные нуклеиновые кислоты также могут содержать метки, включая радиоактивно меченые нуклеотиды, ферменты, флуоресцентные агенты, хемилюминесцентные агенты, хромогенные агенты, субстраты, кофакторы, ингибиторы, магнитные частицы и т.п.

"Производный" полипептид или пептид являются такими пептидами, которые изменены, например, гликозилированием, пэгилированием, фосфорилированием, сульфатированием, восстановлением/алкилированием, ацилированием, химическим сшиванием или мягкой обработкой формалином. Производное также может быть изменено путем введения детектируемой метки, прямо или косвенно, включая, помимо прочего, радиоизотопную, флуоресцентную и ферментную метку.

Используемый в настоящей заявке термин "животное" или "пациент" включает, например, людей, овец, лосей, оленей, чернохвостого оленя, норок, млекопитающих, обезьян, лошадей, рогатый скот, свин