Применение ферментов для удаления альдегидов из продуктов, содержащих альдегиды

Применение ферментов для удаления альдегидов из продуктов, содержащих альдегиды

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к ферментативному удалению формальдегида из композиций, содержащих формальдегид, и из продуктов, обработанных указанными композициями.

Уровень техники

Формальдегид (для удобства далее упоминается как "ФА") является важным химическим соединением, широко применяемым в промышленности при производстве строительных материалов и множества хозяйственных товаров. ФА применяется, например, при обработке для придания стойкости к сминанию в текстильной промышленности, при производстве и покрытии древесно-стружечных плит в деревообрабатывающей промышленности, и при производстве синтетических смол, таких как фенольные пластики и аминопластики, в химической промышленности. В результате высокой неустойчивости ФА выделяется в воздух в ходе производственных процессов и, как полагают, оказывает серьезное воздействие на здоровье людей и окружающую среду.

Выделяют четыре основные области применения ФА: в качестве промежуточного продукта при производстве смол; в качестве промежуточного продукта при производстве промышленных химических реагентов; в качестве биоцида; и в качестве компонента композиции изделий конечного потребления. Производство смол составляет около 65 процентов от общего потребления. Около одной трети применяется в крупномасштабном производстве химических производных, включая пентаэритрит, гексаметилентетрамин и бутандиол. Два процента применяется при обработке текстильных изделий, и небольшие количества ФА присутствуют в качестве консервантов или биоцидов в изделиях потребления и промышленных изделиях, таких как косметические продукты, шампуни и клеи. Наибольшие количества ФА применяются для получения конденсатов (то есть, смол) с мочевиной, меламином, нафталин-сульфонатом и фенолом, и, в меньшей степени, с их производными. Основная часть этих смол применяется для производства адгезивов и пропитывающих смол, которые применяются для производства древесностружечных плит, фанеры и мебели. Эти конденсаты также применяются для производства отверждаемых формовочных материалов; в качестве сырья для покрытия поверхностей и в качестве азотных удобрений с контролируемым высвобождением. Они применяются в качестве вспомогательных добавок в текстильной, кожевенной, резиновой и цементной промышленностях. Другие области применения включают связующие вещества для формовочного песка, маты из минерального войлока и стекловолокна для изоляционных материалов, абразивную бумагу и тормозные накладки. Очень небольшие количества конденсатов мочевина-формальдегид применяются при производстве вспененных смол, которые применяются в горной промышленности и при изоляции зданий и транспортных средств.

Некоторые продукты на основе ФА содержат непрореагировавший ФА в избытке, который может выделяться из продукта или высвобождаться в ходе последующего гидролиза. Одним примером является мочевиноформальдегидная смола. Мочевиноформальдегидная смола - это общий термин, который, на самом деле, включает целый класс родственных композиций. Около 60 процентов продуктов на основе мочевиноформальдегидных смол идут на производство древесностружечных плит и фанеры, где смола применяется в качестве клея. Мочевиноформальдегидные смолы также применяются в декоративных слоистых материалах, текстиле, бумаге и формовочном песке.

Наконец, формальдегидные смолы применяются для обработки текстиля в целях улучшения устойчивости предметов одежды к сминаемости. Обработка смолой или химическим реагентов в большинстве случаев является последней стадией современного процесса производства текстильных изделий. Целью является придание отбеленной, окрашенной или набивной ткани посредством механической и химической обработки подходящего для дальнейшей реализации состояния. Одним из наиболее важных процессов является обработка несмываемым красителем тканного и трикотажного полотен, состоящих из хлопка, других целлюлозных волокон и их смесей с синтетическими волокнами.

Прежде всего, обрабатывающие агенты на основе смолы были разработаны для улучшения усадки вискозного штабельного полотна. Эти соединения, как правило, получали из формальдегида и мочевины. Для улучшения конкурентоспособности хлопка на рынке текстильных товаров, гетероциклические сшивающие реагенты на основе формальдегида, мочевины и глиоксаля были разработаны и, в общем, применяются для обработки, облегчающей уход за одеждой и препятствующей сминанию. Из-за предположений о возможном вреде для здоровья людей, концентрации ФА в продуктах и промышленных процессах сохранялись настолько нисколько это возможно.

В уровне техники раскрываются различные технологии, направленные на удаление ФА, например, переносимого по воздуху, при высвобождении из продуктов или непосредственно из хорошо известных и широко применяемых смол, как указано выше. В патенте США 5,352,274 раскрывается воздушная фильтрация с применением множества гофрированных подложек, которые расположены друг на друге или прижаты друг к другу и которые включают угольную пыль для адсорбции примесей, таких как ФА, ацетальдегид и акролеин. Эта технология обеспечивает способ адсорбции молекул ФА физическим образом, без разложения посредством химической или биохимической реакции. В US 5,830,414 раскрывается обработка углеродных волокон с помощью активной маленькой молекулы, такой как сильная кислота, сильное основание или сильный окисляющий агент. Эти химические вещества могут применяться только для обработки волокон, имеющих высокую химическую устойчивость, как например, у активированных углеродных волокон. Кроме того, волокна, обработанные таким образом, потенциально опасны для применения. Применение ферментов, расщепляющих формальдегид, в воздушных фильтрах раскрывается в патенте JP2001340436.

С точки зрения текстильной промышленности и строительных материалов, агенты, удаляющие ФА, не должны оказывать отрицательное воздействие на свойства волокна, такие как восприятие на ощупь, сминаемость, способность сохранять форму и оттенок или белизну, или механические свойства древесностружечной плиты. И, конечно, их применение должно быть экономически выгонным для применения при производстве и эффективным на разумном уровне. В текстильной промышленности, соединения, имеющие активные метиленовые группы, применялись в качестве агентов для удаления ФА в целях уменьшения количества ФА, высвобождающегося из тканей, обработанных с целью исключения необходимости глажения, как описано в Textile Chemist and Colorist, Vol.16, No. 12, p.33, Dec. 1984 (публикация the American Association of Textile Chemists and Colorists). Агенты для удаления ФА, содержащие активные метиленовые группы, также могут добавляться в покрывающие композиции, содержащие мочевин/формальдегидную или меламин/формальдегидную смолу для уменьшения концентрации формальдегида (например, как описано в патенте США №5,795,933). Также известно добавление мочевины и ее производных для захвата формальдегида.

В уровне техники не раскрываются агенты, удаляющие ФА, которые эффективны при уменьшении высвобождающегося ФА до низких уровней, которые не оказывают пагубного воздействия на свойства материалов, обрабатываемых указанными смолами. В настоящее время агенты, удаляющие ФА, наиболее широко применяемые в композициях для обработки с целью исключения необходимости глажения, представляют собой многотомные спирты, такие как диэтиленгликоль и сорбит, и, при производстве древесностружечных плит, азотосодержащие соединения, такие как мочевина, меламин, диазин, триазин и аминосоединения (Патент США №4,559,097). Соединения, такие как эти, однако не являются достаточно эффективными для уменьшения уровней ФА с получением низких уровней, которые желательны в настоящее время. Более того, они только связывают ФА, но не катализируют его разложение. Также некоторые поглотители формальдегида, такие как мочевина, затормаживают реакционную способность сшивающих агентов для текстиля, уменьшая их эффективность.

Формальдегиддисмутазная (далее упоминаемая как "ФДМ") активность впервые была описана Като и его коллегами в 1983 году (Kato et al., 1983, Agric. Biol. Chem., 47(1), pages 39-46), но соответствующий ген не был обнаружен до 1995 (Yanase et al. 1995, Biosci. Biotechnol. Biochem., 59(2), 197-202). Первый протокол рекомбинантного получения и очищения растворимой ФДМ опубликовали в 2002 (Yanase et al. 2002, Biosci. Biotechnol. Biochem., 66(1), 85-91). Кристаллическая структура ФДМ (Hasegawa et al. 2002, Acta Crystallogr., Sect.A, 58, C102-C102) и других родственных ферментов доступна с 2002 года (Tanaka et al. 2002, Journal of Molecular Biology, 324, 519-533).

Сущность изобретения

Таким образом, техническое решение согласно настоящему изобретению заключается в обеспечении эффективных способов и средств уменьшения содержания ФА в композициях, которые применяются для обработки различных материалов, например, в текстильной или строительной промышленности, преодолевая недостатки, известные из уровня техники. Данное техническое решение достигается посредством объектов настоящего изобретения, а именно, изобретатели неожиданно обнаружили, что содержание формальдегида в смолах, которые применяются для обработки таких материалов, может быть эффективно уменьшено путем применения фермента, который катализирует разложение формальдегида.

Кроме того, в настоящем изобретении раскрываются модель, характеристика и кристаллические структуры мутантов ФДМ с улучшенной специфичностью в отношении формальдегида, усиленной активностью в отношении ацетальдегида и повышенной термостабильностью. В частности, мутант ФДМ I³⁰¹L показывает повышенную активность в отношении формальдегида по сравнению с белком дикого типа и является более термостабильным. Этот фермент может быть легко получен с высоким выходом путем ферментации и сформирован в виде порошка, полученного распылительной сушкой.

Таким образом, настоящее изобретение относится к применению ферментного препарата, который катализирует разложение формальдегида, для уменьшения содержания формальдегида в композиции, содержащей формальдегид.

В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения ферментный препарат включает фермент, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 или ее варианты. В следующем варианте выполнения настоящего изобретения ферментом является формальдегиддисмутаза (ФДМ) из бактериального штамма, предпочтительно ЕС 1.2.99.4. или ЕС 1.2.1.46 согласно классификации ферментов, который является производной штамма Pseudomonas putida.

В особенно предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения ферментный препарат включает фермент, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:10.

В следующем предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения композицией является смола. Смола может представлять собой сшивающий агент для текстиля или полимерный диспергирующий агент, применяемый для создания полимерных дисперсий. В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения сшивающий агент применяется для текстильных материалов, которые содержат целлюлозные волокна, такие как хлопок или вискоза, или их смесь или смеси с синтетическими веществами.

Полученные полимерные дисперсии подходят для обработки материалов, например, таких как строительные или конструкционные материалы, кожа и шкура, древесноволокнистая плита, клееная фанера и/или ковровый настил, и подходят для применения в целях покрытия или производства бумаги.

В другом варианте выполнения настоящее изобретение относится к способу уменьшения содержания формальдегида в композиции, содержащей формальдегид, отличающемуся тем, что он содержит контакт композиции с ферментным препаратом, который катализирует разложение формальдегида.

Изобретение также относится к способу уменьшения содержания формальдегида в текстиле, включающему контакт текстиля с ферментным препаратом, который катализирует разложение формальдегида. Кроме того, оно относится к композициям, содержащим сшивающий агент для текстильных материалов или полимерный диспергирующий агент и ферментный препарат, который катализирует разложение формальдегида.

Другие варианты выполнения настоящего изобретения относятся к кодон-оптимизированной нуклеиновой кислоте, кодирующей дисмутазу, векторам, содержащим указанную нуклеиновую кислоту, и экспрессионному хозяину.

Кроме того, настоящее изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей новые варианты ФДМ, аминокислотной последовательности указанных вариантов ФДМ, а также, в частности, к их применению.

Описание чертежей

Фиг.1: Некоторые сшивающие агенты на основе формальдегида. (А) мочевина-ФА, (В) меламин-ФА, (С) диметилолдигидроксиэтиленмочевина (DMDHEU).

Фиг.2: Начальные скорости ацетальдегидной дисмутации (20 мМ в 50 мМ K₂HPO₄ рН 8, 100 мМ KCl) для ФДМ, ФДМ I³⁰¹L, ФДМ F⁹³A и ФДМ I³⁰¹L/F⁹³A, определенные с помощью ВЭЖХ. Концентрация фермента 50 мкг/мл.

Фиг.3: Ферментативное превращение формальдегида (наверху) и ацетальдегида (внизу), за которым следили с помощью ВЭЖХ, с применением варианта ФДМ I³⁰¹L. Реакционную смесь проанализировали в течение 2 часов для интервалов по 30 минут. Реакции проводили в 50 мМ K₂HPO₄ (рН 7.3 для формальдегида и рН 8 для ацетальдегида), 100 мМ KCl и 20 мМ альдегида. Концентрация фермента для ацетальдегида составляла 50 мкг/мл и для формальдегида - 2,4 мкг/мл. Время удерживания для формальдегида: 16.6 мин; муравьиной кислоты: 17,5 мин; метанола: 22,9 мин; ацетальдегида: 21,2 мин; уксусной кислоты: 18.9 мин; этанола: 25,2 мин. Образование продукта является эквимолярным. Обнаружение проводили с помощью RI.

Фиг.4: Профиль температура - активность для ФДМ I³⁰¹L и ФДМ I³⁰¹L/F⁹³A. Субстрат: ацетальдегид.

Фиг.5: Профиль температура-активность для ФДМ и ФДМ I³⁰¹L. Субстрат: формальдегид.

Фиг.6: Phe 93 дикого типа показана вместе с картой электронной плотности для ФДМ I³⁰¹L/F⁹³A мутанта.

Фиг.7: крупный план активного сайта ФДМ дикого типа в комплексе с формальдегидом (ФА).

Фиг.8: крупный план активного сайта ФДМ I³⁰¹L в комплексе с формальдегидом (ФА).

Фиг.9: крупный план активного сайта ФДМ I³⁰¹L/F⁹³A в комплексе с ацетальдегидом (АА).

Описание последовательностей

SEQ ID NO:1

Аминокислотная последовательность формальдегиддисмутазы, номер доступа в генном банке L25862 (CDS 323..1522)

SEQ ID NO:2

Последовательность белка формальдегиддисмутазы, номер доступа в генном банке L25862

SEQ ID NO:3

Оптимизированная ДНК последовательность для ФДМ из Pseudomonas putida F61 (1197 bp)

SEQ ID NO:4

Нуклеотидная последовательность pDHE-ФДМ

SEQ ID NO:5

Нуклеотидная последовательность pAgro

SEQ ID NO:6

Нуклеотидная последовательность pHSG

SEQ ID NO:7

Последовательность нуклеиновых кислот формальдегиддисмутазы Ile-301-Leu

SEQ ID NO:8

Последовательность белка формальдегиддисмутазы IIe-301-Leu

SEQ ID NO:9

Последовательность нуклеиновых кислот формальдегиддисмутазы Phe-93-Ala/Ile-301-Leu

SEQ ID NO:10

Последовательность белка формальдегиддисмутазы Phe-93-Ala/IIe-301-Leu

Определения

Должно быть понятно, что настоящее изобретение не ограничивается конкретной описанной методологией, протоколами, клеточными линиями, видами или родом растений, конструкциями и реагентами. Необходимо понимать, что терминология, используемая в настоящем документе, применяется в целях описания только конкретных вариантов выполнения настоящего изобретения и не предполагает ограничение объема настоящего изобретения, который ограничивается только приложенной формулой изобретения. Необходимо отметить, что при применении в описании и в формуле изобретения единственная форма включает также и множественную форму, если иного не указано. Так, например, термин "вектор" также относится к одному или более векторам и включает их эквиваленты, известные специалистам в данной области техники, и т.д. Термин "около" применяется в настоящем изобретении со значением приблизительно, грубо, примерно или в интервале. Когда термин "около" применяется в комбинации с интервалом значений, это означает возможный выход за пределы данного интервала значений, то есть выше и ниже приведенных численных значений. В общем, термин "около" применяется в настоящем изобретении для модификации численного значения, то есть для увеличения или уменьшения установленного значения на 20 процентов, предпочтительно 10 процентов, ниже или выше (более высокое или более низкое значение). Согласно настоящему изобретению предлог "или" означает любой один член конкретного списка и также включает любую комбинацию членов списка.

Термин "формальдегид" или "ФА" относится к соединению общей формулы CH₂O, имеющему номер CAS 50-00-0. Это соединение также известно специалисту в данной области техники как формалин, метиленоксид, метилальдегид, метанал, НСНО, муравьиный альдегид, оксометан, формол, оксиметилен, морбицид, veracur, метилегликоль, формалин 40, BFV, фанноформ, формалит, FYDE, НОСН, карзан, лизоформ, суперлизоформ, метан 21. В чистой форме формальдегид представляет собой газ, но часто применяется в жидком виде после разбавления водой, в виде гидрата НО-(CH₂O)_n-Н, известного как метандиол. Водные растворы формальдегида обозначаются как формалин. Он представляет собой бесцветную весьма огнеопасную жидкость или газ с едким запахом, который обнаруживается при количестве 1 часть на миллион (ч.н.м.). Формальдегидные смеси (например, смеси с водой, ацетоном, бензолом, простым диэтиловым эфиром, хлороформом и этанолом) также охватываются в целях настоящего изобретения. Полимеры формальдегида, которые охватываются данным термином, включают полимеры с низкой и высокой молекулярной массой, в частности параформальдегид, а также линейные или циклические полиоксиметилены

Термин "ацетальдегид" или "АА" относится к соединению общей формулы СН₃СНО, имеющему номер CAS 75-07-0. Это соединение также известно специалистам в данной области техники как этанал и представляет собой бесцветную жидкость с резким удушливым запахом, которая слегка благоухает при разбавлении. Ацетальдегид представляет собой промежуточный продукт в метаболизме растительных и животных организмов, в которых его можно обнаружить в небольших количествах. Более высокие количества ацетальдегида участвуют в биологических процессах. В качестве промежуточного продукта в процессах спиртового брожения он присутствует в небольших количествах во всех спиртосодержащих напитках, таких как пиво, вино и спирты. Ацетальдегид также был обнаружен в растительных соках и эфирных маслах, обжаренных зернах кофе и табачном дыме. При более высоких концентрациях (до 1000 частей на миллион) ацетальдегид раздражает слизистые оболочки. Предел осаждения ацетальдегида в воздухе находится в интервале от 0.07 до 0.25 частей на миллион. При таких концентрациях фруктовый запах ацетальдегида является очевидным. Конъюнктивальные раздражения были очевидны через 15 минут воздействия концентраций 25 и 50 частей на миллион, но транзиторный конъюнктивит и раздражение дыхательных путей были обнаружены только после воздействия 200 частей на миллион ацетальдегида в течение 15 минут.

Термин „метилглиоксаль" относится к соединению общей формулы (СН₃-СО-СН=O), имеющему номер CAS 78-98-8 (Kato et al., 1983, Agric. Biol. Chem., 47(1), pages 39-46). Оно также известно специалистам в данной области техники как пирувальдегид, 2-оксопропаналь, 2-оксопропиональдегид, и образуется в качестве побочного продукта некоторых метаболических путей.

Термин "композиция", как применяется в настоящем изобретении, означает химическую композицию, полученную согласно конкретной формуле и/или составу. Она, таким образом, отличается от природных источников, содержащих формальдегид. Композицию получают, применяя добавление ФА. В некоторых случаях композиция также упоминается как "ФА конденсат".

Как применяется в настоящем изобретении термин "смола" означает низкомолекулярное вещество, которое затем вступает в реакцию с формированием высокомолекулярного полимера или сшитых функциональных полимерных цепей, как например, целлюлоза. В частности, термин «смола» относится к "синтетическим смолам", которые обозначают смолы, получаемые путем контролируемых химических реакций, таких как полиприсоединение или поликонденсация между конкретно определенными реагентами, включая формальдегид, который сам по себе не обладает признаками смолы. Синтетические смолы могут также означать смолы, полученные путем полимеризации ненасыщенных мономеров. Этот термин включает (i) углеводородные смолы, то есть, синтетические смолы из каменноугольной смолы, нефтепродукта и скипидарных фракций, полученные путем полимеризации. Эти смолы применяются, также как и природные, например, в комбинации с другими полимерами для придания специфических свойств материалу, таких как липкость, текучесть и твердость, и (ii) синтетические смолы, получаемые, главным образом, путем полиприсоединения и поликонденсации в присутствии формальдегида, которые являются промежуточными продуктами в синтезе пластмасс более высокой молекулярной массы. Примеры и предпочтительные варианты выполнения таких смол более подробно раскрываются далее.

Как применяется в настоящем документ термин "ферментный препарат", как предполагается, охватывает любой препарат фермента (полученного) с любой степенью чистоты (включая экспрессию фермента в хозяине, то есть Е.coli), пока препарат является ферментативно активным. Ферментные препараты согласно настоящему изобретению включают препараты, проявляющие множество отличных специфических активностей, и, как правило, применяемые в форме более или менее необработанных ферментных экстрактов в смеси с одним или более носителями.

Как применяется в настоящем документе термин "сшивающий агент" или "сшивающее средство" означает смолу, содержащую ФА, как определено выше, которая может применяться для сшивания молекул целлюлозы в текстильных материалах для улучшения свойств несминаемости и отсутствия необходимости глажения, особенно для целлюлозных тканей. Примеры предпочтительных вариантов таких сшивающих агентов далее раскрываются более подробно.

Термин "текстиль" или "ткань", как применяется в настоящем документе, означает продукты и объекты, изготовленные из природных материалов, таких как джут, сизаль, рами, конопля и хлопок, а также из синтетических волокон, таких как вискоза, искусственный шелк, сложные эфиры целлюлозы, волокна на основе винильных смол, полиакрилонитрил и его сополимеры, полимеры и сополимеры олефинов, как например, этилен, полиимид или нейлон, сложные полиэфиры и тому подобное. Применяемые ткани могут содержать одну композицию или смесь волокон.

Термин "полимерные диспергирующие агенты" относится к полиэлектролитам, которые легко растворяются в воде. Наиболее распространенными представителями являются поликарбонаты, полисульфонаты или полифосфаты щелочных металлов, как правило, натриевые соли. Предпочтительные диспергирующие агенты получают путем конденсации ароматических соединений с формальдегидом. Применение продуктов конденсации ароматической сульфоновой кислоты с формальдегидом очень широко распространено. Как правило, они либо представляют собой анионные формальдегидные смолы на основе нафталинсульфоната, меламинсульфоната или фенола, либо их производные. Другие полимерные диспергирующие агенты включают графт-полимеры на основе анионных основных цепей и неионных боковых цепей. Как правило, поликарбоксилаты применяются в качестве основных цепей, и полиалкиленгликоли применяются в качестве боковых цепей. Указанные полимерные диспергирующие агенты обеспечивают уменьшение содержания воды в гидравлических связующих смесях, таких как системы на основе цемента и сульфата кальция, соответственно без уменьшения работоспособности и реологических свойств. Они, кроме того, могут применяться для улучшения работоспособности гидравлических связующих или для увеличения нарастания прочности. Полимерные диспергирующие агенты также известны в уровне техники как "суперпластификаторы". Такие полимерные диспргирующие агенты также применяются в красильных растворах для текстиля для стабилизации окрашивающих дисперсий.

Термин "вариант" в отношении последовательности (например, последовательности полипептидов или нуклеиновых кислот, такой как, например, регулирующая транскрипцию нуклеотидная последовательность согласно изобретению), как предполагается, обозначает по существу подобные последовательности. Для нуклеотидных последовательностей, содержащих открытую рамку считывания, варианты включают те последовательности, которые, благодаря вырожденности генетического кода, кодируют идентичные аминокислотные последовательности нативного белка. Аллельные варианты природного происхождения, такие как эти, могут быть идентифицированы с применением хорошо известных методик молекулярной биологии, как например, с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и методик гибридизации. Варианты нуклеотидных последовательностей также включают синтетически полученные нуклеотидные последовательности, такие как полученные, например, путем сайт-направленного мутагенеза и для открытых рамок считывания, кодирующие нативный белок, а также те, которые кодируют полипептид, имеющий замещения аминокислот по сравнению с нативным белком. В общем, варианты нуклеотидных последовательностей согласно настоящему изобретению будут на по меньшей мере 30, 40, 50, 60-70%, например, предпочтительно 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%-79%, в общем, по меньшей мере 80%, например, 81%-84%, по меньшей мере 85%, например, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%-98% и 99% "идентичны" нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1. Термин "вариант" полипептида, как предполагается, обозначает полипептид, полученный из белка SEQ ID NO:2, путем делеции (так называемого усечения) или добавления одной или более аминокислот к N-терминальному и/или C-терминальному концу нативного белка; делецией или добавлением одной или более аминокислот в одном или более сайтах в нативном белке; или замещением одной или более аминокислот в одном или более сайтах в нативном белке. Такие варианты могут быть результатом, например, генного полиморфизма или могут быть получены в результате человеческого воздействия. Пути такого воздействия известны в данной области техники.

Термин "идентичность последовательности" относится к степени, до которой две оптимально выровненные ДНК или аминокислотные последовательности неизменны в окне выравнивания компонентов, например, нуклеотидов или аминокислот. Термин "доля идентичности" для выровненных сегментов тестируемой последовательности и контрольной последовательности означает число идентичных компонентов, которые являются общими для двух выровненных последовательностей, поделенное на общее число компонентов в сегменте контрольной последовательности, то есть во всей контрольной последовательности или более маленькой определенной части контрольной последовательности. "Процент идентичности" означает долю идентичности, умноженную на 100. Оптимальное выравнивание последовательностей для выравнивания окна сравнения хорошо известно специалистам в данной области техники и может быть проведено с помощью инструментов, таких как алгоритм локального выравнивания Смита-Ватермана, алгоритм локального выравнивания Нидламана-Вунша, способ поиска подобия по Пирсону и Липману, и предпочтительно с помощью компьютерных воплощений указанных алгоритмов, как например, GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA, доступных как часть GCG.RTM. Wisconsin Package. RTM. (Accelrys Inc. Burlington, Mass.).

Термин "частей на миллион" (ч.н.м.) относится к массовым долям и эквивалентен "мг/кг".

Полипептид(ы)/белок(и)

Термины "полипептид" и "белок" применяются в настоящем документа взаимозаменяемо и относятся к аминокислотам в полимерной форме любой длины, связанным вместе пептидными связями.

Полинуклеотид(ы)/Нуклеиновая кислота(ы)/ Последовательность(и) нуклеиновых кислот/нуклеотидная последовательность(и)

Термины "полинуклеотид(ы)", "последовательностей) нуклеиновых кислот", "нуклеотидная последовательность(и)", "нуклеиновая кислота(ы)", "молекула нуклеиновой кислоты" применяются в настоящем документе взаимозаменяемо и относятся к нуклеотидам, либо рибонуклеотидам, либо деоксирибонуклеотидам, или комбинации обоих, в полимерной неразветвленной форме любой длины.

Гомолог(и)

"Гомологи" белка охватывают пептиды, олигопептиды, полипептиды, белки и ферменты, имеющие замещения, делеции и/или вставки аминокислот по сравнению с рассматриваемым немодифицированным белком, и имеющие подобную биологическую и функциональную активность по сравнению с немодифицированным белком, из которого они получены.

Делеция относится к удалению одной или более аминокислот из белка.

Вставка относится к введению одного или более аминокислотных остатков в конкретный сайт в белке. Вставки могут содержать N-терминальные и/или C-терминальные слияния, а также вставки одной или множества аминокислот внутри последовательности. В общем, вставки внутри аминокислотной последовательности будут меньше, чем N- или C-терминальные слияния, порядка около 1-10 остатка. Примеры N- или C-терминальных слитых белков или пептидов включают домен связывания или домен активации транскрипционного активатора, как применяется в дрожжевой двугибридной системе, фаговые белки оболочки, (гистидин)-6-tag, глутатион S-трансфераза-tag, белок А, мальтоза-связывающий белок, дигидрофолат-редуктазу, Tag·100 эпитоп, c-myc эпитоп, FLAG^®-эпитоп, lacZ, CMP (пептид, связывающий кальмодулин), НА эпитоп, эпитоп белка С и VSV эпитоп.

Замещение относится к замещению аминокислот белка другими аминокислотами, имеющими подобные свойства (как например, подобная гидрофобность, гидрофильность, антигенность, склонность к образованию или разрушению структур α-спиралей или структур β-листов). Аминокислотные заместители, как правило, представляют собой отдельные остатки или могут находиться в форме кластеров, в зависимости от функциональных ограничений в полипептиде, и могут содержать от 1 до 10 аминокислот; вставки, как правило, будут составлять от 1 до 10 аминокислотных остатков. Аминокислотные замещения предпочтительно представляют собой консервативные аминокислотные замещения. Таблицы консервативных замещений хорошо известны в данной области техники (смотрите, например, Creighton (1984) Proteins. W.H. Freeman and Company (Eds).

Аминокислотные замещения, делеции и/или вставки могут быть легко осуществлены, применяя методики синтеза белков, хорошо известные в данной области техники, как например, твердофазный пептидный синтез и тому подобное, или путем манипуляций с рекомбинантной ДНК. Способы манипуляции с ДНК последовательностями для получения вариантов белков с замещением, вставкой или делецией, хорошо известны из уровня техники. Например, методики создания мутаций на основе замещения в определенных сайтах в ДНК хорошо известны специалистам в данной области техники и включают М13 мутагенез, Т7-ген in vitro мутагенез (USB, Cleveland, ОН), сайт-направленный мутагенез QuickChange (Stratagene, San Diego, CA), ПЦР-опосредованный сайт-направленный мутагенез или другие протоколы сайт-напрвленного мутагенеза.

Производные

"Производные" включают пептиды, олигопептиды, полипепиды, которые могут, по сравнению с аминокислотной последовательностью формы белка природного происхождения, как, например, рассматриваемого белка, содержать замещения аминокислот аминокислотными остатками неприродного происхождения или добавления аминокислотных остатков неприродного происхождения. "Производные" белка также охватывают пептиды, олигопептиды, полипептиды, которые содержат измененные аминокислотные остатки природного происхождения (гликозилированные, ацилированные, пренилированные, фосфорилированные, миристоилированные, сульфатированные и т.д.) или измененные аминокислотные остатки неприродного происхождения, измененные по сравнению с аминокислотной последовательностью формы полипептида природного происхождения. Производная может также содержать одно или более неаминокислотных замещений или добавлений, по сравнению с аминокислотной последовательностью, из которой она получена, например, репортерную молекулу или другой лиганд, ковалентно или нековалентно связанный с аминокислотной последовательностью, как например, репортерная молекула, которая присоединена для облегчения обнаружения, и аминокислотные остатки неприродного происхождения, по сравнению с аминокислотной последовательностью белка природного происхождения. Кроме того, "производные" также включают слияния формы белка природного происхождения с пептидами «метками», такими как FLAG, HIS6 или тиоредоксин (такие пептиды рассматриваются, например, в Terpe, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523-533, 2003).

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к применению ферментного препарата, который катализирует разложение формальдегида, для уменьшения содержания формальдегида в композиции, содержащей формальдегид.

Ферменты, которые катализируют разложение формальдегида, известны в данной области техники. Например, в Bystrykh et al. (1993) J. Gen. Microbiol. 139, 1979-1985; Sakai, Y. et al (1995) FEMS Microbiol. Lett. 127, 229-234; или Ito et al. (1994) J. Bacterial. 176, 2483-2491 or Gonzalez et al., J. Biol. Chem., Vol.281, NO. 20, pp.14514-14522, May 19, 2006 раскрываются ферменты, такие как S-формилглутатионгидролаза, формальдегиддисмутаза, метилформиатсинтаза или глутатион-независимая формальдегиддегидрогеназа, которые могут применяться для разложения ФА.

Ферменты, принадлежащие семейству цинк-содержащих алкогольдегидрогеназ средней цепи, в частности, являются подходящими согласно настоящему изобретению (смотрите также Tanaka et al., J. Mol. Biol. (2002) 324, 519-533). В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения пиридиновый нуклеотид NAD(H), который отличается от кофермента (в качестве ко-субстрата) характерными алкогольдегидрогеназами, тесно, но не ковалентно связан с ферментом и действует в качестве кофактора.

"Тесно связанный" означает, что кофактор связан с ферментом посредством взаимодействий, таких как ионные связи, внутримолекулярные силы, водородные связи, Ван-дер-ваальсовые силы, гидрофобные взаимодействия. Так как кофактор повторно используется в ходе реакции диспропорционирования (разложение ФА до метанола и окисление ФА до муравьиной кислоты одним и тем же ферментом), способ по настоящему изобретению обладает конкретными преимуществами, состоящими в минимизации затрат, так как кофактор не должен непрерывно подаваться в реакционную смесь для поддержания активности фермента.

Особенно подходящими для применения согласно настоящему изобретению являются оксидоредуктазы, которые действуют на альдегидную или оксо-группу доноров (ЕС 1.2). Предпочтительными являются оксидоредуктазы с акцепторами, отличными от NAD или NADP, цитрохромом, кислородом, дисульфидом, белком, содержащим железо и серу (ЕС 1.2.99). Предпочтительно ферментом является формальдегиддисмутаза (далее также упоминается как "ФДМ") из бактериального штамма, более предпочтительно ЕС 1.2.99.4. или ЕС 1.2.1.46 согласно классификации ферментов, которую получают из штамма Pseudomonas putida. Указанный фермент, кроме того, описывается в Kato, N., et al. (1983) Agric. Biol. Chem., 47(1), 39-46, Yanase, H., et al. (1995) Biosci. Biotechnol. Biochem., 59(2), 197-202 и Yanase, H., et al. (2002) Biosci. Biotechnol. Biochem., 66(1), 85-91.

В предпочтительном варианте выполнения изобретения ферментный препарат содержит фермент, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 или ее вариант. В следующем предпочтительном варианте выполнения изобретения ферментный препарат содержит фермент, кодируемый нуклеиновой кислотой SEQ ID NO:1, или его варианты.

В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения ферментный препарат содержит фермент, который содержит вариант или производную аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, как более подробно раскрывается далее, где фенилаланин в положении 93 и/или изолейцин в положении 301, и/или метионин в положении 337 и/или фенилаланин в положении 127 были замещены любой другой аминокислотой.

Для применения согласно настоящему изобретению ферментный препарат может применяться либо в очищенном виде с различной степенью чистоты, либо в виде неочищенного экстра