Способы внутриклеточного превращения одноцепочечных белков в их двухцепочечную форму

Способы внутриклеточного превращения одноцепочечных белков в их двухцепочечную форму

Иллюстрации

Показать все

Реферат

[01] Эта заявка на патент претендует на приоритет согласно 35 U.S.С. § 119(е) Предварительной Заявки на Патент США Серийный No. 61/286963, поданной 25 января 2010, включенной сюда во всей полноте посредством ссылки.

[02] Способность клостридиальных токсинов, таких как, например, нейротоксины Botulinum (BoNTs), BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F и BoNT/G и нейротоксины Tetanus (TeNT), ингибировать нейрональную трансмиссию, находит широкое терапевтическое и косметическое применение, см. например, William J. Lipham, cosmetic and clinical applications of botulinum toxin (Slack, Inc., 2004). Клостридиальные токсины, имеющиеся в продаже в виде фармацевтических составов, включают препараты BoNT/A, такие как, например, ВОТОХ® (Allergan, Inc., Irvine, CA), DYSPORT®/RELOXIN®, (Beaufour Ipsen, Porton Down, England), NEURONOX® (Medy-Tox, Inc., Ochang-myeon, South Korea) BTX-A (Lanzhou Institute Biological Products, China) и XEOMIN® (Merz Pharmaceuticals, GmbH., Frankfurt, Germany); и препараты BoNT/B, такие как, например, MYOBLOC™/NEUROBLOC™ (Elan Pharmaceuticals, San Francisco, CA). В качестве примера, ВОТОХ® iв настоящее время применяется в одной или более странах по следующим показаниям: ахалазия, спазмы у взрослых, анальная трещина, боль в спине, блефароспазм, бруксизм, шейная дистония, эссенциальный тремор, межбровные морщины или мимические морщины лица, головная боль, гемифасциальный спазм, гиперактивность мочевого пузыря, гипергидроз, детский церебральный паралич, рассеянный склероз, миоклонические заболевания, носогубные морщины, спастическая дисфония, косоглазие и расстройство VII нерва.

[03] Терапевтическое использование клостридиальных токсинов расширилось за пределы существующего применения для мышечной релаксации до лечения связанных с чувствительными нервами недомоганий, таких как, например, различные виды хронической боли, нейрогенное воспаление и урогенитальные расстройства, а также несвязанных с нервной системой болезней, такие как, например, панкреатит. Один подход, который в настоящее время используется для расширения терапевтического применения клостридиальных токсинов, включает модификацию клостридиального токсина таким образом, чтобы модифицированный таксин обладал измененной способностью связываться с клеткой, не являющейся мишенью для клостридиального токсина. Такая способность связываться с новой мишенью достигается путем замещения природного связывающегося с мишенью домена клостридиального токсина связывающимся с мишенью доменом, показывающим избирательную активность по отношению к рецептору, не являющемуся рецептором для клостридиального токсина, присутствующему в не являющейся мишенью для клостридиального токсина клетке. В результате такой модификации домена связывающегося с мишенью домена получается модифицированный токсин, обладающий способностью избирательно связываться с рецептором, не являющимся рецептором к клостридиальному токсину (рецептором-мишенью), присутствующим в не являющейся мишенью для клостридиального токсина клетке (измененной мишени). Клостридиальный токсин с измененной мишенью с активностью по отношению к не являющейся мишенью для клостридиального токсина клетке может связываться с рецептором, присутствующим в не являющейся мишенью для клостридиального токсина клетке, транслоцированным в цитоплазме и оказывающим протеолитическое действие на SNARE комплекс не являющейся мишенью для клостридиального токсина клетки.

[04] Не имеющие ограничительного характера примеры клостридиальных токсинов с измененной мишенью с активностью по отношению к не являющейся мишенью для клостридиального токсина клетке описаны, например, в Keith A. Foster et al., Clostridial Toxin Derivatives Able To Modify Peripheral Sensory Afferent Functions, Патент США 5989545; Clifford С. Shone et al., Recombinant Toxin Fragments, Патент США 6461617; Stephan Donovan, Clostridial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain, Патент США 6500436; Conrad P. Quinn et al., Methods and Compounds for the Treatment of Mucus Hypersecretion, Патент США 6632440; Lance E. Steward et al., Methods And Compositions For The Treatment Of Pancreatitis, Патент США 6843998; J. Oliver Dolly et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, Патент США 7419676; Lance E. Steward et al., Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods of Their Use, Патент США 7514088; Keith A. Foster et al., Inhibition of Secretion from Non-neural Cells, Публикация Патента США 2003/0180289; and Keith A. Foster et al., Re-targeted Toxin Conjugates, Международная Публикация Патента США WO 2005/023309. Способность изменять мишени терапевтических эффектов, связанных с клостридиальными токсинами, сильно расширила число медицинских применений, в которых возможно использовать терапию клостридиальным токсином. В качестве не имеющего ограничительного характера примера модифицированных клостридиальных токсинов, измененная мишень которых - чувствительные нейроны, используемых в лечении различных типов хронической боли, таких как, например, гиперальгезия и аллодиния, невропатическая боль и воспалительная боль, см., например, Foster, выше, (1999); и Donovan, выше, (2002); и Stephan Donovan, Method For Treating Neurogenic Inflammation Pain with Botulinum Toxin and Substance P Components, Патент США 7,022,329. В качестве не имеющего ограничительного характера примера модифицированных клостридиальных токсинов, измененная мишень которых - панкреатические клетки, используемых в лечении панкреатита, см., например, Steward, выше, (2005).

[05] Клостридиальные токсины, природные или модифицированные, преобразуются в двуцепочечную форму для того чтобы достигнуть полной активности. Все природные клостридиальные токсины транслируются как одноцепочечный полипептид примерно 150 кДа, который затем протеолитически расщепляется внутри дисульфидной петли природной протеазой (Фигура 1). Это расщепление происходит внутри дискретного двуцепочечного участка петли, образованного между двумя цистеиновыми остатками, которые формируют дисульфидный мостик. В ходе этого посттрансляционного процесса образуется двуцепочечная молекула, содержащая примерно 50 кДа легкую цепь (LC), содержащую энзимный домен, и примерно 100 кДа тяжелую цепь (НС), содержащую транслокационный домен и клеточный домен связывания, LC и НС удерживаются вместе одной дисульфидной связью и нековалентными взаимодействиями (Фигура 1). В образованных путем рекомбинации клостридиальных токсинах природный двуцепочечный петлевой сайт расщепления протеиназой обычно замещается сайтом расщепления экзогенной протеиназой (Фигура 2). См. напр., Dolly, J.O. et al., Activatable Clostridial Toxins, Патент США 7,419,676, включенный сюда во всей полноте посредством ссылки. Хотя клостридиальные токсины с измененной мишенью варьируют по своей полной молекулярной массе из-за размера связывающегося с мишенью компонента, процесс активации и его зависимость от экзогенных сайтов расщепления практически одинаковы для рекомбинантно произведенных клостридиальных токсинов. См. напр., Steward, L.E. et al., Activatable Clostridial Toxins, Публикации. Патента США 2009/0005313; Steward, L.E. et al., Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Activity For Non-Clostridial Toxin Target Cells, Патент США Application 11/776,075; Steward, L.E. et al., Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Activity for Clostridial Toxin Target Cells, Публикацию Патента США 2008/0241881, каждый из которых включен сюда во всей полноте посредством ссылки.

[06] До настоящего времени превращение одноцепочечной формы рекомбинантно произведенного клостридиального токсина или модифицированного клостридиального токсина в его двуцепочечную форму требовало процесса активации in vitro. Во-первых, в бактериальных клетках, используемых для рекомбинантного производства этих токсинов, отсутствует природная протеаза, имеющаяся в штаммах клостридий, которые вырабатывают природные токсины. Во-вторых, нет большой необходимости рекомбинантно производить активированные токсины в бактериальных клетках, поскольку манипуляции с активированными токсинами подняли проблемы безопасности. См., например, Dolly, U.S. 7419676, выше, (2008). Однако, если эти проблемы возможно будет преодолеть, производство рекомбинантных активированных токсинов упростит производственный процесс выработки рекомбинантных клостридиальных токсинов или модифицированных клостридиальных токсинов. Например, в настоящее время производство рекомбинантных клостридиальных токсинов или модифицированных клостридиальных токсинов включает следующие этапы очистки: 1) аффинная хроматография на иммобилизованных ионах металлов, 2) диализ с обменом буфера, 3) реакция расщепления протеазой, 4) ионообменная хроматография и 5) добавление PEG и быстрое замораживание для хранения при -80°С, Использование бактериальной клетки, которая может протеолитически расщеплять рекомбинантный клостридиальный токсин внутриклеточно, продолжая при этом экспрессировать токсин, может уменьшить число этапов очистки до следующих: 1) аффинная хроматография на иммобилизованных ионах металлов, 2) диализ с обменом буфера, 3) ионообменная хроматография и 4) добавление PEG и быстрое замораживание для хранения при -80°С.

[07] Настоящее описание раскрывает способ превращения одноцепочечного белка, содержащего двуцепочечный петлевой участок, в двуцепочечную форму, который не требует процесса in vitro для превращения одноцепочечной формы токсина в двуцепочечную форму. Это возможно благодаря использованию клеток, которые экспрессируют как белок, так и протеазу, необходимую для превращения белка в активную двуцепочечную форму.

[08] Таким образом, аспекты настоящего описания предоставляют двойной экспрессионный конструкт, который включает открытую рамку считывания, кодирующую одноцепочечный белок, содержащий двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой, и открытую рамку считывания, кодирующую протеазу, которая может протеолитически расщеплять сайт расщепления экзогенной протеазой, находящийся в двуцепочечном петлевом участке. В дополнительных аспектах одноцепочечный белок, содержащий двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой, может быть, например, клостридиальным токсином, содержащим двуцепочечный петлевой участок, содержащим сайт расщепления экзогенной протеазой, модифицированным клостридиальным токсином, содержащим двуцепочечный петлевой участок, содержащим сайт расщепления экзогенной протеазой, или одноцепочечным белком, содержащим энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, связывающий домен не клостридиального токсина и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой. Полинуклеотиды, а также клостридиальные токсины, содержащие двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой, которые они кодируют, описаны, например, в Dolly, J.O. et al., Activatable Clostridial Toxins, Патент США 7132259; Dolly, J.O. et al., Activatable Clostridial Toxins, Патент США 7419676, каждый из которых включен сюда во всей полноте посредством ссылки. Полинуклеотиды, а также белки, содержащие энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, связывающий домен не клостридиального токсина и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой, которые они кодируют, описаны, например, в Steward, L.E. et al., Mnltivalent Clostridial Toxins, Публикация Патента США 2009/0048431; Steward, L.E. et al., Activatable Clostridial Toxins, Публикация Патента США 2009/0069238; Steward, L.E. et al., Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Activity For Non-Clostridial Toxin Target Cells, Заявка на Патент США 11/776,075; Steward, L.E. et al., Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Activity for Clostridial Toxin Target Cells, Публикация Патента США 2008/0241881; Foster, K.A. et al., Fusion Proteins, Публикация Патента США 2009/0035822; Foster, K.A. et al., Non-Cytotoxic Protein Conjugates, Публикация Патента США 2009/0162341; Steward, L.E. et al., Activatable Clostridial Toxins, Публикация Патента США 2008/0032931; Foster, K.A. et al., Non-Cytotoxic Protein Conjugates, Публикация Патента США 2008/0187960; Steward, L.E. et al., Degradable Clostridial Toxins, Публикация Патента США 2008/0213830; Steward, L.E. et al., Modified Clostridial Toxins With Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Activity For Clostridial Toxin Target Cells, Публикация Патента США 2008/0241881; Dolly, J.O. et al., Activatable Clostridial Toxins, Патент США 7,419,676; и сопутствующая заявка на патент Ghanshani, et al., Modified Clostridial Toxins Comprising an Integrated Protease Cleavage Site-Binding Domain, Attorney Docket No. 18468 PROV (ВОТ), каждый из которых включен сюда во всей полноте посредством ссылки.

[09] Другие аспекты настоящего описания предоставляют клетку, содержащую двойной экспрессионный конструкт, который включает открытую рамку считывания, кодирующую одноцепочечный белок, содержащий двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой, и открытую рамку считывания, кодирующую протеазу, которая может протеолитически расщеплять сайт расщепления экзогенной протеазой, находящийся в двуцепочечном петлевом участке. В дополнительных аспектах одноцепочечный белок, содержащий двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой, может быть, например, клостридиальным токсином, содержащим двуцепочечный петлевой участок, содержащим сайт расщепления экзогенной протеазой, модифицированным клостридиальным токсином, содержащим двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой или одноцепочечным белком, содержащим энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, связывающий домен не клостридиального токсина и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой, как раскрыто в настоящем описании.

[010] Другие аспекты настоящего описания предоставляют внутриклеточный способ превращения одноцепочечного белка в двуцепочечную форму, способ состоит из следующих этапов а) рост клетки, содержащей двойной экспрессионный конструкт при первой температуре в течение определенного периода времени для достижения максимальной плотности клеток, двойной экспрессионный конструкт содержит: i) открытую рамку считывания, кодирующую одноцепочечный белок, содержащий двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; и ii) открытую рамку считывания, кодирующую протеазу; при этом протеаза может расщеплять сайт расщепления экзогенной протеазой, находящийся в двуцепочечном петлевом участке; б) рост клетки при второй температуре в течение определенного периода времени для достижения максимальной индукции экспрессии белка на открытой рамке считывания, кодирующей одноцепочечный белок, при этом рост на этапе (б) индуцирует экспрессию одноцепочечного белка и протеазы из двойного экспрессионного конструкта; при этом производимая протеаза расщепляет одноцепочечный белок в сайте расщепления экзогенной протеазой, находящемся внутри двуцепочечного петлевого участка, тем самым превращая одноцепочечный белок в его двуцепочечную форму.

[011] Дальнейшие аспекты настоящего описания предоставляют внутриклеточный способ превращения одноцепочечного клостридиального токсина в двуцепочечную форму, способ состоит из следующих этапов: а) рост клетки, содержащей двойной экспрессионный конструкт при 37°С в течение от около 2 до около 3,5 часов, двойной экспрессионный конструкт содержит; i) открытую рамку считывания, кодирующую одноцепочечный клостридиальный токсин, одноцепочечный клостридиальный токсин, содержащий энзимный домен, транслокационный домен, домен связывания и дзуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; и ii) открытую рамку считывания, кодирующую протеазу; при этом протеаза может расщеплять сайт расщепления экзогенной протеазой, находящийся в двуцепочечной петле; б) рост клетки при 22°С в течение от около 16 до около 18 часов, при этом рост на этапе (б) индуцирует экспрессию одноцепочечного клостридиального токсина и протеазы из двойного экспрессионного конструкта; и при этом производимая протеаза расщепляет одноцепочечный клостридиальный токсин в сайте расщепления экзогенной протеазой, находящемся внутри двуцепочечного петлевого участка, тем самым превращая одноцепочечный клостридиальный токсин в его двуцепочечную форму.

[012] Дальнейшие аспекты настоящего описания предоставляют внутриклеточный способ превращения одноцепочечного клостридиального токсина в его двуцепочечную форму, способ состоит из следующих этапов а) рост клетки, содержащей двойной экспрессионный конструкт при 37°С от около 2 до около 8 часов, двойной экспрессионный конструкт содержит; i) открытую рамку считывания, кодирующую одноцепочечный белок, одноцепочечный белок, содержащий энзимный домен, транслокационный домен и интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания опиоидов; и ii) открытую рамку считывания, кодирующую TEV протеазу; б) рост клетки при от около 12 до около 16°С в течение от около 16 до около 18 часов, при этом рост на этапе (б) индуцирует экспрессию одноцепочечного белка и TEV протеазы на двойном экспрессионном конструкте; и при этом производимая TEV протеаза расщепляет одноцепочечный белок в сайте расщепления TEV протеазой, находящемся внутри интегрированного с сайтом расщепления TEV протеазой домена связывания опиоидов, тем самым превращая одноцепочечный белок в его двуцепочечную форму.

[013] Дальнейшие аспекты настоящего описания предоставляют внутриклеточный способ превращения одноцепочечного белка в его двуцепочечную форму, способ состоит из следующих этапов а) рост клетки, содержащей двойной экспрессионный конструкт при 37°С от около 2 до около 8 часов, двойной экспрессионный конструкт содержит; i) открытую рамку считывания, кодирующую одноцепочечный белок, одноцепочечный белок, содержащий энзимный домен, транслокационный домен, и интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания опиоидов; и ii) открытую рамку считывания, кодирующую TEV протеазу; б) рост клетки при от около 20 до около 24°C С в течение от около 16 до около 18 часов, при этом рост на этапе (б) индуцирует экспрессию одноцепочечного белка и TEV протеазы на двойном экспрессионном конструкте; и при этом производимая TEV протеаза расщепляет одноцепочечный белок в сайте расщепления TEV протеазой, находящемся внутри интегрированного с сайтом расщепления TEV протеазой домена связывания опиоидов, тем самым превращая одноцепочечный белок в его двуцепочечную форму.

[014] Другие дальнейшие аспекты настоящего описания предоставляют внутриклеточный способ превращения одноцепочечного белка в его двуцепочечную форму, способ состоит из следующих этапов а) рост клетки, содержащей двойной экспрессионный конструкт при 37°С от около 2 до около 8 часов, двойной экспрессионный конструкт содержит; i) открытую рамку считывания, кодирующую одноцепочечный белок, одноцепочечный белок, содержащий энзимный домен, транслокационный домен, связывающий домен не клостридиального токсина и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления TEV протеазой; и ii) открытую рамку считывания, кодирующую TEV протеазу; б) рост клетки при от около 12 до около 16°С в течение от около 16 до около 18 часов, при этом рост на этапе (б) индуцирует экспрессию одноцепочечного белка и TEV протеазы на двойном экспрессионном конструкте; и при этом производимая TEV протеаза расщепляет одноцепочечный белок в сайте расщепления TEV протеазой, находящемся внутри двуцепочечного петлевого участка, тем самым превращая одноцепочечный белок в его двуцепочечную форму.

[015] Другие дополнительные аспекты настоящего описания предоставляют внутриклеточный способ превращения одноцепочечного белка в его двуцепочечную форму, способ состоит из следующих этапов а) рост клетки, содержащей двойной экспрессионный конструкт при 37°С от около 2 до около 8 часов, двойной экспрессионный конструкт содержит; i) открытую рамку считывания, кодирующую одноцепочечный белок, одноцепочечный белок, содержащий энзимный домен, транслокационный домен, связывающий домен не клостридиального токсина и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления TEV протеазой; и ii) открытую рамку считывания, кодирующую TEV протеазу; б) рост клетки при от около 20 до около 24°С в течение от около 16 до около 18 часов, при этом рост на этапе (б) индуцирует экспрессию одноцепочечного белка и TEV протеазы на двойном экспрессионном конструкте; и при этом производимая TEV протеаза расщепляет одноцепочечный белок в сайте расщепления TEV протеазой, находящемся внутри двуцепочечного петлевого участка, тем самым превращая одноцепочечный белок в его двуцепочечную форму.

[016] Другие аспекты настоящего описания предоставляют экспрессионный конструкт, содержащий открытую рамку считывания, кодирующую одноцепочечный белок, содержащий двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой. В дальнейших аспектах одноцепочечный белок, содержащий двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой, может быть, например, клостридиальным токсином, содержащим двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой, модифицированным клостридиальным токсином, содержащим двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой, или одноцепочечным белком, содержащим энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токсина, связывающий домен не клостридиального токсина и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой, как раскрыто в настоящем описании.

[017] Другие аспекты настоящего описания предоставляют экспрессионный конструкт, содержащий открытую рамку считывания, кодирующую протеазу, которая может протеолитически расщеплять сайт расщепления экзогенной протеазой, находящийся в двуцепочечном петлевом участке одноцепочечного белка, содержащего двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой.

[018] Другие аспекты настоящего описания предоставляют клетку, содержащую экспрессионный конструкт, содержащий открытую рамку считывания, кодирующую одноцепочечный белок, содержащий двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой и другой экспрессионный конструкт, содержащий открытую рамку считывания, кодирующую протеазу, которая может протеолитически расщеплять сайт расщепления экзогенной протеазой, находящийся в двуцепочечном петлевом участке одноцепочечного белка, содержащего двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой. В дальнейших аспектах одноцепочечный белок, содержащий двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой, может быть, например, клостридиальным токсином, содержащим двуцепочечный петлевой участок, содержащим сайт расщепления экзогенной протеазой, модифицированным клостридиальным токсином, содержащим двуцепочечный петлевой участок, содержащим сайт расщепления экзогенной протеазой, или одноцепочечным белком, содержащим энзимный домен клостридиального токсина, транслокационный домен клостридиального токина, домен связывания не клостридиального токсина и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой, как раскрыто в настоящем описании.

[019] Другие дополнительные аспекты настоящего описания предоставляют внутриклеточный способ превращения одноцепочечного белка в его двуцепочечную форму, способ состоит из следующих этапов: а) рост клетки, содержащей i) экспрессионный конструкт, содержащий открытую рамку считывания, кодирующую одноцепочечный белок, содержащий двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой и ii) другой экспрессионный конструкт, содержащий открытую рамку считывания, кодирующую протеазу, которая может протеолитически расщеплять сайт расщепления экзогенной протеазой, находящийся в двуцепочечном петлевом участке одноцепочечного белка, содержащего двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; б) рост клетки при второй температуре в течение определенного периода времени для достижения максимальной индукции экспрессии белка на открытой рамке считывания, кодирующей одноцепочечный белок, при этом рост на этапе (б) индуцирует экспрессию одноцепочечного белка и протеазы из экспрессионного конструкта; при этом производимая протеаза расщепляет одноцепочечный белок в сайте расщепления экзогенной протеазой, находящемся внутри двуцепочечного петлевого участка, тем самым превращая одноцепочечный белок в его двуцепочечную форму.

[020] Другие дополнительные аспекты настоящего описания предоставляют внутриклеточный способ превращения одноцепочечного клостридиального токсина в его двуцепочечную форму, способ состоит из следующих этапов: а) рост клетки при 37°С от около 2 до около 3,5 часов, клетка содержит i) экспрессионный конструкт, содержащий открытую рамку считывания, кодирующую одноцепочечный клостридиальный токсин, содержащий энзимный домен, транслокационный домен, домен связывания и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой и ii) другой экспрессионный конструкт, содержащий открытую рамку считывания, кодирующую протеазу, которая может протеолитически расщеплять сайт расщепления экзогенной протеазой, находящийся в двуцепочечном петлевом участке одноцепочечного белка, содержащего двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления экзогенной протеазой; б) рост клетки при 22°С в течение от около 16 до около 18 часов, при этом рост на этапе (б) индуцирует экспрессию одноцепочечного клостридиального токсина и протеазы из экспрессионных конструктов; и при этом производимая протеаза расщепляет одноцепочечный клостридиальный токсин в сайте расщепления экзогенной протеазой, находящемся внутри двуцепочечного петлевого участка, тем самым превращая одноцепочечный клостридиальный токсин в его двуцепочечную форму.

[021] Дополнительные аспекты настоящего описания предоставляют внутриклеточный способ превращения одноцепочечного белка в его двуцепочечную форму, способ состоит из следующих этапов а) рост клетки при 37°С от около 2 до около 8 часов, клетка содержит: i) экспрессионный конструкт, содержащий открытую рамку считывания, кодирующую одноцепочечный белок, содержащий энзимный домен, транслокационный домен и интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания опиоидов и ii) другой экспрессионный конструкт, содержащий открытую рамку считывания, кодирующую TEV протеазу; б) рост клетки при от около 12 до около 16°С в течение от около 16 до около 18 часов, при этом рост на этапе (б) индуцирует экспрессию одноцепочечного белка и TEV протеазы на экспрессионных конструктах; и при этом производимая TEV протеаза расщепляет одноцепочечный белок в сайте расщепления TEV протеазой, находящемся внутри интегрированного с сайтом расщепления TEV протеазой домена связывания опиоидов, тем самым превращая одноцепочечный белок в его двуцепочечную форму.

[022] Дополнительные аспекты настоящего описания предоставляют внутриклеточный способ превращения одноцепочечного белка в его двуцепочечную форму, способ состоит из следующих этапов: а) рост клетки при 37°С от около 2 до около 8 часов, клетка содержит: i) экспрессионный конструкт, содержащий открытую рамку считывания, кодирующую одноцепочечный белок, содержащий энзимный домен, транслокационный домен и интегрированный с сайтом расщепления TEV протеазой домен связывания опиоидов и ii) другой экспрессионный конструкт, содержащий открытую рамку считывания, кодирующую TEV протеазу; б) рост клетки при от около 20 до около 24°С в течение от около 1 6 до около 18 часов, при этом рост на этапе (б) индуцирует экспрессию одноцепочечного белка и TEV протеазы на экспрессионных конструктах; и при этом производимая TEV протеаза расщепляет одноцепочечный белок в сайте расщепления TEV протеазой, находящемся внутри интегрированного с сайтом расщепления TEV протеазой домена связывания опиоидов, тем самым превращая одноцепочечный белок в его двуцепочечную форму.

[023] Другие дополнительные аспекты настоящего описания предоставляют внутриклеточный способ превращения одноцепочечного белка в его двуцепочечную форму, способ состоит из следующих этапов: а) рост клетки при 37°С от около 2 до около 8 часов, клетка содержит: i) экспрессионный конструкт, содержащий открытую рамку считывания, кодирующую одноцепочечный белок, содержащий энзимный домен, транслокационный домен, связывающий домен не клостридиального токсина и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления TEV протеазой и ii) другой экспрессионный конструкт, содержащий открытую рамку считывания, кодирующую TEV протеазу; б) рост клетки при от около 12 до около 16°С при от около 16 до около 18 часов, при этом рост на этапе (б) индуцирует экспрессию одноцепочечного белка и TEV протеазы на экспрессионных конструктах; и при этом производимая TEV протеаза расщепляет одноцепочечный белок в сайте расщепления TEV протеазой, находящемся внутри интегрированного с сайтом расщепления TEV протеазой домена связывания опиоидов, тем самым превращая одноцепочечный белок в его двуцепочечную форму.

[024] Другие дополнительные аспекты настоящего описания предоставляют внутриклеточный способ превращения одноцепочечного белка в его двуцепочечную форму, способ состоит из следующих этапов: а) рост клетки при 37°С от около 2 до около 8 часов, клетка содержит i) экспрессионный конструкт, содержащий открытую рамку считывания, кодирующую одноцепочечный белок, содержащий энзимный домен, транслокационный домен, связывающий домен не клостридиального токсина и двуцепочечный петлевой участок, содержащий сайт расщепления TEV протеазой и ii) другой экспрессионный конструкт, содержащий открытую рамку считывания, кодирующую TEV протеазу; б) рост клетки при от около 20 до около 24°С при от около 16 до около 18 часов, при этом рост на этапе (б) индуцирует экспрессию одноцепочечного белка и TEV протеазы на экспрессионных конструктах; и при этом производимая TEV протеаза расщепляет одноцепочечный белок в сайте расщепления TEV протеазой, находящемся внутри интегрированного с сайтом расщепления TEV протеазой домена связывания опиоидов, тем самым превращая одноцепочечный белок в его двуцепочечную форму.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

[025] Фигура 1 показывает доменную организацию встречающихся в природе клостридиальных токсинов. Одноцепочечная форма изображает линейную организацию от аминного к карбоксильному концу, включающую энзимный домен, транслокационных домен, и Не связывающий домен. Двуцепочечный петлевой участок, расположенный между транслокационным и энзимным доменами, отмечен двойной SS скобкой. Этот участок содержит двуцепочечный петлевой сайт расщепления эндогенной протеазой, после протеолитического расщепления которого встречающейся в природе протеазой, такой как, например эндогенная протеаза клостридиального токсина или встречающаяся в природе протеаза, вырабатываемая клеточным окружением, одноцепочечная форма токсина превращается в двуцепочечную форму.

[026] Фигура 2 показывает схему существующей на данный момент парадигмы высвобождения нейтротрансмиттера и интоксикации клостридильным токсином в центральном и периферийном нейроне. Фигура 2А показывает схему механизма высвобождения нейротрансмиттера из центрального и периферийного нейрона. Процесс высвобождения можно описать как содержащий два этапа: 1) стыковка везикулы, когда связанный с везикулой связанный SNARE белок везикулы, содержащей молекулы нейротрансмиттера, соединяется со связанными с мембраной SNARE белками, находящимися на плазматической мембране; и 2) высвобождение нейротрансмиттера, когда везикула сливается с плазматической мембраной и молекулы нейротрансмиттера подвергаются экзоцитозу. Фигура 2В показывает схему механизма интоксикации при активности столбнячного и ботулинового токсина в центральном и периферийном нейроне. Этот процесс интоксикации можно описать как содержащий четыре этапа: 1) связывание рецептора, при котором клостридиальный токсин связывается с системой клостридиального рецептора и инициирует процесс интоксикации; 2) интернализация комплекса, когда после связывания токсина везикула, содержащая системный комплекс токсин/рецептор, эндоцитируется в клетку; 3) транслокацию легкой цепи, когда, как предполагается, происходят множественные события, включая, например изменения во внутреннем рН везикулы, формирование перового канала, содержащего H_N домен тяжелой цепи клостридиального токсина, отделение легкой цепи клостридиального токсина от тяжелой цепи, и высвобождение активной легкой цепи и 4) энзимная модификация мишени, когда активированная легкая цепь клостридиального токсина протеолитически расщепляет свою мишень SNARE субстрат, такой как, например SNAP-25, VAMP или Синтаксин, тем самым предотвращая стыковку везикулы и высвобождение нейротрансмиттера.

[027] Клостридиальные токсины, вырабатываемые Clostridium botulinum, Clostridium tetani, Clostridium baratii и Clostridium butyricum, очень широко используются в терапевтическом и косметическом лечении людей и других млекопитающих. Штаммы С.botulinum вырабатывают семь антигенно различных типов ботулиновых токсинов (BoNTs), которые были идентифицированы при исследованиях вспышек ботулизма у людей (BoNT/A, /В, /Е и /F), животных (BoNT/C1 и /D), или выделены из почвы (BoNT/G). BoNTs обладают примерно на 35% идентичными аминокислотами и имеют одинаковую организацию функционального домена и общую структурную композицию. Специалистам будет ясно, что внутри каждого типа клостридиального токсина могут быть подтипы, которые в какой-то степени отличаются по своей аминокислотной последовательности, и также по нуклеиновым кислотам, кодирующим данные белки. Например, в настоящее время есть четыре подтипа BoNT/A: BoNT/A1, BoNT/A2, BoNT/А3 и BoNT/A4, при этом определенные подтипы показывают примерно 89% аминокислотной идентичности при сравнении с другими подтипами BoNT/A. Хотя все семь BoNT серотипов имеют сходную структуру и фармакологические свойства, каждый также демонстрирует гетерогенные бактериологические характеристики. В сравнение, токсин столбняка (TeNT) вырабатывается однородной группой С.tetani. Два других вида Clostridia, С.baratii и С.butyricum, вырабатывают токсины, BaNT и BuNT, которые сходны с BoNT/F и BoNT/E соответственно.

[028] Каждая зрелая двуцепочечная молекула содержит три функционально различных домена: 1) энзимный домен, находящийся в LC, который включает участок металлопротеазы, обладающий цинк-зависимой эндопептидазной активностью, специфичной мишенью которой являются центральные компоненты аппарата высвобождения нейтротрансмиттера; 2) транслокационный домен (H_N), находящийся ближе к аминному концу НС, который содействует высвобождению LC из внутриклеточных везикул в цитоплазму клетки-мишени; и 3) домен связывания (H_C), находящийся ближе к карбоксильному концу НС, который определяет связывающую активность и специфичность связывания токсина с рецепторным комплексом, находящимся на поверхности клетки-мишени. Домен H_C содержит два различных структурных компонента примерно одного размера, которые указывают на функцию и обозначаются как H_CN и H_CC субдомены. В Таблице 1 представлены приблизительные участки связывания для каждого домена, находящегося в приведенных в качестве примеров клостридиальных токсинах.

[029]

[030] Связывающая, транслокационная и энзимная активность этих трех функциональных доменов необходима для токсичности. Хотя все детали этого процесса еще точно не известны, общий клеточный интоксикационный механизм, посредством которого клостридиальные токсины входят в нейрон и ингибируют выброс нейтротрансмиттера, одинаков вне зависимости от серотипа или подтипа. Хотя податели заявки не имеют желания ограничиваться следующим описанием, механизм интоксикации можно описать как содержащий по крайней мере четыре этапа: 1) связывание рецептора, 2) интернализация комплекса, 3) транслокация легкой цепи, и 4) энзимная модификация мишени. Процесс начинается, когда НС домен клостридиального токсина связывается с токсин-специфичной рецепторной системой, локализованной на поверхности плазматической мембраны клетки-мишени. Полагают, что специфичность связывания с рецепторным комплексом достигается, в числе прочего, благодаря специфическим комбинациям ганглиозидных и белковых рецепторов, которые, по всей видимости, включают каждый комплекс клостридиального токсин-рецептора. Связавшись, комплексы токсин/рецептор интернализируются путем эндоцитоза и интернализованные везикулы сортируются по специфичным внутриклеточным путям. Этап транслокации, по-видимости, запускается ацидификацией компармента везикулы.

Этот процесс, видимо, инициируется двумя важными p