Химерные вирусоподобные частицы, содержащие гемагглютинин, сходные с частицами вируса гриппа

Химерные вирусоподобные частицы, содержащие гемагглютинин, сходные с частицами вируса гриппа

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ДАННОЕ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Данная заявка претендует на приоритет предварительной заявки США на патент №61/220161, поданной 24 июня 2009 г.

Данное изобретение относится к вирусоподобным частицам. Более конкретно, настоящее изобретение предусматривает вирусоподобные частицы, содержащие гемагглютинин химерного вируса гриппа, и способы получения химерных вирусоподобных частиц, сходных с частицами вируса гриппа.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Грипп является основной причиной смерти людей, вызванной респираторным вирусом, подсчитано, что во время «сезона гриппа» во всем мире могут быть инфицированы 10-20% населения, при этом каждый год умирают 250000-500000 людей.

Применяемый в настоящее время способ борьбы с заболеванием гриппом у людей состоит в ежегодной вакцинации. Обычно вакцина представляет собой комбинацию нескольких штаммов, которые рассматриваются как доминирующие штаммы в предстоящем сезоне гриппа, однако, количество доз вакцин, производимых ежегодно, является недостаточным для вакцинации всего населения в мире. Например, в Канаде и Соединенных штатах Америки производится количество доз вакцин, достаточное для иммунизации примерно одной трети населения, а в Европе в настоящее время могут быть вакцинированы только 17% населения - перед лицом возможной мировой пандемии гриппа это количество доз вакцин является недостаточным. Даже, если необходимое на год производство вакцин в данном году будет достаточным, доминирующие штаммы меняются от года к году, поэтому накопление вакцины в период отсутствия заболеваний в данном году не является рациональным. С экономической точки зрения крупномасштабное производство эффективной вакцины против гриппа представляет значительный интерес для правительств, а также для частных производителей в различных странах.

Гемагглютинин вируса гриппа (НА), являющийся поверхностным гликопротеином, представляет собой мембранный слитый белок и связывает рецепторы. Он является тримером идентичных подъединиц, каждая из которых содержит два полипептида, НА1 и НА2, связанных дисульфидными связями, которые получаются в результате протеолитического расщепления предшественника, НА0, который включает сигнальную пептидную последовательность на своем N - конце и мембранную якорную последовательность на С - конце. Расщепление с образованием НА1 и НА2 приводит к получению N - конца у меньшего полипептида, НА2, который содержит мембранную якорную последовательность на своем С - конце. Расщепление требуется для обеспечения активности слияния с мембраной, но не для иммуногенности. N - концевая последовательность НА2 называется "слитым пептидом", так как расщепление подобных гидрофобных последовательностей также требуется для проявления активности других слитых вирусных белков и потому, что аналоги синтетических пептидов, содержащие 20 остатков, сливаются с мембранами in vitro.

Вообще поверхность глобулярной «головки» содержит несколько гибких петель с хорошо охарактеризованными и вариабельными антигенными участками, обозначаемыми как А, В, С, D и Е (см. обзор в Wiley et al., 1987. Annu. Rev. Biochem. 56: 365-394). Инсерция или замещение коротких пептидных последовательностей в некоторых сайтах (например, В и Е) для изучения механизма иммунитета уже были описаны (см. Garcia - Sastre et al. 1995. Biologicals 23: 171-178).

Эпидермальный фактор роста (EGF), одноцепочечное антитело (scFV) и Fc - домен IgG, меняющиеся по размеру от 53 to 246 аминокислот, были введены инсерцией на N - конце вируса гриппа подтипа Н7, и химеры были успешно экспрессированы (см. Hatziioannou et al., 1999, Human Gene Therapy, 10: 1533-1544). Позже с амино - концом вируса подтипа Н3 были слиты 90 и 140 доменов аминокислот защитного антигена Bacillus anthracis (Li et al., 2005, Journ. Virol. 79: 10003-1002). Copeland (Copeland et al., 2005. J. Virol. 79: 6459-6471) описывает экспрессию поверхностного гликопротеина gp120 Env H1V на "стебле" Н3, где домен gp120 заместил всю глобулярную головку НА.

В качестве рекомбинантных вакцин - кандидатов от гриппа были разработаны несколько рекомбинантных продуктов. Подходы к их созданию были сфокусированы на экспрессии, продуцировании и очистке белков вируса гриппа типов А НА и NA, включая экспрессию этих белков с применением клеток насекомых, инфицированных бакуловирусом (Crawford et al, 1999, Vaccine, 17: 2265-74; Johansson, 1999, Vaccine, 17: 2073-80), вирусных векторов и конструктов ДНК - вакцин (Olsen et al., 1997, Vaccine 15: 1149-56).

Одним из путей предотвращения недиагностируемой инфекции является получение штамма неинфекционного вируса гриппа для производства вакцины. Или же в качестве заместителей культивируемого вируса можно изучать вирусоподобные частицы (VLP). VLP имитируют структуру капсида вируса, но не содержат генома и вследствие этого не могут реплицироваться или создавать средство для вторичной инфекции. Современные технологии производства VLP, сходной с частицами вируса гриппа, основаны на совместной экспрессии множественных вирусных белков, эта зависимость представляет собой недостаток, так как в случае пандемической системы и ежегодных эпидемий гриппа время ответа при проведении вакцинации является критическим. Более простая система производства VLP, например, система, которая основывается на экспрессии только одного или нескольких вирусных белков без необходимости экспрессии неструктурных вирусных белков, является желательной для ускорения развития вакцин.

Вирусы в оболочке могут получать свою липидную оболочку при «отпочковывании» от инфицированной клетки и приобретать мембрану из плазменной мембраны или из мембраны внутренней органеллы. Например, в системах клеток млекопитающих или клеток бакуловирусов вирус гриппа отпочковывается от плазменной мембраны (Quan et al., 2007, J. Virol, 81: 3514-3524). Известно, что только немногие вирусы в оболочке инфицируют растения (например, члены семейств вирусов Tospo viruses и Rhabdo viruses). Из известных вирусов растений в оболочке они характеризуются отпочковыванием от внутренних мембран клетки-хозяина, а не от плазменной мембраны. Хотя в клетках-хозяевах было получено небольшое количество рекомбинантных VLP, из плазменной мембраны не было получено ни одной такой VLP, что ставит вопрос о том, могут ли быть получены из плазменной мембраны VLP, сходные с частицами вируса гриппа, в растениях.

Образование VLP в любой системе предъявляет значительные требования к структуре белков - изменение коротких отрезков последовательности, которая соответствует выбранной структуре петель глобулярной структуры, может не оказывать большого влияния на экспрессию самого полипептида, однако, не известны результаты изучения структуры, которые демонстрируют влияние таких изменений на образование VLP. Совместное действие различных участков и структур НА (например, мембранные якорные последовательности, "стебель" и "ствол" тримера, которые отделяют глобулярную головку от мембран) меняется вместе с вирусом и не может быть подвержено подобным изменениям без потери целостности тримера НА и образования VLP.

Получение VLP НА вируса гриппа было ранее описано в заявке WO 2009/009876.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение относится к вирусоподобным частицам. Более конкретно, настоящее изобретение направлено на вирусоподобные частицы, содержащие химерный гемагглютинин вируса гриппа и на способы получения химерных вирусоподобных частиц, сходных с частицами вируса гриппа.

Цель данного изобретения состоит в получении усовершенствованной химерной вирусоподобной частицы (VLP), сходной с частицей вируса гриппа.

Настоящее изобретение предусматривает полипептид, включающий химерный НА вируса гриппа, содержащий кластер "стволового" домена (SDC), кластер головного домена (HDC) и кластер трансмембранного домена (TDC), где SDC включает субдомен F'1, F'2 и F; HDC включает субдомен RB, Е1 и Е2; TDC включает субдомен TmD и Ctail; где по меньшей мере один субдомен представляет собой субдомен первого НА вируса гриппа и другие субдомены являются субдоменами одного или более вторых НА вируса гриппа НА. Первый и второй НА вируса гриппа могут быть независимо выбраны из группы, включающей НА H1, Н3, Н5 и В. Кроме того, полипептид может включать сигнальный пептид.

Настоящее изобретение предусматривает также нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, включающий химерный НА вируса гриппа, содержащий кластер "стволового" домена (SDC), кластер головного домена (HDC) и кластер трансмембранного домена (TDC), где SDC включает субдомен F'1, F'2 и F; HDC включает субдомен RB, E1 и Е2; TDC включает субдомен TmD и Ctail; где по меньшей мере один субдомен представляет собой субдомен НА первого вируса гриппа и другие субдомены являются субдоменами НА одного или более второго вируса гриппа. Эта нуклеиновая кислота может также кодировать полипептид, который включает сигнальный пептид в добавление к доменам SDC, HDC и TDC, описанным выше.

Предусматривается также способ получения химерных вирусоподобных частиц (VLP), сходных с частицами вируса гриппа, в растении, который включает:

а) введение в растение или его часть нуклеиновой кислоты, кодирующей химерный НА вируса гриппа, включающий сигнальный пептид, кластер "стволового" домена (SDC), кластер головного домена (HDC) и кластер трансмембранного домена (TDC), где SDC включает субдомен F'1, F'2 и F; HDC включает субдомен RB, E1 и Е2; TDC включает субдомен TmD и Ctail; где по меньшей мере один субдомен представляет собой субдомен НА первого вируса гриппа и другие субдомены являются субдоменами одного или более второго НА вируса гриппа и

б) инкубирование растения или его части в условиях, которые позволяют осуществить экспрессию нуклеиновой кислоты, при этом получаются VLP.

Данное изобретение включает способ, описанный выше, где на стадии введения (на стадии а) нуклеиновая кислота вводится в растение транзиентно (временно). Или же на стадии введения (на стадии а) нуклеиновая кислота вводится в растение и стабильно интегрируется. Способ может также включать стадию с): сбора хозяина и очистки VLP.

Данное изобретение обеспечивает получение растения или его части, которые включают химерный НА вируса гриппа или нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный НА вируса гриппа, химерный НА вируса гриппа, содержащий кластер "стволового" домена (SDC), кластер головного домена (HDC) и кластер трансмембранного домена (TDC), где SDC включает субдомен F'1, F'2 и F; HDC включает субдомен RB, E1 и Е2; TDC включает субдомен TmD и Ctail; где по меньшей мере один субдомен представляет собой субдомен НА первого вируса гриппа и другие субдомены являются субдоменами одного или более НА второго вируса гриппа.

Это растение или его часть могут также включать нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую один или более шапероновых белков, функционально связанных с регуляторной активной областью в растении. Один или более, чем один шапероновый белок может быть выбран из группы, включающей Hsp40 и Hsp70.

Настоящее изобретение относится к вирусоподобной частице (VLP), включающей химерный НА вируса гриппа, химерный НА вируса гриппа, содержащий кластер стволового домена (SDC), кластер головного домена (HDC) и кластер трансмембранного домена (TDC), где SDC включает субдомен F'1, F'2 и F; HDC включает субдомен RB, Е1 и Е2; TDC включает субдомен TmD и Ctail; где по меньшей мере один субдомен представляет собой субдомен НА первого вируса гриппа и другие субдомены являются субдоменами НА одного или более второго вируса гриппа. VLP может также включать специфические для растения N-гликаны или модифицированные N-гликаны.

Данным изобретением предусмотрена также композиция, содержащая эффективную дозу VLP, описанной выше, и фармацевтически приемлемый носитель.

В соответствии с альтернативным аспектом данного изобретения предусмотрен способ индуцирования иммунитета к инфекции вирусом гриппа у субъекта, включающий введение VLP субъекту. VLP могут вводиться субъекту перорально, интрадермально или интраназально, внутримышечно, интраперитонеально, внутривенно или подкожно.

Регуляторные области, которые могут быть функционально связаны с последовательностью, кодирующей химерный белок НА, включают области, которые функционируют в клетке растения, в клетке насекомого или в дрожжевой клетке. Такие регуляторные области могут включать регуляторную область пластоцианина, регуляторную область рибулозо-1,5-бифосфаткарбоксилазы/оксигеназы (RuBisCO), регуляторную область хлорофиллового а/b-связывающего белка (CAB) или регуляторную область ST - LSI. Другие регуляторные области включают 5'UTR, 3'UTR или терминаторные последовательности. Регуляторная область пластоцианина может представлять собой участок пластоцианина люцерны; 5'UTR, 3'UTR или терминаторные последовательности также могут быть последовательностями белка люцерны.

Данное изобретение предусматривает полипептид химерного НА вируса гриппа, выбранного из первичного вируса гриппа и вторичного вируса гриппа, при этом первичный вирус гриппа и вторичный вирус гриппа могут быть независимо выбраны из группы, включающей В, H1, Н2, Н3, Н4, Н5, H6, Н7, Н8, Н9, H10, H11, Н12, Н13, Н14, H15 и Н16; при условии, что первичный вирус гриппа и вторичный вирус гриппа не являются одними и теми же самыми типами, подтипами вирусов гриппа или не имеют одного и того же происхождения.

В соответствии с некоторыми аспектами данного изобретения полипептид химерного НА вируса гриппа включает сигнальную пептидную последовательность, сигнальная пептидная последовательность может быть выбрана из группы, включающей нативную сигнальную пептидную последовательность, PDI сигнальную последовательность люцерны, сигнальную последовательность вируса гриппа Н5 и сигнальную пептидную последовательность вируса гриппа H1.

Данное изобретение предусматривает способ получения VLP, содержащей химерный гемагглютинин (НА) вируса гриппа с хозяином, способным продуцировать VLP и включающим растение, насекомое или дрожжи, заключающийся во введении в клетку хозяина нуклеиновой кислоты, кодирующей химерный НА вируса гриппа, включающий кластер стволового домена (SDC), кластер головного домена (HDC) и кластер трансмембранного домена (TDC), где SDC включает субдомен F'1, F'2 и F; HDC включает субдомен RB, Е1 и Е2; TDC включает субдомен TmD и Ctail; где по меньшей мере один субдомен представляет собой субдомен НА первого вируса гриппа и другие субдомены являются субдоменами НА одного или более второго вируса гриппа, и в инкубировании хозяина в условиях, которые позволяют осуществиться экспрессии нуклеиновой кислоты, при этом образуются VLP.

Получение VLP в растениях имеет несколько преимуществ по сравнению с получением этих частиц в культуре клеток насекомого. Растительные липиды могут стимулировать специфические иммунные клетки и способствуют вызванному иммунному ответу. Растительные мембраны изготовлены из липидов фосфатидилхолина (PC) и фосфатидилэтаноламина (РЕ) и содержат также гликосфинголипиды, которые являются уникальными для растений и некоторых бактерий и простейших. Сфинголипиды необычны тем, что они не являются эфирами глицерина, такими как PC или РЕ, но скорее состоят из длинноцепочечного аминоспирта, который образует амидную связь с цепью жирной кислоты, содержащей более 18 атомов углерода. PC и РЕ, а также гликосфинголипиды могут связываться с молекулами CD1, экспрессированными иммунными клетками млекопитающего, такими как антиген - презентирующие клетки (АРС) типа дендритных клеток, и макрофаги и другие клетки, включающие В- и T-лимфоциты в вилочковой железе и печени. Кроме того, в дополнение к потенциальному адъювантному эффекту от наличия растительных липидов способность растительных N-гликанов увеличивать захват антигенов гликопротеина антиген - представляющими клетками может обеспечивать преимущество при получении химерных VLP в растениях. Не ограничиваясь какой-либо теорией, ожидают, что полученные в растениях химерные VLP вызовут более сильный иммунный ответ, чем химерные VLP, полученные в других системах, и что иммунная реакция, вызванная этими полученными в растениях химерными VLP, является более сильной, чем в случае иммунной реакции, вызванной живой или ослабленной цельно - вирионной вакциной.

В противоположность вакцинам, изготовленным из цельных вирусов, химерные VLP обеспечивают преимущество, состоящее в том, что они не являются инфекционными, поэтому ограничивающая их применение биологическая безопасность не является такой существенной, как в случае целого инфекционного вируса и она не требуется для производства вакцины. Полученные в растениях химерные VLP обеспечивают еще одно преимущество за счет выращивания системы экспрессии в теплице или в поле, что является значительно более экономичным и подходящим для масштабирования производства.

Кроме того, растения не включают ферменты, участвующие в синтезе и присоединении остатков сиаловой кислоты к белкам. VLP могут быть получены в отсутствие нейраминидазы (NA) и поэтому нет необходимости в совместной экспрессии NA или в обработке получающихся клеток или экстракции сиалидазой (нейраминидазой) для обеспечения получения VLP в растениях.

Изложенная сущность изобретения не описывает все признаки этого изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ

Эти и другие признаки изобретения станут более очевидными из следующего ниже описания, в котором даются ссылки на прилагаемые рисунки, которые представляют собой следующее:

Фигура 1A показывает схематическую диаграмму субдоменов НА вируса. СР: сигнальный пептид, F'1, F'2, и F: субдомены слияния; RB: рецептор-связывающий субдомен, Е1 и Е2: субдомены эстеразы, TMD/СТ: трансмембранный и цитоплазматический хвостовые субдомены. Фигура 1B схематически отображает кассеты экспрессии на основе пластоцианина (номера конструктов: 774, 540, 660, 690, 691, 696) для экспрессии гемагглютинина H1 A/Brisbane/59/2007 (H1/Bri), гемагглютинина H1 A/New Caledonia/20/99 (H1/NC) и гемагглютинина Н5 A/Indonesia/5/05 (Н5/Indo) в нативной и в химерной формах. Plasto pro: промотор пластоцианина люцерны, Plasto ter : терминатор пластоцианина люцерны, SP : сигнальный пептид, RB: рецептор-связывающий субдомен, Е1-RB-Е2: субдомен эстеразы и рецептор-связывающий субдомен, TMD/СТ : трансмембранный и цитоплазматический хвостовые субдомены, PDI : протеин - дисульфидизомераза люцерны. Фигура 1C показывает выравнивание последовательности аминокислот, наложенное на структурное выравнивание нескольких вирусов гриппа HAs (В/Florida/4/2006 (В Florida), SEQ ID NO: 94 (GenBank Accession No. ACA33493.1; В/Malaysia/2506/2004 (В - Malaysia), SEQ ID NO: 95 (GenBank Accession No. ABU99194.1; H1/Bri (A - Brisbane), SEQ ID NO: 96 (GenBank Accession No. ADE28750.1; H1 A/Solomon Islands/3/2006 (A - Sol.Isl), SEQ ID NO: 97 (GenBank Accession No. ABU99109.1); H1/NC (A - NewCal)., SEQ ID NO: 98 (GenBank Accession No. AAP34324.1; H2 A/Singapore/1/1957 (A - Singapore), SEQ ID NO: 99 (GenBank Accession No. AAA64366.1); H3 A/Brisbane/10/2007 (A - Brisbane), SEQ ID NO: 100 (GenBank Accession No. ACI26318.1); H3 A/Wisconsin/67/2005 (A - WCN), SEQ ID NO: 101 (GenBank Accession No. AB037599.1); Н5 A/Anhui 1/2005 (A - Anhui), SEQ ID NO: 102 (GenBank Accession No. ABD28180.1); Н5 A/Vietnam/1194/2004 (A - Vietnam), SEQ ID NO: 103 (GenBank Accession No. ACR48874.1); Н5 - Indo, SEQ ID NO: 104 (GenBank Accession No. ABW06108.1. Указаны границы между субдоменами F'1, эстеразы 1, рецептор-связывающим, эстеразы 2, F'2, белка слияния, TMD/СТ и дисульфидными мостиками.

На Фигуре 2 показана аминокислотная последовательность указанных субдоменов химерного НА вируса, экспрессированного при помощи конструктов 690, 734 (SEQ ID NO: 11), 696 (SEQ ID NO: 112), что показано на верхней панели, и 691 (SEQ ID NO: 113), что показано на нижней панели. Аминокислоты 1-92 в SEQ ID NO: 111 представляют собой F'1+E1 домен Н5/Indo; аминокислоты 93-263 представляют собой RB головной домен H1/Brisbane и аминокислоты 264-552 представляют собой домен E2+F'2 Н5/Indo. Аминокислоты 1-92 в SEQ ID NO: 112 представляют собой домен F'1+E1B Н5/NC; аминокислоты 93-301 представляют собой головной домен RB в Н5/Indo и аминокислоты 302-586 представляют собой домен E2+F'2 в H1/NC. Аминокислоты 1-42 в SEQ ID NO: 113 представляют собой домен F'1B Н5/Indo; аминокислоты 43-273 представляют собой головной домен Е1-RB-Е2 в H1/Brisbane и аминокислоты 274-552 представляют собой домен F'2 в Н5/Indo.

На Фигуре 3 приведена аминокислотная последовательность кодирующей области конструктов 690 и 734 (SEQ ID NO: 80), включающая субдомен RB H1/Bri, сигнальный пептид Н5/Indo и комплекс "стволового" домена (SDC), включающего субдомены Н5/Indo F'1, El, E2, F'2 и F.

На Фигуре 4 приведена аминокислотная последовательность кодирующей области конструкта 691 (SEQ ID NO: 81), включающего комплекс головного домена H1/Bri (HDC), включающего сигнальный пептид Е1, RB, E2, Н5/Indo, и комплекс "стволового" домена Н5/Indo (SDC), включающего субдомены Н5/Indo F'1, F'2 и F.

На Фигуре 5 приведена аминокислотная последовательность кодирующей области конструкта 696 (SEQ ID NO: 82), включающего субдомен RB в Н5/Indo, сигнальный пептид PDI и комплекс "стволового" домена (SDC) H1/NC, включающий F'1, El, E2 и F'2.

На Фигуре 6 показаны результаты определения методом иммуноблоттинга уровня экспрессии H1/Bri в нативной форме, конструкта 774 (включающего H1/Bri), конструкта 692 (включающего комплекс головного домена (HDC) в H1/Bri) и конструкта 690 (включающего субдомен RB в H1/Bri, слитый с комплексом "стволового" домена (SDC) Н5/Indo в растениях. Для каждого конструкта проводили анализ экстрактов белков, полученных из трех отдельных растений. Загружали 20 мг белка для каждого анализируемого растения. Вестерн-блот выявляли при помощи моноклональных антител к НА (анти - H1 - Brisbane; FII 10-150). Конструкт 774 экспрессирует H1/Bri при помощи нативного сигнального пептида H1/Bri; конструкты 690, 691 экспрессируют НА при помощи нативного сигнального пептида Н5/Indo.

На Фигуре 7 показаны результаты определения методом иммуноблоттинга уровня экспрессии Н5/Indo в нативной форме, конструкта 660 (включающего H5/Indo) или конструкта 696 (включающего субдомен H1/Indo RB, слитый с субдоменами H1/NC SDC, E1 и Е2). Для каждого конструкта проводили анализ экстрактов белков, полученных из трех отдельных растений. Загружали 20 мкг белка для каждого анализируемого растения. Вестерн-блот выявляли при помощи поликлональных антител к Н5 Indonesia (ITC IT-003-005V). Конструкт 660 экспрессирует Н5/Indo при помощи своего нативного сигнального пептида; конструкт 696 экспрессирует химерный НА при помощи сигнального пептида PDI.

На Фигуре 8 схематически показаны основанные на 35SCPMV/НТ кассеты экспрессии H1/Bri в нативной (конструкт 732) и химерной (конструкты 733 и 734) формах. Конструкт 733, включает сигнальный пептид PDI и HDC, SDC и комплекс трансмембранного домена (TDC) в H1/Bri и конструкт 734 включает сигнальный пептид Н5/Indo, F'1, El, Е2, F'2, F, и RB из H1/Bri. 35S pro: промотор CaMV 35S, NO ter: терминатор нопалин - синтазы, SP: сигнальный пептид, RB: рецептор-связывающий субдомен, E1-RB-E2: субдомен эстеразы и рецептор-связывающий субдомен, TMD/СТ: трансмембранный и цитоплазматический хвостовые субдомены, PDI: протеин - дисульфидизомераза люцерны; CPMV - НТ: 5' и 3' - элементы гипертранслируемой системы экспрессии вируса мозаики коровьего гороха Cowpea Mosaic Virus.

На Фигуре 9 приведены результаты определения методом иммуноблоттинга уровня экспрессии H1/Bri в нативной форме, конструкта 732 (включающего H1/Bri под контролем основанной на 35SCPMV/НТ кассеты экспрессии), конструкта 733 (включающего сигнальный пептид PDI, который слит с H1/Bri; под контролем основанной на 35SCPMV/НТ кассеты экспрессии) или конструкта 734, включающего субдомен H1/Bri RB, который слит с субдоменами Н5/Indo SDC, E1 и Е2; под контролем основанной на 35SCPMV/НТ кассеты экспрессии). Для каждого конструкта проводили анализ экстрактов белков, полученных из трех отдельных растений. Загружали 5 мкг белка для каждого анализируемого растения. Вестерн-блот проявляли при помощи моноклональных антител к НА (FII 10-150).

На Фигуре 10 схематически показаны основанные на 35SCPMV/НТ кассеты экспрессии гемагглютининов H3A/Brisbane/10/2007 НА (H3/Bri) и В/Florida/4/2006 НА (В/Flo). Конструкт 736 включает Н3/Bri, слитый с сигнальным пептидом PDI. Конструкт 737 включает Н3/Bri, который слит с сигнальным пептидом PDI и Н5/Indo TMD/СТ. Конструкт 739 включает В/Flo, который слит с сигнальным пептидом PDI. Конструкт 745Включает В/Flo, который слит с сигнальным пептидом PDI, и Н5/Indo TMD/СТ. 35S pro: промотор CaMV 35S, NO ter: терминатор нопалин - синтазы, SP: сигнальный пептид, RB: рецептор-связывающий субдомен, Е1-RB-Е2: субдомен эстеразы и рецептор-связывающий субдомен, TMD/СТ: трансмембранный и цитоплазматический хвостовые субдомены, PDI: протеин - дисульфидизомераза люцерны; CPMV - НТ: 5' и 3' - элементы гипертранслируемой системы экспрессии вируса мозаики коровьего гороха.

На Фигуре 11 показана граница слияния в конструктах номер 745 и номер 737. Происхождение последовательности НА указано стрелками, заканчивающимися жирными точками. Аминокислоты трансмембранного домена представляют собой QILSIYSTVA и им предшествуют аминокислоты, которые являются частью эктодомена.

На Фигуре 12 показана аминокислотная последовательность химерного гемагглютинина Н5/Н3 (SEQ ID NO: 83; конструкт 737), включающего сигнальный пептид PDI, эктодомен H3A/Brisbane/10/2007 и TMD/СТ в Н5 A/Indonesia/5/2005.

На Фигуре 13 показана аминокислотная последовательность химерного гемагглютинина Н5/В (SEQ ID NO: 84), включающего эктодомен В/Florida/4/2006 и TMD/СТ в Н5 А/Indonesia/5/2005, кодируемый открытой рамкой считывания в конструкте номер 745.

На фигуре 14 показаны результаты определения методом иммуноблоттинга уровня экспрессии В/Flo в нативной форме, конструкта 739 (включающего PDI-В/Flo) или с конструктом 745 (включающим В/Flo HDC и SDC, слитый с TDC H5/Indo). Для каждого конструкта проводили анализ экстрактов белков, полученных из трех отдельных растений. Загружали 20 мг белка для каждого анализируемого растения. Вестерн-блот выявляли при помощи поликлональных антител к НА В/Florida (NIBSC 07/356).

На фигуре 15 показаны результаты определения методом иммуноблоттинга уровня экспрессии Н3/Bri в нативной форме, конструкта 736 (включающего PDI sp-H3/Bri) или с конструктом 737 (H3/Bri HDC и SCD, слитый с H5/Indo TDC). Для каждого конструкта проводили анализ экстрактов белков, полученных из трех отдельных растений. Загружали 20 мг белка для каждого анализируемого растения. Вестерн-блот выявляли при помощи поликлональных антител к Н3 Brisbane (NIBSC 08/124).

На Фигуре 16 приведены результаты гель-хроматографии белковых экстрактов, полученных из листьев растений, инфильтрированных конструктом номер 745. Для каждой фракции показано относительное содержание белка во фракциях элюирования. Результаты иммунологического анализа (Вестерн-блоттинга) гемагглютинина с применением поликлональных антител к НА В/Florida (NIBSC 07/356) во фракциях 7-15 показаны под графиком. Пик элюирования Blue Dextran 2000 показан стрелкой (фракция 8).

На Фигуре 17 показана последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 52) синтезированного фрагмента, включающего полный участок кодирования H5 (А/Indonesia/5/05 (H5N1)) (включающий сигнальный пептид и стоп - код он), фланкированный в положении 5' сайтом HindIII и в положении 3' - сайтом SacI.

На Фигуре 18 показана последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 53) конструкта 660, кассета экспрессии НА, включающая промотор пластоцианина люцерны и 5'UTR, последовательность, кодирующую гемагглютинин формы H5 А/Indonesia/5/05 (H5N1), последовательность 3'UTR пластоцианина люцерны и терминаторная последовательность.

На Фигуре 19 показана последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 54) H1 дикого типа (А/New Caledonia/20/99 (H1N1) (GenBank acc. no. AY 289929), кодирующая последовательность без TmD и Ctail.

На Фигуре 20 приведена последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 55) синтезированного фрагмента, содержащая последовательность, кодирующую H1 (А/New Caledonia/20/99 (H1N1), в которой отсутствуют TmD и Ctail. В положении 5' последние нуклеотиды происходят от PDI SP и включают сайт рестрикции BglII и в положении 3', двойной сайт SacI/StuI расположен сразу же в направлении 5'-3' стоп - ко дона.

На Фигуре 21 приведена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 56) синтезированного фрагмента, содержащая последовательность, кодирующую С - ter H1 (А/New Caledonia/20/99 (H1N1)), включающую TmD и Ctail из сайта Kpnl к стоп - кодону (фланкированному в положении 3' двойным сайтом SacI/StuI).

На Фигуре 22 оказана нуклеотидная последовательность для Medicago sativa mRNA протеин - дисульфидизомеразы. GenBank Accession No. Z11499 (SEQ ID NO: 57). Нуклеотиды 32-103 кодируют сигнальный пептид PDI.

На Фигуре 23 показана нуклеотидная последовательность плазмиды PromPlasto - PDISP - Plasto 3'UTR. На Фигуре 23A показана нуклеотидная последовательность в PromPlasto - PDISP (SEQ ID NO: 58). На Фигуре 23B показана нуклеотидная последовательность в Plasto 3'UTR (SEQ ID NO: 85). Сигнальный пептид протеин-дисульфидизомеразы (PDI) подчеркнут. Сайты рестрикции BglII (AGATCT) и SacI (GAGCTC), использованные для клонирования, выделены жирным шрифтом.

На Фигуре 24 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 59; конструкт 540) кассеты экспрессии НА, включающей промотор пластоцианина люцерны и 5'UTR, последовательность, кодирующую сигнальный пептид из PDI и формы H1A/New Caledonia/20/99 (H1N1), 3'UTR и терминаторные последовательности пластоцианина люцерны. H1 из кодирующей последовательности А/New Caledonia/20/1999 подчеркнута.

На Фигуре 25 приведена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 60) синтезированного фрагмента, содержащая полную область, кодирующую H1 (А/Brisbane/59/07 (H1N1) (включая сигнальный пептид и стоп - кодон), фланкированный в положении 5' последовательностями гена пластоцианина люцерны, соответствующими первьм 84 нуклеотидам в обратном направлении от первоначального ATG, начиная с сайта DraIII, и фланкированного в положении 3'-сайтом SacI.

На Фигуре 26 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 61; конструкт 774) кассеты для экспрессии НА, включающей промотор и 5'UTR пластоцианина люцерны, последовательность, кодирующую гемагглютинин формы H1A/Brisbane/59/07 (H1N1), последовательность 3'UTR и терминаторную последовательность пластоцианина люцерны.

На Фигуре 27 показана нуклеотидная последовательность кассеты экспрессии номер 828 (SEQ ID NO: 62) от сайта PacI (против хода транскрипции относительно промотора) к сайту Asd (непосредственно по ходу транскрипции от NO - терминатора). Последовательность CPMV НТ 3'UTR подчеркнута и мутированный ATG выделен жирным шрифтом. Сайт рестрикции Apal подчеркнут и выделен курсивом.

На Фигуре 28 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 63; конструкт 690) кассеты экспрессии химерного Н5/H1, включающая промотор и 5'UTR пластоцианина люцерны, последовательность, кодирующую химерный гемагглютинин, 3'UTR и терминаторную последовательность пластоцианина люцерны. Последовательность, кодирующая химерный НА, подчеркнута.

На Фигуре 29 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 64; конструкт 691) кассеты для экспрессии химерного Н5/H1, включающая промотор и 5'UTR пластоцианина люцерны, последовательность, кодирующую химерный гемагглютинин, 3'UTR и терминаторную последовательность пластоцианина люцерны. Последовательность, кодирующая химерный НА, подчеркнута.

На Фигуре 30 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 65; конструкт 696) кассеты экспрессии химерного Н5/H1, включающая промотор пластоцианина люцерны и 5'UTR, последовательность, кодирующую химерный гемагглютинин, последовательность 3'UTR и терминаторную последовательность пластоцианина люцерны. Последовательность, кодирующая химерный НА, подчеркнута.

На Фигуре 31 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 66; конструкт 732) кассеты экспрессии НА, включающая промотор CaMV 35S, CPMV-НТ 5'UTR, кодирующую последовательность гемагглютинина формы H1 A/Brisbane/59/07 (H1N1), терминаторные последовательности CPMV - НТ 3'UTR и NO. Последовательность, кодирующая H1/Bri, подчеркнута.

На Фигуре 32 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 67) кодирующей последовательности от ATG до стоп - кодона промежуточного конструкта номер 787.

На Фигуре 33 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 68; конструкт номер 733) кассеты экспрессии SpPDI H1/Bri, включающей промотор CaMV 35S, CPMV-HT 5'UTR, последовательность, кодирующую сигнальный пептид из PDI, кодирующую последовательность гемагглютинина формы H1A/Brisbane/59/07 (H1N1), CPMV - НТ 3'UTR и последовательности NO - терминатора. Последовательность, кодирующая SpPDI H1/Bri, подчеркнута.

На Фигуре 34 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 69; конструкт номер 734) кассеты экспрессии химерного Н5/H1, включающая промотор CaMV 35S, CPMV - НТ 5'UTR, кодирующую последовательность химерного гемагглютинина, последовательность CPMV - НТ 3'UTR и последовательность NO - терминатора. Последовательность, кодирующая химерный НА, подчеркнута.

На Фигуре 35 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 70) синтезированного фрагмента, включающего полный кодирующий участок Н3 (А/Brisbane/10/07 (H3N2)) (включая сигнальный пептид и стоп - кодон), фланкированный в положении 5' нуклеотидными последовательностями генов пластоцианина люцерны, соответствующими первьм 84 нуклеотидам против хода транскрипции от исходного ATG, начиная с сайта DraIII, и в положении 3' - сайтом SacI.

На Фигуре 36 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 71; конструкт номер 736) кассеты экспрессии НА, включающей промотор CaMV 35S, CPMV-HT 5'UTR, кодирующую последовательность сигнального пептида из PDI, кодирующую последовательность гемагглютинина формы H3A/Brisbane/10/07 (H2N3), CPMV - HT 3'UTR и последовательности NO - терминатора. Последовательность, кодирующая SpPDI H1/Bris, подчеркнута.

На Фигуре 37 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 72; конструкт номер 737) кассеты экспрессии химерного Н5/H3, включающая промотор CaMV 35S, CPMV-HT 5'UTR, кодирующую последовательность сигнального пептида из PDI, кодирующую последовательность химерного гемагглютинина, последовательность CPMV-HT 3'UTR и последовательности NO - терминатора. Последовательность, кодирующая химерный НА, подчеркнута.

На Фигуре 38 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 73) синтезированного фрагмента, включающая полную область, кодирующую НА (В/Florida/4/06) (включая сигнальный пептид и стоп - кодон), фланкированный в положении 5' нуклеотидными последовательностями гена пластоцианина люцерны, соответствующими первым 84 нуклеотидам вверх по ходу транскрипции от исходной ATG, начиная с сайта DraIII, и фланкированного в положении 3' сайтом SacI.

На Фигуре 39 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 74; конструкт номер 739) кассеты экспрессии НА, включающая промотор CaMV35S, CPMV - HT 5'UTR, последовательность, кодирующую сигнальный пептид из PDI, кодирующую последовательность гемагглютинина НА формы В/Florida/4/06, CPMV - HT 3'UTR и последовательности NO - терминатора. Последовательность, кодирующая Sp PDI B/Flo, подчеркнута

На Фигуре 40 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 75; конструкт номер 745) кассеты экспрессии химерного Н5/В, включающая промотор CaMV 35S, CPMV-HT 5'UTR, кодирующую последовательность химерного гемагглютинина, последовательность CPMV-HT 3'UTR и последовательности NO - терминатора. Последовательность, кодирующая химерный НА, подчеркнута.

На Фигуре 41 показана нуклеотидная последовательность, кодирующая Msj1 (SEQ ID NO: 76).

На Фигуре 42 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 77) части конструкта номер R850 от сайта HindIII (в сайте множественного клонирования, против хода транскрипции от промотора) до сайта EcoRI (по ходу транскрипции от терминатора NO). Последовательность, кодирующая HSP40, подчеркнута.

На Фигуре 43 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 78) части конструкта номер R860 от сайта HindIII (в сайте множественного клонирования, против хода транскрипции от промотора) до сайта EcoRI (сразу же по ходу транскрипции от терминатора NO). Последовательность, кодирующая HSP70, подчеркнута.

На Фигуре 44 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 79) части конструкта номер R870 от сайта HindIII (в сайте множественного клонирования, против хода транскрипции от промотора) до сайта EcoRI (по ходу транскрипции по течению от терминатора NO). Последовательность, кодирующая HSP40, выделена курсивом и подчеркнута и последовательность, кодирующая HSP70, подчеркнута.

На Фигуре 45 представлено схематическое изображение конструкта номер R472.

На Фигуре 46 показан дисульфидный мостиковый "образ" вируса гриппа типа А. Нумерация в мостике: 1) Cys4HA1-Cysl37HA2, 2) Cys60HA1-Cys72HA1, 3) Cys94HA1-Cysl43HA1, 4) Cys292HA1-Cys318HA1 5) Cysl44HA2-Cysl48HA2 и 6) Cys52HA1-Cys277HA1. Дисульфидные мостики, которые являются разными у вирусов подтипов А и В (Фигура 47), указаны стрелками. Применена нумерация, начиная от зрелого белка Н3.

На Фигуре 47 показан дисульфидный мостиковый "образ" вируса гриппа типа В НА. Нумерация в мостике: 1) Cys4HA1-Cysl37HA2, 2) Cys60HA1-Cys72HA1, 3) Cys94HA1-Cysl43HA1, 4) Cys292HA1-Cys318HA1 5) Cysl44HA2-Cysl48HA2, 6) Cys52HA1-Cys277HA1, 7) Cys54HA1-Cys57HA1 и 8) Cysl78HA1-Cys272HA1. Дисульфидные мостики, которые являются разными у вирусов подтипов А и В (Фигура 46), указаны стрелками. Применена нумерация последовательности зрелого белка Н3.

На Фигуре 48 показана схематическая диаграмма, которая показывает переходы слияния в домене. На Фигуре 48A показано слияние субдомена RB от H1/Bri, Н3/Bri и В/Flo с Н5/Indo SDC's, и субдомена RB от Н5/Indo со "стволовым" доменом H1/NC. На Фигуре 48B показано слияние субдоменов Е1-RB-Е2 (HDC) от H1/Bri, Н3/Bri или В/Flo с Н5/Indo SDC и Н5/Indo HDC с SDC H1/NC.

На Фигуре 49A показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 86) H1 A/California/04/09. Последовательность, кодирующая сигнальный пептид протеин - дисульфидизомераз