Гуманизированные моноклональные антитела к сеа с созревшей аффинностью

Гуманизированные моноклональные антитела к сеа с созревшей аффинностью

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Предпосылки создания изобретения Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к антигенсвязывающим молекулам (АСМ). Конкретные варианты осуществления настоящего изобретения относятся к рекомбинантным моноклональным антителам, включая химерные, приматизированные или гуманизированные антитела, обладающие специфичностью в отношении человеческого карциноэмбрионального антигена СЕА. Кроме того, настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют указанные АСМ, и векторам и клеткам-хозяевам, содержащим указанные молекулы нуклеиновых кислот. Изобретение относится также к способам получения АСМ, предлагаемых в изобретении, и к способам применения указанных АСМ для лечения заболевания. Кроме того, настоящее изобретение относится к АСМ с модифицированным гликозилированием, которые обладают улучшенными терапевтическими свойствами, включая антитела с повышенной способностью к связыванию с Fc-рецептором и повышенной эффекторной функцией, такой как ADCC.

Известный уровень техники

Карциноэмбриональный антиген (СЕА) и антитела к СЕА

Карциноэмбриональный антиген (СЕА, который обозначают также как СЕАСАМ-5 или CD66e) представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 180 кДа. СЕА является представителем суперсемейства иммуноглобулинов и содержит семь доменов, которые связаны с клеточной мембраной посредством гликозилфосфатидилинозитольного якоря (GPI) (Thompson J.A., J Clin Lab Anal. 5, 1991, cc.344-366). Семь доменов включают одну N-концевую вариабельную область Ig и шесть доменов (А1-В1-А2-В2-А3-В3), гомологичных константным областям Ig (Hefta L.J. и др., Cancer Res. 52, 1992, cc.5647-5655).

Семейство человеческих СЕА содержит 29 генов, из которых 18 точно определены: 7 принадлежат к подгруппе СЕА и 11 к подгруппе специфических для беременности гликопротеинов. Несколько представителей подгруппы СЕА, вероятно, обладают способностью к клеточной адгезии. СЕА, вероятно, принимает участие в развитии врожденного иммунитета (Hammarstrom S., Semin Cancer Biol. 9(2), 1999, cc.67-81). В связи с наличием белков, близкородственных к СЕА, может возникать задача получения антител к СЕА, специфических в отношении СЕА, которые обладают при этом минимальной перекрестной реактивностью к другим близкородственным белкам.

СЕА ранее был идентифицирован в качестве ассоциированного с опухолью антигена (Gold и Freedman, J Exp Med., 121, 1965, cc. 439-462; Berinstein N.L., J Clin Oncol., 20, 2002, cc.2197-2207). Хотя СЕА первоначально был классифицирован в качестве белка, который экспрессируется только в эмбриональной ткани, в настоящее время СЕА обнаружен в некоторых здоровых тканях взрослых особей. Эти ткани имеют в основном эпителиальное происхождение и включают клетки желудочно-кишечной, респираторной и мочеполовой систем, а также клетки ободочной кишки, шейки матки, потовых желез и предстательной железы (Nap и др., Tumour Biol., 9(2-3), 1988, cc.145-153; Nap и др., Cancer Res., 52(8), 1992, cc. 2329-2339).

Опухоли эпителиального происхождения, а также их метастазы содержат СЕА в качестве ассоциированного с опухолью антигена. Хотя присутствие СЕА само по себе не свидетельствует о превращении в раковую клетку, распределение СЕА является показательным. В здоровой ткани СЕА, как правило, экспрессируется на апикальной поверхности клетки (Hammarstrom S., Semin Cancer Biol. 9(2), 1999, cc.67-81), делая ее недоступной для антитела, присутствующего в кровотоке. В отличие от здоровой ткани в случае раковых клеток СЕА имеет тенденцию к экспрессии по всей их поверхности (Hammarstrom S., Semin Cancer Biol. 9(2), 1999, cc.67-81). Указанное изменение схемы экспрессии делает СЕА доступным для связывания с антителом в раковых клетках. Кроме того, уровень экспрессии СЕА возрастает в раковых клетках. Кроме того, повышенный уровень экспрессии СЕА стимулирует повышенную межклеточную адгезию, что может приводить к метастазам (Marshall J., Semin Oncol., 30 (приложение 8), 2002, cc.30-36).

СЕА легко отщепляется от клеточной поверхности и проникает в кровоток из опухолей либо непосредственно, либо через лимфатические сосуды. Благодаря этой особенности уровень СЕА в сыворотке использовали в качестве клинического маркера для диагностики различных видов рака и скрининга в отношении рецидива различных видов рака, прежде всего колоректального рака (Goldenberg D М., The International Journal of Biological Markers, 7, 1992, cc. 183-188; Chau I. и др., J Clin Oncol., 22, 2004, cc.1420-1429; Flamini и др., Clin Cancer Res; 12(23), 2006, cc.6985-6988). Эта особенность определяет также одну из возможностей применения СЕА в качестве мишени, поскольку сывороточный СЕА связывается с большинством доступных в настоящее время антител к СЕА, препятствуя их взаимодействию с их мишенями на клеточной поверхности и ограничивая тем самым потенциальные клинические воздействия.

Создано множество моноклональных антител к СЕА, пригодных для исследовательских целей, в качестве диагностических «инструментов» и для терапевтических целей (см., например, Nap и др., Cancer Res., 52(8), 1992, cc. 2329-2339; Sheahan и др., Am.J.Clin. Path. 94, 1990, cc. 157-164; Sakurai и др., J.Surg. Oncol., 42, 1989, cc.39-46; Goldenberg D.M., The International Journal of Biological Markers, 7, 1992, cc.183-188; Ledermann J.A, Br.J.Cancer, 58, 1988, c.654; Ledermann J.A., Br.J.Cancer, 68, 1993, cc.69-73; Pedley R.В. и др., Br. J.

Cancer, 68, 1993, cc.69-73; Boxer G.M., и др., Br.J.Cancer, 65, 1992, cc.825-831). Chester с соавторами выделили одноцепочечное антитело к СЕА из фаговой дисплейной библиотеки, которое использовали для радиоиммунодетекции и радиоиммунотерапии (US 5876691), и это антитело в дальнейшем гуманизировали (US 7232888). Антитела к СЕА выделяли также из человеческих фаговых дисплейных библиотек (US 5872215).

Мышиное моноклональное антитело PR1A3 получали путем слияния клеток миеломы NS1 (P3/NS1/I-Ag-4-1) со спленоцитами мышей, иммунизированных здоровым колоректальными эпителием (Richman P.I. и Bodmer W.F., Int. J. Cancer, 39, 1987, cc.317-328). Для PR1A3 характерно сильное взаимодействие, как с хорошо, так и со слабо дифференцированными колоректальными карциномами, и оно имеет преимущество по сравнению с другими дающими реакцию с колоректальным эпителием антителами, поскольку его антиген, вероятно, фиксирован на опухоли и не присутствует в лимфатических сосудах или здоровых лимфатических узлах, дренирующих опухоль (Granowska М. и др., Eur. J.Nucl. Med., 20, 199, cc.690-698, 1989). Например, установлено, что PR1A3 вступал во взаимодействие с 59 из 60 колоректальных опухолей (Richman P.I. и Bodmer W.F., Int. J.Cancer, 39, 1987, cc.317-328), в то время как реактивное в отношение СЕА антитело В72.3 взаимодействовало только с 75% колоректальных опухолей (Mansi L. и др., Int J Rad Appl Instrum В., 16(2), 1989, cc.127-135).

Эпитопное картирование PR1A3 продемонстрировало, что мишенью антитела является В3-домен и GPI-якорь молекулы СЕА (Durbin Н. и др., Proc.Natl. Scad. Sci. USA, 91, 1994, cc.4313-4317). Таким образом, антитело PR1A3 связывается только со связанным с мембраной СЕА, но не с растворимой формой СЕА, которая может присутствовать в кровотоке страдающих раком пациентов. Благодаря указанной особенности связывания маловероятно, чтобы антитело PR1A3 секвестрировалось сывороточным СЕА; наоборот, его мишенью может являться СЕА, экспрессируемый на раковых клетках. Эпитоп, с которым связывается PR1A3, представляет собой конформационный эпитоп, а не линейный эпитоп, что, вероятно, обусловливает снижение связывания PR1A3 с растворимым СЕА (Stewart и др., Cancer Immunol Immunother, 47, 1999, cc.299-306).

Антитело PR1A3 ранее гуманизировали путем трансплантации CDR мышиного родительского антитела в каркасные участки 1-3 тяжелой цепи человеческого антитела RF-TS3'CL (у которого сохраняли мышиный каркасный участок 4 PR1A3) и в каркасные участки легкой цепи антитела REI (Stewart и др., Cancer Immunol Immunother, 47, 1999, cc.299-306). Указанная гуманизированная версия PR1A3 сохраняла специфичность и связывалась с экспрессируемым на поверхности СЕА с аффинностью, сходной с аффинностью мышиного антитела (Stewart и др., Cancer Immunol Immunother, 47, 1999, cc.299-306; US 5965710). Установлено, что гуманизированное антитело PR1A3 (hPR1A3) индуцировало целенаправленное уничтожение линий клеток колоректального рака (Conaghhan P.J. и др., Br.J.Cancer, 98(7), cc.1217-1225). Однако аффинность hPR1A3 к СЕА оказалась относительно низкой.

Меченные с помощью радиоактивных изотопов антитела к СЕА применяли в клинических испытаниях на пациентах, страдающих колоректальным раком. Например, меченное с помощью ¹²³I химерное минитело Т84.66 (сТ84.66) применяли в пилотном клиническом исследовании на пациентах, страдающих колоректальным раком. Меченное с помощью радиоактивных изотопов минитело обладало способностью направленно воздействовать на раковые клетки (Wong J.Y. и др., Clin Cancer Res. 10(15), 2004, cc.5014-5021). В другом примере ⁽¹³¹⁾I-лабетузумаб, т.е. меченное с помощью радиоактивного изотопа антитело к СЕА, оценивали в качестве средства вспомогательной терапии на пациентах, которые страдали колоректальным раком, дающим метастазы в печень, и были получены обнадеживающие результаты, касающиеся выживаемости (Liersch Т., и др., Ann. Surg. Oncol. 14(9), 2007, cc.2577-2590).

Гликозилирование антител

Олигосахаридный компонент может оказывать существенное влияние на свойства, имеющие отношение к эффективности терапевтического гликопротеина, включая физическую стабильность, устойчивость к воздействию протеаз, взаимодействия с иммунной системой, фармакокинетические параметры и специфическую биологическую активность. Указанные свойства могут зависеть не только от присутствия или отсутствия олигосахаридов, но также от их специфических структур. Можно сделать определенные обобщения, касающиеся взаимосвязи между структурой олигосахарида и функцией гликопротеина. Например, некоторые структуры олигосахарида опосредуют быстрый клиренс гликопротеина из кровотока в результате взаимодействий со специфическими связывающими углеводы белками, а другие могут связываться антителами и запускать нежелательные иммунные реакции (Jenkins N. и др., Nature Biotechnol. 14, 1996, cc.975-981).

Было установлено, что клетки млекопитающих являются предпочтительными хозяевами для производства терапевтических гликопротеинов благодаря их способности гликозилировать белки с получением наиболее приемлемой для применения на человеке формы (Cumming D.A. и др., Glycobiology 1, 1991, cc.115-130; Jenkins N. и др., Nature Biotechnol. 14, 1996, cc.975-981). Бактерии очень редко гликозилируют белки, и подобно другим типам обычных хозяев, таких как клетки дрожжей, нитчатых грибов, насекомых и растений, обеспечивают схемы гликозилирования, ассоциированные с быстрым клиренсом из кровотока, нежелательными иммунными взаимодействиями и в некоторых случаях пониженной биологической активностью. Среди клеток млекопитающих клетки яичника китайского хомячка (СНО) нашли наиболее широкое применение в течение двух последних десятилетий. Помимо обеспечения приемлемых схем гликозилрования эти клетки позволяют устойчиво получать генетически стабильные, высокопродуктивные клональные клеточные линии. Их можно культивировать, достигая высокой плотности, в простых биореакторах с использованием бессывороточных сред, и на их основе можно разрабатывать безопасные и воспроизводимые биопроцессы. Другими обычно применяемыми клетками животных являются клетки почки детеныша хомяка (ВНК), клетки мышиной миеломы NSO и SP2/0. В последние годы изучали также возможность их производства в трансгенных животных (Jenkins N. и др.. Nature Biotechnol. 14, 1996, cc.975-981).

Все антитела содержат углеводные структуры в консервативных положениях в константных областях тяжелой цепи, при этом каждый изотип характеризуется различной организацией N-связанных углеводных структур, которые оказывают различное действие на сборку, секрецию и функциональную активность белка (Wright А. и Monison S.L., Trends Biotech. 15, 1997, cc.26-32). Структура присоединенного N-связанного углевода значительно варьируется в зависимости от степени процессирования, и она может включать имеющие высокое содержание маннозы, большое количество разветвлений, а также биантенные сложные олигосахариды (Wright А. и Morrison S.L., Trends Biotech. 15, 1997, cc.26-32). Как правило, имеет место гетерогенный процессинг структур коровых олигосахаридов, присоединенных в конкретном сайте гликозилирования, в результате чего даже моноклональные антитела существует в виде нескольких гликоформ. Было установлено также, что основные различия в гликозилировании антител обусловлены клеточными линиями, и даже при выращивании конкретной клеточной линии в других условиях культивирования имеют место небольшие различия (Lifely М.R. и др., Glycobiology 5(8), 1995, cc.813-22).

Одним из путей достижения значительного повышения эффективности при сохранении простого процесса получения и, который, по-видимому, может обеспечить отсутствие значительных нежелательных побочных действий, является усиление встречающихся в естественных условиях обусловленных клеткой эффекторных функций моноклональных антител путем конструирования их олигосахаридного компонента согласно методу, описанному у Umana Р. и др., Nature Biotechnol. 17, 1999, cc.176-180; и US 6602684; полное содержание указанных документов включено в настоящее описание в качестве ссылки. Антитела IgGl-типа, которые наиболее часто применяют в иммунотерапии рака, представляют собой гликопротеины, имеющие консервативный N-связанный сайт гликозилирования на Asn297 в каждом СН2-домене. Два сложных биантенных олигосахарида, присоединенных к Asn297, располагаются между СН2-доменами, формируя обширные контакты с полипептидным каркасом, и их присутствие является важным для того, чтобы антитело могло осуществлять эффекторные функции, такие как антитело-обусловленная клеточнозависимая цитотоксичность (ADCC) (Lifely M.R. и др., Glycobiology 5, 1995, cc.813-822; Jefferis R. и др., Immunol. Rev. 163, 1998, cc.59-76; Wright А. и Morrison S.L., Trends Biotechnol. 15, 1997, cc.26-32).

Ранее Umaña с соавторами установили, что сверхэкспрессия β(l,4)-N-ацетилглюкозаминилтрансферазы III («GnTIII»), т.е. гликозилтрансферазы, катализирующей образование бисекционных олигосахаридов в клетках яичника китайского хомячка (СНО), значительно повышает in vitro ADCC-активность антинейробластомного химерного моноклонального антитела (chCE7), продуцируемого сконструированными СНО-клетками (см. Umana Р. и др., Nature Biotechnol. 17, 1999, cc.176-180; и публикацию международной заявки на патент WO 99/154342, полное содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки). Антитело chCE7 принадлежит к большому классу неконъюгированных МАт, которые обладают высоким уровнем аффинности и специфичности в отношении опухолей, но обладают слишком низкой эффективностью для их клинического применения при производстве в стандартных применяемых в промышленности индустриальных клеточных линиях, в которых отсутствует фермент GnTIII (Umana Р. и др., Nature Biotechnol. 17, 1999, cc.176-180). В этом исследовании впервые было продемонстрировано, что значительное повышение ADCC-активности можно достигать путем создания продуцирующих антитела клеток, которые экспрессируют GnTIII, что приводит также к повышению относительного содержания ассоциированных с константной областью (Fc) бисекционных олигосахаридов, включая бисекционные нефукозилированные олигосахариды, по сравнению с уровнями, характерными для встречающихся в естественных условиях антител.

Таким образом, сохраняется необходимость в улучшенных терапевтических подходах целенаправленного действия на СЕА, в частности, связанного с мембраной СЕА, для лечения рака у приматов, включая (но, не ограничиваясь только ими) людей.

Краткое изложение сущности изобретения

Принимая во внимание чрезвычайно большой терапевтический потенциал антигенсвязывающих молекул (АСМ), которые обладают специфичностью связывания, присущей антителу PR1A3, и которые были подвергнуты процедуре созревания аффиности и/или у которых с помощью гликоинженерии повышена аффинности к связыванию с Fc-рецептором, и/или повышена эффекторная функция, при создании настоящего изобретения были разработаны указанные АСМ. Одним из объектов изобретения являются варианты АСМ и/или АСМ с созревшей аффинностью, которые обладают способностью конкурировать с антителом PR1A3 за связывание с антигеном. Эффективность указанных АСМ дополнительно повышают путем конструирования профиля гликозилирования Fc-области антитела.

Одним из объектов настоящего изобретения является также антигенсвязывающая молекула (АСМ), содержащая гуманизированный с созревшей аффинностью антигенсвязывающи центр, который включает один или несколько гипервариабельных участков (CDR), где указанный антигенсвязывающий центр специфически связывается со связанным с мембраной карциноэмбриональным антигеном (СЕА) и где указанный антигенсвязывающий центр связывается с тем же эпитопом, что и мышиное моноклональное антитело PR1 A3, или конкурирует за связыванием с антителом PR1A3. Изобретение относится также к АСМ, предлагаемой в настоящем изобретении, где указанная АСМ имеет модифицированные олигосахариды. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения модифицированные олигосахариды обладают пониженным уровнем фукозилирования по сравнению с немодифицированными олигосахаридами. В других вариантах осуществления изобретения модифицированные олигосахариды являются гибридными или комплексными. Другим объектом изобретения являются также полипептиды, полинуклеотиды, клетки-хозяева и экспрессионные векторы, пригодные для АСМ. Следующим объектом изобретения являются способы получения АСМ. Еще одним объектом изобретения являются способы применения АСМ, прежде всего для лечения заболеваний, связанных с аномальной экспрессией СЕА, таких как рак.

Краткое описание чертежей

На чертежах показано:

на фиг.1 - схематическая диаграмма антигена СЕА (СЕАСАМ-5, CD66e). Антитело PR1A3 связывается специфически с В3-доменом антигена, в том случае, когда он связан с клеточной мембраной;

на фиг.2 - данные о повышенной ADCC-активности созданного с помощью гликоинженерии химерного антитела PR1A3 при применении человеческих РВМС в качестве клеток-эффекторов;

на фиг.3 - данные об антигенсвязывающей активности гуманизированного антитела PR1A3, которое содержит конструкцию вариабельной области тяжелой цепи, а именно СН7А, и конструкцию вариабельной области легкой цепи, а именно CL1A;

на фиг.4 - сайты рандомизации, предназначенные для создания библиотеки антител для созревания аффинности легкой цепи гуманизированного антитела PR1A3. Рандомизированные позиции обозначены символом X;

на фиг.5 - сайты рандомизации, предназначенные для создания библиотеки антител для созревания аффинности тяжелой цепи гуманизированного антитела PR1A3. Рандомизированные позиции обозначены символом X;

на фиг.6 - данные об активности связывания антител к СЕА с созревшей аффинностью, выведенных из гуманизированного антитела PR1A3, которое содержит конструкцию вариабельной области тяжелой цепи CH7ArF9 и конструкцию вариабельной области легкой цепи CH7ArF9;

на фиг.7 - результаты опыта по оценке эффективности, проведенные на SCID/bg-мышах, которым вводили внутрь селезенки клетки человеческой колоректальной карциномы линии LS174T для создания ортотопической модели опухоли. Лечение антителом начинали через семь дней путем инъекции антитела в дозе 25 мг/кг веса тела с последующим осуществлением двух дополнительных инъекций один раз в неделю. «США» обозначает представленное в настоящем описании гуманизированное антитело, содержащее CDR PR1A3. «SM3E» обозначает ранее созданное антитело к СЕА. «GA201» обозначает гуманизированное антитело к EGF, которое применяли в качестве положительного контроля. «ЗФР» обозначает забуференный фосфатом физиологический раствор, который применяли в качестве отрицательного контроля. Выживание оценивали с использованием критериев завершения, установленных швейцарскими регулирующими органами;

на фиг.8 - результаты опыта по оценке эффективности, проведенные на SCID/bg-мышах, которым вводили внутривенно клетки карциномы легкого линии А549, приживляя опухоли в легкие животных. Лечение антителом начинали через семь дней путем инъекции антитела в дозе 25 мг/кг веса тела с последующим осуществлением двух дополнительных инъекций один раз в неделю. «США», «SM3E» и «GA201» имеют значения, представленные выше на фиг.7. «CH7ArF9 CL1ArH11» обозначает вариант антитела СН7А с тяжелыми и легкими цепями с созревшей аффинностью. Сокращение «ge» обозначает, что антитело создано с помощью гликоинженерии, в результате у него понижено количество фукозилированных олигосахаридов в Fc-области. «Наполнитель» обозначает отрицательный контроль. Клетки карциномы легкого линии А549 являются выражено позитивными в отношении экспрессии EGFR и слабо позитивными в отношении экспрессии СЕА;

на фиг.9 - результаты опыта по оценке эффективности, проведенные на SCID/bg-мышах, которым вводили внутрь селезенки клетки желудочной карциномы линии MKN45, получая метастазы опухолей в печени животных. «CH7ArF9 CL1A rH11», «SM3E», «ge» и «ЗФР» имеют значения, представленные на фиг.7 и 8, выше;

на фиг.10 - результаты кинетического анализа клонов с созревшей аффинностью: (а) - сенсограммы Fab-фрагментов антител к СЕА, имеющих тяжелую цепь с созревшей аффинностью СН7А Н4Е9 (SEQ ID NO: 199) в сочетании с легкой цепью с несозревшей аффинностью CL1A (SEQ ID NO: 105); легкую цепь с созревшей аффинностью CL1A рАС18 (SEQ ID NO: 209), объединенную с тяжелой цепью с несозревшей аффинностью СН7А; и их комбинации, а именно СН7А Н4Е9 и CL1A рАС18 (SEQ ID NO: 199 и 209); (б) обобщение результатов кинетических анализов клонов с созревшей аффинностью;

на фиг.11 - схема рандомизации CDR1 и CDR2 тяжелой цепи гуманизированного антитела к СЕА СН7А;

на фиг.12 - схема рандомизации CDR1 и CDR2 легкой цепи гуманизированного антитела к СЕА CL1A;

на фиг.13 - схема рандомизации CDR3 тяжелой цепи гуманизированного антитела к СЕА СН7А;

на фиг.14 - схема рандомизации CDR3 легкой цепи гуманизированного антитела к СЕА CL1A;

на фиг.15 - данные об аффинности связывания антител к СЕА со связанным с мембраной СЕА на клетках-мишенях линии MKN45. Гуманизированные антитела к СЕА имели либо легкие цепи с созревшей аффинностью (панель А, СН7А, CL1ArH7 или СН7А, CL1ArH11), либо и тяжелые, и легкие цепи с созревшей аффинностью (панель Б, СН7А rB9, CL1A rH11 G2(1)), которые при превращении в формат IgG отличались улучшенной способностью к связыванию по сравнению с контрольным антителом (СН7А, CL1A);

на фиг.16 - результаты анализа антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичности (ADCC) антител с созревшей аффинностью (CH7ArB9, CL1A rH11G2(1), CH7Arf9, CL1A rH11G2(1) и СН7А, CL1A rH11G2(1)) по сравнению с контрольными антителами (СН7А, CL1A G2(R2).

Подробное описание изобретения

Определения

Понятия, применяемые в контексте настоящего описания, имеют значения, общепринятые в данной области, если из контекста не следует иное.

В контексте настоящего описания понятие «антигенсвязывающая молекула» в наиболее широком смысле относится к молекуле, которая специфически связывается с антигенной детерминантой. Примером антигенсвязывающей молекулы является (но, не ограничиваясь только им) антитело или его фрагмент, который сохраняет способность специфически связываться со специфическим антигеном. Более конкретно в контексте настоящего описания «антигенсвязывающая молекула, которая связывается со связанным с мембраной человеческим карциноэмбриональным антигеном (СЕА)», является АСМ, которая специфически связывается с СЕА, более конкретно с присутствующим на клеточной поверхности или связанным с мембраной СЕА и не связывается с растворимым СЕА, отщепленным от клеточной поверхности. Понятие «специфически связывается» означает, что связывание является избирательным в отношении антигена и его можно отличать от нежелательных или неспецифических взаимодействий.

В контексте настоящего описания понятие «антитело» относится к полным молекулам антител, включая моноклональные, поликлональные и мультиспецифические (например, биспецифические) антитела, а также фрагменты антител, которые имеют Fc-область и сохраняют специфичность связывания, и к слитым белкам, которые включают область, эквивалентную Fc-области иммуноглобулина, и которые сохраняют специфичность связывания. Под объем изобретения подпадают также фрагменты антител, которые сохраняют специфичность связывания, такие как (но, не ограничиваясь только ими) VH- фрагменты, VL-фрагменты, Fab-фрагменты, F(ab')₂-фрагменты, scFv-фрагменты, Fv-фрагменты, минитела, димерные, тримерные и тетрамерные антитела (см., например, Hudson и Souriau, Nature Med. 9, 2003, cc.129-134).

В контексте настоящего описания понятие «антигенсвязывающий центр» относится к части антигенсвязывающей молекулы, которая содержит область, специфически связывающуюся и являющуюся комплементарной части антигена или полному антигену. Если антиген является крупным, то антигенсвязывающая молекула может связываться только с конкретной частью антигена, которую называют эпитопом. Антигенсвязывающий центр может представлять собой, например, один или несколько вариабельных доменов антитела. Предпочтительно антигенсвязывающий центр содержит вариабельную область легкой цепи (VL) антитела и вариабельную область тяжелой цепи антитела (VH).

В контексте настоящего описания понятие «с созревшей аффинностью» касательно антигенсвязывающих молекул (например, антител) относится к антигенсвязывающей молекуле, полученной из антигенсвязывающей референс-молекулы, например, с помощью мутаций, которая связывается с тем же антигеном, предпочтительно связывается с тем же эпитопом, что референс-антитело; и которая обладает более высокой аффинностью к антигену по сравнению с антигенсвязывающей референс-молекулой. Созревание аффинности, как правило, включает модификацию одного или нескольких аминокислотных остатков в одном или нескольких CDR антигенсвязывающей молекулы. Как правило, антигенсвязывающая молекула с созревшей аффинностью связывается с тем же эпитопом, что и исходная антигенсвязывающая референс-молекула.

В контексте настоящего описания «аффинность связывания», как правило, описывают с помощью понятий констант ассоциации или диссоциации (K_a или Kd соответственно), которые, в свою очередь, представляют собой отношения обратных величин констант скорости диссоциации и ассоциации (k_d и k_a соответственно). Таким образом, эквивалентные аффиности могут соответствовать различным константам скорости, если соотношение констант скорости остается таким же.

В контексте настоящего описания понятие «Fc-область» относится к С-концевой области тяжелой цепи IgG. Хотя примыкающие к Fc-области участки тяжелой цепи IgG могут слегка различаться, Fc-область тяжелой цепи человеческого IgG, как правило, представляет собой участок цепи, простирающийся от аминокислоты Cys226 до карбоксильного конца.

В контексте настоящего описания понятие «область, эквивалентная Fc-области иммуноглобулина» относится к встречающимся в естественных условиях аллельным вариантам Fc-области иммуноглобулина, а также вариантам, имеющим изменения, которые получают в результате замен, добавлений или делеций, но которые не снижают в значительной степени способность иммуноглобулина опосредовать эффекторные функции (такие как антитело-обусловленная клеточнозависимая цитотоксичность). Например, одну или несколько аминокислот можно изымать путем делеций из N-конца или С-конца Fc-области иммуноглобулина без существенного снижения биологической функции. Такие варианты можно отбирать согласно общим правилам, которые известны в данной области, так, чтобы оказывать минимальное воздействие на активность (см., например, Bowie J.U. и др., Science 247, 1990, cc.1306-1310).

В контексте настоящего описания понятие «связанный с мембраной человеческий СЕА» относится к человеческого карциноэмбриональному антигену (СЕА)», который связан с представляющей собой мембрану областью клетки или с поверхностью клетки, в частности поверхностью опухолевой клетки. Понятие «связанный с мембраной человеческий СЕА» может в определенных обстоятельствах относиться к СЕА, который не связан с мембраной клетки, но который был сконструирован так, чтобы предохранять эпитоп от связывания с антителом PR1A3. Понятие «растворимый СЕА» относится к человеческому карциноэмбриональному антигену, который не связан или отщеплен от клеточной мембраны или клеточной поверхности (например, поверхности опухолевой клетки), и/или который, как правило, не предохраняет конформационный эпитоп, с которым связывается антитело PR1A3. Растворимый СЕА, например, может присутствовать в кровотоке или лимфатических сосудах страдающего раком индивидуума.

В контексте настоящего описания понятие «не обладает существенной перекрестной реактивностью к растворимому СЕА» означает, что молекула (например, антигенсвязывающая молекула) не распознает или не связывается специфически с растворимым СЕА, прежде всего по сравнению со связанным с мембраной СЕА. Например, антигенсвязывающая молекула может связывать от меньше чем примерно 10% до меньше чем примерно 5% растворимого СЕА, или может связывать растворимый СЕА в количестве, выбранном из группы, включающей количества растворимого СЕА, составляющие менее чем примерно 10%, 9%, 8% 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,2% и 0,1%, предпочтительно менее чем примерно 2%, 1% или 0,5% растворимого СЕА, и наиболее предпочтительно менее чем примерно 0,2% или 0,1% растворимого СЕА.

В контексте настоящего описания понятия «слитый» и «химерный» касательно полипептидов, таких как АСМ, относится к полипептидам, которые содержат аминокислотные последовательности, выведенные из двух или большего количества гетерологичных полипептидов, таких как фрагменты антител из различных видов. Для химерных АСМ, например, несвязывающие антиген компоненты можно получать из широкого разнообразия видов, включая приматов, таких как шимпанзе и люди. Константная область химерной АСМ, как правило, является практически идентичной константной области встречающего в естественных условиях человеческого антитела; вариабельная область химерного антитела, как правило, практически идентична вариабельной области рекомбинантного антитела к СЕА, которое имеет аминокислотную последовательность вариабельной области мышиного антитела PR1A3. Наиболее предпочтительной формой слитого или химерного антитела являются гуманизированные антитела.

В контексте настоящего описания понятие «гуманизированная» относится к антигенсвязывающей молекуле, полученной из антигенсвязывающей молекулы из организма кроме человека, например, мышиного антитела, которая сохраняет или практически сохраняет антигенсвязывающие свойства родительской молекулы, но которая является менее иммуногенной для людей. Это можно достигать с помощью различных методов (обозначены в контексте настоящего описания как методы «гуманизации»), которые включают (но, не ограничиваясь только ими) (а) трансплантацию полных нечеловеческих вариабельных областей в человеческие константные области с получением химерных антител, (б) трансплантацию только нечеловеческих (например, из антигенсвязывающей молекулы-донора) CDR в человеческий (например, в антигенсвязывающую молекулу-реципиента) каркасный участок и константные области с сохранением имеющих решающее значение остатков каркасного участка (например, остатков, важных для сохранения хорошей аффинности к связыванию антигена или функций антитела) или без их сохранения, или (в) трансплантацию полных нечеловеческих вариабельных областей, но с их «маскировкой» участком, напоминающим человеческий, путем замены находящихся на поверхности остатков. Такие методы описаны у Jones и др., Morrison и др., Proc. Natl. Acad. Sci., 81, 1984, cc.6851-6855; Morrison и Oi, Adv. Immunol., 44, 1988, cc.65-92; Verhoeyen и др., Science, 239, 1988, cc.1534-1536; Padlan, Molec. Immun., 28, 1991, cc.489-498; Padlan, Molec. Immun., 31(3), 1994, cc.169-217, все указанные публикации полностью включены в настоящее описание в качестве ссылки. В каждой из вариабельных областей тяжелой и легкой цепи антитела, как правило, присутствуют 3 гипервариабельных участка или CDR (CDR1, CDR2 и CDR3), которые фланкированы четырьмя каркасными подобластями (участками) (т.е., FR1, FR2, FR3 и FR4) в каждой из вариабельных областей тяжелой и легкой цепи антитела: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Обсуждение гуманизированных антител представлено среди прочего в US 6632927, и в опубликованной заявке на патент США №. 2003/0175269, оба документа полностью включены в настоящее описание в качестве ссылки. Для достижения гуманизации можно трансплантировать также укороченные CDR, которые содержат только определяющие специфичность аминокислотные остатки для данного CDR, в выбранный каркасный участок. Под «определяющими специфичность остатками» подразумевают остатки, которые непосредственно участвуют в специфическом взаимодействии с антигеном и/или которые необходимы для специфического связывания антигена. В целом, только примерно от одной пятой до одной трети остатков в данном CDR принимают участие в связывании с антигеном. Определяющие специфичность остатки в конкретном CDR можно идентифицировать, например, путем расчета внутриатомных контактов на основе трехмерных моделей и определения вариабельности последовательностей в данном положении остатка согласно методам, описанным у Padlan и др., FASEB J. 9(1), 1995, сс.133-139, содержание публикации полностью включено в настоящее описание в качестве ссылки.

В некоторых случаях остатки каркасного участка (FR) человеческого иммуноглобулина заменяют на соответствующие остатки нечеловеческого иммуноглобулина. Кроме того, гуманизированные антигенсвязывающие молекулы могут содержать остатки, отсутствующие в антителе-реципиенте или антителе-доноре. Эти модификации осуществляют с целью дополнительного улучшения характеристик антигенсвязывающих молекул. Как правило, гуманизированная антигенсвязывающая молекула может содержать практически всю по меньшей мере одну и, как правило, две вариабельных области, в которых по меньшей мере один или практически все, или все гипервариабельные участки соответствуют участкам нечеловеческого иммуноглобулина и все или практически все FR представляют собой участки, имеющие последовательность человеческого иммуноглобулина. Гуманизированная антигенсвязывающая молекула необязательно может содержать также по меньшей мере часть константной области (Fc) иммуноглобулина, как правило, человеческого иммуноглобулина (см., например, Jones и др., Nature 321, 1986, cc.522-525; Reichmann и др., Nature 332, 1988, cc.323-329; и Presta, Curr. Op.Struct. Biol. 2, 1992, cc.593-596).

Аналогично этому, в контексте настоящего описания понятие «приматизированная» относится к антигенсвязывающей молекуле, полученной из антигенсвязывающей молекулы организма кроме примата, например, мышиного антитела, которая сохраняет или практически сохраняет антигенсвязывающие свойства родительской молекулы, но которая является менее иммуногенной для приматов.

В контексте настоящего описания понятие «вариант» (или «аналог») полинуклеотида или полипептида относится к полинуклеотиду или полипептиду, который отличается от конкретного указанного полинуклеотида или полипептида, предлагаемого в изобретении, наличием инсерций, делеций и замен, созданных, например, с помощью метода рекомбинантной ДНК. В частности, рекомбинантные варианты, кодирующие такие же или сходные полипептиды, можно синтезировать или отбирать на основе «избыточности» генетического кода. Различные замены кодонов, такие как «молчащие» замены, которые приводят к получению различных сайтов рестрикции, можно интродуцировать с целью оптимизации клонирования в плазмидном или вирусном векторе или экспрессии в конкретной прокариотической или эукариотической системе. Мутации в полинуклеотидной последовательности могут проявляться в полипептиде или доменах других пептидов, добавленных к полипептиду для модификации свойств любого фрагмента полипептида с целью изменения характеристик, таких как аффинность связывания лиганда, межцепочечная аффинность или скорость расщепления/обновления.

В контексте настоящего описания понятие «вариант антигенсвязывающей молекулы, мишенью которой является СЕА» относится к молекуле, которая отличается по аминокислотной последовательности от «родительской» антигенсвязывающей молекулы, мишенью которой является СЕА, благодаря добавлению, делеций и/или замене одного или нескольких аминокислотного(ых) остатка(ов) в последовательности родительского антитела. В конкретном варианте осуществления изобретения вариант содержит одну или несколько аминокислотную(ых) замену(н) в одном или нескольких гипервариабельном(ых) участке(ах) или CDR тяжелой и/или легкой цепи родительской антигенсвязывающей молекулы. Например, вариант может содержать по меньшей мере одну, например, от примерно одной до примерно десяти (т.е. примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10) и предпочтительно от примерно двух до примерно пяти замен в одном или нескольких гипервариабельных участках или CDR (т.е. в 1, 2, 3, 4, 5 или 6 гипервариабе