Выделение нерастворимых искомых белков

Выделение нерастворимых искомых белков

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение касается способа выделения нерастворимых искомых белков из суспензии целых или разрушенных клеток хозяев. Изобретение также касается нерастворимых искомых белков, получаемых данным способом.

Уровень техники

Системы для выделения искомых белков из суспензии клеток хозяев, например, микробных клеток, и/или отделения от других примесей были разработаны ранее и поэтому представляют предшествующий уровень знаний.

В качестве примера можно привести стандартные методики очистки белков для очистки и выделения растворимых искомых белков с применением таких хроматографических методов, как ионообменная или эксклюзионная хроматография (Guide to Protein Purification, Academic Press, Vol.182, 1990). Другие методы, которые применяются на сегодняшний день, - это фазовое разделение жидкость-жидкость и ультрафильтрация, среди прочего (Guide to Protein Purification, Academic Press, Vol.182, 1990). С вариациями, эти фундаментальные способы очистки могут быть модифицированы для очистки большинства белков, необходимых для научных или промышленных целей, однако, в общем, они очень дорогостоящие, сложные и требуют много времени.

Специальный способ обработки белков шелка, в частности, был описан в Huemmerich et al., Biochemistry 2004, 43, 13604-13612. В этой публикации для очистки рекомбинантных белков шелка пауков (паутины) для технического применения успешно применялась методика, в которой использовалась тепловая денатурация белков клеток хозяев с последующей стадией осаждения искомого белка, но отсутствовали хроматографические методы очистки. Поскольку белки шелка имеют тенденцию к аутоагрегации, этот способ страдает от потери существенной доли искомых белков, которые осаждаются и поэтому недоступны для способа очистки растворимого белка.

Хотя описанные способы хорошо работают для большинства растворимых белков, очевидно, что они обладают большими недостатками при работе со склонными к агрегации белками. Такие склонные к агрегации белки выпадают в осадок из раствора через определенный период времени, образуя стабильные, часто нерастворимые белковые агрегаты. Эти белковые агрегаты больше невозможно выделить описанными способами очистки фракции растворимых белков. Поэтому для того, чтобы избежать нежелательного осаждения, критическими параметрами обычно являются время ферментации и/или время очистки. Известно, что данные белковые агрегаты можно растворить при помощи некоторых детергентов, однако также известно, что такое растворение отрицательно сказывается на выходе белка, а также на качестве белка. Кроме того, полное растворение белковых агрегатов в течение продолжительного времени почти невозможно.

Таким образом, существует потребность в разработке способа очистки/выделения склонных к агрегации искомых белков и/или уже агрегированных искомых белков, который сосредоточен на отделении фракции склонных к агрегации искомых белков и/или фракции агрегированных искомых белков от фракции, содержащей нерастворимые белки клеток хозяев и другие остатки, без полного растворения этих искомых белков. Такой способ очистки даст возможность выделять нерастворимые искомые белки из суспензии клеток хозяев, например, микробных клеток, и/или других клеточных остатков, с высоким выходом и высокого качества. Такой способ очистки также должен быть экономически эффективным, быстрым, легким и воспроизводимым.

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что искомые белки нерастворимы и остаются нерастворимыми при определенных условиях, необходимых для растворения всех или почти всех других нерастворимых белков клеток хозяев, обломков клеток хозяев и/или других возможных загрязнений в связи с ферментацией, и именно это позволяет выделить и очистить эти искомые белки всего за несколько стадий очистки без потери значительного количества данных искомых белков вследствие их нежелательного растворения или из-за других перекрестных реакций.

Вне ожидания, очистка нерастворимых искомых белков предпочтительно по меньшей мере на 80% достигается путем отделения нерастворимых искомых белков от растворяющихся нерастворимых частей клеток хозяев в соответствии со способом настоящего изобретения. Даже если некоторые нерастворимые части клеток хозяев и не полностью растворяются, а остаются в суспензии, все-таки можно достичь эффективного разделения, так как удельная плотность этих суспендированных частей клеток хозяев меньше, чем у нерастворимых искомых белков, что способствует эффективному разделению путем центрифугирования, осаждения и/или фильтрации.

Способ настоящего изобретения дает некоторые поразительные преимущества по сравнению с известными методами очистки. Например, способ настоящего изобретения уменьшает количество сложных стадий очистки и поэтому он является быстрым, надежным и легко выполнимым способом очистки. Кроме того, данный способ позволяет очистку/выделение нерастворимых искомых белков с высоким выходом и чистотой. Он позволяет резко сократить затраты по сравнению с традиционными способами. К тому же данный способ является экологически чистым.

Хотя способ настоящего изобретения включает небольшое количество стадий, но до сих пор было совершенно непредвиденно, что некоторые искомые белки являются и остаются нерастворимыми в применяемых условиях. Особенно если учесть то, что применяются такие концентрации оснований (~0,1 М NaOH), которые обычно используются для промывки и очистки биореакторов, а также реакционных сосудов, контактирующих с белками и клетками. Так что было совсем не очевидно, что эти условия также могут применяться для очистки нерастворимых искомых белков в больших масштабах.

Сущность изобретения

В первом аспекте настоящим изобретением предусмотрен способ выделения нерастворимых искомых белков из суспензии целых или разрушенных клеток хозяев, включающий стадии:

a) получение суспензии целых или разрушенных клеток хозяев, содержащих нерастворимый искомый белок и нерастворимые части клеток хозяев,

b) добавление водного раствора по меньшей мере одного основания к данной суспензии в количестве, достаточном для разрушения данных клеток хозяев и/или солюбилизации нерастворимых частей клеток хозяев, и

c) отделение нерастворимого искомого белка от солюбилизированных нерастворимых частей клеток хозяев,

причем на стадии b) искомый белок остается нерастворимым, а по меньшей мере 80% нерастворимых частей клеток хозяев подвергаются солюбилизации.

Во втором аспекте настоящее изобретение касается нерастворимых искомых белков, получаемых способом из первого аспекта.

В этом разделе не обязательно описаны все особенности изобретения.

Раскрытие сущности изобретения

Перед тем, как перейти к подробному описанию настоящего изобретения, следует иметь в виду, что оно не ограничивается конкретной методологией, протоколами и реагентами, описанными здесь, так как они могут различаться. Также следует иметь в виду, что применяемая здесь терминология служит только для описания конкретных воплощений и не предназначена для ограничения объема настоящего изобретения, которые ограничиваются только прилагаемой формулой изобретения. Если не указано иначе, все применяемые здесь технические и научные термины имеют те же значения которые обычно понимаются рядовыми специалистами в данной области.

Предпочтительно применяемые здесь термины определяются так, как описано в "А multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberger H.G.W, Nagel B. and Kolbl H., eds. (1995) Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland).

По всему тексту настоящего описания цитируются некоторые документы. Каждый из цитированных здесь документов (включая все патенты, патентные заявки, научные публикации, спецификации, инструкции производителей, номера доступа поданных в GenBank последовательностей и т.д.), будь то выше или ниже, включены сюда путем ссылки во всей полноте. При этом ничто не должно истолковываться как допущение того, будто изобретение не может предвосхищать такие раскрытия в силу более раннего создания изобретения.

В дальнейшем будут описаны элементы настоящего изобретения. Эти элементы перечислены со специфическими воплощениями, однако следует понимать, что их можно комбинировать любым образом и в любом количестве для создания дополнительных воплощений. Описанные по-разному примеры и предпочтительные воплощения не должны истолковываться как ограничение настоящего изобретения только описанными в явном виде воплощениями. Следует иметь в виду, что данное описание поддерживает и охватывает воплощения, в которых подробно описанные воплощения комбинируются с любым числом раскрытых и/или предпочтительных элементов. Более того, любые перестановки и комбинации всех описанных в данной заявке элементов следует считать раскрытыми путем описания настоящей заявки, если контекст не указывает иначе.

По всему описанию и следующей за ним формуле изобретения, если из контекста не следует иное, слово "включать" и его варианты типа "включает" и "включающий" следует понимать как включение указанного точного числа или стадии, либо группы чисел или стадий, но не исключение каких-либо других чисел или стадий, либо группы чисел или стадий.

В настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают значения множественного числа, если из контекста четко не следует иное.

Принимается, что остатки у двух или нескольких полипептидов "соответствуют" друг другу, если они занимают аналогичное положение в структуре полипептидов. При этом хорошо известно, что аналогичные положения в двух или нескольких полипептидах можно определить путем выравнивания последовательностей полипептидов на основе аминокислотной последовательности или структурного сходства. Средства для такого выравнивания хорошо известны специалистам, к примеру, они могут быть получены через Интернет, например, ClustalW (www.ebi.ac.uk/clustalw) или Align (http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html) со стандартными настройками, для Align предпочтительно EMBOSS::needle, Matrix: Blosum62, Gap Open 10.0, Gap Extend 0.5.

В первом аспекте изобретением предусмотрен способ выделения нерастворимых искомых белков из суспензии целых или разрушенных клеток хозяев, включающий стадии:

a) получение суспензии целых или разрушенных клеток хозяев, содержащих нерастворимый искомый белок и нерастворимые части клеток хозяев,

b) добавление водного раствора по меньшей мере одного основания к данной суспензии в количестве, достаточном для разрушения данных клеток хозяев и/или солюбилизации нерастворимых частей клеток хозяев, и

c) отделение нерастворимого искомого белка от солюбилизированных нерастворимых частей клеток хозяев,

причем на стадии b) искомый белок остается нерастворимым, а по меньшей мере 80%, предпочтительно 85%, более предпочтительно 90% и наиболее предпочтительно 95% или даже 100% нерастворимых частей клеток хозяев подвергаются солюбилизации.

Например, изобретением предусмотрен способ выделения нерастворимых искомых белков из суспензии разрушенных клеток хозяев, включающий стадии:

a) получение суспензии разрушенных клеток хозяев, содержащих нерастворимый искомый белок и нерастворимые части клеток хозяев,

b) добавление водного раствора по меньшей мере одного основания к данной суспензии в количестве, достаточном для солюбилизации данных нерастворимых частей клеток хозяев, и

c) отделение нерастворимого искомого белка от солюбилизированных нерастворимых частей клеток хозяев,

причем на стадии b) искомый белок остается нерастворимым, а по меньшей мере 80%, предпочтительно 85%, более предпочтительно 90% и наиболее предпочтительно 95% или даже 100% нерастворимых частей клеток хозяев подвергаются солюбилизации.

Далее, к примеру, изобретением предусмотрен способ выделения нерастворимых искомых белков из суспензии целых клеток хозяев, включающий стадии:

a) получение суспензии целых клеток хозяев, содержащих нерастворимый искомый белок и нерастворимые части клеток хозяев,

b) добавление водного раствора по меньшей мере одного основания к данной суспензии в количестве, достаточном для разрушения данных клеток хозяев и солюбилизации нерастворимых частей клеток хозяев, и

с) отделение нерастворимого искомого белка от солюбилизированных нерастворимых частей клеток хозяев,

причем на стадии b) искомый белок остается нерастворимым, а по меньшей мере 80%, предпочтительно 85%, более предпочтительно 90% и наиболее предпочтительно 95% или даже 100% нерастворимых частей клеток хозяев подвергаются солюбилизации.

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что нерастворимые искомые белки, например, белки паучьего шелка, присутствующие в суспензии целых или разрушенных клеток хозяев, остаются нерастворимыми в определенных условиях, необходимых для разрушения целых клеток хозяев и/или солюбилизации всех или почти всех других нерастворимых частей клеток хозяев, например, нерастворимых белков клеток хозяев, клеточных стенок, остатков клеток хозяев или других возможных примесей, связанных с процессом ферментации (например, остатков от ферментации), и при этом данные нерастворимые искомые белки, например, белок шелка пауков, можно просто выделить и очистить из суспензии всего за несколько стадий очистки без потери значительного количества белка.

В частности, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что отделение нерастворимых искомых белков от нерастворимых частей клеток хозяев достигается добавлением водного раствора, содержащего по меньшей мере одно основание (например, NaOH) в низкой концентрации (например, 0,05 М NaOH), к суспензии целых или разрушенных клеток хозяев. Авторы изобретения открыли, что водный раствор, содержащий по меньшей мере одно основание, разрушает клетки хозяева и/или солюбилизирует нерастворимые белки клеток хозяев и оставшиеся обломки клеток, не затрагивая нерастворимый искомый белок.

Авторы изобретения также установили, что после этой стадии нужно лишь отделить твердую фазу, содержащую нерастворимый искомый белок, от жидкой фазы, содержащей солюбилизированные нерастворимые части клеток хозяев, например, путем центрифугирования и/или фильтрации, и необязательно промыть осадок искомого белка для очистки представляющего интерес нерастворимого искомого белка. Полученный очищенный нерастворимый искомый белок можно непосредственно использовать для научного или промышленного применения без дальнейшей обработки.

Авторы изобретения неожиданного установили, что способом настоящего изобретения можно выделить нерастворимый искомый белок с чистотой по меньшей мере 80%, предпочтительно 85% или 90%, более предпочтительно 95%, 98% или 99% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99,9% или даже 100%, например, по меньшей мере 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9% или 100%. Большинство нерастворимых искомых белков, выделенных способом настоящего изобретения, не требует дополнительных стадий очистки. Соответственно, способ настоящего изобретения представляет собой очень экономичный и эффективный способ очистки.

В настоящем изобретении термин "клетки хозяева" относится к клеткам, содержащим представляющий интерес искомый белок, например, белок шелка типа белка шелка паука или его вариант. Такой искомый белок, например, белок шелка типа белка шелка паука или его вариант может кодироваться полинуклеотидом, предпочтительно выделенным полинуклеотидом. Такой полинуклеотид может находиться внутри клеток хозяев: (i) в свободном виде, (ii) внедренным в рекомбинантный вектор или (iii) встроенным в геном клетки хозяева или в митохондриальную ДНК. Клетки хозяева могут использоваться для амплификации и экспрессии полинуклеотида, кодирующего данный искомый белок, например, белок шелка типа белка шелка паука или его вариант.

Термин "выделенный полинуклеотид" в настоящем изобретении относится к такому полинуклеотиду, который был (i) выделен из своего естественного окружения, (ii) амплифицирован при полимеразной цепной реакции и/или (iii) полностью или частично синтезирован, и означает одноцепочечный или двухцепочечный полимер из дезоксирибонуклеотидных или рибонуклеотидных оснований и включает молекулы ДНК и РНК, как смысловые, так и антисмысловые нити. Термин включает кДНК, геномную ДНК, мРНК и рекомбинантную ДНК. Полинуклеотид может состоять из целого гена или его части.

В предпочтительном воплощении настоящего изобретения вышеупомянутый полинуклеотид является рекомбинантным полинуклеотидом, кодирующим представляющий интерес искомый белок. Термин "рекомбинантный полинуклеотид" относится к полинуклеотидам, синтезированным или подвергавшимся обработке in vitro. Искомый белок, кодируемый данным рекомбинантным полинуклеотидом, может именоваться рекомбинантным искомым белком. Клетки хозяева, содержащие данный рекомбинантный полинуклеотид и/или данный рекомбинантный искомый белок, могут именоваться рекомбинантными клетками хозяевами.

Термин "рекомбинантный вектор" в настоящем изобретении охватывает любые вектора, известные специалистам, включая плазмидные вектора, космидные вектора, фаговые вектора, как-то фаг лямбда, вирусные вектора, как-то аденовирусные или бакуловирусные вектора, или искусственные хромосомные вектора типа бактериальных искусственных хромосом (ВАС), искусственных хромосом дрожжей (YAC) или искусственных хромосом P1 (РАС). Данные вектора включают как экспрессионные, так и клонирующие вектора. Экспрессионные вектора включают как плазмидные, так и вирусные вектора и обычно содержат требуемую кодирующую последовательность и соответствующие последовательности ДНК, необходимые для экспрессии функционально связанной кодирующей последовательности в определенном организме хозяине (например, бактерий, дрожжей или растений), либо системы экспрессии in vitro. Клонирующие вектора обычно используются для конструирования и амплификации определенных фрагментов ДНК и в них могут отсутствовать функциональные последовательности, необходимые для экспрессии данных фрагментов ДНК.

В предпочтительном воплощении настоящего изобретения полинуклеотид, кодирующий представляющий интерес искомый белок, содержится в экспрессионном векторе и функционально связан с контролирующими экспрессию последовательностями для регуляции его экспрессии в клетках хозяевах или же содержится в клонирующем векторе, способствующем его амплификации в клетках хозяевах. Клонирующий вектор или экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий представляющий интерес искомый белок, обычно вводится в клетки хозяева путем трансформации или трансфекции.

В предпочтительном воплощении настоящего изобретения клетки хозяева представлены микробными клетками, как-то клетками бактерий или дрожжей, клетками растений или клетками насекомых.

В контексте настоящего изобретения термин "микробные клетки хозяева" в настоящем изобретении относится к клеткам микробного происхождения, к примеру, бактериальным клеткам типа клеток грамм-отрицательных или грамм-положительных бактерий, например, клеткам Escherichia (например, Escherichia coli), Anabaena, Caulobacter, Gluconobacter, Rhodobacter, Pseudomonas, Paracoccus, Bacillus (например, Bacillus subtilis), Brevibacterium, Corynebacterium, Rhizobium (Sinorhizobium), Flavobacterium, Klebsiella, Enterobacter, Lactobacillus, Lactococcus, Methylo bacterium, Propionibacterium, Staphylococcus или Streptomyces, или клеткам дрожжей типа клеток аскоспорогенных (Endomycetales), базидиоспорогенных или клеток, принадлежащих к Fungi Imperfecti (Blastomycetes), например, клеткам Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Saccharomyces (например, Saccharomyces cerevisiae), Schizosaccharomyces, Pichia (например, Pichia pastoris) или Yarrowia.

В контексте настоящего изобретения термин "клетки хозяева из насекомых" относится к клеткам, происходящим из насекомых, типа клеток Spodoptera frugiperda или Trichoplusia ni. Предпочтительными клетками насекомых являются клетки SF9 клетки SF-21 или клетки High-Five. SF-9 и SF-21 - это клетки яичников из Spodoptera frugiperda. Клетки High-Five - это яйцеклетки из Trichoplusia ni.

В контексте настоящего изобретения термин "клетки хозяева из растений" в настоящем изобретении относится к клеткам растительного происхождения типа клеток табака, картофеля или гороха.

Термин "суспензия целых или разрушенных клеток хозяев" в настоящем изобретении относится к гетерогенной жидкости, содержащей целые или разрушенные клетки хозяева. Жидкость, в которой суспендированы целые или разрушенные клетки, может представлять собой среду для ферментации, культуральную среду, водный раствор, например, буферный водный раствор, техническую H₂O или деионизированную Н₂О. Буферный водный раствор может представлять собой, к примеру, трис/HCl. Значение рН буферного водного раствора может составлять от рН 5,0 до рН 9,0, предпочтительно от рН 6,0 до рН 8,0, более предпочтительно от рН 6,7 до рН 7,2, например, трис/HCl рН 7,0, рН 7,5 или рН 8,0. Предпочтительно буферный водный раствор содержит от 10 до 100 мМ трис/HCl, более предпочтительно от 10 до 50 мМ трис/HCl и наиболее предпочтительно от 10 до 20 мМ трис/HCl, например, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 мМ трис/HCl, причем данный буферный водный раствор предпочтительно имеет рН от 5,0 до 9,0, более предпочтительно от 6,0 до 8,0 и наиболее предпочтительно от 6,7 до 7,2, например, трис/HCl рН 7,0, рН 7,5 или рН 8,0. Культуральная среда может представлять собой минимальную среду или солевую среду (например, см. Korz et al., Journal of Biotechnology 39, 1995, 59-65). Соотношение жидкости к целым или разрушенным клеткам хозяевам в суспензии может составлять, например, от 5% до 95%. Так, термин "суспензия целых или разрушенных клеток хозяев" охватывает суспензии, в которых соотношение жидкости к целым или разрушенным клеткам хозяевам может составлять от 5 до 95%, от 10 до 90%, от 15 до 85%, от 20 до 80%, от 25% до 75%, от 30 до 70%, от 35 до 65%, от 40 до 60%, от 45 до 55%, от 50 до 50%, от 55 до 45%, от 60 до 40%, от 65 до 35%, от 70 до 30%, от 75 до 25%, от 80 до 20%, от 85 до 15%, от 90 до 10% или от 95 до 5%.

В контексте настоящего изобретения термин "суспензия целых клеток хозяев" охватывает целые, обычно не подвергавшиеся лизису клетки хозяева, например, микробные клетки, клетки растений или клетки насекомых, суспендированные в жидкости, например, в водном растворе (например, в буферном водном растворе), технической воде, деионизированной воде, культуральной среде или среде ферментации. Термин "суспензия разрушенных клеток хозяев" в настоящем изобретении охватывает клетки хозяева, например, микробные клетки, клетки растений или клетки насекомых, у которых разрушены клеточные стенки или в большинстве своем подвергались лизису и суспендированы в жидкости, например, в водном растворе (например, буферном водном растворе), технической воде, культуральной среде, деионизированной воде или среде ферментации. "Суспензия разрушенных клеток хозяев" может быть получена: (i) немеханическим разрушением клеток (например, лизисом клеток с помощью ферментов, обработкой клеток химическими реагентами для растворения/частичного растворения или вскрытия/частичного вскрытия клеточных стенок и/или клеточных мембран либо разрушением клеток воздействием осмотического давления), (ii) механическим разрушением клеток (например, механическим растиранием или измельчением на шаровой мельнице), (iii) гомогенизацией под высоким давлением или (iv) обработкой ультразвуком, а также их комбинациями.

В предпочтительном воплощении настоящего изобретения целые клетки хозяева, например, микробные клетки типа бактериальных клеток, полученные на стадии а), находятся в суспензии с влагосодержанием от 5 до 20%, предпочтительно 5, 10, 15 или 20% (например, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20%), т.е. в клеточном осадке, предпочтительно после отделения этих клеток от культуральной среды, например, центрифугированием или фильтрацией. В другом воплощении настоящего изобретения разрушенные клетки хозяева, например, микробные клетки типа бактериальных клеток, находятся в суспензии с влагосодержанием от 5 до 20%, предпочтительно 5, 10, 15 или 20% (например, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20%), т.е. в клеточном осадке, предпочтительно после отделения данных разрушенных, например, лизированных или обработанных ультразвуком клеток, от культуральной среды, например, центрифугированием или фильтрацией.

Следует отметить, что количество растворимых частей клеток хозяев, например, органелл, растворимых белков или растворимых остатков клеток хозяев и/или других растворимых ингредиентов, например, растворимых примесей в связи с ферментацией, растворимых частей среды ферментации или растворимых частей культуральной среды, в суспензии целых или разрушенных клеток хозяев, полученных на стадии а), может колебаться. Например, количество растворимых частей клеток хозяев и/или других растворимых ингредиентов будет меньше (i) в клеточном осадке целых или разрушенных клеток хозяев с влагосодержанием от 5 до 10%, полученном при отделении целых или разрушенных клеток хозяев от культуральной или ферментационной среды центрифугированием или фильтрацией, или (ii) в водном растворе, в котором данный клеточный осадок ресуспендирован, по сравнению с количеством растворимых частей клеток хозяев и/или других растворимых ингредиентов (i) в суспензии целых клеток хозяев в культуральной или ферментационной среде или (ii) в суспензии разрушенных клеток хозяев в культуральной или ферментационной среде. Также возможно, что в суспензии, например, водном растворе, нет растворимых частей клеток хозяев и/или других растворимых ингредиентов, особенно в тех случаях, когда клеточный осадок разрушенных клеток хозяев промывают и ресуспендируют в водном растворе, который впоследствии представлен в пункте а).

"Суспензия клеток хозяев", например, микробных, клеток растений или насекомых, может быть получена при культивировании клеток хозяев, например, микробных, клеток растений или насекомых, в культуральной или ферментационной среде. Производство искомых белков может осуществляться в биореакторах, в которых можно эффективно культивировать клетки хозяева, например, микробные, клетки растений или насекомых. Можно использовать три пересекающихся стратегии ферментации: (i) непрерывная ферментация, (ii) периодическая ферментация или (iii) периодическая ферментация с подпиткой. Эти стратегии ферментации также можно комбинировать. Для получения максимального выхода, т.е. получения большой биомассы требуемого искомого белка, нужно обеспечить снабжение клеток хозяев, например, микробных, клеток растений или насекомых, достаточным количеством питательных веществ и совмещать эту обработку с непрерывным мониторингом и адаптацией соответствующих параметров процесса (например, растворенного кислорода, рН и температуры). Можно использовать системы индукции экспрессии искомого белка (например, индукции изопропил-β-D-тиогалактопиранозидом (IPTG), индукции сахарами или их аналогами, температурной индукции с использованием зависимых от температуры промоторов, индукции с помощью промоторов, контролируемых осмотическим стрессом, или индукции, запускаемой метаболическими изменениями в клетке). Многие параметры могут оказывать воздействие на продукцию искомого белка и его качество. Для увеличения выхода нерастворимого искомого белка можно использовать, в частности, более продолжительную фазу индукции, изменение температуры при инкубации, оптимизировать подачу питательных веществ и/или применять различные типы клеточного стресса. Также можно повлиять на количество агрегатов искомого белка, образующихся при культивировании клеток и в процессе очистки, путем тщательного контроля окружающей среды (например, компонентов среды, температуры в процессе ферментации, продолжительности процесса ферментации) и реализации соответствующих стратегий для максимизации степени агрегации.

"Суспензия клеток хозяев", например, микробных, клеток растений или насекомых, также может быть получена путем ресуспендирования культивируемых клеток хозяев, например, микробных, клеток растений или насекомых, выделенных из культуральной среды, например, центрифугированием или фильтрацией, в водном растворе, например, буферном водном растворе, в технической воде или в деионизированной воде. Суспензия растительных клеток также может быть получена путем суспендирования клеток растений, полученных из целых растений, например, путем извлечения этих растительных клеток или разрушения целых растений, в водном растворе, например, буферном водном растворе, в технической воде или в деионизированной воде.

В том случае, когда на стадии а) способа настоящего изобретения представлена суспензия целых клеток хозяев, можно непосредственно использовать одну из вышеописанных суспензий клеток хозяев. В том случае, когда на стадии а) способа настоящего изобретения представлена суспензия разрушенных клеток хозяев, можно сначала разрушить (целые) клетки хозяева, содержащиеся в одной из описанных выше суспензий, например, методами немеханического разрушения клеток или методами механического разрушения клеток (см. выше).

В контексте настоящего изобретения термин "суспензия разрушенных клеток хозяев, содержащая нерастворимый искомый белок и нерастворимые части клеток хозяев" относится к суспензии, например, культуральной среде, буферному водному раствору, технической воде или деионизированной воде, непосредственно содержащей нерастворимый искомый белок и нерастворимые части клеток хозяев (например, нерастворимые части клеточной стенки или нерастворимые обломки клеток) из разрушенных клеток хозяев. В противоположность этому, используемый здесь термин "суспензия целых клеток хозяев, содержащая нерастворимый искомый белок и нерастворимые части клеток хозяев" относится к суспензии, например, культуральной среде, водному раствору (например, буферному водному раствору), технической воде или деионизированной воде, содержащей целые клетки хозяева, в которых содержится нерастворимый искомый белок и нерастворимые части клеток хозяев (например, нерастворимая клеточная стенка или нерастворимые белки клеток хозяев).

Термин "нерастворимые части клеток хозяев" в настоящем изобретении относится к нерастворимым белкам клеток хозяев, клеточным стенкам, клеточным мембранам, частям клеточной стенки, частям клеточной мембраны, частям цитоскелета, обломкам клеток хозяев и/или нерастворимым цитоплазматическим включениям (например, кристаллам оксалата кальция или диоксида кремния, гранулам запасающих энергию материалов, таких как крахмал, гликоген или полигидроксибутират), которые входят в состав клеток хозяев, например, микробных, клеток растений или насекомых, или систем экспрессии, используемых для экспрессии искомого белка. Этот термин не охватывает нерастворимый искомый белок настоящего изобретения. Термин "нерастворимые части клеток хозяев" также относится к тем частям клеток хозяев, которые нерастворимы в условиях, существующих на стадии а), но подвергаются солюбилизации в условиях, существующих на стадии b).

Термин "растворимые части клеток хозяев" в настоящем изобретении относится к растворимым белкам клеток хозяев, клеточным органеллам, частям клеточных органелл и/или другим растворимым компонентам клетки, которые входят в состав клеток хозяев, например, микробных, клеток растений или насекомых, или системы экспрессии, используемой для экспрессии искомого белка. Термин "растворимые части клеток хозяев" также относится к тем частям клеток хозяев, которые уже растворимы в условиях, существующих на стадии а), и остаются растворимыми в условиях, существующих на стадии b).

Термин "искомый белок" в контексте настоящего изобретения относится к представляющему интерес белку, например, белку шелка типа белка шелка паука или белка шелка насекомых, коллагену, резилину или кератину, который может быть выделен из суспензии клеток хозяев, например, микробных, клеток растений или насекомых. В предпочтительном воплощении данный искомый белок является рекомбинантным искомым белком, более предпочтительно рекомбинантным искомым белком, кодируемым рекомбинантным полинуклеотидом. В другом воплощении рекомбинантный искомый белок является гибридным белком белка шелка паука и белка шелка насекомых, белка шелка паука и коллагена, белка шелка паука и резилина или белка шелка паука и кератина. Особенно предпочтительно, чтобы данный искомый белок вырабатывался рекомбинантно в данных клетках хозяевах.

В предпочтительном воплощении искомые белки представляют собой белки, содержащие повторяющиеся звенья/домены, которые обладают свойством образовывать агрегаты искомого белка в клетках хозяевах или в суспензии, например, в культуральной среде, в водном растворе (например, буферном водном растворе), в технической воде или в деионизированной воде.

В другом предпочтительном воплощении искомые белки присутствуют в виде агрегатов искомого белка в клетках хозяевах или в суспензии, например, в культуральной среде, водном растворе (например, буферном водном растворе), в технической воде или в деионизированной воде. Такие агрегаты искомого белка могут образовываться путем аутоагрегации искомых белков в клетках хозяевах без влияния клеточного скелета или других внутриклеточных механизмов.

В частности, агрегаты искомого белка могут образоваться путем аутоагрегации множественных копий/звеньев искомого белка в частицы или твердую массу без влияния клеточного скелета или других внутриклеточных механизмов. Агрегаты искомого белка также могут образоваться путем аутоагрегации искомого белка в суспензии, например, в культуральной среде, другом водном растворе (например, буферном водном растворе), в технической воде или деионизированной воде. Агрегаты искомого белка могут образовываться по нескольким механизмам, которые могут включать ковалентные или нековалентные взаимодействия между молекулами искомого белка.

Предпочтительно агрегаты искомого белка содержат по меньшей мере 85%, более предпочтительно 90% и наиболее предпочтительно 95% или даже 100%, например, по меньшей мере 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или 100% одного и того же искомого белка и образуются при агрегации множественных копий данного искомого белка. Поразительно, что агрегаты данного искомого белка не только совместно локализуются внутри неспецифических агрегатов, но содержат по меньшей мере 85% или даже 100% одного и того же искомого белка, что свидетельствует о склонности искомых белков к аутоагрегации.

Термины "нерастворимый искомый белок" или "агрегат нерастворимого искомого белка" в настоящем изобретении относятся к такому искомому белку или агрегату искомого белка, который нерастворим в суспензии, например, культуральной среде, среде ферментации, водном растворе (например, буферном водном растворе типа трис/HCl, рН 7,5), технической воде или деионизированной воде, и поэтому может быть отделен от растворимых частей клеток хозяев, присутствующих в данной суспензии, например, центрифугированием и/или фильтрацией. Кроме того, термин "нерастворимый искомый белок" или термин "агрегат нерастворимого искомого белка" относятся к такому искомому белку или агрегату искомого белка, который также нерастворим в суспензии, например, культуральной среде, среде ферментации, водном растворе (например, буферном водном растворе типа трис/HCl, рН 7,5), технической воде или деионизированной воде, после добавления к данной суспензии водного раствора, содержащего основание (например, 0,05 М NaOH), тогда как другие части клеток хозяев, которые нерастворимы в суспензии, например, клеточной культуральной среде, среде ферментации, водном растворе (например, буферном водной растворе типа трис/HCl, рН 7,5), технической воде или деионизированной воде, становятся растворимыми после добавления к данной суспензии водного раствора, содержащего основание, и поэтому могут быть далее отделены от солюбилизированных нерастворимых частей клеток хозяев присутствующих в данной суспензии, например, центрифугированием и/или фильтрацией.

Предпочтительно, чтобы нерастворимый искомый белок или агрегат нерастворимого искомого белка был нерастворим в буферном водном растворе от 10 до 100 мМ трис/HCl, более предпочтительно от 10 до 50 мМ трис/HCl и наиболее предпочтительно от 10 до 20 мМ трис/HCl, например, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 мМ трис/HCl, причем данный буферный водный раствор предпочтительно имеет рН от 5,0 до 9,0, более п