Новые конструкции транспортеров и молекулы-конъюгаты, являющиеся транспортерами карго-молекул

Новые конструкции транспортеров и молекулы-конъюгаты, являющиеся транспортерами карго-молекул

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к новым конструкциям транспортеров общей формулы (I) D₁LLL_xD_m(LLL_yD_n)_a и их вариантам. Настоящее изобретение относится также к молекулам-конъюгатам, которые являются транспортерами переносимой молекулы (карго-молекулы), прежде всего к конъюгатам новых конструкций транспортеров с карго-фрагментом, который представляет собой, например, белки или пептиды, нуклеиновые кислоты, цитотоксические агенты, органические молекулы и т.д. В настоящем изобретении описаны также (фармацевтические) композиции, содержащие указанные конъюгаты, и способы лечения и применения этих конструкций транспортеров.

Методики, позволяющие обеспечивать эффективный перенос представляющей интерес субстанции, такой как нуклеиновые кислоты, белки или цитотоксические агенты, но также и другие (обладающие терапевтической активностью) соединения, из внешней среды в ткань или клетки, прежде всего в ядра клеток, представляют большой интерес в области биотехнологии. Эти методики можно применять для переноса и транслокации нуклеиновых кислот в клетки in vitro и in vivo и, как следствие, для производства белка или пептида, для регуляции генной экспрессии, для индукции цитотоксических или апоптозных действий, для анализа внутриклеточных процессов и для анализа воздействий, обусловленных транспортом широкого разнообразия различных карго-молекул в клетку (или ядро клетки), и т.д.

Одной из важных областей применения указанного переноса представляющей интерес карго-молекулы из внешней среды в ткань или клетку, является генная терапия, в этом случае карго-молекула, как правило, представляет собой нуклеиновую кислоту или ген. Хотя, как известно, в последние десятилетия достигнуты многообещающие результаты в совершенствовании этого метода, применение переноса генов, как правило, ограничено из-за отсутствия у векторов, предназначенных для транспорта генов, способности к эффективному переносу биологически активных карго-молекул в цитоплазму или ядра клеток в организме хозяина, подлежащего лечению, без воздействия на геном хозяина или изменения биологических свойств активной карго-молекулы.

С учетом этого было разработано несколько методик, способствующих более эффективной трансфекции клеток, например, нуклеиновыми кислотами, такими как ДНК или РНК. Трансфекция нуклеиновыми кислотам клеток или тканей пациентов с помощью метода переноса генов представляет собой основной метод молекулярной медицины, и она имеет решающее значение для лечения и предупреждения многочисленных заболеваний.

Репрезентативными примерами методов переноса генов являются общепринятые (физические или физико-химические) методы, такие как копреципитация нуклеиновых кислот с фосфатом кальция или ДЭАЭ-декстраном, метод, который обеспечивает проникновение нуклеиновых кислот в плазматическую мембрану, а затем проникать в клетку и/или ядро. Однако недостатком этого метода является низкая эффективность переноса и высокий процент гибели клеток. Кроме того, указанный метод можно применять только в условиях in vitro или ex vivo, но он не применим в ситуациях in vivo из-за их специфических природных особенностей.

Это же можно отнести к методам, включающим электропорацию in vitro. Электропорация in vitro основана на применении тока высокого напряжения для того, чтобы сделать клеточные мембраны достаточно проницаемыми с целью интродукции в клетку новых нуклеиновых кислот, например, ДНК или РНК. Однако такие методы, как правило, не пригодны для применения in vivo. Кроме того, недостатками этого метода являются также низкая эффективность переноса и высокий процент гибели клеток.

Другие хорошо известные физические или физико-химические методы включают (непосредственную) инъекцию («голых») нуклеиновых кислот или биобаллистический перенос генов. Биобаллистический перенос генов (известный также как бомбардировка биобаллистическими частицами) представляет собой метод, разработанный в Корнельском университете, который позволяет интродуцировать генетический материал в ткани или культуры клеток. Биобаллистический перенос генов, как правило, осуществляют путем нанесения покрытия на поверхность металлических частиц, таких как золотые или серебряные частицы, и бомбардировки этими металлическими частицами, содержащими адсорбированную ДНК, клеток с помощью генной пушки. Аналогично описанным выше методам этот метод можно применять только в условиях in vitro или ex vivo, но, как правило, он не применим в ситуациях in vivo.

Другие методы основаны на транспортных способностях так называемых молекул-транспортеров. В этом контексте предназначенные для применения молекулы-транспортеры, как правило, можно подразделять на вирусные векторы, т.е. молекулы-транспортеры, которые включают вирусные элементы, и невирусные векторы.

Наиболее успешные применяемые в настоящее время стратегии генной терапии основаны на вирусных векторах, таких как аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, ретровирусы и вирусы герпеса. Эти вирусные векторы, как правило, применяют для конъюгации родственной вирусу субстанции, обладающей высокой аффинностью к ДНК и нуклеиновой кислоте. Из-за их инфекционных свойств вирусы или вирусные векторы обладают очень высоким уровнем трансфекции. Вирусные векторы, как правило, представляют собой вирусы, генетически модифицированные таким образом, чтобы в трансфектированных клетках не образовывались функциональные инфекционные частицы. Однако в свете указанных мер предосторожности, связанных с безопасностью, существует много проблем, ассоциированных с вирусными векторами, которые связаны с иммуногенностью, цитотоксичностью и инсерционным мутагенезом. Например, нельзя исключать риск неконтролируемого увеличения интродуцированных терапевтически активных генов или вирусных генов, например, из-за возможных случаев рекомбинации. Кроме того, включающие вирусы конъюгаты трудно применять, и их использование, как правило, требует длительного периода подготовки перед осуществлением обработки (см., например, US №5521291).

Хотя невирусные векторы являются менее эффективными, чем вирусные векторы, при их применении в генной терапии; однако многие из них созданы в качестве безопасной альтернативы генной терапии. Некоторые из наиболее распространенных невирусных векторов включают транспортные системы на основе полиэтиленимина, дендримеров, хитозана, полилизина и пептидов, например, многих типов пептидов, которые, как правило, являются катионными по природе и обладают способностью взаимодействовать с нуклеиновыми кислотами, такими как плазмидная ДНК, посредством электростатических взаимодействий.

Для обеспечения успешного введения невирусные векторы, в частности транспортные системы на основе пептидов, должны обладать способностью преодолевать многие барьеры. Такие барьеры включают защиту карго-фрагмента, например, ДНК или других соединений, в процессе транспорта и предупреждают раннее расщепление или метаболизм карго-фрагмента in vivo. В случае нуклеиновых кислот, таких как молекулы ДНК и РНК, невирусные векторы также могут обладать способностью к специфическому введению этих молекул для эффективной экспрессии генов в клетках-мишенях.

Так, касательно нуклеиновых кислот, таких как молекулы ДНК и РНК, известно 4 барьера, которые должны преодолеть невирусные векторы для обеспечения успешного введения гена (см., например, Martin и др., The AAPS Journal, 9 (1), 2007, статья 3). Невирусные векторы должны обладать способностью 1) плотно сжимать и защищать нуклеиновые кислоты, 2) они должны обладать способностью направленно воздействовать на специфические для клеток поверхностные рецепторы, 3) невирусные векторы должны обладать способностью разрушать эндосомальную мембрану и 4) они должны обеспечивать введение карго-молекулы, представляющей собой нуклеиновую кислоту, в ядро и давать возможность транслироваться кодируемой белковой или пептидной последовательности.

Указанные невирусные векторы, прежде всего невирусные векторы, основой которых являются пептиды, обладают преимуществом по сравнению с другими стратегиями, основанными на применении невирусных векторов, состоящим в том, что они, как правило, обладают способностью решать все 4 указанные задачи, однако с различной эффективностью в отношении различных барьеров.

Например, катионные пептиды, богатые оснбвными остатками, такими как лизин и/или аргинин, обладают способностью эффективно конденсировать нуклеиновые кислоты, такие как ДНК, в небольшие компактные частицы, которые могут стабилизоваться в сыворотке. Кроме того, присоединение пептидного лиганда с полиплексом позволяет обеспечивать направленный перенос к специфическим рецепторам и/или специфическим типам клеток. Как отмечалось выше, полиплексы или катионные полимеры, как правило, формируют комплексы с отрицательно заряженными нуклеиновыми кислотами, что приводит к конденсации нуклеиновых кислот и защите этих нуклеиновых кислот от расщепления. Транспорт в клетки с помощью полиплексов (катионных полимеров), как правило, происходит посредством опосредуемого рецептором эндоцитоза. При этом ДНК сшивают с отличной от нее молекулой, такой как трансферрин, например, через полиплекс поли-L-лизин (PLL), который связывается с поверхностным рецептором и инициирует эндоцитоз. Полиплексы (катионные полимеры) включают, например, поли-L-лизин (PLL), хитозан, полиэтиленимин (PEI), полидиметиламиноэтилметакрилат (PD-MAEMA), полиамидоамин (РАМАМ). Известно, что такие действия характерны также для наноплексов (системы на основе наночастиц) или липоплексов (системы на основе липосом). Наноплексы (системы на основе наночастиц), как правило, предусматривают применение полиакрилатов, полиамидов, полистирола, цианакрилатов, полилактата (PLA), сополимера молочной и гликолевой кислоты (PLGA) и т.д. Липоплексы или липосомные системы, как правило, предусматривают применение катионных липидов, которые обладают способностью имитировать клеточную мембрану. При этом положительно заряженный остаток липида взаимодействует с отрицательно заряженным остатком нуклеиновой кислоты и тем самым может обеспечивать слияние с клеточной мембраной. Липоплексы или липосомные системы включают, например, DOTMA, DOPE, DOSPA, DOTAP, DC-Chol, EDMPC и т.д.

В этом контексте опосредуемый рецептором эндоцитоз также широко используется в экспериментальных системах, предназначенных для направленного введения карго-молекул, таких как нуклеиновые кислоты или терапевтические агенты, в клетки. В процессе опосредуемого рецептором эндоцитоза содержащие карго-молекулу комплексы либо избирательно интернализируются рецепторами, локализованными в клеточной мембране, которые являются специфическими для карго-молекулы, либо специфическими антителами, локализованными в компонентах мембраны. Эндоцитозная активность описана для многих рецепторов, включая IgG-Fc, рецепторы соматостатина, инсулина, IGF-I и -II, трансферрина, EGF, GLP-1, VLDL или интегрина и т.д.

Различные пептидные или белковые последовательности всесторонне протестированы в отношении их применения в методах переноса генов с помощью опосредуемого рецептором эндоцитоза. Важно отметить, что выделение пептидных последовательностей, которые контролируют эффективный опосредуемый рецептором эндоцитоз, в значительной степени усовершенствовалось в результате применения методов фагового дисплея. Фаговые дисплейные библиотеки представляют собой чрезвычайно эффективные инструменты, которые являются практически неограниченными источниками молекулярных вариантов, включая модификации встречающихся в естественных условиях лигандов или карго-фрагментов клеточных рецепторов и коротких пептидов. Подобные библиотеки инъецировали также непосредственно мышам и успешно выделяли пептидные последовательности, которые обладали 13-кратной селективностью в отношении головного мозга и почки.

Пропротеинконвертазы могут служить примером пептидных или белковых последовательностей, которые можно применять для транспорта молекул в клетки. Пропротеинконвертазы являются примером рецептора клеточной поверхности, который интернализируется в результате опосредуемого рецептором эндоцитоза. Установлено, что эти белки ответственны за превращение предшественников пептидных гормонов, нейропептидов и многих других белков в их биологически активные формы. Все сайты расщепления семейства пропротеинконвертаз характеризуются наличием консенсусной последовательности R-X-X-R. Пропротеинконвертазы млекопитающих можно подразделить на 3 группы на основе их распределения в тканях. Фурин, РАСЕ4, РС5/РС6 и LPCIPC7/PC8/SPC7 экспрессируются в широком разнообразии тканей и клеточных линий. В отличие от этого, экспрессия РС2 и РС1/РС3 ограничена нейроэндокринными тканями, такими как панкреатические островки, гипофиз, мозговое вещество надпочечников и многие области головного мозга. Экспрессия РС4 в значительной степени ограничена тестикулярными сперматогенными клетками. Специфические для нейроэндокринной ткани конвертазы РС2 и РС1/РС3 главным образом локализованы в секреторных гранулах. Опубликованы также данные о том, что РС5/РС6А локализованы в секреторных гранулах. Кроме того, имеются косвенные данные, которые позволяют предположить, что часть молекул пропротеинконвертаз присутствует на клеточной поверхности, и было установлено, что фурин циркулирует между TGN (транс-сеть аппарата Гольджи) и клеточной поверхностью. Взятые в совокупности эти свойства свидетельствуют о том, что Пропротеинконвертазы транспортируют внеклеточные лиганды во внутриклеточное пространство.

Представляют интерес также так называемые транслокаторные белки или домены белковой трансдукции (PTD). Пептидные последовательности, выведенные из транслокаторных белков или доменов белковой трансдукции (PTD), как правило, обладают способностью осуществлять избирательный лизис эндосомальной мембраны в ее кислотном окружении, приводя к высвобождению полиплекса в цитоплазму. Транслокаторные белки рассматриваются в качестве группы пептидов, обладающих способностью осуществлять транспорт макромолекул между клетками (транслокаторные белки), к ним относятся белок ТАТ вируса ВИЧ-ЦВИЧ), белок гена antennapedia (Drosophila antennapedia), VP22 HSV (вирус герпеса простого), FGF или лактоферрин и т.д. В отличие от этого домены белковой трансдукции (PTD) рассматриваются в качестве группы пептидов, которые обладают способностью направлять белки и пептиды, ковалентно связанные с этими последовательностями, в клетку через мембрану (Leifert и Whitton: Translocatory proteins and protein transduction domains: a critical analysis of their biological effects and the underlying mechanisms, Molecular Therapy, т.8, №1, 2003). Общей для транслокаторных белков, а также для PTD является основная область, которая рассматривается как основной элемент, ответственный за транспорт слитых пептидов, поскольку она обладает способностью связывать полианионы, такие как нуклеиновые кислоты. Не вдаваясь в теорию, можно предположить, что PTD действуют подобно катионным трансфектирующим реагентам, используя зависящий от рецептора ненасыщаемый адсорбтивный эндоцитоз. PTD, как правило, сшивают с белками или пептидами для того, чтобы оказывать воздействие или повышать CTL-ответ при введении вакцины на основе пептида (см. Melikov и Chernomordik, Arginine-rich cell penetrating polypeptides: from endosomal uptake to nuclear delivery, Cell. Mol. Life Sci., 2005).

К сожалению, основанные на пептидах системы транспортеров подвержены протеолитическому расщеплению in vivo пептидазами, что приводит к образованию укороченных последовательностей транспортеров (и/или карго-молекул). Указанные пептидазы можно подразделять на экзопептидазы и эндопептидазы, оба эта фермента обладают способностью катализировать расщепление белков на пептидные фракции меньшего размера и даже на индивидуальные аминокислоты посредством процесса, известного как протеолиз. В этом контексте к эндопептидазам, как правило, относят протеолитические пептидазы, которые разрушают пептидные связи неконцевых аминокислот (т.е. внутри молекулы). Эндопептидазы, как правило, обладают специфичностью в отношении определенных аминокислот.Примерами эндопептидаз являются, например, трипсин, химотрипсин, эластаза, термолизин, пепсин и эндопептидаза V и т.д. Трипсин, как известно, осуществляет расщепление после Arg или Lys, но, если за ними не следует Pro. Химотрипсин, как известно, осуществляет расщепление после Phe, Trp или Tyr, но, если за ними не следует Pro. Химотрипсин осуществляет расщепление более медленно после Asn, His, Met или Leu. Эластаза осуществляет расщепление после Ala, Gly, Ser или Val, но, если за ними не следует Pro. Термолизин представляет собой термостабильную эндопротеазу, которая осуществляет расщепление перед Ile, Met, Phe, Trp, Tyr или Val, но если перед ними не расположен Pro. Термолизин иногда осуществляет расщепление после Ala, Asp, His или Thr. Пепсин, как известно, осуществляет расщепление перед Leu, Phe, Trp или Tyr, но если перед ними не расположен Pro. И, наконец, эндопептидаза V8, как известно, осуществляет расщепление после Glu. В отличие от эндопептидаз экзопептидазы представляет собой ферменты, которые катализируют удаление аминокислоты с конца полипептидной цепи и, таким образом, расщепляют конец указанной полипептидной цепи. Экзопептидазы можно подразделять на основе их сайта расщепления на аминопептидазы и карбоксипептидазы. Аминопептидазы, как правило, представляют собой цинк-зависимые ферменты, и они продуцируются железами тонкого кишечника. Аминопептидазы, как правило, отщепляют индивидуальную аминокислоту от аминоконца пептидной или белковой последовательности. Карбоксипептидазы, как правило, представляют собой ферменты, которые гидролизуют карбоксиконец (С-конец) пептидной связи. У людей, животных и растений присутствует несколько типов карбоксипептидаз с различными функциями от катаболизма до созревания белков, которые представляют собой пищеварительные ферменты, присутствующие в соке поджелудочной железы, которые отщепляют индивидуальную аминокислоту от карбоксильного конца пептида. Конкретным примером является карбоксипептидаза N (CPN), плазматическая цинксодержащая металлопротеаза, состоящая из двух малых субъединиц, которые обладают ферментативной активностью, и двух больших субъединиц, которые защищают фермент от расщепления. CPN отщепляет карбоксиконцевые аминокислоты аргинин и лизин от биологически активных пептидов, таких как анафилоксины, кинины и фибринопептиды системы комплемента.

Для модификации протеолитического расщепления основанных на пептидах систем транспортеров, указанных выше, основанные на пептидах системы транспортеров могут состоять полностью из D-аминокислот, образуя тем самым «ретро-инвертированные пептидые последовательности». Понятие «ретро-инвертированные (пептидные) последовательности» относится к изомеру линейной пептидной последовательности, в котором направление последовательности изменено на противоположное и хиральность каждого аминокислотного остатка является инвертированной (см., например, Jameson и др., Nature, 368, 1994, cc.744-746; Brady и др., Nature, 368, 1994, cc.692-693). Преимуществом объединения D-энантиомерных аминокислот и обратного синтеза состоит в том, что положения карбонильных и аминогрупп в каждой амидной связи меняются местами, при этом положение групп боковой цепи на каждом альфа-атоме углерода сохраняется. В результате конформационного изменения встречающихся в естественных условиях L-энантиомерных аминокислот пептидной последовательности основанного на пептиде транспортера на D-энантиомерные аминокислоты риск протеолитического расщепления in vivo элиминируется, что является преимуществом и обусловливает высокую эффективность в отношении трансфекции карго-фрагмента в клетку. В отличие от этого, понятие «обратная последовательность» относится к последовательности, в которой направление последовательности является обратным (но хиральность каждого аминокислотного остатка не является инвертированной) (например, D-Arg-L-Arg-L-Arg→L-Arg-L-Arg-D-Arg).

Однако, несмотря на эффективность «работы» в качестве молекулы-транспортера, как указано выше, конформационное изменение встречающихся в естественных условиях L-энантиомерных аминокислот пептидной последовательности основанного на пептиде транспортера на D-энантиомерные аминокислоты влечет за собой риск доминирующего накопления этих транспортеров в клетке в течение всего времени жизни клетки или даже в течение более длительного периода времени в (окружающей) ткани или организме. Таким образом, указанные транспортеры даже, если прикрепленная карго-молекула отщепляется или метаболизируется к тому времени, могут сохраняться в клетке и принимать участие в дальнейших меж - и внутриклеточных процессах, приводя к неизвестным и нежелательным побочным действиям.

Таким образом, в данной области существует необходимость в создании альтернативных невирусных молекул-транспортеров, предпочтительно основанных на пептидах систем транспортеров, указанных выше, которые не обладают указанным нежелательным накоплением в клетке или ткани, но при этом могут эффективно переносить карго-фрагменты в клетки.

Вышеуказанная задача решается с помощью объектов изобретения, представленных в прилагаемой формуле изобретения, прежде всего с помощью новой конструкции транспортеров и их конъюгатов (молекула-конъюгат, являющаяся транспортером карго-молекулы), описанных в формуле изобретения. Вышеуказанная задача решается также с помощью способов и вариантов применения новой конструкции транспортера и его конъюгатов, описанных в формуле изобретения.

Таким образом, согласно первому объекту настоящего изобретения задача решается с помощью новой конструкции транспортера, которая содержит или состоит по меньшей мере из одной последовательности общей формулы (I) (SEQ IDNO:I):

D₁LLL_xD_m(LLL_yD_n)_a

в которой:

D обозначает D-аминокислоту;

L обозначает L-аминокислоту;

а обозначает 0-3, предпочтительно 0-2, более предпочтительно 0, 1, 2 или 3, еще более предпочтительно 0, 1 или 2 и наиболее предпочтительно 1;

l, m и n каждый независимо друг от друга обозначает 1 или 2, предпочтительно 1;

x и y каждый независимо друг от друга обозначает 0, 1 или 2, предпочтительно 1.

В контексте настоящего описания понятие «конструкция транспортера» относится к состоящему из аминокислот соединению, которое обладает способностью к транслокации через биологические мембраны. В контексте настоящего описания понятие «переносящая (обеспечивающая перенос) последовательность» (или «последовательность транспортера») относится к последовательности аминокислот, которая обеспечивает транслокацию через биологические мембраны. Таким образом, конструкции транспортеров, предлагаемые в настоящем изобретении, содержат переносящую последовательность, которая обеспечивает транслокацию конструкции транспортера через биологические мембраны. Таким образом, новые конструкции транспортеров общей формулы (I) позволяют эффективно осуществлять и могут обеспечивать транспорт карго-фрагментов, например, белков или пептидов, нуклеиновых кислот или небольших органических молекул, антигенов, цитотоксических агентов и т.д. в организм, ткань, клетку (например, подлежащую лечению), клеточный субкомпартмент и/или в ядро клетки.

Предпочтительно предлагаемая в изобретении конструкция транспортера общей формулы (I) является достаточно стабильной, не расщепляясь протеазами до транспорта карго-фрагмента в его область-мишень. С другой стороны, предлагаемые в изобретении конструкции транспортеров общей формулы (I) не обладают длительной устойчивостью в клетке и могут расщепляться протеазами в течение приемлемого периода времени, что позволяет избегать отрицательных побочных действий, таких как нежелательное накопление нового предлагаемого в изобретении транспортера или его конъюгата в клетке. При создании изобретения неожиданно было установлено, что указанные благоприятные свойства можно придавать обеспечивающей перенос последовательности, прежде всего любой обеспечивающей перенос последовательности, известной в данной области, только с помощью предлагаемой в изобретении схемы (в контексте настоящего описания обозначена также как D-/L-cxeмa) указанной выше общей формулы (I), конкретного содержания и положения D-аминокислот в чередовании с конкретным содержанием L-аминокислот, как указано в общей формуле (I). Такая предлагаемая в изобретении D-/L-схема позволяет специалисту в данной области определять персистентность in vivo или in vitro предлагаемой в изобретении новой конструкции транспортера, описанной выше, в клетке, которая точно является достаточной, поскольку представляет собой промежуток времени, достаточно длинный для гарантии введения и проникновения предлагаемой в изобретении новой конструкции транспортера в клетку или ядро, до расщепления предлагаемой в изобретении новой конструкции транспортера протеазами в приемлемый промежуток времени. Такая персистентность in vivo или in vitro предлагаемой в изобретении новой конструкции транспортера в клетке фактически зависит от конкретного содержания и положения D-аминокислот в чередовании с конкретным содержанием L-аминокислот, как указано в общей формуле (I). Кроме того, конструкция транспортера, отличающаяся предлагаемой в изобретении D-/L-схемой, указанной выше в общей формуле (I), является достаточно короткой для того, чтобы избегать стерических помех, связанных с карго-фрагментом, в предлагаемой в изобретении новой конструкции транспортера, входящей в описанную ниже молекулу-конъюгат, которая является транспортером карго-молекулы. Это обеспечивает также эффективную стоимость получения таких предлагаемых в изобретении новых конструкций транспортеров. Кроме того, можно легко получать конъюгат являющегося транспортером пептида или белка указанной выше общей формулы (I) либо с белками или пептидами, нуклеиновыми кислотами, такими как молекулы ДНК и РНК, либо с цитотоксическими агентами или даже небольшими органическими молекулами и т.д.

Согласно указанной выше общей формуле (I) предлагаемая в изобретении новая конструкция транспортера содержит L-аминокислоты и D-аминокислоты согласно конкретной D-/L-cxeмe, представленной в общей формуле (I).

В контексте настоящего изобретения L-аминокислоты, обозначенные также как L-энантиомерные аминокислоты, предпочтительно представляют собой аминокислоты, выбранные из встречающихся в естественных условиях аминокислот или их производных. Встречающиеся в естественных условиях аминокислоты, как правило, выбирают из стандартных (протеиногенных) аминокислот, таких как аланин, аргинин, аспарагин, аспарагиновая кислота, цистеин, глутамин, глутаминовая кислота, глицин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, пролин, серин, треонин, триптофан, тирозин и валин, а также из нестандартных аминокислот, таких как орнитин, цитруллин, гомоцистеин, S-аденозилметионин, гидроксипролин, селеноцистеин, пирролизин, лантионин, 2-аминоизомасляная кислота, дегидроаланин, гамма-аминомасляная кислота и т.д.

Производные указанных L-аминокислот или L-энантиомерных аминокислот, как правило, представляют собой любое встречающееся в естественных условиях или не встречающееся в естественных условиях производное этих аминокислот, включая (но, не ограничиваясь только ими), указанные выше аминокислоты, содержащие пост-трансляционные модификации или синтетические модификации, включая ацетилирование (на N-конце пептидной последовательности, на остатках лизина и т.д.), деацетилирование, алкилирование, например, метилирование, этилирование и т.д. (предпочтительно на остатках лизина или аргинина в пептидной последовательности), деалкилирование, например, деметилирование, деэтилирование и т.д., амидирование (предпочтительно на С-конце пептидной последовательности), формилирование, гамма-карбоксилирование, глутамилирование, гликозилирование (предпочтительно на остатках аспарагина, лизина, гидроксилизина, серина или треонина и т.д. в пептидной последовательности), добавление гема или фрагмента гема, гидроксилирование, йодирование, изопренилирование, включающее добавление изопреноидного остатка, такого как фарнезил или геранилгераниол и т.д.), липоилирование (присоединение функциональной группы липоата), например, пренилирование, образование GPI-якоря, включая миристоилирование, фарнезилирование, геранилгераниолирование и т.д., окисление, фосфорилирование (например, на остатках серина, тирозина, треонина или гистидина и т.д. в пептидной последовательности), сульфатацию (например, тирозина), селеноилирование, сульфатирование и т.д.

Производные L-аминокислот включают также (но, не ограничиваясь только ими) модифицированные L-аминокислоты, которые модифицированы путем интродукции одной из следующих меток:

(I) радиоактивные метки, т.е. радиоактивное фосфорилирование или радиоактивная метка, представляющая собой радиоактивную/радиоактивный серу, водород, углерод, азот и т.д.;

(II) окрашивающие вещества (например, дигоксигенин и т.д.);

(III) флуоресцентные группы (например, флуоресцеин, родамин, флуорохромные белки, описанные ниже и т.д.);

(IV) хемолюминесцентные группы;

(V) комбинация меток, состоящая из двух или большего количества меток, указанных в подпунктах (I)-(IV).

Наиболее предпочтительными примерами производных L-аминокислот являются (но, не ограничиваясь только ими) АМС (аминометилкумарин), дабцил (диметиламинофенилазобензоил), дансил (диметиламинонафталинсульфонил), FAM (карбоксифлуоросцеин), Мса (метоксикумаринацетил), Хап (ксантил), Abu (аминомасляная кислота), бета-Ala (бета-аланин), E-Ahx (6-аминокапроновая кислота), альфа-Aib (альфа-аминоизомасляная кислота), Ams (аминосерин), Cha (циклогексиламин), Dab (диаминомасляная кислота), Hse (гомосерин). Hyp (гидроксипролин), Mpr (меркаптопропионовая кислота), Nal (нафтилаланин), Nva (норвалин), Огп (орнитин), Phg (фенилглицин), Sar (саркозин), Sec (селеноцистеин), ТЫ (тиенилаланин) и т.д.

Кроме того, L-энантиомерные аминокислоты, выбранные для предлагаемой в изобретении конструкции транспортера, можно выбирать из конкретных комбинаций вышеуказанных L-энантиомерных аминокислот или их производных. Такие комбинации могут включать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 или даже большее количество вышеуказанных L-энантиомерных аминокислот или их производных. Возможны также комбинации между любыми вышеуказанными L-энантиомерными аминокислотами или их производными и любыми из вышеуказанных D-энантиомерных аминокислот или их производных в контексте понятий общей формулы (I) или любых подформул, указанных в настоящем описании. Указанные конкретные комбинации аминокислот могут отличаться более высокой или более низкой стабильностью при воздействии пептидаз и поэтому могут представлять собой дополнительную возможность придания in vivo или in vitro предлагаемой в изобретении новой конструкции транспортера, указанной выше, более высокой или более низкой стабильности. Например, предлагаемая в изобретении новая конструкция транспортера может содержать дипептидную последовательность Arg-Lys в D- и/или L-форме (т.е. либо в виде D-энантиомерных аминокислот, либо L-энантиомерных аминокислот, либо смешанных D- и L-энантиомерных аминокислот), предпочтительно в L-форме, которая обладает пониженной стабильностью при воздействии пептидаз, и поэтому их можно применять для дестабилизации пептидной последовательности предлагаемой в изобретении новой конструкции транспортера и тем самым для снижения ее времени полужизни in vivo до требуемого уровня.

В контексте настоящего изобретения D-аминокислоты, обозначенные также как D-энантиомерные аминокислоты, предпочтительно обозначают ненативные (непротеиногенные) «ретро-инвертированные» аминокислоты, где эти ненативные (непротеиногенные) «ретро-инвертированные» аминокислоты предпочтительно выведены из встречающихся в естественных условиях L-аминокислот и/или их производных, как указано выше. В этом контексте понятие «ретро-инвертированные» относится к изомеру встречающейся в естественных условиях L-аминокислоты, как она определена выше (и к полученным из нее пептидамв), в котором хиральность остатка встречающейся в естественных условиях L-аминокислоты является инвертированной с образованием соответствующей D-аминокислоты (см., например, Jameson и др., Nature, 368, 1994, cc.744-746; Brady и др., Nature, 368, 1994, cc.692-693). Другими словами, в пептидных связях D-аминокислот положения карбонильной и аминогрупп меняются местами, при этом положение групп боковых цепей на каждом альфа-атоме углерода сохраняется прежним. Таким образом, D-аминокислоты можно встраивать в пептидную последовательность, которая состоит или содержит L-аминокислоты, и при этом можно конъюгировать с L-аминокислотами, как указано выше, с помощью методов, известных в данной области. Такие методы известны и включают, например (но, не ограничиваясь только ими) методы жидкофазного синтеза пептидов или методы твердофазного синтеза пептидов, например, методы твердофазного синтеза пептидов согласно методу Меррифилда, твердофазный синтез пептидов с использованием трет-Вос, твердофазный синтез пептидов с использованием, Fmoc, твердофазный синтез пептидов с использованием ВОР (гексафторфосфат бензотриазол-1-илокси-трис(диметиламино)фосфония) и т.д. Содержание D-аминокислот в предлагаемых в изобретении новых конструкциях транспортеров, которые имеют D-/L-схему общей формулы (I), обеспечивает дополнительное разнообразие ценных свойств. Например, такие новые конструкции транспортеров проникают в клетку более эффективно и являются более стабильными (прежде всего in vivo) и отличаются пониженной иммуногенностью по сравнению с конструкциями транспортеров на основе соответствующих L-аминокислотных последовательностей. Однако они не являются столь же персистентными в клетке, что и конструкции транспортеров, состоящие полностью из D-аминокислот, в частности, из-за того, что практически все расщепляющие ферменты, типа протеаз или пептидаз, расщепляют пептидные связи между смежными L-аминокислотами. Следовательно, пептиды, состоящие из D-энантиомерных аминокислот и L-энантиомерных аминокислот, обладают более значительной устойчивостью к быстрому протеолитическому расщеплению, не накапливаясь в клетке благодаря отсутствию расщепления протеазами.

Указанная выше предлагаемая в изобретении новая конструкция транспортера общей формулы (I) предпочтительно содержит L-аминокислоты и D-аминокислоты или их производные, указанные выше. Такие производные могут входить в состав полной предлагаемой в изобретении новой конструкции транспортера в количестве примерно 0%, примерно 10%, примерно 20%, примерно 30%, примерно 40%, примерно 50%, примерно 60%, примерно 70%, примерно 80%, примерно 90% или даже примерно 100%. Другими словами, предлагаемая в изобретении новая конструкция транспортера может содержать примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 или даже большее количество таких производных, при этом максимальное количество возможных производных ограничено, естественно, максимальным количеством аминокислот, входящих в указанную выше предлагаемую в изобретении новую конструкцию транспортера общей формулы (I).

Согласно указанной выше общей формулы (I) предлагаемая в изобретении новая конструкция транспортера содержит определенную D-/L-схему L-аминокислот и D-аминокислот, что обозначено целыми числами а, l, m, n, x и y.

Согласно указанному выше определению общей формулы (I) а обозначает символ, определяющий количество повторов подгруппы (LLL_yD), как она определена в общей формуле (I) D₁LLL_xD_m(LLL_yD_n)_a. Согласно указанному выше определению а можно выбирать из любого числа от 0 до 3, предпочтительно от 0 до 2, более предпочтительно от 0 до 1, или его можно выбирать из индивидуальных значений 0, 1, 2 или 3, еще более предпочтительно из индивидуальных значений 0, 1 или 2 и наиболее предпочтительно а=1. В зависимости от конкретного количества повторов (а=0, 1, 2 или 3) предлагаемая в изобретении новая конструкция транспортера общей формулы (I) D₁LLL_xD_m(LLL_yD_n)_a может содержать или состоять по меньшей мере из одной из следующих подформул (Ia)-(Id):

(Ia): D₁LLL_xD_m (SEQ ID NO:2);

(Ib): D₁LLL_xD