Микровезикулы, происходящие из протопластов клеток, и их применение

Микровезикулы, происходящие из протопластов клеток, и их применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к микровезикулам, происходящим из протопластов клеток, таких как бактерии, археи, грибы, клетки растений и т.п., и к их применению для доставки терапевтических, диагностических и/или вакцинных веществ в клетки-мишени и ткани-мишени.

Уровень техники

В целях применения в фармакотерапии, система для доставки лекарственных средств (DDS) предназначена для способствования доставке лекарственного средства в область-мишень в организме для обеспечения терапевтического эффекта. Если лекарственное средство экскретируется слишком быстро из организма вследствие его низких уровней всасывания или биодоступности, DDS можно использовать для модификации профиля высвобождения лекарственного средства. Лекарственные средства с тяжелыми побочными эффектами должны доставляться только в ткани-мишени клетки-мишени. Например, множество доступных в настоящее время средств против злокачественной опухоли проявляют цитотоксичность в отношении нормальных клеток помимо злокачественных клеток. Доставка средств против злокачественной опухоли в основном в злокачественные клетки или ткани должна снизить страдание и неудобство пациентов со злокачественной опухолью в ходе лечения.

С первого применения в 1960 годах липосомы широко исследовали в отношении их применения в DDS. Достижения в исследованиях липосом привели к конструированию, путем конъюгации с полимерами, такими как полиэтиленгликоль (PEG), закрепленными снаружи мембраны, так называемых липосом-невидимок, которые могут избегать обнаружения иммунной системой организма. Покрытие PEG обеспечивает более длительное время полужизни в кровотоке механизма доставки лекарственных средств. На практике был разработан DOXIL, пегилированная инкапсулированная в липосомы форма доксорубицина. Однако сами по себе липосомы и липосомы-невидимки не могут доставлять лекарственные средства в клетки-мишени или ткани-мишени, поскольку они лишены способности распознавать клетки-мишени или ткани-мишени. Чтобы обеспечить связывание липосом с конкретной мишенью, недавно проводили исследования, направленные на включение нацеливающих лигандов, таких как моноклональные антитела, в липосомы, однако ни одно из них еще не прошло клинические испытания и не было успешно запущено в серийное производство.

Вместо искусственно синтезированных липосом, состоящих из липидов, в целях разработки систем для доставки используют существующие в природе клеточные мембраны. Описан способ доставки лекарственных средств с использованием мини-клеток, секретируемых из микроорганизмов, выращенных в среде, содержащей лекарственное средство [WO 2005/079854, “Compositions and methods for targeted in vitro and in vivo drug delivery to mammalian cells via bacterially derived intact minicells”]. Миниклетки, обычно состоящие из бактериальной клеточной мембраны, склонны содержать токсические материалы, например, эндотоксины (липополисахариды), присутствующие на внешней мембране, если они происходят из грамотрицательных бактерий, или пептидогликаны, присутствующие в клеточной стенке, если они происходят из грамположительных бактерий, так что они могут вызывать различные побочные эффекты, такие как системное воспаление, сепсис и т.д.

Протопласт представляет собой клетку бактерий, архей, грибов, растений, из которой полностью удалена ее клеточная стенка. Удаление клеточной стенки можно осуществить с помощью ферментов, таких как лизоцим для клеток бактерий и архей, хитиназа для клеток грибов и целлюлаза, пектиназа и/или ксиланаза для клеток растений. Протопласты можно использовать для исследования биологии мембран, включая захват макромолекул и вирусов. Кроме того, протопласты применяют для трансформации ДНК, чтобы создавать генетически модифицированные организмы. Протопласты можно использовать для выведения растений с использованием способа, называемого слиянием протопластов. Однако до настоящего времени еще не были описаны происходящие из протопластов микровезикулы, также как и их применение.

Описание

Техническая проблема

К настоящему изобретению привело глубокое и тщательное исследование DDS, проведенное авторами настоящего изобретения, нацеленное на преодоление проблем, имеющихся на уровне техники, что привело к открытию того, что микровезикулы, происходящие из клеток бактерий, архей, грибов или растений, у которых удалены их клеточные стенки, можно использовать для эффективной доставки терапевтических и диагностических веществ или вакцин, в конкретные клетки или ткани.

Таким образом, задачей настоящего изобретения является предоставление композиции, содержащей микровезикулы, происходящие из протопластов клеток. Другой задачей настоящего изобретения является предоставление фармацевтической композиции, содержащей микровезикулы, нагруженные веществом, необходимым для диагностики, терапии, вакцинации, нацеливания или слияния клеточной мембраны с клеткой мишенью, и обладающей сниженными побочными эффектами и улучшенной стабильностью in vivo и in vitro. Следующей задачей настоящего изобретения является предоставление композиции для доставки терапевтического, диагностического и/или вакцинного вещества, содержащего микровезикулы, происходящие из протопластов клеток. Следующей задачей настоящего изобретения является предоставление способа доставки вещества к конкретной мишени с использованием микровезикул, системы для доставки вещества, содержащей микровезикулы, и набора для диагностики заболевания, содержащего микровезикулы.

Однако технические задачи, решаемые с помощью настоящего изобретения, не ограничиваются задачами, указанными выше, и другие задачи могут быть хорошо понятны специалистам в данной области из представленного ниже описания.

Техническое решение

В соответствии с его аспектами, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей микровезикулы, происходящие из протопластов клетки. Клетка, пригодная для настоящего изобретения, может быть выбрана из группы, состоящей из клетки бактерий, клетки архей, клетки грибов и клетки растений.

В соответствии с другим аспектом, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей происходящие из протопластов микровезикулы, нагруженные терапевтическим или диагностическим веществом.

В соответствии с другим аспектом, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей микровезикулы протопластов, нагруженные вакцинным веществом.

Благодаря наличию способности к транспорту терапевтического, диагностического и/или вакцинного вещества в конкретную ткань или клетку, микровезикулы по настоящему изобретению можно использовать для предупреждения, лечения и/или диагностики представляющего интерес заболевания. Вещество, предназначенное для нагрузки микровезикул, конкретно не ограничено. Терапевтическое, диагностическое и/или вакцинное вещество для нагрузки может быть экспрессировано естественным образом или путем трансформации клетки, используемой в качестве источника микровезикул, или оно может быть внесено извне клетки.

В соответствии со следующим аспектом, настоящее изобретение относится к композиции для доставки диагностического, терапевтического и/или вакцинного вещества от заболевания, включающего происходящие из протопластов микровезикулы.

В соответствии с другим аспектом, настоящее изобретение относится к системе для доставки диагностического, терапевтического и/или вакцинного вещества от заболевания, содержащего происходящие из протопластов микровезикулы.

В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение относится к способу получения происходящих из протопластов микровезикул, включающему: удаление клеточных стенок из клеток с получением протопластов; конструирование микровезикул в суспензии клеток; и выделение микровезикул из суспензии.

В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение относится к способу получения происходящих из протопластов микровезикул, нагруженных терапевтическим, диагностическим или вакцинным веществом от заболевания, включающему: нагрузку клеток терапевтическим, диагностическим или вакцинным веществом извне, а затем удаление клеточной стенки из клеток с получением протопластов; конструирование микровезикул в суспензии протопластов; и выделение микровезикул из суспензии.

В соответствии с другим аспектом, настоящее изобретение относится к способу получения происходящих из протопластов микровезикул, нагруженных терапевтическим, диагностическим или вакцинным веществом от заболевания, включающему: удаление клеточной стенки из клеток с получением протопластов; нагрузку клеток терапевтическим, диагностическим или вакцинным веществом извне; конструирование микровезикул в суспензии протопластов, нагруженных веществом; и выделение микровезикул из суспензии.

В соответствии с другим аспектом, настоящее изобретение относится к способу получения происходящих из протопластов микровезикул, нагруженных терапевтическим, диагностическим или вакцинным веществом от заболевания, включающему: удаление клеточной стенки из клеток с получением протопластов; добавление терапевтического, диагностического или вакцинного вещества к суспензии протопластов для конструирования микровезикул; и выделение микровезикул из суспензии.

В соответствии с дополнительным аспектом, настоящее изобретение относится к способу получения происходящих из протопластов микровезикул, нагруженных терапевтическим, диагностическим или вакцинным веществом от заболевания, включающему: удаление клеточной стенки из клеток с получением протопластов; конструирование микровезикул в суспензии протопластов; добавление терапевтического, диагностического или вакцинного вещества к суспензии, содержащей микровезикулы, и обеспечения нагрузки микровезикул терапевтическим, диагностическим или вакцинным веществом; и выделение микровезикул, нагруженных терапевтическим, диагностическим или вакцинным веществом, из суспензии.

В соответствии со следующим дополнительным аспектом, настоящее изобретение относится к способу получения происходящих из протопластов микровезикул, нагруженных терапевтическим, диагностическим или вакцинным веществом от заболевания, включающему: удаление клеточной стенки из клеток с получением протопластов; конструирование микровезикул в суспензии протопластов; выделение микровезикул из суспензии; и добавление терапевтического, диагностического или вакцинного вещества к суспензии, содержащей микровезикулы, и обеспечение нагрузки микровезикул терапевтическим, диагностическим или вакцинным веществом.

В соответствии с другим дополнительным аспектом, настоящее изобретение относится к способу доставки диагностического, терапевтического или вакцинного вещества в конкретную клетку или ткань, включающему использование происходящих из протопластов микровезикул, нагруженных диагностическим, терапевтическим или вакцинным веществом.

В соответствии со следующим дополнительным аспектом, настоящее изобретение относится к способу лечения и/или диагностики заболевания, включающему доставку диагностического или терапевтического вещества в конкретную клетку или ткань с использованием происходящих из протопластов микровезикул, нагруженных терапевтическим или диагностическим веществом.

В соответствии с другим дополнительным аспектом, настоящее изобретение относится к способу профилактики и/или лечения заболевания, включающему доставку вакцинного вещества в конкретную клетку или ткань с использованием происходящих из протопластов микровезикул, нагруженных вакцинным веществом.

В соответствии со следующим дополнительным аспектом, настоящее изобретение относится к набору для диагностики заболевания, содержащему происходящие из протопластов микровезикулы субпротопластного размера, нагруженные праймером, зондом, антисмысловой нуклеиновой кислотой или антителом, необходимыми для диагностики заболевания.

Преимущественные эффекты

Патогенная способность клеток микробов или клеток высших организмов часто ассоциирована с определенными компонентами оболочек и мембран клеток, включая эндотоксины, расположенные в наружной мембране клетки, и пептидогликаны и липопротеины, расположенные в клеточной стенке грамотрицательных бактерий, псевдопептидогликан у архей, и хитин и целлюлозу, расположенные в клеточной стенке клеток грибов и растений. Эти компоненты могут запускать иммунные ответы, одновременно вызывая тяжелые симптомы. Будучи происходящими из протопластов, сконструированных удалением клеточной стенки из бактерий, архей, грибов или клеток растений, микровезикулы по настоящему изобретению не запускают иммунный ответ сами по себе. Кроме того, происходящие из протопластов микровезикулы являются преимущественными в том, что их можно легко нагрузить терапевтическим и/или диагностическим веществом или вакцинным веществом, и можно получить в крупном масштабе.

Терапевтические, диагностические и/или вакцинные вещества, когда ими нагружены происходящие из протопластов микровезикулы по настоящему изобретению, можно доставлять в клетки-мишени или ткани-мишени без направления их на не являющиеся мишенями клетки или ткани. Таким образом, происходящие из протопластов микровезикулы по настоящему изобретению могут селективно доставлять терапевтическое средство, такое как лекарственное средство, в представляющие интерес клетки или ткани со значительным снижением побочных эффектов, таким образом, смягчая неудобство и боль у пациента. Кроме того, благодаря способности к точному нацеливанию, происходящие из протопластов микровезикулы по настоящему изобретению можно использовать для точной диагностики заболеваний, когда они нагружены диагностическим веществом, и для эффективной вакцинации индивидуума, когда они нагружены вакцинным веществом, без возникновения побочных эффектов.

Более того, если микровезикулы получены из протопласта клетки, экспрессирующей терапевтическое, диагностическое и/или вакцинное вещество, они имеют промышленные и экономические преимущества, поскольку их можно получить без очистки вещества.

Также микровезикулы или терапевтические и/или диагностические вещества, которыми их нагружают, и способ их получения в соответствии с настоящим изобретением можно использовать для лечения, диагностики или экспериментов in vitro и/или in vivo.

Описание чертежей

На ФИГ.1 представлено схематическое изображение, иллюстрирующее процессы получения происходящих из протопластов микровезикул.

На ФИГ.2 проиллюстрирована точная конструкция протопластов из бактериальных клеток.

На ФИГ.3 представлено изображение TEM, демонстрирующее микровезикулы, происходящие из протопластов грамотрицательных бактерий.

На ФИГ.4 представлено изображение TEM, демонстрирующее микровезикулы, происходящие из протопластов грамположительных бактерий.

На ФИГ.5 представлен график, демонстрирующий размеры частиц микровезикул, происходящих из протопластов грамотрицательных бактерий.

На ФИГ.6 представлен график, демонстрирующий размеры частиц микровезикул, происходящих из протопластов грамположительных бактерий.

На ФИГ.7 представлен график, демонстрирующий, что микровезикулы, происходящие из протопластов грамотрицательных бактерий, не вызывают побочных эффектов.

На ФИГ.8 представлен график, демонстрирующий, что микровезикулы, происходящие из протопластов грамположительных бактерий, не вызывают побочных эффектов.

На ФИГ.9 представлен график, демонстрирующий, что микровезикулы, происходящие из протопластов грамотрицательных бактерий, не вызывают побочных эффектов у мышей.

На ФИГ.10 представлен график, демонстрирующий, что микровезикулы, происходящие из протопластов грамположительных бактерий, не индуцируют продуцирование IL-6 у мышей.

На ФИГ.11 представлено изображение, демонстрирующее способность происходящих из протопластов микровезикул быть нагруженными плазмидой.

На ФИГ.12 представлено изображение, демонстрирующее целостность плазмиды, которой нагрузили происходящие из протопластов микровезикулы.

На ФИГ.13 представлено изображение, демонстрирующее опосредуемую происходящими из протопластов микровезикулами доставку плазмиды в бактерии.

На ФИГ.14 представлен график, демонстрирующий способность нагруженных антигеном происходящих из протопластов микровезикул индуцировать продуцирование IgG-антитела, специфичного к антигену, у мышей.

На ФИГ.15 представлен график, демонстрирующий способность нагруженных антигеном происходящих из протопластов микровезикул индуцировать продуцирование IgE-антитела, специфичного к антигену, у мышей.

На ФИГ.16 представлены графики, иллюстрирующие способность нагруженных антигеном происходящих из протопластов микровезикул индуцировать образование T-клеток памяти, специфичных к антигену, у мышей.

На ФИГ.17 представлено изображение, демонстрирующее способность происходящих из протопластов микровезикул быть нагруженными тельцами включения.

На ФИГ.18 представлено изображение, демонстрирующее способность происходящих из протопластов микровезикул быть нагруженными белком Omp.

На ФИГ.19 представлен график, демонстрирующий, что нагруженные антигеном OmpA происходящие из протопластов микровезикулы индуцируют продуцирование специфичного к OmpA IgG-антитела у мышей.

На ФИГ.20 представлен график, демонстрирующий, что нагруженные антигеном Omp микровезикулы действуют в качестве вакцин против бактерий.

На ФИГ.21 представлено изображение, демонстрирующее антиген меланомы Mart-1, которым нагружены происходящие из протопластов микровезикулы.

На ФИГ.22 представлен график, демонстрирующий вакцинный эффект нагруженных Mart-1 происходящих из протопластов микровезикул на меланому.

На ФИГ.23 представлено изображение, демонстрирующее слитый белок EGF, которым нагружены происходящие из протопластов микровезикулы.

На ФИГ.24 представлено изображение, демонстрирующее, что слитый белок EGF нагружает поверхность происходящих из протопластов микровезикул при сохранении точной топологии.

На ФИГ.25 представлен график, демонстрирующий селективную доставку слитого белка EGF, которым нагружены микровезикулы, в представляющие интерес клетки.

На ФИГ.26 представлены изображения, иллюстрирующие доставку слитого белка EGF, которым нагружены микровезикулы, направляемую EGF.

На ФИГ.27 представлены изображения, иллюстрирующие передачу сигнала EGF микровезикулами, которые нагружены слитым белком EGF.

На ФИГ.28 представлены изображения, иллюстрирующие опосредуемую микровезикулами, нагруженными слитым белком EGF, доставку доксорубицина в представляющую интерес злокачественную ткань у мышей.

На ФИГ.29 представлен график, демонстрирующий индукцию EGF-специфического антитела микровезикулами, нагруженными слитым белком EGF, у мышей.

На ФИГ.30 проиллюстрирована нагрузка слитым белком рецептора EGF происходящих из протопластов микровезикул.

На ФИГ.31 представлен график, демонстрирующий аффинность микровезикул, нагруженных слитым белком рецептора EGF, к EGF.

На ФИГ.32 представлено изображение, демонстрирующее слитый белок His-метки, которым нагружены происходящие из протопластов микровезикулы.

На ФИГ.33 представлен график, демонстрирующий индукцию гибели клеток эндотелия сосудов происходящими из протопластов микровезикулами, нагруженными доксорубицином.

На ФИГ.34 представлен график, демонстрирующий индукцию гибели клеток толстого кишечника мыши происходящими из протопластов микровезикулами, нагруженными доксорубицином.

На ФИГ.35 представлен график, демонстрирующий ингибирование нагруженными доксорубицином происходящими из протопластов микровезикулами роста злокачественных тканей у мышей.

Способ осуществления изобретения

В соответствии с одним аспектом настоящее изобретение относится к композиции, содержащей микровезикулы, происходящие из протопластов клеток.

Примеры клетки, пригодной для настоящего изобретения, включают бактерии с клеточными стенками, археи, грибы, клетки растений, L-формы бактерий (или бактерии с дефицитом клеточной стенки (CWD)), но не ограничиваются ими. Бактерии могут быть грамположительными или грамотрицательными. Например, можно использовать Escherichia coli (E. coli) и Staphylococcus aureus (S. aureus), которые являются грамотрицательными и грамположительными, соответственно.

Кроме того, среди клеток, пригодных для настоящего изобретения, находятся “существующие в природе клетки” и “трансформированные клетки”.

Как используют в рамках изобретения, термин “существующие в природе клетки” включает клетки, которые могут быть направлены к конкретным клеткам или тканям, клетки, которые экспрессируют конкретные вещества.

Термин “трансформированные клетки”, как используют в рамках изобретения, включает, но не ограничивается ими, клетки, трансформированные так, чтобы они имели сниженную токсичность или ингибировали синтез их клеточной стенки; клетки, трансформированные для экспрессии вещества, необходимого для диагностики, лечения, вакцинации, нацеливания или слияния клеточной мембраны с клеткой-мишенью (фузоген); и их смесь.

Кроме того, “трансформированные клетки” включают клетки, которые трансформированы два или более раз, и клетки, которые трансформированы так, что в них предотвращается экспрессия конкретного белка.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения трансформированные клетки могут быть трансформированы так, чтобы они экспрессировали вещество, выбранное из группы, состоящей из молекулы клеточной адгезии, антитела, нацеливающего белка, фузогена и их слитого белка.

Что касается “трансформации клеток”, ее можно достигать путем введения чужеродного гена в клетки, путем обработки клеток веществом или путем применения физического/ химического/ биологического/ электрического/ механического стимула к клеткам.

Термин “протопласт”, как используют в рамках изобретения, относится к клетке бактерий, архей, грибов или растений, в которой клеточная стенка полностью или частично удалена, с обнаженной липидной двухслойной мембраной, и, таким образом, она включает протопласты, у которых их клеточная стенка полностью удалена, сферопласты, в которых их клеточная стенка частично удалена, и “L-форму бактерий”, но не ограничивается ими.

“L-форма бактерий” включает существующие в природе клетки и трансформированные клетки, но не ограничиваются ими.

Термин “происходящая из протопласта микровезикула”, как используют в рамках изобретения, относится к везикуле субпротопластного размера, внутреннее содержимое которого отделено от внешней среды только липидной двухслойной мембраной, состоящей из липидов мембран, белков мембран и цитоплазматического компонента клеток.

Примеры “происходящей из протопласта микровезикулы”, пригодной для настоящего изобретения, включают, но не ограничиваются ими, микровезикулы, которые самопроизвольно секретируются из протопластов, микровезикулы, которые искусственно синтезированы из протопластов с использованием физического, механического, электрического или химического способа, и микровезикулы, полученные обработкой конкретным веществом или трансформацией, которая индуцирует секрецию микровезикул из протопластов.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения микровезикулы могут сохранять ту же топологию мембраны, что и плазматическая мембрана, служащая в качестве источника.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения микровезикулы могут включать, но не ограничиваться ими, тельца включения.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения микровезикулы могут дополнительно включать компонент в их мембране, отличный от компонентов, происходящих из клеточной мембраны протопласта, служащего в качестве источника.

Компонент, отличный от компонента, происходящего из клеточной мембраны, может включать нацеливающие молекулы, фузогены, циклодекстрины и полиэтиленгликоль, но не ограничивается ими. Кроме того, компонент, отличный от компонента, происходящего из клеточной мембраны, можно добавлять с использованием различных способов, включая химическую модификацию клеточных мембран.

Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения, компоненты мембран везикул могут быть химически модифицированными. Например, они могут быть химически модифицированы тиольными (-SH) группами или аминогруппами (-NH₂), или путем связывания с мембраной нацеливающей молекулы, фузогена или полиэтиленгликоля.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предусматривается фармацевтическая композиция, содержащая микровезикулы, нагруженные веществом, необходимым для диагностики, терапии, вакцинации, нацеливания, слияния клеточной мембраны с клеткой-мишенью, или уменьшения побочных эффектов и повышения стабильности in vivo и in vitro.

Как используют в рамках изобретения, “нагрузка” веществом происходящих из протопластов микровезикул означает, что одно или несколько веществ, необходимых для диагностики, терапии, вакцинации, нацеливания, слияния клеточной мембраны с клеткой-мишенью, и/или уменьшения побочных эффектов и повышения стабильности in vivo и in vitro экспонированы на поверхности микровезикул или инкапсулированы в микровезикулы, однако настоящее изобретение не ограничивается этим.

Вещество, предназначенное для нагрузки происходящих из протопластов микровезикул, может происходить из клеток (включая существующие в природе клетки и трансформированные клетки), служащих в качестве источника микровезикул. Иными словами, клетки, пригодные для настоящего изобретения, включают клетки, которые естественным образом экспрессируют терапевтическое, диагностическое или вакцинное вещество, или которые трансформированы так, чтобы экспрессировать вещество.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения можно использовать клетку, которая трансформирована для экспрессии вещества, выбранного из группы, состоящей из, но не ограничиваясь ими, молекулы клеточной адгезии, антитела, нацеливающего белка, фузогена, их слитого белка, чтобы нагружать нацеливающим белком происходящие из протопластов микровезикулы. Нацеливающий белок может быть экспонирован на происходящей из протопласта микровезикуле или инкапсулирован в нее.

Трансформации клеток можно достигать путем стимуляции клеток или внесения чужеродного гена в клетки для модификации, например, активации или подавления, экспрессии представляющих интерес белков. Введение чужеродного гена может индуцировать экспрессию или ингибирование представляющего интерес белка.

В этом контексте плазмидную ДНК, РНК или вирус вводят в клетки с использованием осаждения с фосфатом кальция, с помощью липофектамина, путем электропорации, микроинъекции или другими способами, известными в данной области. После трансформации протопластов для экспрессии белка или антитела, способного связываться со злокачественными клетками, тканями или сосудами или воспаленными тканями, в чистом виде или в качестве слитого белка на поверхности, из клеток можно конструировать микровезикулы.

Для подавления экспрессии представляющего белка можно использовать микроРНК, миРНК или антисмысловую РНК. Когда микровезикулы, сконструированные из протопласта клетки, направлены на две мишени, клетку можно трансформировать так, чтобы экспрессия одного или нескольких конкретных белков ингибировалась для снижения направления клеток к одной из двух мишеней, что означает усиление специфичности доставки вещества в отношении микровезикул, происходящих из трансформированных клеток. Альтернативно можно использовать клетки, которые претерпели два или более раундов трансформации. Например, первичные трансформанты можно подвергать вторичной трансформации до того, как использовать их в качестве источника для протопластов, из которых конструируют микровезикулы.

Существует множество белков плазматической мембраны, которые вовлечены в направление моноцитов, макрофагов, дендритных клеток и стволовых клеток в конкретные ткани. Например, на поверхности моноцитов присутствуют молекулы клеточной адгезии, включающие интегрины, такие как LFA-1 (антиген, ассоциированный с функцией лейкоцитов-1) и Mac-1 (антиген макрофагов-1). Эти молекулы клеточной адгезии могут связываться с другими молекулами клеточной адгезии, такими как ICAM-1 (молекула внутриклеточной адгезии-1) и VCAM-1 (молекула адгезии клеток сосудов-1), на клетках сосудов. Взаимодействие между LFA-1 и ICAM-1 позволяет моноцитам проходить через эндотелиальные клетки сосудов, так чтобы моноциты могли направляться к воспалительным или злокачественным клеткам. Когда клетки трансформированы для экспрессии белков плазматической мембраны, специфичных к представляющей интерес злокачественной опухоли или тканям, их можно направлять в различные ткани, включая злокачественные и воспаленные ткани. Например, белок клеточной мембраны ERBB2 сверхэкспрессируется на поверхности клеток рака молочной железы. Нацеливание T-клеток на злокачественные клетки-мишени можно обеспечивать путем трансформации для экспрессии модифицированных T-клеточных рецепторов (TCR). T-клетки можно направлять на ткань рака молочной железы, если они трансформированы для экспрессии слитого белка, в котором TCR слит его внешним доменом с антителом, распознающим ERBB2, и его цитоплазматическим доменом с CD3 ζ (зета), ответственным за внутриклеточную передачу сигнала. Кроме того, T-клетки могут быть направлены на ткань рака толстого кишечника, рака поджелудочной железы и рака легкого, если они трансформированы для экспрессии слитого белка, в котором антитело, распознающее карциноэмбриональный антиген, в большом количестве находящемся на злокачественных тканях, слито с CD3 ζ. Происходящие из протопластов микровезикулы, сконструированные из клеток, которые экспрессируют белки или слитые белки, можно направлять в представляющие интерес ткани, однако нацеливающие молекулы не ограничиваются проиллюстрированными выше белками или слитыми белками.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения микровезикулы можно получать из клетки, которая адаптирована для экспрессии вещества, выбранного из группы, состоящей из цитокина, фактора роста, молекулы клеточной адгезии, антитела, рецептора и их комбинации.

Вещество, подлежащее нагрузке в происходящие из протопластов микровезикулы, может не происходить из клеток-источников, а может быть чужеродным для этих клеток. Вещество для нагрузки может быть гомогенным или гетерогенным.

Микровезикулы по настоящему изобретению могут быть нагружены веществом, которое не происходит из клеток-источников, а является чужеродным для клеток, с использованием одного из следующих способов: нагрузка веществом 1) непосредственно клеток; 2) после получения протопластов из клеток; 3) при конструировании микровезикул; и 4) после конструирования происходящих из протопластов микровезикул.

Кроме того, веществом может быть нагружена поверхность микровезикул с использованием, но не ограничиваясь ими, физических, химических и/или биологических способов.

Подробно, микровезикулы по настоящему изобретению можно нагружать различными чужеродными веществами следующим образом.

Во-первых, микровезикулы можно получать из клетки, которая уже нагружена различными представляющими интерес терапевтическими, диагностическими и/или вакцинными веществами. Например, когда клетки культивируют в среде, содержащей представляющие интерес терапевтические или диагностические вещества, они могут содержать вещества. Альтернативно вещество можно вводить в клетки путем электропорации. Микровезикулы, которые самопроизвольно отделяются от клеток или которые конструируют из клеток, содержащих вещества, путем ультразвукового облучения, экструзии или механической деградации, нагружены веществом.

Далее, микровезикулы можно получать из протопласта, который уже нагружен различными представляющими интерес терапевтическими, диагностическими и/или вакцинными веществами. Например, когда протопласты, после преобразования из клеток, культивируют в среде, содержащей представляющие интерес терапевтические или диагностические вещества, они могут содержать вещества. Альтернативно вещество можно вводить в протопласты электропорацией. Микровезикулы, которые самопроизвольно отделяются от протопластов или которые конструируют из протопластов, содержащих вещества, путем ультразвукового облучения, экструзии или механической деградации, нагружены веществом.

C одной стороны, микровезикулы могут быть нагружены веществом в ходе их конструирования. Например, когда суспензию протопластов, содержащую представляющее интерес вещество, экструдируют через фильтр субпротопластного размера, образуются микровезикулы, нагруженные веществом.

В другой альтернативе, микровезикулы могут быть нагружены представляющим интерес веществом после их конструирования и формирования из протопластов. Например, нагрузку можно обеспечивать путем инкубации суспензии микровезикул с веществом или введения вещества путем электропорации в уже полученные микровезикулы.

Однако специалисты в данной области должны понимать, что нагрузка представляющим интерес веществом микровезикул не ограничивается проиллюстрированными выше способами.

Среди терапевтических и/или диагностических веществ, предназначенных для нагрузки происходящих из протопластов микровезикул по настоящему изобретению, находятся средства против злокачественной опухоли, противовоспалительные средства, ингибиторы ангиогенеза, пептиды, белки, токсины, нуклеиновые кислоты, гранулы, микрочастицы и наночастицы, однако настоящее изобретение на ограничивается ими.

Средство против злокачественной опухоли является общим термином для лекарственного средства, используемого для подавления роста и метастазирования злокачественной опухоли. Большинство средств против злокачественной опухоли действуют путем блокирования репликации, транскрипции и/или трансляции злокачественных клеток. Типы средств против злокачественной опухоли, пригодные для настоящего изобретения, конкретно не ограничены. Средства против злокачественной опухоли можно выбирать согласно общему принципу, учитывающему типы злокачественных клеток, скорость всасывания средств против злокачественной опухоли (длительность лечения, путь введения и т.д.), положение опухоли, размеры опухоли и т.д. Примеры средств против злокачественной опухоли, пригодных для настоящего изобретения, включают алкилирующие ДНК средства, такие как мехлорэтамин, хлорамбуцил, фенилаланин, иприт, циклофосфамид, ифосфамид, кармустин (BCNU), ломустин (CCNU), стрептозотоцин, бусульфан, тиотепа, цисплатин и карбоплатин, антибиотики против злокачественной опухоли, такие как дактиномицин (актиномицин D), доксорубицин (адриамицин), эпирубицин, идарубицин, митоксантрон, пликамицин, митомицин C и блеомицин, и алкалоиды растений, такие как винкристин, винбластин, паклитаксел, доцетаксел, даунорубицин, таксол, онковин, преднизон, цисплатин, герцептин, ритуксимаб, этопозид, тенипозид, топотекан и иридотекан. Также можно использовать радиоактивные вещества, известные в данной области. Однако средства против злокачественной опухоли, пригодные для настоящего изобретения, не ограничиваются этими примерами.

Кроме того, противовоспалительное средство, предназначенное для нагрузки происходящих из протопластов микровезикул по настоящему изобретению, выбрано из группы, состоящей из, но не ограничиваясь ими, дексаметазона, солумедрола, аспирина, индометацина, ибупрофена, клобетазола, пропионата, дифлоразона диацетата, галобетазола пропионата, амцинонида, флуоционида, мометазона фуроата, дезоксиметазона, диклофенака и пироксикама.

Как используют в рамках изобретения, термин “злокачественная опухоль” относится к группе различных заболеваний, которые характеризуются увеличенным ростом клеток и инфильтрацией