Штамм культивируемых гибридных клеток животного mus musculus l. bpm vd-10 - продуцент моноклонального антитела 5h11/e5 к антигену 200 kda возбудителя мелиоидоза

Штамм культивируемых гибридных клеток животного mus musculus l. bpm vd-10 - продуцент моноклонального антитела 5h11/e5 к антигену 200 kda возбудителя мелиоидоза

Реферат

Изобретение относится к биотехнологии получения гибридом-продуцентов моноклональных антител (МКА) заданной специфичности. Штамм-продуцент моноклональных антител к антигену 200 kDa назван Bpm Vd-10 (5Н₁₁/Е₅). Штамм депонирован в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под номером Н-40.

Изобретение может быть использовано в научно-исследовательской работе для изучения свойств коллекционных штаммов патогенных и непатогенных буркхольдерий, а также для изготовления препарата иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих моноклональных для метода флуоресцирующих антител (МФА), способного выявлять и идентифицировать вирулентные штаммы возбудителя мелиоидоза, но не обладающего кросс-реактивностью в отношении близкородственных буркхольдерий III-IV группы патогенности.

Использование МКА в иммунодиагностических реакциях обеспечивает высокую чувствительность и специфичность тестов, направленных на обнаружение возбудителей опасных и социально-значимых заболеваний [1, 2, 3]. Существенным преимуществом работы с МКА является наличие постоянного источника их получения - гибридомы-продуцента. Применение МКА в иммунофлуоресцентном анализе, как правило, позволяет увеличить вероятность обнаружения микроорганизмов в исследуемом материале, устранить фоновые реакции, повысить специфичность иммуноанализа [4, 5].

При производстве иммунобиологических средств для выявления патогенных микроорганизмов приоритеты давно отданы МКА как наиболее чувствительному компоненту современных препаратов и тест-систем, применяемых для быстрого и достоверного обнаружения различных патогенов.

Первые публикации по вопросам применения мелиоидозных и сапных МКА в качестве ингредиентов в различных иммунодиагностических тестах, предназначенных для обнаружения, идентификации возбудителей мелиоидоза и сапа и их дифференциации от близкородственных видов буркхольдерий, датируются концом 80-х - началом 90-х годов прошлого века [6, 7, 8, 9].

За рубежом МКА к антигенам В. pseudomallei используют в ряде традиционных иммунодиагностических тестов, применяемых, преимущественно, в эндемичных регионах распространения инфекции для идентификации выделяемых культур буркхольдерий и их дифференциации от других представителей рода Burkholderia [10].

Отечественный опыт работы по использованию МКА в производстве препаратов для МФА подтвердил существенные преимущества моноклонального сырья [11, 12].

Для дифференциации двух близких в антигенном отношении видов микроорганизмов, В. mallei и В. pseudomallei, были получены МКА к поверхностно локализованным антигенам этих бактерий [5, 11]. Установлено, что при проверке спектра специфической активности «Иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие мелиоидозные моноклональные» взаимодействуют с 75-80% коллекционных штаммов данного микроорганизма. Основой препарата являются МКА (1F₄) против одного из эпитопов в составе клеточной стенки В. pseudomallei. Позже было установлено, что этот препарат обладает перекрестной активностью в отношении В. thailandensis, близкородственной непатогенной бактерии.

Следует отметить, что вопросы создания иммунодиагностических средств для дифференциации В. pseudomallei и В. thailandensis не теряют актуальности. Данные о препаратах такого типа, внедренных в практику, отсутствуют.

Дальнейшее совершенствование лабораторной диагностики мелиоидоза ориентировано на разработку иммунодиагностических препаратов и тест-систем на основе МКА к антигену 200 kDa (гликопротеину капсулы) В. pseudomallei для обнаружения и идентификации вирулентных штаммов этого патогена. Известно, что антиген 200 kDa является маркером вирулентных штаммов возбудителя мелиоидоза [13, 14].

Цель изобретения - получение штамма гибридомы-продуцента высокоспецифичного МКА против эпитопа в составе антигена 200 kDa, экспонированного на поверхности микробных клеток возбудителя мелиоидоза (В. pseudomallei), пригодного к применению в качестве основы препарата иммуноглобулинов флуоресцирующих, предназначенного для обнаружения вирулентных штаммов В. pseudomallei.

Получение гибридомы достигается гибридизацией двух типов клеток: спленоцитов инбредной мыши линии BALB/c, иммунизированной антигеном 200 kDa возбудителя мелиоидоза, и клеток мышиной миеломы.

Гибридома-продуцент МКА 5Н₁₁/Е₅ получена в результате слияния спленоцитов иммунной мыши линии BALB/c с клетками мышиной миеломы P3-X63.Ag8.653 в присутствии полиэтиленгликоля (ПЭГ-4000) в качестве конъюгирующего агента, рассева взвеси клеток в лунки 96-луночных культуральных пластин, выращивания в селективных средах в течение трех недель с постепенным переходом на полную среду культивирования гибридных клеток, отбора первичного клона по показателю продукции специфических антител к антигену 200 kDa возбудителя мелиоидоза, его клонирования и реклонирования с использованием метода лимитирующих разведении. Штамм назван Bpm Vd-10 (5Н₁₁/Е₅), депонирован в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под номером Н-40, обладает следующими характеристиками.

Условия культивирования гибридомы in vitro. Оптимальной средой выращивания гибридомы in vitro является среда RPMI-1640 с 15% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 2 mM L-глютамина, 10 mM Hepes, 4 mM пирувата натрия, рН 7,1-7,2.

Клетки культивируют при 37°С в атмосфере 5-7% СО₂ и влажности 70-80%. Темпы роста популяции клеток оценивают при просмотре лунок пластин в инвертированном микроскопе. Пересевы делают каждые 3-4 сут. Кратность рассева 1:4-1:8.

Условия культивирования гибридомы in vivo в организме сингенного животного. Клетки гибридомы вводят внутрибрюшинно предварительно праймированным мышам линии BALB/c, по 2·10⁶ - 4·10⁶ клеток на мышь. Асцит образуется через 2-4 недели.

Культуральные признаки. Характер роста на питательной среде -полусуспензионный, in vivo - прививаемость гибридных клеток в брюшной полости достигает 80%.

Продуктивность штамма. Продукция МКА в среде культивирования составляет 0,27 мкг/мл, в асцитической жидкости - 10-12 мкг/мл. Объем асцитической жидкости в среднем равен 4,5-5,0 мл.

Характеристика получаемого продукта. Антитела относятся к классу IgM. Они специфически взаимодействуют с антигеном 200 kDa возбудителя мелиоидоза. Специфичность взаимодействия определяют с помощью твердофазного иммуноферментного метода (ТИФМ).

Криоконсервирование. Для перевода клеток гибридомы-продуцента МКА 5Н₁₁/Е₅ в криоконсервированное состояние готовят взвесь клеток с концентрацией 4·10⁶ клеток в 1 мл в защитной среде, состоящей из среды RPMI-1640 с 20% ЭТС и 7% диметилсульфоксида. По 1 мл взвеси переносят в пластиковые ампулы, которые помещают в аппарат для контролируемого замораживания биологического материала при режиме постепенного программируемого понижения температуры. Затем ампулы погружают в биохранилище с жидким азотом и хранят до момента использования. Размораживание клеток гибридомы осуществляют при 37°С на водяной бане в течение 2-3 минут. Жизнеспособность клеток после размораживания достигает 75-80%.

Пример 1. Получение штамма гибридомы-продуцента

Получение штамма гибридомы-продуцента состоит из последовательных стадий по подготовке клеток-партнеров (В-лимфоцитов мыши линии BALB/c, иммунизированной антигеном 200 kDa, и клеток мышиной миеломы P3-X63.Ag8.653) и соматической гибридизации, последующего выращивания гибридных клеток в селективных средах, клонирования первичных гибридом методом предельных разведении и отбора моноклонов, секретирующих иммуноглобулины, направленные против эпитопов антигена, применяемого для стимуляции лимфоцитов.

Все манипуляции выполняют в ламинарном потоковом шкафу с горизонтальным потоком воздуха (тип "защита продукта").

1. Подготовка спленоцитов. Иммунизацию мыши-донора В-лимфоцитов, стимулированных антигеном 200 kDa В. pseudomallei, выполняют согласно схеме, описанной в [15]. Антиген для иммунизации мышей получают методикой экстракции гликопротеина из клеток В. pseudomallei 100 по способу Фуллера в модификации Пивеня Н.Н., заключающейся в изменении температурного режима экстрагирования биополимера: этап необходимо проводить при более мягких температурных условиях (экстракция при 20°С вместо 150°С, рекомендованных Фуллером) [16].

2. Подготовка миеломных клеток. В качестве злокачественного партнера в опытах по гибридизации клеточных линий используют клетки одной из наиболее распространенных мышиных миеломных линий Р3-Х63-Ag 8.653.

К моменту гибридизации клетки миеломы должны находиться в экспоненциальной фазе роста. Это достигается последовательным выполнением следующих этапов: культивирование клеток миеломы в среде RPMI-1640 с 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 8-азагуанином в течение 2 недель, затем последующие 2 недели - в основной среде без 8-азагуанина. Регулярная смена среды - каждые 3-4 суток.

3. Гибридизация спленоцитов и клеток мышиной миеломы. Процедуру соматической гибридизации спленоцитов и клеток миеломы выполняют в присутствии конъюгирующего агента - ПЭГ-4000 - по следующей схеме:

- взвесь иммунных спленоцитов (1·10⁸ клеток) и миеломных клеток (1·10⁷) центрифугируют при 800-1000 об/мин в течение 10 мин, надосадочную среду декантируют;

- к осадку клеток медленно (в течение 2 мин) добавляют 1 мл 50% раствора ПЭГ, затем вносят 1, 2, 4 и 8 мл бессывороточной среды, по 2 минуты каждое внесение. Во время добавления реактивов центрифужный стакан непрерывно вращают;

- после завершения данной манипуляции клеточную суспензию центрифугируют, надосадочную жидкость декантируют, осадок клеток ресуспендируют в 20 мл селективной НАТ-среды с 15% эмбриональной телячьей сыворотки;

- взвесь клеток, по 2 капли, вносят в лунки двух 96-луночных пластин с предварительно подготовленным слоем фидерных клеток.

Все этапы последующего культивирования гибридных клеток, отбора растущих клонов, секретирующих специфические иммуноглобулины, клонирования, тиражирования культур и накопления МКА in vivo выполняют согласно традиционному протоколу [17].

Для скрининга антителопродукции используют твердофазный иммуноферментный метод [18]. В лунки полистироловой пластины для иммуноферментного анализа вносят по 100 мкл раствора антигена 200 kDa В. pseudomallei (с концентрацией 10 мкг/мл по белку) в 0,05 М карбонатно-бикарбонатном буфере, рН 9,5. Пластину в течение ночи выдерживают при 4-8°С, затем трижды отмывают фосфатным буферным раствором с 0,05% твина-20 (ФБР-Т) и блокируют свободные участки пластика 1% раствором нейтрального белка (бычьего сывороточного альбумина), внося на 30 минут в каждую лунку по 100 мкл этого раствора. Пластину вновь трижды отмывают. Затем на 1 ч при 37°С вносят в лунки пластины по 100 мкл различных разведении (1:10, 1:20, 1:40) среды выращивания гибридных клеток из лунок культуральных пластин, приготовленных на 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,4, с 0,05% твина-20, с последующей трехкратной отмывкой и внесением антивидового конъюгата в рабочем разведении по 100 мкл (коммерческий препарат антител диагностических против IgG (H+L) белой мыши, меченных пероксидазой). Пластину инкубируют при 37°С в течение 1 ч, трижды отмывают. В завершение реакции на 15 мин в лунки вносят по 100 мкл смеси перекиси водорода с хромогеном. Пластину помещают в защищенное от света место на 15-20 минут, затем реакцию останавливают стоп-реагентом. Результаты реакции регистрируют на планшетном фотометре при длине волны, соответствующей характеристике применяемого хромогена.

Скрининг антителопродуцирующих гибридных клонов начинают проводить с 7-10 суток после рассева гибридных клеток в 96-луночные пластины. При просмотре лунок регистрируют те из них, в которых имеет место характерный рост групп клеток. Из этих лунок отбирают квоты культуральной среды для исследования в непрямом варианте ТИФМ. Положительные результаты этого метода скрининга, полученные с пробой из одной и той же лунки не менее трех раз, являются основанием для отбора первичного клона-продуцента целевого продукта. Все первичные клоны, отобранные в течение месяца, клонируют и реклонируют методом предельных разведении. На этом этапе используют среду RPMI-1640 с 15% ЭТС и необходимыми добавками. После второго клонирования каждого из первичных вариантов клонов формируют рабочую коллекцию гибридом-продуцентов МКА заданной специфичности. Среди продуктивных клонов, секретирующих моноклональные иммуноглобулины против различных эпитопов антигена (Аг) 200 kDa В. pseudomallei, селекционирован клон-продуцент Bpm Vd-10 (5Н₁₁/Е₅).

Пример 2. Накопление МКА 5Н₁₁/Е₅ в препаративных количествах

Ампулу с клетками гибридомы достают из биохранилища с жидким азотом и быстро размораживают по общепринятой методике [19]. Далее выполняют проверку жизнеспособности клеток. Условия культивирования in vitro аналогичны описанным ранее. При последовательном выполнении этих условий продукция МКА 5Н₁₁/Е₅ восстанавливается до уровня 0,26-0,28 мкг/мл. Из образцов культуральной среды выделяют моноклональные иммуноглобулины.

Тиражирование клеток гибридомы in vivo в брюшной полости сингенного животного для накопления высоких концентраций МКА. Животным предварительно внутрибрюшинно вводят по 0,4 мл стерильного минерального масла, пристана - 2, 6, 10, 14-тетраметил-пентадекана или неполного адъюванта Фрейнда. Через 5-7 суток мышам внутрибрюшинно вводят по 2·10⁶ - 4·10⁶ клеток гибридомы. После накопления асцитической жидкости ее собирают. Клетки осаждают центрифугированием, надосадочную жидкость отделяют и используют для выделения антител (Ат) методом сульфатного трехкратного переосаждения белка при 50% насыщении сульфата аммония. Рыхлый осадок центрифугируют при 12000 об/мин в течение 20 минут, надосадочную жидкость удаляют. Осадок растворяют в 0,01 М фосфатном буфере, диализуют до полного удаления ионов сульфата аммония. Полученный раствор моноклональных иммуноглобулинов стерилизуют методом мембранной фильтрации, ампулируют и хранят при минус 20°С до момента их использования в качестве основы препарата для МФА. Перед ампулированием часть раствора отбирают для определения (1) концентрации белка в нем спектрофотометрически при длине волны 280 нм, (2) активности иммуноглобулинов в ТИФМ и непрямом методе флуоресцирующих антител (НМФА).

Пример 3. Контроль специфической активности МКА 5Н₁₁/Е₅ в непрямом методе флуоресцирующих антител

Все образцы МКА 5Н₁₁/Е₅, подготовленные к последующему применению в качестве основы диагностического препарата для МФА, обязательно проверяют в непрямом методе флуоресцирующих антител для подтверждения того, что они «узнают» гомологичные им эпитопы на поверхности микробных клеток вирулентного штамма возбудителя мелиоидоза [20, 21]. Реакцию выполняют согласно схеме: исследуемый объект + МКА + иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие антивидовые против иммуноглобулинов белой мыши (пр-во НИИЭМ им. Гамалеи РАН).

Взвесь микробных клеток В. pseudomallei 100 с концентрацией 5·10⁸ - 1·10⁹ наносят на тщательно обезжиренные предметные стекла (по 10 мазков на стекле). Препараты высушивают при комнатной температуре и фиксируют 96% этиловым спиртом в течение 30 минут. На поверхность каждого мазка наносят по 30 мкл МКА 5Н₁₁/Е₅ с различной концентрацией. Время контакта Аг+Ат - 20-25 мин при комнатной температуре во влажной камере. Затем стекло промывают забуференным физиологическим раствором дважды по 10 мин и один раз дистиллированной водой. Стекла высушивают в вертикальном положении, затем окрашивают антивидовым конъюгатом в рабочем разведении в течение 20 мин, вновь промывают и высушивают по вышеописанной схеме.

Микроскопию мазков проводят с помощью люминесцентного микроскопа. Для оценки интенсивности специфического свечения бактериальной клетки используют общепринятую четырехкрестовую систему. За положительный результат принимают специфическое свечение с яркостью на 4 или 3 креста. Отрицательный результат (1-2 креста) свидетельствует об отсутствии искомой мишени на поверхности бактериальной клетки.

На основании результатов просмотра мазков определяют минимальную концентрацию МКА, обеспечивающую получение положительного результата в НМФА. Для МКА 5Н₁₁/Е₅ минимальная концентрация иммуноглобулинов в растворе, наносимом на мазок, равна 30-36 мкг/мл, что свидетельствует о высокой специфической активности иммуноглобулинов.

Пример 4. Определение диагностических возможностей МКА 5Н₁₁/Е₅ в методе флуоресцирующих антител

При изготовлении диагностического препарата для МФА моноклональные иммуноглобулины метят флуорохромом - флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ) [20]. Для процедуры конъюгирования концентрация белка в растворе МКА должна быть 20-25 мг/мл. Процедуру метки осуществляют при комнатной температуре и постоянном перемешивании реагентов. Нагрузка ФИТЦ не должна превышать 25 мг на 1 г иммуноглобулинов. Внесение раствора флуорохрома дробное в течение первых 30 минут. Суммарное время конъюгирования - 2,5 ч. Все перечисленные этапы выполняют при постоянном контроле рН раствора, не допуская превышения этого показателя более 9,0. Последующую очистку конъюгата от немеченого белка и не связавшегося красителя проводят на колонке с сефадексом G-25, используя для элюирования 0,1 М фосфатный буфер, рН 7,2. При расчете показателей концентрации белка и молярного соотношения М_ФИТЦ/ М_белок применяют методику The Т.Н. и Feltkamp Т.Е. [22]. Для определения рабочего разведения конъюгата МКА-ФИТЦ необходимо подготовить обеззараженные мазки-препараты из взвеси В. pseudomallei 100 с концентрацией 5-10 м.к./мл. После определения рабочего разведения препарат готов к этапу проверки спектра специфической активности на наборе гомологичных штаммов возбудителя мелиоидоза и этапу проверки специфичности на наборе штаммов гетерологичных буркхольдерий. Готовый и охарактеризованный препарат ампулируют, лиофилизируют или хранят при минус 20°С. Целевое назначение препарата - обнаружение возбудителя мелиоидоза в пробах с объектов внешней среды и биологического материала методом МФА.

Диагностические возможности экспериментального препарата иммуноглобулинов флуоресцирующих моноклональных, приготовленного на основе иммуноглобулинов 5Н₁₁/Е₅, оценивают по результатам МФА. Для этого были использованы фиксированные и обеззараженные мазки-препараты чистых культур коллекционных штаммов буркхольдерий II группы патогенности (В. pseudomallei - 31 штамм) и условно-патогенных буркхольдерий III-IV группы патогенности (В. thailandensis - 5 штаммов, В. cepacia - 7 штаммов, В. allicola, В. gladioli, В. marginata, P. putida - по одному штамму, Р. aeruginosa - 3 штамма) (таблица).

Установлено, что иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие моноклональные 5Н₁₁/Е₅ специфически окрашивают микробные клетки 71% коллекционных штаммов возбудителя мелиоидоза, но не взаимодействуют с м.к. близкородственных буркхольдерий III-IV группы патогенности.

Таким образом, перечисленные выше свойства гибридомы-продуцента МКА 5Н₁₁/Е₅ позволили сделать следующее заключение. Штамм культивируемых гибридных клеток животного Mus musculus L. (авторское название клеточной линии Bpm Vd-10) предназначен для получения моноклонального антитела 5Н₁₁/Е₅ против эпитопа в составе антигена 200 kDa, экспонированного на поверхности микробных клеток патогенной буркхольдерий В. pseudomallei, пригодного для применения в качестве основы для получения высокоактивного диагностического препарата для МФА, специфически окрашивающего микробные клетки вирулентных штаммов возбудителя мелиоидоза, не обладающего перекрестной активностью в отношении близкородственных условно-патогенных буркхольдерий.

Список использованных источников

1. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней: Практическое руководство / Под редакцией академика РАМН Г.Г. Онищенко, академика РАМН В.В. Кутырева. Изд. 2-е, переработанное и дополненное. - М.: ЗАО «Шико», 2013. - 560 с.

2. Лабораторная диагностика мелиоидоза (МУ 4.2.2787-10.4.2) / Демина Ю.В., Пакскина Н.Д., Илюхин В.И., Алексеев В.В., Храпова Н.П. и др. // Изданы ФЦГиЭ. - 2011. - 160 с.

3. Применение сапных и мелиоидозных моноклональных антител различной эпитопной направленности для обнаружения и идентификации патогенных буркхольдерий / Храпова Н.П., Алексеев В.В., Корсакова И.И. и др. // Проблемы особо опасных инфекций. - 2011. - Вып. 107. - С. 66-69.

4. Храпова Н.П., Тихонов Н.Г., Прохватилова Е.В., Кулаков М.Я. Перспективы совершенствования иммуноглобулиновых препаратов для обнаружения и идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза // Мед. паразитология и паразитарные болезни. - 1995. - №4. - С. 49-53.

5. О разработке новых иммунобиологических препаратов на основе моноклональных антител к Burkholderia mallei и Burkholderia pseudomallei I Прохватилова Е.В., Храпова Н.П., Алексеев В.В., Кулаков М.Я. // Проблемы особо опасных инфекций. - 2003.- Вып. 86. - С. 153-158.

6. Ismail G., Embi M.N., Omar О., Razak N. Toxigenic properties of Pseudomonas pseudomallei extracellular products // Trop. Biomed. - 1987. - №4. -P. 101-110.

7. Свиридов В.В., Храпова Н.П., Липницкий А.В., Новицкая И.В. Получение моноклональных антител к антигенам возбудителей сапа и мелиоидоза // Актуальные вопросы теоретической и прикладной инфекционной иммунологии: механизмы противоинфекционного иммунитета: Тез. докл. Всесоюз. конф. - М., 1987. - С.97.

8. Перспективы создания иммуноглобулиновых препаратов нового поколения для индикации возбудителей сапа и мелиоидоза. Сообщение 1 / Храпова Н.П., Липницкий А.В., Свиридов В.В. и др. // Вопр. противоэпид. защиты населения. - 1988. - Вып. 34. - С. 129-134.

9. Перспективы расширения перечня моноклональных средств для обнаружения и идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза/ Храпова Н.П., Прохватилова Е.В., Тихонов Н.Г. и др. // Акт. пробл. разработки медиц. средств и методов сохранения и восстановления боеспособности личного состава вооруж. сил: Сб. тез. докл. юбил. конф., посвящ. 25-летию НИИ военной медицины. - СПб, 1994. - С. 134-135.

10. Recent developments in laboratory diagnosis of melioidosis / Sirisinha S., Anuntagool N., Dharakul T. et al. // Acta Tropica. - 2000. - V. 74. - P. 235-245.

11. Изучение диагностической ценности новых препаратов для выявления возбудителей сапа и мелиоидоза / Саяпина Л.В., Касина И.В., Малахаева А.Н. и др. // Матер. Всеросс. науч. - практич. конф. «Медицинская микробиология - XXI век» (28 - 30.09.2004, г. Саратов). - Саратов, 2004. - С. 202-204.

12. Моноклональные антитела в дифференциации Pseudomonas mallei и Pseudomonas pseudomallei I Яковлева И.В., Свиридов В.В., Титова Н.Г. и др. // Журн. микробиол., эпидемиол и иммунобиол. - 1995. - №3. - С. 14-15.

13. Anuntagool N., Panichakul Т., Aramsri P., Sirisinha S. Shedding of lipopolysaccaride and 200-kDa surface antigen during the in vitro growth of virulent Ara' and avirulent Ата⁺ Burkholderia pseudomallei II Acta tropica. - 2000. - V. 74. - P. 221-228.

14. Перспективы создания диагностических средств индикации и идентификации вирулентных штаммов возбудителя мелиоидоза / Храпова Н.П., Пивень Н.Н., Корсакова И.И. и др. // Матер, науч. - практич. конф. «Соврем, аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на юге России» (21-22.03.07).- Ставрополь, 2007. - Ч. 2 - С. 155-156.

15. Способ определения предельно допустимой антигенной нагрузки, стимулирующей продукцию гуморальных антител / Храпова Н.П., Корсакова И.И., Ломова Л.В. и др. // Патент РФ на изобретение №2371196 от 27.10.2009.

16. Пивень Н.Н., Смирнова В.И. Выделение, очистка и химический состав поверхностного полисахаридного антигенного комплекса возбудителя мелиоидоза // Особо опасные инфекционные заболевания: диагностика, профилактика и биологические свойства возбудителей. Вып. 4. -Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт, 1990. - С. 111-117.

17. Goding, J.W. Monoclonal antibodies: principles and practice // Acad. Press., 1986. - 315 p.

18. Антитела. Методы. Пер. с англ. / Под ред. Д. Кэтти. - М.: Мир, 1991. - 384 с., ил.

19. Фрешни Р.Я. Культура животных клеток: практическое руководство / Р.Я. Фрешни; - М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2011. - 691 с.

20. Иммунолюминесценция в медицине / Под ред. Е.Н. Левиной. - М.: Медицина, 1977. - 240 с.

21. Специфическая индикация патогенных биологических агентов: Практическое руководство / Под ред. Г.Г. Онищенко. - М., 2006. - 288 с.

22. The Т.Н., Feltkamp T.E.W. Conjugation of fluorescein isothiocyanate to antibodies. I. Experiments on the conditions of conjugation // Immunology. - 1970. - V. 18. - P. 865-873.

Штамм культивируемых гибридных клеток животного Mus musculus L. Bpm Vd-10, депонированный в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур “ГКПМ-Оболенск” под номером Н-40, является продуцентом моноклонального антитела 5Н₁₁/Е₅ к эпитопу в составе антигена 200 kDa, экспонированного на поверхности микробных клеток возбудителя мелиоидоза, пригодного для изготовления на его основе диагностического препарата для МФА, предназначенного для обнаружения и идентификации вирулентных штаммов В. pseudomallei и их дифференциации от штаммов близкородственной буркхольдерии В. thailandensis.