Стабильные иммуногенные композиции антигенов staphylococcus aureus

Стабильные иммуногенные композиции антигенов staphylococcus aureus

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Предпосылки создания изобретения

[0001] Люди являются естественным вместилищем для Staphylococcus aureus (S.aureus) (золотистого стафилококка). Здоровые индивидуумы могут быть заселены S.aureus на коже, в ноздрях и горле или постоянно (10-35%), периодически (20-75%) или находится в состоянии носительства (5-70%) не связанным с заболеванием. Смотри Vandenbergh et al., J. Clin. Micro. 37:3133-3140 (1999). Заболевание проявляется впоследствии, когда у индивидуумов становятся ослабленным иммунитет в результате брешей в иммунном барьере, таких как во время операций, установке постоянно присутствующих катетеров или других устройств, при травме или ранениях. В результате чего инфекция S.aureus может служить причиной широкого спектра заболеваний от слабых кожных инфекций до эндокардита, остеомиелита, бактериемии, сепсиса и других форм заболевания, которые сопровождаются высокими уровнями смертности. Большое вместилище человека увеличивает благоприятную возможность для развития и распространения подходящих патогенных клональных типов.

[0002] Инвазивные стафилококковые инфекции из грамположительных кокков S.aureus и S.epidermidis имеет особо важное значение, потому что они являются возрастающей проблемой общественного здравоохранения во всем мире. В частности, S.aureus является ответственным за большинство внутрибольничных (нозокомиальных) инфекций, и его распространение в сообществе проявление инфекций возрастает. Например, заболеваемость от инвазивного устойчивого к метициллину S.aureus (MRSA) оценивалась в 31,8 на 100000 человек, включая 18 650 смертельных исходов в Соединенных Штатах в 2005 году. Смотри Klevens R.M. et al., JAMA, 298:1763-71 (2007).

[0003] За последние 20 лет наблюдается резкое увеличение стафилококковый заболеваний, такое увеличение соответствует использованию внутрисосудистых устройств и проведению инвазивных процедур. Возрастание частоты заболеваний становится более тревожным из-за параллельного возрастания устойчивости к антибиотикам, и поэтому существует настоятельная необходимость в иммуногенных композициях для использования в вакцинах, или чтобы выявлять поликлональные или моноклональные антитела для предоставления пассивного иммунитета как средства для предотвращения или лечения стафилококковой инфекции и связанной с ней заболеваниями.

[0004] Агглютинирующий фактор A (ClfA) представляет собой клеточную стенку S.Aureus, связанную с адгезином, который является посредником стафилококкового связывания с фибриногеном и тромбоцитами. Он экспрессирует на поверхности клетки бактерии, где предполагается, что активизируется патогенез путем связывания с фибриногеном и фибрином, который депонируется в месте повреждения ткани. ClfA хорошо сохраняется, и даже наиболее отличающаяся форма (~85% идентичности) демонстрирует экстенсивную перекрестную реактивность как к моноклональным, так и к поликлональным антителам. Таким образом, ClfA является приемлемым кандидатом на компонент вакцины против S.aureus. Однако, принимая во внимание структурную неустойчивость ClfA, формулирование ClfA является проблематичным, поскольку он может легко разлагаться с течением времени при хранении.

[0005] Полноразмерный ClfA включает несколько участков и доменов: N-терминальный секреторный домен ("S" домен); следующий за ним лигандсвязывающий участок A, который содержит три домена (N1, N2, который содержит мотив спираль-петля-спираль (EF-плечо), и N3); следующий за ним R участок, который содержит серин-аспартат дипептидные повторения; следующий за ним участок связывания с клеточной стенкой ("W" участок), содержащий LPXTG мотив; гидрофобный трансмембранный домен ("M" участок); и заряженный C-конец ("C" участок), содержащий положительно заряженные аминокислоты. Участок N1 содержит сайт чувствительный к протеазе. Значительную часть нестабильности ClfA приписывают клиппированию ClfA на N1, которое в результате приводит к фрагментам, содержащим N1 и N2N3. Структура и функции ClfA раскрыты в заявке на патент США No. 20070087014 A1 (Pavliak et al., April 19, 2007), которая включена в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме.

[0006] Стафилококковые микроорганизмы, способные вызвать инвазивное заболевание, как правило, также способны к продуцированию капсульного полисахарида (CP), который инкапсулирует бактерию и повышает его устойчивость по отношению к клиренсу за счет врожденной иммунной системы хозяина. CP служит для покрытия бактериальной клетки защитной капсулой, которая делает бактерии устойчивыми к фагоцитозу и внутриклеточному уничтожению. Бактерии, испытывающие недостаток в капсуле, являются более чувствительными к фагоцитозу. Капсульные полисахариды часто представляют собой важный фактор вирулентности для многих бактериальных патогенов, включая Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae и стрептококки группы B.

[0007] Большинство клинических штаммов S.aureus являются инкапсулированными с или серотипом 5, или 8. Тип 5 (CP5) и тип 8 (СР8) капсульных полисахаридов имеют подобные три-сахаридные повторяющиеся единицы, состоящие из N-ацетилманнозаминуроновой кислоты, N-ацетил-L-фукозамина и N-ацетил-D-фукозамина. Смотри Fournier, J.M. et al., Infect. Immun. 45:97-93 (1984) и Moreau, M., et al., Carbohydrate Res. 201:285-297 (1990). Два CP, которые имеют одинаковые сахара, но различаются в связях сахаров и по сайтам O-ацетилирования, каждый продуцирует серологически индивидуальные модели иммунореактивности.

[0008] Белок S.aureus MntC (также известный как белок 305, Р305, Р305А и ORF305) является компонентом ABC переносчиком марганца. Данный белок экспрессируется in vivo. S.aureus использует марганец как кофактор для фермента, который повышает выживаемость S.aureus в нейтрофилах. MntC, таким образом, является важным для выживания S.aureus in vivo во время инфекции. Подобно ClfA, данный белок также нестабильный в растворе. Однако, в отличие от ClfA, который может агрегировать или сокращаться за счет гидролиза, первичный механизм деградации MntC представляет собой дезамидирование под воздействием щелочного pH и/или температуры близкой к комнатной температуре (около 25°C) или выше.

[0009] Таким образом, существует острая необходимость не только в вакцинах против инфекции S.aureus, но, в частности, в вакцинах с повышенной стабильностью антигена.

Краткое описание сущности изобретения

[0010] Представленное изобретение касается лиофилизированной или восстановленной мульти-антигенной или многокомпонентной иммуногенной композиции, содержащей, по меньшей мере, один антиген, выделенный из стафилококковой бактерии. Антигены, которые являются полипептидами и полисахаридами, могут быть получены, среди прочего прямо из бактерии, используя процедуры выделения, известные квалифицированному специалисту в данной области с уровня техники, или они могут быть получены, используя синтетические протоколы, или они могут быть рекомбинантно получены, используя генетические инжиниринговые процедуры также известные квалифицированному специалисту в данной области с уровня техники, или посредством комбинирования каких-либо из вышеизложенных. В конкретных вариантах осуществления, лиофилизированная или восстановленная иммуногенная композиция изобретения содержит выделенный агглютинирующий фактор A (ClfA) S.aureus. В конкретных вариантах осуществления, лиофилизированная или восстановленная иммуногенная композиция изобретения содержит три или более антигенов, выбранных из выделенного полипептида агглютинирующего фактора A (ClfA) S.aureus, выделенного полипептида агглютинирующего фактора B (ClfB) S.aureus, выделенного капсульного полисахарида типа 5 (CP5) S.Aureus, конъюгированного с белком-носителем, выделенного капсульного полисахарида типа 8 (СР8) S.Aureus, конъюгированного с белком-носителем, и выделенного MntC белка S.aureus. Кроме того, представленное изобретение предусматривает способы индуцирования иммунного ответа против стафилококковой бактерии; способы предупреждения, уменьшение тяжести, или замедления проявления заболевания, вызванного стафилококковой бактерией.

[0011] Соответственно, в одном варианте осуществления, изобретение предусматривает лиофилизированную или восстановленную иммуногенную композицию, содержащую: выделенный полипептид агглютинирующего фактора A (ClfA) S.aureus, выделенный капсульный полисахарид типа 5 (СР5) S.Aureus, конъюгированный с белком-носителем, и выделенный капсульный полисахарид типа 8 (СР8) S.Aureus, конъюгированный с белком-носителем.

[0012] В одном варианте осуществления, изобретение предусматривает лиофилизированную или восстановленную иммуногенную композицию, содержащую: выделенный полипептид агглютинирующего фактора A (ClfA) S.aureus, выделенный полипептид агглютинирующего фактора B (ClfB) S.aureus, выделенный капсульный полисахарид типа 5 (СР5) S.aureus, конъюгированный с белком-носителем, и выделенный капсульный полисахарид типа 8 (СР8) S.aureus, конъюгированный с белком-носителем.

[0013] В одном варианте осуществления, изобретение предусматривает лиофилизированную или восстановленную иммуногенную композицию, содержащую: выделенный полипептид агглютинирующего фактора A (ClfA) S.aureus, выделенный полипептид агглютинирующего фактора B (ClfB) S.aureus, выделенный MntC белок S.aureus, выделенный капсульный полисахарид типа 5 (СР5) S.aureus, конъюгированный с белком-носителем, и выделенный капсульный полисахарид типа 8 (СР8) S.aureus, конъюгированный с белком-носителем.

[0014] В одном варианте осуществления, изобретение предусматривает лиофилизированную или восстановленную иммуногенную композицию, содержащую: выделенный полипептид агглютинирующего фактора A (ClfA) S.aureus, выделенный MntC белок S.aureus, выделенный капсульный полисахарид типа 5 (СР5) S.aureus, конъюгированный с белком-носителем, и выделенный капсульный полисахарид типа 8 (СР8) S.aureus, конъюгированный с белком-носителем.

[0015] В одном варианте осуществления, изобретение предусматривает лиофилизированную или восстановленную иммуногенную композицию, содержащую: выделенный полипептид агглютинирующего фактора B (ClfB) S.aureus, выделенный капсульный полисахарид типа 5 (СР5) S.aureus, конъюгированный с белком-носителем, и выделенный капсульный полисахарид типа 8 (СР8) S.aureus, конъюгированный с белком-носителем.

[0016] В одном варианте осуществления, изобретение предусматривает лиофилизированную иммуногенную композицию, содержащую: (а) по меньшей мере, три компонента, выбранные из группы, состоящей из выделенного полипептида агглютинирующего фактора A ("ClfA") золотистого стафилококка, выделенного полипептида агглютинирующего фактора B ("ClfB") золотистого стафилококка, капсульного полисахарида типа 5 (СР5), конъюгированного с белком, капсульного полисахарида типа 8 (СР8), конъюгированного с белком, и выделенного MntC полипептида золотистого стафилококка; (b) буфера, имеющего рКа равный 6,0±0,6, и (c) объемообразующего агента. В конкретных вариантах осуществления, ClfA полипептид сохраняется в значительной степени неразложившимся в течение, по меньшей мере, 1 месяца при 37°C.

[0017] В одном варианте осуществления, изобретение предусматривает лиофилизированную иммуногенную композицию, содержащую: (а) выделенный полипептид агглютинирующего фактора A ("ClfA") золотистого стафилококка, (b) капсульный полисахарид типа 5 (СР5), конъюгированный с белком, (c) капсульный полисахарид типа 8 (СР8), конъюгированный с белком, (d) буфер, имеющий рКа равный 6,0±0,6, и (e) объемообразующий агент. В конкретных вариантах осуществления, ClfA полипептид сохраняется в значительной степени неразложившимся в течение, по меньшей мере, 1 месяца при 37°C.

[0018] В одном варианте осуществления, лиофилизированная иммуногенная композиция содержит воду меньше, чем 3 процента по массе от общей массы иммуногенной композиции (% масс./масс.), где ClfA полипептид составляет от 0,09%±0,027% до 0,85%±0,26% масс./масс., СР5, конъюгированный с белком, составляет от 0,04%±0,013% до 0,42±0,13% масс/масс, СР8, конъюгированный с белком, составляет от 0,04%±0,013% до 0,42±0,13% масс./масс., и буфер составляет от 2,54%±0,76% масс./масс.

[0019] В одном варианте осуществления, изобретение предусматривает лиофилизированную иммуногенную композицию, содержащую: (a) ClfA полипептид; (b) СР5, конъюгированный с белком; (c) СР8, конъюгированный с белком; (d) гистидиновый буфер, pH 6,0±0,5; (е) сахарозу; (f) полисорбат 80; и (g) воду. В конкретных вариантах осуществления, ClfA полипептид сохраняется в значительной степени неразложившимся в течение, по меньшей мере, 3 месяцев при 37°C.

[0020] В одном варианте осуществления, изобретение предусматривает лиофилизированную иммуногенную композицию, содержащую: (a) ClfA полипептид от 0,09%±0,027% до 0,85%±0,26% масс./масс.; (b) СР5, конъюгированный с белком, от 0,04%±0,013% до 0,42±0,13% масс./масс.; (c) СР8, конъюгированный с белком, от 0,04%±0,013% до 0,42±0,13% масс./масс.; (d) гистидиновый буфер, pH 6,0±0,5-2,54%±0,76% масс./масс.; (e) сахарозу - 97%±2,0% масс./масс.; (f) полисорбат 80 - 0,21%±0,04% масс./масс.; и (g) воду - 2%±1% масс./масс.

[0021] В одном варианте осуществления, изобретение предусматривает жидкую иммуногенную три-антигенную композицию, изготовляемую путем восстановления лиофилизированной иммуногенной композиции изобретения в водном разбавителе, причем указанная восстановленная композиция имеет конечное значение pH 6,0±0,5.

[0022] В одном варианте осуществления, изобретение предусматривает жидкую иммуногенную композицию, изготовляемую путем восстановления лиофилизированной иммуногенной композиции изобретения, содержащую: (a) ClfA полипептид с концентрацией от 40 мкг/мл ± 4 мкг/мл до 800 мкг/мл ± 80 мкг/мл; (b) СР5, конъюгированный с белком, с концентрацией от 20 мкг/мл ± 2 мкг/мл до 400 мкг/мл ± 40 мкг/мл; (c) СР8, конъюгированный с белком, с концентрацией от 20 мкг/мл ± 2 мкг/мл до 400 мкг/мл ± 40 мкг/мл; (d) гистидиновый буфер с концентрацией от 10 мМ ± 5 мМ; (e) полисорбат 80 с концентрацией от 0,1%±0,05% по массе к объему (масс./об.); и (f) сахарозу с концентрацией от 9%±4,5% масс./об. В другом варианте осуществления, концентрация полисорбата 80 составляет 0,01%±0,005% по массе к объему (масс./об.) и концентрация сахарозы составляет 4,5%±±1,5% масс/об.

[0023] В одном варианте осуществления, изобретение предусматривает жидкую иммуногенную композицию, содержащую: (a) восстановленный лиофилизированный ClfA полипептид; (b) СР5, конъюгированный с белком; (c) СР8, конъюгированный с белком; (d) гистидиновый буфер, pH 6,0±0,5; (e) полисорбат 80; (f) сахарозу; и (g) водный разбавитель.

[0024] В одном варианте осуществления, изобретение предусматривает жидкую иммуногенную композицию, изготовляемую путем восстановления лиофилизированной иммуногенной композиции изобретения, содержащую: (a) восстановленный лиофилизированный ClfA полипептид с концентрацией от 40 мкг/мл ± 4 мкг/мл до 800 мкг/мл ± 80 мкг/мл; (b) СР5, конъюгированный с белком, с концентрацией от 20 мкг/мл ± 2 мкг/мл до 400 мкг/мл ± 40 мкг/мл; (c) СР8, конъюгированный с белком, с концентрацией от 20 мкг/мл ± 2 мкг/мл до 400 мкг/мл ± 40 мкг/мл; (d) гистидиновый буфер с концентрацией от 10 мМ ± 5 мМ; (e) полисорбат 80 с концентрацией от 0,1%±0,05% по массе к объему (масс./об.); (f) сахарозу с концентрацией от 9%±4.5% масс./об.; и (g) водный разбавитель. В другом варианте осуществления, концентрация полисорбата 80 составляет 0,01%±0,005% по массе к объему (масс./об.), и концентрация сахарозы составляет 4,5%±1,5% масс./об.

[0025] В одном варианте осуществления, изобретение предусматривает процесс изготовления иммуногенной композиции, включающий стадии: (a) комбинирования водного раствора, содержащего: (i) ClfA полипептид, (ii) СР5, конъюгированный с белком, (iii) СР8, конъюгированный с белком, (iv) буфер, имеющий рКа 6,0±0,6, и (v) объемообразующий агент; и (b) лиофилизации комбинации со стадии (a) для получения таблетки, содержащей меньше, чем 3 процента воды по массе. В конкретных вариантах осуществления, процесс дополнительно включает комбинирование (vi) поверхностно-активного вещества на стадии (a). В конкретных вариантах осуществления, процесс дополнительно включает стадию стерилизующей фильтрации композиции со стадии (a) перед лиофилизацией стадии (b). В конкретных вариантах осуществления, водный раствор содержит 10 мМ ± 1 мМ гистидина, pH 6,0±0,5, сахарозы 9%±4,5% масс./об. и полисорбат 80 0,1%±0,05% масс./об. В другом варианте осуществления, полисорбат 80 присутствует в концентрации 0,01%±0,005% масс./об., и сахароза присутствует в концентрации 4,5%±1,5% масс./об.

[0026] В конкретных вариантах осуществления, стадия лиофилизации (b) включает стадии: (i) замораживания стерилизованной композиции со стадии (a) со скоростью 0,3°C±0,03°C в минуту до достижения температуры -50°C±5°C при давлении 400 миллибар±40 миллибар; и затем выдерживания композиции при -50°C±5°C в течение 60 минут ± 6 минут; (ii) ренатурации композиции путем повышения температуры до -10°C±5°C со скоростью 0,3°C±0,03°C в минуту; впоследствии выдерживая при температуре -10°C±5°C в течение 120 минут±12 минут, с последующим понижением температуры со скоростью 0,3°C±0,03°C в минуту до достижения температуры -50°C±5°C, и выдерживание при температуре -50°C±5°C в течение 180 минут ± 18 минут; (iii) высушивания композиции путем понижения давления до 50 миллиторр (мТорр) и выдерживания в течение 30 минут, с последующим повышением температуры до -30°C±5°C со скоростью 0,2°C±0,02°C в минуту, и впоследствии выдерживая при температуре -30°C±5°C в течение 1 920 минут ± 192 минуты; (iv) дополнительное высушивание композиции путем повышения температуры до 30°C±5°C со скоростью 0,2°C±0,02°C в минуту и повышения давления до 200 мТорр, и впоследствии выдерживая при температуре 30°C±5°C в течение 720 минут ± 72 минуты; и (v) понижение температуры до 5°C±5°C со скоростью 0,5°C±0,05°C в минуту. В некоторых вариантах осуществления, лиофилизацию проводят во флаконах. В некоторых вариантах осуществления, флаконы закупоривают после лиофилизации. В конкретных вариантах осуществления, флаконы заполняют газообразным азотом перед закупориванием флакона. В конкретных вариантах осуществления, процесс дополнительно включает стадию: (c) восстановления лиофилизированной композиции со стадии (b) в водной среде. В конкретных вариантах осуществления, осмоляльность восстановленной композиции со стадии (c) составляет от 250 мосмоль ± 25 мосмоль до 300 мосмоль ± 30 мосмоль. В конкретных вариантах осуществления, иммуногенную композицию изобретения изготовляют в соответствии с каким-либо процессом производства иммуногенной композиции изобретения.

[0027] В одном варианте осуществления, изобретение предусматривает лиофилизированную иммуногенную композицию, содержащую: (а) по меньшей мере, четыре компонента, выбранные из группы, которая состоит из выделенного полипептида агглютинирующего фактора A (ClfA) Staphylococcus aureus, выделенного полипептида агглютинирующего фактора B (ClfB) Staphylococcus aureus, СР5, конъюгированного с белком, СР8, конъюгированного с белком, и выделенного MntC полипептида Staphylococcus aureus, (b) буфер, имеющий рКа 6,0±0,6, и (c) объемообразующий агент. В конкретных вариантах осуществления, ClfA полипептид сохраняется в значительной степени неразложившийся в течение, по меньшей мере, 1 месяца при 37°C.

[0028] В одном варианте осуществления, изобретение предусматривает лиофилизированную иммуногенную композицию, содержащую: (а) выделенный полипептид агглютинирующего фактора A (ClfA) Staphylococcus aureus; (b) капсульный полисахарид типа 5, конъюгированный с CRM₁₉₇ (CP5-CRM₁₉₇); (c) капсульный полисахарид типа 8, конъюгированный с CRM₁₉₇ (CP8-CRM₁₉₇); (d) выделенный MntC полипептид; (e) буфер, имеющий рКа 6,0±0,6, и (f) объемообразующий агент. В конкретных вариантах осуществления, ClfA полипептид сохраняется в значительной степени неразложившийся в течение, по меньшей мере, 1 месяца при 37°C.

[0029] В одном варианте осуществления, изобретение предусматривает лиофилизированную иммуногенную композицию, содержащую: воду меньше, чем 3 массовых процента к общей массе иммуногенной композиции (% масс./масс.), в которой ClfA полипептид составляет от 0,09%±0,027% до 0,84%±0,25% масс/масс, СР5-CRM₁₉₇ составляет от 0,04%±0,013% до 0,42±0,13% масс/масс, CP8-CRM₁₉₇ составляет от 0,04%±0,013% до 0,42±0,13% масс./масс., MntC составляет от 0,09%±0,027% до 0,84%±0,25% масс./масс., и буфер составляет 3,3%±0,99% масс/масс.

[0030] В одном варианте осуществления, изобретение предусматривает лиофилизированную иммуногенную композицию, содержащую: (a) ClfA полипептид; (b) конъюгат CP5-CRM₁₉₇; (c) конъюгат CP8-CRM₁₉₇; (d) MntC полипептид; (е) гистидиновый буфер; (f) сахарозу; (g) полисорбат 80; и (h) воду. В конкретных вариантах осуществления, ClfA полипептид сохраняется в значительной степени неразложившийся в течение, по меньшей мере, 3 месяцев при 37°C.

[0031] В одном варианте осуществления, изобретение предусматривает лиофилизированную иммуногенную композицию, содержащую: (a) ClfA полипептид от 0,09%±0,027% до 0,84%±0,25% масс/масс; (b) конъюгат CP5-CRM₁₉₇ от 0,04%±0,013% до 0,42±0,13% масс/масс; (с) конъюгат CP8-CRM₁₉₇ от 0,04%±0,013% до 0,42±0,13% масс/масс; (d) MntC полипептид от 0,09%±0,027% до 0,84%±0,25% масс/масс; (e) гистидиновый буфер 3,3%±0,99% масс/масс; (f) сахарозу 95%±2% масс./масс.; (g) полисорбат 80 0,21%±0,063% масс/масс; и (h) воду 2%±1% масс./масс. В конкретных вариантах осуществления, ClfA полипептид сохраняется в значительной степени неразложившийся в течение, по меньшей мере, 3 месяцев при 37°C.

[0032] В одном варианте осуществления, изобретение предусматривает жидкую иммуногенную четырех антигенную композицию, изготовленную путем восстановления лиофилизированной иммуногенной композиции изобретения в водном разбавителе, где упомянутая восстановленная композиция имеет конечное значение pH 6,5±0,5.

[0033] В одном варианте осуществления, изобретение предусматривает жидкую иммуногенную композицию, содержащую: (a) ClfA полипептид в концентрации от 40 мкг/мл ± 4 мкг/мл до 800 мкг/мл ± 80 мкг/мл; (b) конъюгат CP5-CRM₁₉₇ в концентрации от 20 мкг/мл ± 2 мкг/мл до 400 мкг/мл ± 40 мкг/мл; (c) конъюгат CP8-CRM197 в концентрации от 20 мкг/мл ± 2 мкг/мл до 400 мкг/мл ± 40 мкг/мл; (d) выделенный MntC полипептид в концентрации от 40 мкг/мл ± 4 мкг/мл до 800 мкг/мл ± 80 мкг/мл; (е) гистидиновый буфер в концентрации от 10 мМ±5 мМ; (f) полисорбат 80 в концентрации от 0,01%±0,005% массы к объему (масс/об.); и (g) сахарозу в концентрации от 4,5%±1,5% масс./об. В другом варианте осуществления, полисорбат 80 присутствует в концентрации 0,01%±0,005% масс./об. и сахароза присутствует в концентрации 4,5%±1,5% масс./об.

[0034] В одном варианте осуществления, изобретение предусматривает жидкую иммуногенную композицию, содержащую: (а) восстановленный лиофилизированный ClfA полипептид; (b) конъюгат CP5-CRM₁₉₇; (c) конъюгат CP8-CRM₁₉₇; (d) MntC полипептид; (d) гистидиновый буфер; (е) полисорбат 80; (f) сахарозу; и (g) водный разбавитель.

[0035] В одном варианте осуществления, изобретение предусматривает жидкую иммуногенную композицию, содержащую: (а) восстановленный лиофилизированный ClfA полипептид в концентрации от 40 мкг/мл ± 4 мкг/мл до 800 мкг/мл ± 80 мкг/мл; (b) конъюгат CP5-CRM₁₉₇ в концентрации от 20 мкг/мл ± 2 мкг/мл до 400 мкг/мл ± 40 мкг/мл; (c) конъюгат CP8-CRM₁₉₇ в концентрации от 20 мкг/мл ± 20 мкг/мл до 400 мкг/мл ± 40 мкг/мл; (d) выделенный MntC полипептид в концентрации от 40 мкг/мл ± 4 мкг/мл до 800 мкг/мл ± 80 мкг/мл; (e) гистидиновый буфер в концентрации 10 мМ ± 5 мМ; (f) полисорбат 80 в концентрации 0,1%±0,05% массы к объему (масс./об.); и (g) сахарозу в концентрации 9%±4,5% масс./об.; и (h) водный разбавитель. В другом варианте осуществления, полисорбат 80 присутствует в концентрации 0,01%±0,005% масс/об. и сахарозу присутствует в концентрации 4,5%±1,5% масс/об.

[0036] В одном варианте осуществления, изобретение предусматривает процесс изготовления иммуногенной композиции, включающий стадии: (а) формуляции водного раствора: (i) ClfA полипептид, (ii) конъюгат CP5-CRM₁₉₇, (iii) конъюгат CP8-CRM₁₉₇, (iv) MntC полипептид, (v) буфер, имеющий рКа 6,0±0,6, и (vi) объемообразующий агент; и (b) лиофилизации композиции стадии (a), чтобы сформировалась таблетка, содержащая меньше, чем 3 процента воды по массе. В конкретных вариантах осуществления, процесс дополнительно включает комбинирование с (vi) поверхностно-активным веществом на стадии (a). В конкретных вариантах осуществления, процесс дополнительно включает стадию стерилизующей фильтрации композиции со стадии (a) перед лиофилизацией стадии (b). В конкретных вариантах осуществления, водный раствор содержит 10 мМ±5 мМ гистидина, pH 6,0±0,5, сахарозу в концентрации 9%±1% масс./об. и полисорбат 80 в концентрации 0,1%±0,02% масс./об. В других вариантах осуществления, полисорбат 80 присутствует в концентрации 0,01%±0,001% масс./об., и сахароза присутствует в концентрации 4,5%±0,45% масс./об. В конкретных вариантах осуществления, стадия лиофилизации (b) включает стадии: (i) замораживания стерилизованной композиции со стадии (a) со скоростью 0,3°C±0,03°C в минуту до достижения температуры -50°C±5°C при давлении 400 миллибар ± 40 миллибар; и затем выдерживания композиции при -50°C±5°C в течение 60 минут ± 6 минут; (ii) ренатурации композиции путем повышения температуры до -10°C±5°C со скоростью 0,3°C±0,03°C в минуту; затем выдерживания при температуре -10°C±5°C в течение 120 минут ± 12 минут; затем снижения температуры со скоростью 0,3°C±0,03°C в минуту до достижения температуры -50°C±5°C; и затем выдерживания при температуре -50°C±5°C в течение 180 минут ± 18 минут; (iii) высушивания композиции путем снижения давления до 50 миллиторр (мТорр) и выдерживания в течение 30 минут; затем повышения температуры до -30°C±5°C со скоростью 0,2°C±0,02°C в минуту; и затем выдерживания при температуре -30°C±5°C в течение 1 920 минут ± 192 минут; (iv) высушивания композиции путем повышения температура до 30°C±5°C со скоростью 0,2°C±0,02°C в минуту; и затем повышения давления до 200 мТорр и выдерживания при температуре 30°C±5°C в течение 720 минут ± 72 минут; (v) понижения температуры до 5°C±5°C со скоростью 0,5°C±0,05°C в минуту. В некоторых вариантах осуществления, лиофилизацию проводят во флаконах. В некоторых вариантах осуществления, флаконы закупоривают после лиофилизации. В конкретных вариантах осуществления, флаконы заполняют газообразным азотом перед закупориванием флаконов. В конкретных вариантах осуществления, процесс дополнительно включает стадию: (c) восстановления лиофилизированной композиции со стадии (b) в водной среде. В конкретных вариантах осуществления, осмоляльность восстановленной композиции со стадии (c) составляет от 250 мосмоль ± 25 мосмоль до 300 мосмоль ± 30 мосмоль. В конкретных вариантах осуществления, иммуногенную композицию изобретения изготовляют в соответствии с каким-либо процессом производства иммуногенной композиции изобретения.

[0037] В одном варианте осуществления, изобретение предусматривает лиофилизированную иммуногенную композицию, содержащую: (а) выделенный полипептид агглютинирующего фактора A (ClfA) Staphylococcus aureus, включающий фибриногеновый домен, (b) буфер, имеющий рКа 6,0±0,6, и (c) объемообразующий агент. В конкретных вариантах осуществления, ClfA полипептид сохраняется в значительной степени неразложившийся в течение, по меньшей мере, 1 месяца при 37°C. В одном варианте осуществления, изобретение предусматривает лиофилизированную иммуногенную композицию, содержащую воду в количестве меньшем, чем 3 массовых процента от общей массы иммуногенной композиции (% масс./масс), в которой ClfA полипептид составляет 0,52 процента ± 0,46% масс./масс., и буфер составляет 0,28%±0,065% масс./масс. В конкретных вариантах осуществления, объемообразующим агентом является сахароза - 97%±2,0% масс./масс.

[0038] В одном варианте осуществления, изобретение предусматривает лиофилизированную иммуногенную композицию, содержащую: (a) ClfA полипептид - 0,52%±0,46% масс./масс, (b) сукцинатный буфер - 0,28%±0,065% масс./масс, (c) сахарозу - 97%±0,57% масс./масс, (d) полисорбат 80 - 0,20%±0,042% масс./масс., и (e) воду -2,5%±0,5% масс./масс. В конкретных вариантах осуществления, ClfA полипептид сохраняется в значительной степени неразложившийся в течение, по меньшей мере, 1 месяца при 37°C.

[0039] В одном варианте осуществления, изобретение предусматривает жидкую иммуногенную ClfA композицию, изготовленную путем восстановления лиофилизированной иммуногенной композиции изобретения в водном разбавителе, где упомянутая восстановленная композиция имеет конечное значение pH 6,0±0,3.

[0040] В одном варианте осуществления, изобретение предусматривает жидкую иммуногенную ClfA композицию, изготовленную путем восстановления лиофилизированной иммуногенной композиции изобретения в водном разбавителе, где упомянутая восстановленная композиция имеет конечное значение pH 6,5±0,3.

[0041] В одном варианте осуществления, изобретение предусматривает жидкую иммуногенную композицию, содержащую: (a) ClfA полипептид в концентрации от 20 мкг/мл±2 мкг/мл до 600 мкг/мл±60 мкг/мл; (b) гистидиновый буфер в концентрации 10 мМ±5 мМ; (c) полисорбат 80 в концентрации 0,1%±0,05% по массе к объему (масс./об.); и (d) сахарозу в концентрации 9%±4,5% масс./об. В другом варианте осуществления, полисорбат 80 присутствует в концентрации 0,01%±0,005% масс./об., и сахароза присутствует в концентрации 4,5%±1,5% масс./об.

[0042] В одном варианте осуществления, изобретение предусматривает процесс изготовления иммуногенной композиции, включающий стадии: (a) формуляции водного раствора, (i) рекомбинантного полипептида агглютинирующего фактора A (rClfA), (ii) буфера, имеющего рКа 6,0±0,6, и (iii) объемообразующего агента, (b) лиофилизации композиции со стадии (a), чтобы сформировать таблетку, содержащую меньше, чем 3% воды по массе. В конкретных вариантах осуществления, процесс дополнительно включает комбинирование с (vi) поверхностно-активным веществом на стадии (a). В конкретных вариантах осуществления, процесс дополнительно включает стадию стерилизующей фильтрации композиции со стадии (a) перед лиофилизацией на стадии (b). В конкретных вариантах осуществления, водный раствор содержит 10 мМ ± 1 мМ гистидина, pH 6,0±0,5, сахарозу - 9%±1% масс./об. и полисорбат 80-0,1%±0,02% масс./об. В других вариантах осуществления, полисорбат 80 присутствует в концентрации 0,01%±0,001% масс./об., и сахароза присутствует в концентрации 4,5%±0,45% масс./об. В конкретных вариантах осуществления, стадия лиофилизации (b) включает стадии: (i) замораживания стерилизованной композиции со стадии (а) со скоростью 0,3°C±0,03°C в минуту до достижения температуры -50°C±5°C при давлении 400 миллибар ± 40 миллибар; и затем выдерживания композиции при -50°C±5°C в течение 60 минут ± 6 минут; (ii) ренатурации композиции путем повышения температуры до -10°C±5°C со скоростью 0,3°C±0,03°C в минуту; затем выдерживания при температуре -10°C±5°C в течение 120 минут ± 12 минут; затем снижения температуры со скоростью 0,3°C±0,03°C в минуту до достижения температуры -50°C±5°C; и затем выдерживания при температуре -50°C±5°C в течение 180 минут ± 18 минут; (iii) высушивания композиции путем понижения давления до 50 миллиторр (мТорр) и повышения температуры до -25°C±5°C со скоростью 0,2°C±0,02°C в минуту; и затем выдерживания при температуре 25°C±5°C в течение 1 320 минут ± 132 минут; (iv) высушивания композиции путем повышения температуры до 30°C±5°C со скоростью 0,2°C±0,02°C в минуту; и затем повышения давления до 200 мТорр и выдерживания при температуре 30°C±5°C в течение 720 минут ± 72 минут; (v) понижения температуры до 5°C±5°C со скоростью 0,5°C±0,05°C в минуту. В некоторых вариантах осуществления лиофилизацию проводят во флаконе. В некоторых вариантах осуществления, флакон закупоривают после лиофилизации. В конкретных вариантах осуществления, флакон заполняют газообразным азотом перед закупориванием флакона. В конкретных вариантах осуществления, процесс дополнительно включает стадию: (c) восстановления лиофилизированной композиции со стадии (b) в водной среде. В конкретных вариантах осуществления, осмоляльность восстановленной композиции со стадии (c), воспроизводимой из высушенной композиции со стадии (b) в водном разбавителе, в которой осмоляльность восстановленной композиции составляет 300 мосмоль ± 30 мосмоль. В конкретных вариантах осуществления, водная среда содержит, по меньшей мере, два компонента, выбранные из группы, которая состоит из: (a) полипептида агглютинирующего фактора B (ClfB) Staphylococcus aureus, (b) капсульного полисахарида типа 5 (СР5), конъюгированного с белком, (c) капсульного полисахарида типа 8 (СР8), конъюгированного с белком, и (d) MntC полипептида Staphylococcus aureus. В конкретных вариантах осуществления, водный раствор содержит СР5, конъюгированного с белком, и СР8, конъюгированного с белком. В конкретных вариантах осуществления, водный раствор содержит СР-5, конъюгированного с белком, СР8, конъюгированного с белком, и MntC полипептид. В конкретных вариантах осуществления, иммуногенную композицию изобретения производят в соответствии с каким-либо процессом изготовления иммуногенной композиция изобретения.

[0043] В конкретных вариантах осуществления, ClfA полипептид содержит N домен. В конкретных вариантах осуществления, ClfA полипептид содержит N1, N2 или N3 домен. В конкретных вариантах осуществления, ClfA полипептид содержит N1, N2 и N3 домен. В конкретных вариантах осуществления, ClfA полипептид содержит фибриноген-связывающий домен. В конкретных вариантах осуществления, фибриноген-связывающий домен является видоизмененным для того, чтобы связываться с фибриногеном на пониженном уровне по сравнению со связыванием с фибриногеном, которое наблюдали с нативным фибриноген-связывающим доменом ClfA. В конкретных вариантах осуществления, фибриноген-связывающий домен демонстрирует пониженное связывание с фибриногеном посредством имеющегося аминокислотного замещения при одном или более из Tyr 338, Tyr 256, Pro 336, Lys 389, Ala 254 и Ile 387. В конкретных вариантах осуществления, аминокислотное замещение при одном или более из Tyr 338, Tyr 256, Pro 336, Lys 389, Ala 254 и Ile 387 происходит на Ala или Ser. В конкретных вариантах осуществления, Tyr 338 замещается на Ala.

[0044] В конкретных вариантах осуществления, СР5, конъюгированный с белком, представляет собой CP5-CRM₁₉₇, СР5-пневмолизин или СР5-стрептококковую C5a пептидазу (SCP). В конкретных вариантах осуществления, СР8, конъюгированный с белком, представляет собой CP8-CRM197, СР8-пневмолизин или СР8-стрептококковую C5a пептидазу (SCP).

[0045] В конкретных вариантах осуществления, буфер лиофилизированной иммуногенной композиции содержит сукцинат при pH 6,0±0,3. В конкретных вариантах осуществления, буфер содержит гистидин при pH 6,5±0,5. В конкретных вариантах осуществления, буфер содержит гистидин при pH 6,0±0,3. В конкретных вариантах осуществления, объемообразующий агент выбирают из группы, состоящей из сахарозы, трегалозы, маннита, глицина или сорбита. В конкретных вариантах осуществления, объемообразующим агентом является сахароза. В конкретных вариантах осуществления, объемообразующим агентом является сахароза с содержанием 96%±0,2% масс./масс. В конкретных вариантах осуществления, лиофилизированная иммуногенная композиция дополнительно содержит поверхностно-активное вещество. В конкретных вариантах осуществления, поверхностно-активное вещество выбирают из группы, состоящей из полоксамера, полиоксиэтиленалкилового простого эфира и полиоксиэтиленовый сложный эфир сорбита и жирной кислоты. В конкретных вариантах осуществления полиоксиэтиленовым сложным эфиром сорбита и жирной кислоты является полисорбат 80. В конкретных вариантах осуществления, полисорбат 80 присутствует в концентрации 0,20%±0,041% масс./масс., для ClfA и три-антигенных композиций. В конкретных вариантах осуществления, полисорбат 80 присутствует в концентрации 0,1%±0,05% масс./масс., для четырех- антигенных композиций. В других вариантах осуществления, полисорбат 80 присутствует в концентрации 0,01%±0,005% масс./об.

[0046] В конкретных вариантах осуществления, лиофилизированная иммуногенная композиция дополнительно содержит вспомогательное вещество. В конкретных вариантах осуществления, вспомогательным веществом является ISCOMATRIX™.

[0047] В конкретных вариантах осуществления, водным разбавителем жидкой композиции является вода. В конкретных вариантах осуществления, водным разбавителем является слабый солевой раствор. В конкретных вариантах осуществления, слабый солевой раствор содержит 60 мМ ± 10 мМ хлорида натрия. В конкретных вариантах осуществления, водный разбавитель содержит полисорбат 80. В конкретных вариантах осуществления, водный разбавитель содержит вспомогательное вещество. В конкретных вариантах осуществления, вспомогательным веществом является ISCOMATRIX™.

Краткое описание фигур

[0048] Фигура 1 представляет схематическую диаграмму различных форм рекомбинантного ClfA полипептида и раскрывает SEQ ID No: 125 и 127-129.

[0049] Фигура 2 представляет изменение в концентрации различных серий лиофилизированного ClfA белка по сравнению с их жидкими аналогами, выраженное как In[C], в течение времени при различных условиях. Панель A: номера серий L36051-37-1 и L36051-44. Панель B: номер серии L36051-72. Панель C: номер серии L36051-81-1. Панель D: номер серии 36051-81-2.

[0050] На фигуре 3 изображены гельпроникающие хроматограммы лиофилизированного DS L40184-61 при t=0 по сравнению с таблетками, которые хранились при 2-8°C, 25°C, и 37°C в течение трех месяцев.

[0051] На фигуре 4 изображены гельпроникающие хроматограммы, сравнивающие лиофилизированную композиц