Индуктор считывания и терапевтический агент для генетических заболеваний, вызванных мутациями типа нонсенс-мутаций

Индуктор считывания и терапевтический агент для генетических заболеваний, вызванных мутациями типа нонсенс-мутаций

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к индуктору считывания для индукции считывания преждевременного стоп-кодона, образовавшегося вследствие нонсенс-мутаций, и лекарственному средству для лечения генетического заболевания, вызванного нонсенс-мутациями.

Уровень техники

При генетическом заболевании, вызванном нонсенс-мутациями, экспрессия белка ингибируется по причине преждевременного стоп-кодона, образовавшегося вследствие точечной мутации гена. Примеры генетического заболевания, вызванного нонсенс-мутациями, включают мышечную дистрофию, множественный склероз, детский нейронный восковидный липофусциноз, болезнь Альцгеймера, болезнь Тея-Сакса, дегенерацию нервной ткани, болезнь Паркинсона, хронический ревматоидный артрит, реакцию “трансплантат против хозяина”, артрит, гемофилию, болезнь фон Виллебранда, атаксию-телеангиэктазию, талассемию, нефролитиаз, незавершенный остеогенез, цирроз, нейрофиброму, буллезную болезнь, лизосомную болезнь накопления, болезнь Гурлер, семейную холестеринемию, мозжечковую атаксию, туберозный склероз, семейный эритроцитоз, иммунодефицит, почечное заболевание, легочное заболевание, кистозный фиброз, семейную гиперхолестеринемию, пигментную ретинопатию, амилоидоз, атеросклероз, гигантизм, карликовость, гипотиреоидизм, гипертиреоидизм, старение, ожирение, сахарный диабет, болезнь Ниманна-Пика, синдром Марфана и рак.

Например, мышечная дистрофия Дюшенна возникает из-за недостатка белка дистрофина в сарколемме. При данном заболевании образуется стоп-кодон (преждевременный стоп-кодон) вследствие мутации в гене мышечной дистрофии, расположенном в X-хромосоме, и трансляция прерывается или завершается на участке мутации. Таким образом, нормальная экспрессия дистрофина и связанных с дистрофином белков ингибируется, и, как результат, пациенты, которые страдают от данного заболевания, имеют недостаток дистрофиновых белков.

Для лечения такого генетического заболевания, вызванного нонсенс-мутациями, предпринималась попытка использовать способ, в котором применяется соединение, имеющее считывающую активность. Считывающая активность означает, что когда определенное соединение вводят пациентам, которые имеют преждевременный стоп-кодон, образовавшийся в результате нонсенс-мутаций, и недостаток специфического белка, вышеупомянутое соединение действует на рибосому и рибосома прочитывает без остановки стоп-кодон и продолжает трансляцию. В результате считывания синтезируются нормальные белки дикого типа.

Аминогликозидный антибиотик гентамицин и дипептидный антибиотик негамицин представляют собой известные иллюстративные соединения, имеющие такую считывающую активность.

Что касается гентамицина, Politano et al. обнаружили, что введение гентамицина пациентам с мышечной дистрофией Дюшенна ведет к накоплению белка дистрофина (например, см. НПЛ 1). Кроме того, сообщается, что местное введение гентамицина в респираторный эпителий пациентов с кистозным фиброзом может корректировать типичные электрофизиологические отклонения (например, см. НПЛ 2). Более того, в Соединенных Штатах были проведены клинические испытания гентамицина в качестве терапевтического средства для генетических заболеваний. Однако существует обеспокоенность, связанная с токсичностью гентамицина. Поскольку требуется длительное применение, гентамицин не является удовлетворительным терапевтическим агентом для пациентов с генетическим заболеванием, вызванным нонсенс-мутациями.

Что касается негамицина, подтверждено, что введение данного соединения в мышиной модели мышечной дистрофии восстанавливает экспрессию дистрофина (например, см. ПТЛ 1). Однако негамицин представляет собой не получившее одобрения лекарственное средство. Существует неотложная потребность в лекарственном средстве против генетических заболеваний, вызванных нонсенс-мутациями. Таким образом, негамицин не может рассматриваться в качестве реального терапевтического лекарственного средства для лечения генетических заболеваний, вызванных нонсенс-мутациями.

Кроме того, в Соединенных Штатах было проведено клиническое испытание аталурена (PTC124), который имеет считывающую активность, в качестве лекарственного средства, например, против мышечной дистрофии Дюшенна. Однако в настоящее время испытание остановлено в фазе III. Как упомянуто выше, лекарственное средство против генетических заболеваний, вызванных нонсенс-мутациями, требуется немедленно. Таким образом, аталурен не может рассматриваться в качестве реального терапевтического лекарственного средства для лечения генетических заболеваний, вызванных нонсенс-мутациями.

Ввиду вышеизложенного имеется потребность в немедленной разработке индуктора считывания, который содержит соединение, имеющее низкую токсичность и считывающую активность, и лекарственного средства для лечения генетического заболевания, вызванного нонсенс-мутацией.

Список цитированных документов

Патентная литература

ПТЛ 1: Международная публикация № WO 2002/102361

Непатентная литература

НПЛ 1: Acta Myol. 2003, Vol. 22, pp.15-21

НПЛ 2: N. Engl. J. Med. 2003, Vol. 349, pp.1433-1441

Сущность изобретения

Техническая проблема

Задачей настоящего изобретения является решение вышеназванных существующих проблем и достижение следующей цели. Цель настоящего изобретения заключается в том, чтобы предоставить индуктор считывания, который включает соединение, имеющее низкую токсичность и считывающую активность, и лекарственное средство для лечения генетического заболевания, вызванного нонсенс-мутациями, причем лекарственное средство включает индуктор считывания.

Решение проблемы

В результате тщательных исследований, проведенных авторами настоящего изобретения, направленных на решение вышеупомянутых проблем, авторы настоящего изобретения обнаружили, что соединение, имеющее структуру, отображаемую следующей структурной формулой (A) (здесь и далее оно может быть названо как “арбекацин”), которое используется в качестве специфичного лекарственного средства против инфекционного заболевания, вызванного MRSA (золотистый стафилококк, устойчивый к метициллину), имеет превосходную считывающую активность, и пришли к изобретению, изложенному в настоящей заявке.

Настоящее изобретение основывается на вышеупомянутом открытии, сделанном авторами настоящего изобретения. Предложены следующие способы решения вышеупомянутых существующих проблем.

1. Индуктор считывания для индукции считывания преждевременного стоп-кодона, образовавшегося вследствие нонсенс-мутаций, где индуктор считывания включает:

соединение, имеющее структуру, отображаемую следующей структурной формулой (A):

2. Лекарственное средство для лечения генетического заболевания, вызванного нонсенс-мутациями, где лекарственное средство включает индуктор считывания по п.1.

3. Лекарственное средство по п.2, где генетическое заболевание, вызванное нонсенс-мутациями, представляет собой мышечную дистрофию.

4. Способ лечения индивида, имеющего генетическое заболевание, вызванное нонсенс-мутациями, где способ включает введение индивиду по меньшей мере одного из индуктора считывания по п.1 и лекарственного средства по п.2.

5. Способ по п.4, где генетическое заболевание, вызванное нонсенс-мутациями, представляет собой мышечную дистрофию.

6. Способ по п.4 или 5, где доза по меньшей мере одного из индуктора считывания по п.1 и лекарственного средства по п.2 составляет в единицах количества соединения, имеющего структуру, отображаемую структурной формулой (А), от 0,1 мг/кг/сутки до 300 мг/кг/сутки.

7. Способ по п.4 или 5, где доза по меньшей мере одного из индуктора считывания по п.1 и лекарственного средства по п.2 составляет в единицах количества соединения, имеющего структуру, отображаемую структурной формулой (А), от 0,5 мг/кг/сутки до 50 мг/кг/сутки.

8. Индуктор считывания по п.1, где индуктор считывания применяют для лечения генетического заболевания, вызванного нонсенс-мутациями.

9. Применение индуктора считывания по п.1 для производства лекарственного средства для эффективного лечения генетического заболевания, вызванного нонсенс-мутациями.

Обеспечивающие преимущество эффекты изобретения

Настоящее изобретение может предоставить индуктор считывания, включающий соединение, имеющее низкую токсичность и считывающую активность, и лекарственное средство для лечения генетического заболевания, вызванного нонсенс-мутациями, причем лекарственное средство включает индуктор считывания.

Краткое описание фигур

На Фиг.1 показано изображение нормальной мышиной ткани, полученное иммуноокрашиванием антителом к дистрофину.

На Фиг.2 показано изображение, полученное окрашиванием гематоксилином и эозином нормальной мышиной ткани.

На Фиг.3 показано изображение, полученное иммуноокрашиванием антителом к дистрофину ткани mdx-мыши, которой вводили лишь физиологический раствор.

На Фиг.4 показано изображение, полученное окрашиванием гематоксилином и эозином ткани mdx-мыши, которой вводили лишь физиологический раствор.

На Фиг.5 показано изображение, полученное иммуноокрашиванием антителом к дистрофину ткани mdx-мыши, которой вводили ABK.

На Фиг.6 показано изображение, полученное окрашиванием гематоксилином и эозином ткани mdx-мыши, которой вводили ABK.

На Фиг.7 представлена диаграмма, показывающая результат измерений силы хватки в примере 5 испытания для мышей B10, mdx-мышей, которым вводили арбекацин, и mdx-мышей, которым арбекацин не вводили.

На Фиг.8 представлена диаграмма, показывающая результат измерений тетанического сокращения икроножной мышцы в тестовом примере 6 для mdx-мышей, которым вводили арбекацин, и для mdx-мышей, которым арбекацин не вводили.

На Фиг.9 представлена диаграмма, показывающая результат измерений судорожного сокращения икроножной мышцы в тестовом примере 7 для mdx-мышей, которым вводили арбекацин (2,5 мг/сутки, 5 мг/сутки), и для mdx-мышей, которым арбекацин не вводили.

На Фиг.10 представлено изображение с результатом вестерн-блоттинга, полученное в тестовом примере 8.

Описание вариантов осуществления

Индуктор считывания

Индуктор считывания настоящего изобретения содержит по меньшей мере соединение, имеющее структуру, отображаемую следующей структурной формулой (A), и, если необходимо, дополнительно содержит другие ингредиенты.

Считывание означает, что, когда одно основание замещается вследствие точечной мутации в гене и образуется преждевременный стоп-кодон по ходу до нормального участка прекращения трансляции, преждевременный стоп-кодон прочитывается без остановки и трансляция продолжается до нормального участка прекращения трансляции. Считывание преждевременного стоп-кодона позволяет протекать синтезу функционального белка с полной длиной.

Соединение, имеющее структуру, отображаемую структурной формулой (А) (арбекацин)

Арбекацин (1-N-AHB-дибекацин) представляет собой соединение, в котором 4-амино-2-гидроксибутирильная (AHB) группа присоединена к дибекацину (3',4'-дезоксиканамицину В), и арбекацин используется в качестве специфического лекарственного средства против инфекционного заболевания, вызванного MRSA, с конца 1990.

Арбекацин может находиться в форме соли или в форме сольвата.

На соль не накладываются особые ограничения, и она может быть надлежащим образом выбрана согласно предполагаемой цели. Примеры соли включают соли галогеноводородных кислот, соли неорганических кислот, карбоксилаты, соли аминокислот и соли органических кислот. Среди них предпочтительными являются соли неорганических кислот.

Конкретные примеры соли галогеноводородной кислоты включают гидрофторид, гидрохлорид, гидробромид и гидроиодид.

Конкретные примеры соли неорганической кислоты включают сульфаты, нитраты, фосфаты, перхлораты и карбонаты. Среди них предпочтительными являются сульфаты.

Конкретные примеры карбоксилата включают ацетаты, трихлорацетаты, трифторацетаты, гидроксиацетаты, лактаты, цитраты, тартраты, оксалаты, бензоаты, соли миндальной кислоты, бутираты, малеаты, пропионаты, формиаты и соли яблочной кислоты.

Конкретные примеры соли аминокислоты включают альгинаты, аспартаты и глутаматы.

Конкретные примеры соли органической кислоты включают метансульфонаты и п-толуолсульфонаты.

На сольват не накладываются особые ограничения, и он может быть надлежащим образом выбран согласно предполагаемой цели. Примеры сольвата включают гидраты и этанолаты.

Арбекацин может быть синтезирован химическим синтезом, или же могут быть использованы коммерчески доступные продукты.

На способ синтеза арбекацина не накладываются особые ограничения, и он может быть надлежащим образом выбран согласно предполагаемой цели. Примеры способа включают способ, описанный на странице 412 в The Journal of Antibiotics, Vol. 26, 1973.

Примеры коммерчески доступного арбекацина включают хабекацин (продукт Meiji Seika Pharma Co., Ltd).

На способы получения соли арбекацина и сольвата арбекацина не накладываются особые ограничения, и они могут быть надлежащим образом выбраны из общеизвестных способов.

Арбекацин может находиться в форме своих производных.

На количество арбекацина в индукторе считывания не накладываются особые ограничения, и оно может быть надлежащим образом выбрано согласно предполагаемой цели. Индуктор считывания может представлять собой сам арбекацин.

Другой ингредиент

На другой ингредиент в индукторе считывания не накладываются особые ограничения, и он может быть надлежащим образом выбран согласно предполагаемой цели. Его примеры включают фармакологически приемлемые носители.

На фармакологически приемлемый носитель не накладываются особые ограничения, и он может быть надлежащим образом выбран согласно предполагаемой цели. Его примеры включают этанол, воду и крахмал.

На количество других ингредиентов, содержащихся в индукторе считывания, не накладываются особые ограничения, при условии что эффекты арбекацина не ухудшаются, и оно может быть надлежащим образом выбрано согласно предполагаемой цели.

Применение

Индуктор считывания может быть применен сам по себе или в сочетании с лекарственным средством, содержащим другие активные ингредиенты. Также индуктор считывания может быть включен до применения в лекарственное средство, содержащее другие активные ингредиенты.

Как показано в тестовых примерах 1-8, описываемых ниже, индуктор считывания имеет низкую токсичность и превосходную считывающую активность, поскольку он содержит арбекацин.

Соответственно, индуктор считывания может быть надлежащим образом использован для лечения генетических заболеваний, вызванных нонсенс-мутациями.

Дозированная форма

На дозированную форму индуктора считывания не накладываются особые ограничения, и она может быть надлежащим образом выбрана согласно предполагаемой цели. Примеры дозированной формы включают жидкости, порошки, капсулы и таблетки. Индуктору считывания может быть придана любая форма из этих дозированных форм посредством рутинного способа.

Введение

На способ введения индуктора считывания не накладываются особые ограничения, и он может быть надлежащим образом выбран в зависимости, например, от дозированной формы индуктора считывания. Индуктор считывания может быть введен перорально или парентерально.

На дозу индуктора считывания не накладываются особые ограничения, и она может быть надлежащим образом выбрана, принимая во внимание различные факторы целевых индивидуумов, такие как их возраст, масса тела, конституция, симптомы и одновременное применение лекарственного средства, содержащего другие активные ингредиенты. Доза индуктора считывания может составлять, в выражении на количество соединения, имеющего структуру, отображаемую структурной формулой (А) (арбекацин), например, от 0,1 мг/кг/сутки до 300 мг/кг/сутки, предпочтительно от 0,5 мг/кг/сутки до 50 мг/кг/сутки.

На временной режим введения индуктора считывания не накладываются особые ограничения, и оно может быть надлежащим образом выбрано согласно предполагаемой цели.

На вид животного, которому вводится индуктор считывания, не накладываются особые ограничения, и он может быть надлежащим образом выбран согласно предполагаемой цели. Его особенно подходящие примеры включают человека.

Предпочтительно перед введением индуктора считывания у индивидуума производят отбор биологического образца и оценивают присутствие или отсутствие преждевременного стоп-кодона в гене, содержащемся в биологическом образце, и индуктор считывания вводят индивидууму, у которого был обнаружен преждевременный стоп-кодон. На способ оценки присутствия или отсутствия преждевременного стоп-кодона не накладываются особые ограничения, и он может быть надлежащим образом выбран из известных способов. Его примеры включают Саузерн-блоттинг, полимеразную цепную реакцию (ПЦР), короткий концевой повтор (STR) и полиморфизм длины фрагментов рестрикции (ПДРФ).

Лекарственное средство для лечения генетического заболевания, вызванного нонсенс-мутациями

Лекарственное средство для лечения генетического заболевания, вызванного нонсенс-мутациями настоящего изобретения, содержит по меньшей мере индуктор считывания и, если необходимо, дополнительно содержит другие ингредиенты.

Генетическое заболевание, вызванное нонсенс-мутациями

Генетическое заболевание, вызванное нонсенс-мутациями, представляет собой заболевание, при котором одно основание замещается вследствие точечной мутации в гене и преждевременный стоп-кодон образуется по ходу до нормального участка прекращения трансляции, вызывая ингибирование экспрессии функционально белка с полной длиной.

Конкретные примеры генетического заболевания, вызванного нонсенс-мутациями, включают мышечную дистрофию, множественный склероз, детский нейронный восковидный липофусциноз, болезнь Альцгеймера, болезнь Тея-Сакса, дегенерацию нервной ткани, болезнь Паркинсона, хронический ревматоидный артрит, реакцию “трансплантат против хозяина”, артрит, гемофилию, болезнь фон Виллебранда, атаксию-телеангиэктазию, талассемию, нефролитиаз, незавершенный остеогенез, цирроз, нейрофиброму, буллезную болезнь, лизосомную болезнь накопления, болезнь Гурлер, семейную холестеринемию, мозжечковую атаксию, туберозный склероз, семейный эритроцитоз, иммунодефицит, почечное заболевание, легочное заболевание, кистозный фиброз, семейную гиперхолестеринемию, пигментную ретинопатию, амилоидоз, атеросклероз, гигантизм, карликовость, гипотиреоидизм, гипертиреоидизм, старение, ожирение, сахарный диабет, болезнь Ниманна-Пика, синдром Марфана и рак. Среди них предпочтительные примеры заболевания включают мышечную дистрофию и особенно предпочтительные примеры заболевания включают мышечную дистрофию Дюшенна.

На количество индуктора считывания в лекарственном средстве для лечения генетического заболевания, вызванного нонсенс-мутациями, не накладываются особые ограничения, и оно может быть надлежащим образом выбрано согласно предполагаемой цели. Лекарственное средство для лечения генетического заболевания, вызванного нонсенс-мутациями, может представлять собой сам индуктор считывания.

Другой ингредиент

На другой ингредиент в лекарственном средстве для лечения генетического заболевания, вызванного нонсенс-мутациями, не накладываются особые ограничения, и он может быть надлежащим образом выбран согласно предполагаемой цели. Его примеры включают фармакологически приемлемые носители.

На фармакологически приемлемый носитель не накладываются особые ограничения, и он может быть надлежащим образом выбран согласно предполагаемой цели. Его примеры включают этанол, воду и крахмал.

На количество других ингредиентов, содержащихся в лекарственном средстве для лечения генетического заболевания, вызванного нонсенс-мутациями, не накладываются особые ограничения, при условии что эффекты арбекацина не ухудшаются, и оно может быть надлежащим образом выбрано согласно предполагаемой цели.

Применение

Лекарственное средство для лечения генетического заболевания, вызванного нонсенс-мутациями, может быть применено само по себе или в сочетании с лекарственным средством, содержащим другие активные ингредиенты. Также лекарственное средство для лечения генетического заболевания, вызванного нонсенс-мутациями, может быть включено до применения в лекарственное средство, содержащее другие активные ингредиенты.

Как показано в тестовых примерах 1-8, описываемых ниже, лекарственное средство для лечения генетического заболевания, вызванного нонсенс-мутациями, имеет низкую токсичность и превосходную считывающую активность, поскольку оно содержит индуктор считывания.

Соответственно, лекарственное средство для лечения генетического заболевания, вызванного нонсенс-мутациями, может быть надлежащим образом использовано для лечения генетических заболеваний, вызванных нонсенс-мутациями.

Дозированная форма

На дозированную форму лекарственного средства для лечения генетического заболевания, вызванного нонсенс-мутациями, не накладываются особые ограничения, и она может быть надлежащим образом выбрана согласно предполагаемой цели. Примеры дозированной формы включают жидкости, порошки, капсулы и таблетки. Лекарственному средству для лечения генетического заболевания, вызванного нонсенс-мутациями, может быть придана любая форма из указанных дозированных форм посредством рутинного способа.

Введение

На способ введения лекарственного средства для лечения генетического заболевания, вызванного нонсенс-мутациями, не накладываются особые ограничения, и он может быть надлежащим образом выбран в зависимости, например, от лекарственной формы лекарственного средства для лечения генетического заболевания, вызванного нонсенс-мутациями. Лекарственное средство для лечения генетического заболевания, вызванного нонсенс-мутациями, может быть введено перорально или парентерально.

На дозу лекарственного средства для лечения генетического заболевания, вызванного нонсенс-мутациями, не накладываются особые ограничения, и она может быть надлежащим образом выбрана, принимая во внимание различные факторы целевых индивидуумов, такие как их возраст, масса тела, конституция, симптомы и одновременное применение лекарственного средства, содержащего другие активные ингредиенты. Доза лекарственного средства для лечения генетического заболевания, вызванного нонсенс-мутациями, может составлять в выражении на количество соединения, имеющего структуру, отображаемую структурной формулой (А) (арбекацин), например, от 0,1 мг/кг/сутки до 300 мг/кг/сутки, предпочтительно от 0,5 мг/кг/сутки до 50 мг/кг/сутки.

На время введения лекарственного средства для лечения генетического заболевания, вызванного нонсенс-мутациями, не накладываются особые ограничения, и оно может быть надлежащим образом выбрано согласно предполагаемой цели.

На вид животного, которому вводится лекарственное средство для лечения генетического заболевания, вызванного нонсенс-мутациями, не накладываются особые ограничения, и он может быть надлежащим образом выбран согласно предполагаемой цели. Его особенно подходящие примеры включают человека.

Предпочтительно перед введением лекарственного средства для лечения генетического заболевания, вызванного нонсенс-мутациями, у индивидуума производят забор биологического образца и оценивают присутствие или отсутствие преждевременного стоп-кодона в гене, содержащемся в биологическом образце, и лекарственное средство для лечения генетического заболевания, вызванного нонсенс-мутациями, вводят индивидууму, у которого был обнаружен преждевременный стоп-кодон. На способ оценки присутствия или отсутствия преждевременного стоп-кодона не накладываются особые ограничения, и он может быть надлежащим образом выбран из известных способов. Его примеры включают Саузерн-блоттинг, полимеразную цепную реакцию (ПЦР), короткий концевой повтор (STR) и полиморфизм длины фрагментов рестрикции (ПДРФ).

Способ лечения

Поскольку лекарственное средство для лечения генетического заболевания, вызванного нонсенс-мутациями, содержит индуктор считывания, введение лекарственного средства для лечения генетического заболевания, вызванного нонсенс-мутациями, индивидууму, имеющему генетическое заболевание, вызванное нонсенс-мутациями, позволяет провести лечение индивидуума, имеющего генетическое заболевание, вызванное нонсенс-мутациями. Следовательно, настоящее изобретение также относится к способу лечения индивидуума, имеющего генетическое заболевание, вызванное нонсенс-мутациями, где способ включает введение лекарственного средства для лечения генетического заболевания, вызванного нонсенс-мутациями, индивидууму.

Примеры

Настоящее изобретение далее будет подробно описано с использованием тестовых примеров, что не следует рассматривать как ограничение настоящего изобретения данными примерами.

Тестовый пример 1: анализ считывающей активности

Получение трансгенных мышей для детектирования считывающей активности

Чтобы проанализировать in vivo считывающую активность, трансгенных мышей для детектирования считывающей активности (оценка и определение считывания на двухрепортерных мышах, Readthrough Evaluation and Assessment by Dual-reporter mice (здесь и далее может быть использовано название “R.E.A.D.-мыши”)) получали аналогично тому, как описано в абзацах с [0071] по [0083] международной публикации № WO 2008/004610.

В случае R.E.A.D.-мышей экспрессирующий вектор (pCAGGS) введен в зародышевую линию. pCAGGS содержит цитомегаловирусный усилитель/куриный β-актиновый гибридный промотор и конструкт, в котором ген β-галактозидазы и ген люциферазы связаны с преждевременным стоп-кодоном (TGA) (27-мер, содержащий окружающую 12-мерную последовательность до и после преждевременного стоп-кодона экзона 23 mdx-мышей). В полученных R.E.A.D.-мышах типично экспрессируется только β-галактозидаза, но считывание преждевременного стоп-кодона приводит к экспрессии люциферазы.

Оценка считывающей активности

Соединения, приведенные ниже в Таблице 1, вводили подкожно трем группам самок однопометных R.E.A.D.-мышей (одна группа из 8-недельных мышей (7 мышей) и двум группам из 10-недельных мышей (5 мышей в каждой группе)) в дозе, указанной в Таблице 1, ежесуточно в течение 7 суток.

Арбекацин (здесь и далее может быть назван как “ABK”) и гентамицин (здесь и далее может быть назван как “GM”) использовали в качестве вводимого соединения.

Нефасованный порошок ABK, поставляемый Meiji Seika Pharma Co., Ltd., использовали в качестве арбекацина. Также для сравнения использовали гентамицин.

Введение проводили путем первоначального разведения соединения, подлежащего введению, физиологическим солевым раствором (продукт Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) и затем введением 0,1 мл раствора.

Эффективность считывания определяли следующим образом. После подкожной инъекции, проводимой ежесуточно в течение 7 дней, мышечную ткань вырезали. Используя экстракты мышечной ткани, активность β-галактозидазы и активность люциферазы измеряли люминометром с использованием люциферин-галактозидазы и люциферина. Эффективность считывания получали делением измеренной активности люциферазы на измеренную активность β-галактозидазы. В Таблице 1 ниже эффективность считывания представлена как относительная эффективность считывания, принимая за основу эффективность считывания, полученную при введении гентамицина, за 1.

Таблица 1
Введенное соединение	Доза, мг/сутки	Эффективность считывания
GM	0,5	1
Нет (только физиологический раствор)	0,62
ABK	0,5	1,17
ABK	1	1,14
ABK	2	1,33
ABK	4	1,47

Результаты в Таблице 1 подтверждали, что арбекацин (ABK) имеет считывающую активность. Кроме того, подтверждалось, что считывающая активность арбекацина выше таковой гентамицина (GM), который, как известно, обладает считывающей активностью.

Тестовый пример 2: тест на токсичность

Раствор для инъекций (50 мг/1 мл) хабекацина (сульфат арбекацина), коммерчески доступный в качестве арбекацина (ABK) от Meiji Seika Pharma Co., Ltd., разводили физиологическим солевым раствором (продукт Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) так, чтобы дозы ABK представляли ли бы собой таковые, показанные в нижеследующей Таблице 2, и 0,2 мл каждого разведенного раствора подкожно вводили ежесуточно в течение 7 суток 10-недельным однопометным R.E.A.D.-мышам (одна группа самцов (3 мыши) и одна группа самок (3 мыши)).

Токсичность оценивали следующим образом. Массу тела измеряли до и после ежесуточной подкожной инъекции в течение 7 суток и токсичность оценивали, основываясь на изменении массы тела (среднее значение для 6 мышей).

Эффективность считывания рассчитывали таким же образом, что и в тестовом примере 1. Конкретно, измеряли активность β-галактозидазы и активность люциферазы, и эффективность считывания получали делением измеренной активности люциферазы на измеренную активность β-галактозидазы. В Таблице 2 ниже эффективность считывания представлена как относительная эффективность считывания, принимая за основу эффективность считывания, полученную при введении только физиологического раствора, за 1.

Таблица 2
Введенное соединение	Доза, мг/сутки	Эффективность считывания	Изменение массы тела
Нет (только физиологический раствор)	1	102,5% (SD = 0,31)
ABK	2,5	2,20	98,8% (SD = 0,38)
ABK	5	1,50	96,9% (SD = 0,38)
ABK	7,5	-	-

Когда ABK вводили в количестве 7,5 мг/сутки, одна мышь погибла спустя 2 суток после начала введения (масса тела изменилась с 18,4 г до 17,3 г) и две мыши погибли спустя 3 суток после начала введения (масса тела одной мыши изменилась с 21,0 г до 19,0 г и у второй изменилась с 19,3 г до 18,2 г).

Результаты в Таблице 2 показывают, что токсичность арбекацина (ABK) мала. А именно, когда вводили большое количество арбекацина (ABK), 7,5 мг/сутки, мыши погибали, тогда как когда вводили 2,5 мг/сутки или 5 мг/сутки, то есть дозы, при которых наблюдалась считывающая активность, уменьшение массы тела было мало и была зафиксирована потеря токсичности.

Кроме того, из величины ЛД₅₀ (50% летальная доза) найдено, что токсичность арбекацина слаба. Когда мышам внутривенно вводили гентамицин, ЛД₅₀ составляла приблизительно 76 мг/кг, данные о чем можно найти в следующих публикациях: Development of Novel Aminoglycoside (NB54) with Reduced Toxicity and Enhanced Suppression of Disease-Causing Premature Stop Mutations, J. Med. Chem. 2009, 52, 2836-2845; Fujisawa, K., Hoshiya, T., Kawaguchi, H., Aminoglycoside antibiotics. VII. Acute toxicity of aminoglycoside antibiotics, J. Antibiot. 1974, 27, 677-681; и Kondo, S., Hotta, K., Semisynthetic aminoglycoside antibiotics: Development and enzymatic modifications, J. Infect. Chemother. 1999, 5, 1-9. В противоположность этому, когда мышам внутривенно вводили арбекацин, ЛД₅₀ составляла приблизительно 118 мг/кг.

Тестовый пример 3: экспрессия дистрофина

Нефасованный порошок ABK, поставляемый Meiji Seika Pharma Co., Ltd., разводили физиологическим солевым раствором (продукт Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) так, чтобы приготовить раствор 1 мг/0,1 мл. Полученный раствор подкожно вводили ежесуточно в течение 2 недель mdx-мышам, представляющим собой животную модель мышечной дистрофии Дюшенна (однопометные самцы и самки, возрастом 5 месяцев, n=8). Затем прямую мышцу бедра вырезали и готовили замороженные срезы. Приготовленные замороженные срезы подвергали иммуноокрашиванию, используя кроличье поликлональное антитело к дистрофину (продукт AbCam) в качестве первого антитела.

На Фиг.1 показано изображение, полученное иммуноокрашиванием антителом к дистрофину среза нормальной мышиной ткани. На Фиг.2 показано изображение, полученное окрашиванием гематоксилином и эозином среза нормальной мышиной ткани. На Фиг.3 показано изображение, полученное иммуноокрашиванием антителом к дистрофину среза ткани mdx-мыши, которой вводили лишь физиологический раствор. На Фиг.4 показано изображение, полученное окрашиванием гематоксилином и эозином среза ткани mdx-мыши, которой вводили лишь физиологический раствор. На Фиг.5 показано изображение, полученное иммуноокрашиванием антителом к дистрофину среза ткани mdx-мыши, которой вводили ABK. На Фиг.6 показано изображение, полученное окрашиванием гематоксилином и эозином среза ткани mdx-мыши, которой вводили ABK.

Как показано на Фиг.1 и 2, обнаружено, что нормальные мыши экспрессируют дистрофин и объем мышечной ткани однороден и гомогенен. Напротив, как показано на Фиг.3 и 4, обнаружено, что mdx-мыши не экспрессируют дистрофин и объем мышечной ткани гетерогенен.

Как показано на Фиг.5 и 6, обнаружено, что mdx-мыши, которым вводили арбекацин (ABK), экспрессируют дистрофин и, кроме того, объем мышечной ткани однороден и гомогенен.

Таким образом, было подтверждено, что арбекацин эффективен в качестве терапевтического лекарственного средства против мышечной дистрофии.

Тестовый пример 4: измерение напряжения передней конечности

Нефасованный порошок ABK, поставляемый Meiji Seika Pharma Co., Ltd., разводили физиологическим солевым раствором (продукт Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) так, чтобы вводить ABK в дозе, показанной ниже в Таблице 3, готовя, тем самым, 0,1 мл раствора. Полученный раствор вводили подкожно ежесуточно в течение 2 недель mdx-мышам, представляющим собой животную модель мышечной дистрофии Дюшенна (однопометные самцы и самки, возрастом 5 месяцев, n=8). Спустя 2 недели измеряли напряжение передней конечности.

Напряжение передней конечности измеряли измерителем силы хватки для небольших животных (динамометр представлял собой продукт Japan Instrumentation System Co., Ltd).

Ниже в Таблице 3 напряжение представлено как относительное напряжение, где напряжение передней конечности нормальных мышей, которое скорректировано на массу тела, определено за 100.

Таблица 3
Введенное соединение	Доза, мг/сутки	Напряжение
Нет (только физиологический раствор)	76,3 (SD=5,3)
ABK	1	87,0 (SD=3,9)

Результаты в Таблице 3 показывают, что введение арбекацина (ABK) восстанавливает напряжение передней конечности mdx-мышей. Таким образом, было подтверждено, что арбекацин эффективен в качестве терапевтического лекарственного средства против мышечной дистрофии.

Тестовый пример 5: измерение силы хватки

В данном тесте использовались следующие три группы мышей: (1) нормальные мыши, мыши B10 (однопометные самцы и самки, возрастом 5 месяцев, n=9); (2) mdx-мыши, представляющие собой животную модель мышечной дистрофии Дюшенна (однопометные самцы и самки, возрастом 5 месяцев, n=9), которым подкожно вводили разведенный раствор хабекацина (сульфата арбекацина) в дозе 1 мг/сутки ежесуточно в течение 3 недель; и (3) mdx-мыши, представляющие собой животную модель мышечной дистрофии Дюшенна (однопометные самцы и самки, возрастом 5 месяцев, n=8). Разведенный раствор хабекацина (сульфата арбекацина) готовили разведением раствора хабекацина (сульфата арбекацина) для инъекций, коммерчески доступного от Meiji Seika Pharma Co., Ltd., физиологическим солевым раствором (продукт Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.).

В качестве устройства для измерения силы хватки изготавливали устройство, относящееся к измерителю силы хватки для небольших животных, путем прикрепления нержавеющей проволочной сетки длиной 70 мм и шириной 55 мм к коммерчески доступному динамометру (продукт Japan Instrumentation System Co., Ltd). Данный динамометр имеет спецификацию: точность ±0,2% FS, точность при повторении ±0,1% FS и максимальное значение 100 Н (10 килограмм-сила). Динамометр имеет разрешение 1/10000 0,01 Н (1 грамм-сила) и позволяет проводить измерение пика.

Силу хватки мышей измеряли следующим образом.

Мышь помещали на сетку для измерения и тянули рукой за хвост горизонтально. Максимальную силу (силу хват