Специфические связывающие агенты против в7-н1

Специфические связывающие агенты против в7-н1

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Изобретение относится к специфическим связывающим агентам против белка B7-H1 и к применению таких агентов. В некоторых вариантах воплощения изобретение относится к полностью человеческим моноклональным антителам, направленным на B7-H1, и к применению таких антител. Аспекты изобретения также относятся к клеточным линиям, экспрессирующим такие специфические связывающие агенты или антитела. Описанные специфические связывающие агенты пригодны для использования в качестве диагностических средств и для лечения болезней, ассоциированных с активностью и/или экспрессией B7-H1.

Уровень техники

Адаптивный иммунный ответ включает активацию, селекцию и клональную пролиферацию двух основных классов лимфоцитов, названных T-клетками и B-клетками. После встречи с антигеном T-клетки пролиферируют и дифференцируют в антигенспецифические эффекторные клетки, в то время как B-клетки пролиферируют и дифференцируют в антителосекретирующие клетки. Активация T-клетки представляет собой многостадийный процесс, требующий нескольких сигнальных событий между T-клеткой и антигенпрезентирующей клеткой (APC) (АГК). Для активации T-клетки к покоящейся T-клетке должны быть доставлены два типа сигналов. Первый тип медиируется рецептором антигенспецифической T-клетки (TcR) (ТкР), и придает иммунному ответу специфичность. Второй, костимулирующий, тип регулирует величину ответа и доставляется через вспомогательные рецепторы на T-клетке.

Первичный костимулирующий сигнал доставляется путем активации рецептора CD28 при связывании его лигандов B7-1 или B7-2. В отличие от этого, связывание ингибирующего рецептора CTLA-4 этими же лигандами B7-1 или B7-2 приводит к ослаблению T-клеточного ответа. Таким образом, сигналы CTLA-4 антагонизируют костимуляцию, медиируемую CD28. При высоких концентрациях антигена костимуляция CD28 преобладает над ингибирующим эффектом CTLA-4. Временная регуляция экспрессии CD28 и CTLA-4 поддерживает баланс между активирующими и ингибирующими сигналами и обеспечивает развитие эффективного иммунного ответа, предотвращая в то же время развитие аутоиммунитета.

В последнее время были идентифицированы молекулярные гомологи CD28 и CTLA-4 и их B-7-подобные лиганды. ICOS представляет собой CD28-подобный костимулирующий рецептор. Рецептор PD-1 (запрограммированной смерти 1) является ингибирующим рецептором и партнером CTLA-4. Данное изобретение относится к модуляции иммунных ответов, медиируемых B7-H1.

B7-H1, также известный как PD-L1, представляет собой трансмембранный белок типа I размером приблизительно 53 кДа. У людей B7-H1 экспрессируется на ряде типов иммунных клеток, включая активированные и анергичные/истощенные T-клетки, на наивных и активированных B-клетках, а также на миелоидных дендритных клетках (DC), моноцитах и мастоцитах. Он также экспрессируется на неиммунных клетках, включая панкреатические островки, клетки Купфера в печени, сосудистый эндотелий и избранный эпителий, например, эпителий дыхательных путей и эпителий почечных канальцев, где его экспрессия усиливается во время воспалительных эпизодов. Повышенные уровни экспрессии B7-H1 были также обнаружены на ряде опухолей, включая, без ограничений, опухоли молочной железы, ободочной кишки, колоректальные, легкого, почки, включая почечно-клеточную карциному, желудка, мочевого пузыря, немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), гепатоцеллюлярную карциному (HCC) и рак поджелудочной железы, а также меланому.

B7-H1 является членом семейства белков B7, которые включают два внеклеточных Ig-домена, один N-концевой домен V-типа, за которым следует домен C-типа. Внутриклеточный домен длиной 30 аминокислот не содержит явных сигнальных мотивов, но несет потенциальный сайт фосфорилирования протеинкиназы C. Мышиная форма B7-H1 имеет 69% идентичности аминокислотных последовательностей с человеческой формой B7-H1, а также общую с ней консервативную структуру.

Известно, что B7-H1 связывает два альтернативных лиганда, первый из которых, PD-1, представляет собой 50-55 кДа трансмембранный рецептор типа I, который был первоначально идентифицирован в T-клеточной линии, подвергнутой индуцируемому активацией апоптозу. PD-1 экспрессируется на активированных T-клетках, B-клетках и моноцитах, а также других клетках иммунной системы, и связывает как B7-H1 (PD-L1), так и родственный B7-DC (PD-L2). Вторым является B7-1, член семейства B7, который экспрессируется на активированных T-клетках, B-клетках, моноцитах и антигенпрезентирующих клетках.

PD-1 является членом суперсемейства иммуноглобулинов (Ig), содержащим один V-подобный домен Ig в своей внеклеточной области. Цитоплазматический домен PD-1 содержит два тирозина, причем проксимальный по отношению к мембране тирозин (VAYEEL в мышином PD-1) расположен в ITIM (иммунорецепторный тирозиновый ингибирующий мотив). Присутствие ITIM на PD-1 указывает, что эта молекула функционирует, ослабляя сигналы антигенного рецептора путем рекрутмента цитоплазматических фосфатаз. Человеческие и мышиные белки PD-1 имеют примерно 60% идентичности аминокислотных последовательностей, с сохранением четырех потенциальных сайтов N-гликозилирования и остатков, образующих домен Ig-V. ITIM в цитоплазматической области и ITIM-подобный мотив, окружающие карбоксиконцевой тирозин (TEYATI у человека и мыши), также остаются консервативными в человеческих и мышиных ортологах.

Считается, что сигнализация по оси PD-1/B7-H1 выполняет в иммунной системе критические, незарезервированные функции, негативно регулируя T-клеточные ответы. Эта регуляция участвует в развитии T-клеток в тимусе, в регуляции хронических воспалительных ответов и в поддержании как периферической толерантности, так и иммунной привилегии. Критический характер этих функций продемонстрирован на примере PD-1-дефицитных мышей, которые проявляют аутоиммунный фенотип. Дефицит PD-1 у C57BL/6 мышей приводит к хроническому прогрессирующему волчаночному гломерулонефриту и артриту. У мышей Balb/c дефицит PD-1 приводит к тяжелой кардиомиопатии вследствие присутствия специфических к сердечным тканям аутореактивных антител. Функция сигнализации B7-H1/B7-1 менее понятна, но считается, что она также принимает участие в передаче негативных регуляторных сигналов как к T-клеткам, так и к антигенпрезентирующим клеткам.

Считается, что экспрессия B7-H1 на опухолевых клетках помогает опухолям избегать обнаружения и уничтожения иммунной системой. B7-H1 функционирует в этом отношении по нескольким альтернативным механизмам, включая стимуляцию истощения и анергии инфильтрующих опухоль T-лимфоцитов, стимуляцию секреции иммуннорепрессивных цитокинов в микроокружение опухоли, стимуляцию репрессорной функции регуляторных T-клеток и защиту экспрессирующих B7-H1 опухолевых клеток от лизиса специфическими к опухолевым клеткам цитотоксическими T-клетками.

В общем, существует потребность в создании безопасных и эффективных терапевтических способов лечения расстройств, ассоциированных с репрессией иммунного ответа, таких как, например, рак и хронические вирусные инфекции. Модуляция иммунных ответов, задействованных в этих расстройствах, может быть осуществлена путем проведения манипуляций с проводящим путем B7-H1/PD-1.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к специфическим связывающим агентам, которые специфически связываются с B7-H1 и ингибируют биологическую активность B7-H1. В одном варианте воплощения изобретение относится к специфическим связывающим агентам, которые специфически связываются с B7-H1 и тем самым ингибируют активность B7-H1. В другом варианте воплощения изобретения оно относится к специфическим связывающим агентам, которые специфически связываются с B7-H1 и тем самым ингибируют связывание B7-H1 с PD-1. В еще одном варианте воплощения изобретение относится к специфическим связывающим агентам, которые блокируют индуцируемую B7-H1 супрессию T-клеток и тем самым усиливают противоопухолевый иммунитет. В еще одном варианте воплощения изобретения оно дополнительно относится к специфическим связывающим агентам, которые могут дополнительно стимулировать одну или несколько из следующих активностей, включая пролиферацию T-клеток, секрецию IFN-γ и/или IL-2 в смешанных лимфоцитарных реакциях. Варианты воплощения изобретения относятся к специфическим связывающим агентам, которые специфически связываются с B7-H1 и ингибируют биологическую активность B7-H1. В одном варианте воплощения изобретения специфический связывающий агент ингибирует по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% биологической активности, которая наблюдалась бы в отсутствие специфического связывающего агента.

Варианты воплощения изобретения относятся к специфическим связывающим агентам, которые специфически связываются с B7-H1 и тем самым ингибируют активность B7-H1. В одном варианте воплощения изобретения специфический связывающий агент ингибирует по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% активности B7-H1, которая наблюдалась бы в отсутствие специфического связывающего агента.

Варианты воплощения изобретения относятся к специфическим связывающим агентам, которые специфически связываются с B7-H1 и тем самым ингибируют связывание с PD-1. В одном варианте воплощения изобретения специфический связывающий агент ингибирует по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% связывания лиганда рецептором B7-H1/PD-1 по сравнению с тем, которое наблюдалось бы в отсутствие специфического связывающего агента.

В другом варианте воплощения специфические связывающие агенты по изобретению могут ингибировать связывание PD-1/Fc с человеческим B7-H1, экспрессируемым на клетках ES-2. В одном варианте воплощения специфический связывающий агент ингибирует связывание с IC₅₀ менее 1 нМ, 0,5 нМ, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1, 0,09, 0,08, 0,07 или 0,06 нМ. Дополнительно, в другом варианте воплощения, антитела по изобретению имеют IC₅₀, равный от примерно 1 нМ до примерно 0,06 нМ; или от примерно 0,5 нМ до примерно 0,06 нМ; или от примерно 0,1 нМ до примерно 0,06 нМ; или от примерно 1 нМ до примерно 0,1 нМ; или от примерно 1 нМ до примерно 0,5 нМ.

Варианты воплощения изобретения относятся к специфическим связывающим агентам, которые специфически связываются с B7-H1 и тем самым ингибируют связывание с его лигандом B7-1. В одном варианте воплощения специфический связывающий агент ингибирует, по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% связывания лиганда рецептором B7-H1/B7-1 по сравнению с тем, которое наблюдалось бы в отсутствие специфического связывающего агента.

Варианты воплощения изобретения относятся к специфическим связывающим агентам, которые специфически связываются с B7-H1 и ингибируют индуцируемую B7-H1 пролиферацию опухоли. В одном варианте воплощения специфический связывающий агент ингибирует по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% от индуцируемой B7-H1 пролиферации опухоли, которая наблюдалась бы в отсутствие специфического связывающего агента.

Дополнительные варианты воплощения изобретения относятся к специфическим связывающим агентам, которые специфически связываются с B7-H1 и тем самым ингибируют индуцируемое B7-H1 выживание опухолевых клеток. В одном варианте воплощения специфический связывающий агент ингибирует по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% индуцируемого B7-H1 выживания опухолевых клеток, которое наблюдалась бы в отсутствие специфического связывающего агента.

Дополнительные варианты воплощения изобретения относятся к специфическим связывающим агентам, которые специфически связываются с B7-H1 и тем самым ингибируют рост опухоли раковых клеточных линий A375 или HPAC. В одном варианте воплощения специфический связывающий агент ингибирует по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% роста раковых клеток в день 30 по сравнению с изотипическим контролем.

Дополнительные варианты воплощения изобретения относятся к специфическим связывающим агентам, которые специфически связываются с B7-H1 и тем самым ингибируют медиируемую B7-H1 супрессию опухолевореактивных T-клеток, тем самым усиливая противоопухолевую цитолитическую активность T-клеток. В одном варианте воплощения специфический связывающий агент ингибирует по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% медиируемой B7-H1 супрессии опухолевореактивной T-клеточной активности, которая наблюдалась бы в отсутствие специфического связывающего агента.

Дополнительные варианты воплощения изобретения относятся к специфическим связывающим агентам, которые специфически связываются с B7-H1 и тем самым усиливают противоопухолевый иммунитет. В одном варианте воплощения специфический связывающий агент повышает на по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% противоопухолевый иммунитет, который наблюдался бы в отсутствие специфического связывающего агента.

Дополнительные варианты воплощения изобретения относятся к специфическим связывающим агентам, которые специфически связываются с B7-H1 и тем самым ингибируют пролиферацию клеток. В одном варианте воплощения специфический связывающий агент ингибирует по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% пролиферации клеток, которая наблюдалась бы в отсутствие специфического связывающего агента.

Дополнительные варианты воплощения изобретения относятся к специфическим связывающим агентам, которые специфически связываются с B7-H1 и усиливают специфическую цитолитическую (CTL) активность против опухолевых клеток, экспрессирующих B7-H1. В одном варианте воплощения антитела по изобретению имеют величину EC₅₀, меньшую или равную 100 нМ, 50 нМ или 1 нМ. Дополнительно, в другом варианте воплощения, антитела по изобретению имеют величину EC₅₀, составляющую от примерно 100 нМ до примерно 1 нМ; или от примерно 50 нМ до примерно 1 нМ; или от примерно 20 нМ до примерно 1 нМ; или от примерно 100 нМ до примерно 50 нМ; или от примерно 100 нМ до примерно 70 нМ.

Дополнительные варианты воплощения изобретения относятся к специфическим связывающим агентам, которые специфически связываются с B7-H1 и ингибируют медиируемую B7-H1 супрессию пролиферации T-клеток при величине EC50, меньшей или равной 100 нМ. В одном варианте воплощения антитела по изобретению имеют величину EC50, меньшую или равную 100 нМ, например, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 или 10 нМ. Дополнительно, в другом варианте воплощения, антитела по изобретению имеют величину EC50, составляющую от примерно 100 нМ до примерно 10 нМ; или от примерно 50 нМ до примерно 10 нМ; или от примерно 20 нМ до примерно 10 нМ; или от примерно 100 нМ до примерно 50 нМ; или от примерно 100 нМ до примерно 70 нМ; или от примерно 100 нМ до примерно 80 нМ.

Специфические связывающие агенты также ингибируют адгезию, подвижность, инвазию опухолевых клеток и клеточные метастазы, и, в дополнение к этому, специфические связывающие агенты пригодны для уменьшения роста опухоли. Механизмы, по которым это может быть достигнуто, могут включать, без ограничений, ингибирование активности B7-H1.

В одном варианте воплощения изобретения специфический связывающий агент представляет собой антитело. В одном варианте воплощения изобретения специфический связывающий агент представляет собой моноклональное антитело. В одном варианте воплощения изобретения специфический связывающий агент представляет собой полностью человеческое моноклональное антитело или его фрагмент. Такие моноклональные антитела могут быть названы здесь анти-B7-H1 антителами или антителами по изобретению.

Антитела, моноклональные антитела и человеческие моноклональные антитела включают антитела изотипов IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, например, IgG2. В одном варианте воплощения изобретения специфический связывающий агент представляет собой полностью человеческое моноклональное антитело изотипа IgG2. Этот изотип обладает пониженным потенциалом возбуждения эффекторной функции по сравнению с другими изотипами, что может приводить к пониженной токсичности. В другом варианте воплощения изобретения специфический связывающий агент представляет собой полностью человеческое моноклональное антитело изотипа IgG1. Изотип IgG1 обладает повышенным потенциалом возбуждения опосредованной антителами клеточной цитотоксичности (ADCC) по сравнению с другими изотипами, что может приводить к повышенной эффективности. Изотип IgG1 обладает повышенной стабильностью по сравнению с другими изотипами, например, IgG4, что может приводить к улучшенной биодоступности/простоте производства/большего периода полувыведения. В одном варианте воплощения полностью человеческое моноклональное антитело изотипа IgG1 принадлежит к аллотипу z, za или f. В одном варианте воплощения изобретения специфический связывающий агент обладает желательными терапевтическими свойствами, выбранными из одного или нескольких из следующего: высокая аффинность связывания с B7-H1, способность ингибировать активность B7-H1 in vitro и in vivo, способность ингибировать медиируемое B7-H1 выживание опухолевых клеток, и способность ингибировать медиируемую B7-H1 супрессию опухолевореактивных T-клеток, что может, в свою очередь, уменьшить пролиферацию, подвижность, инвазивность, метастазирование опухолевых клеток и рост опухоли.

В одном варианте воплощения изобретение включает антитела, которые специфически связываются с B7-H1 с очень высокими аффинностями (Kd). В некоторых вариантах воплощения изобретения специфический связывающий агент связывает B7-H1 с аффинностью связывания (Kd) менее 5 наномоль (нМ). В других вариантах воплощения специфический связывающий агент связывается с величиной Kd менее 4 нМ, 3 нМ, 2,5 нМ, 2 нМ или 1 нМ. Дополнительно, в некоторых других вариантах воплощения антитела по изобретению связывают B7-H1 с величиной Kd, равной от примерно 5 нМ до примерно 1 нМ; или от примерно 5 нМ до примерно 2 нМ; или от примерно 5 нМ до примерно 3 нМ; или от примерно 5 нМ до примерно 4 нМ; или от примерно 3 нМ до примерно 1 нМ; или от примерно 2 нМ до примерно 1 нМ. В некоторых вариантах воплощения изобретения специфический связывающий агент связывает B7-H1 с величиной Kd менее 950 пикомоль (пМ). В некоторых вариантах воплощения изобретения специфический связывающий агент связывает B7-H1 с величиной Kd менее 900 пМ. В других вариантах воплощения специфический связывающий агент связывает B7-H1 с величиной Kd менее 800 пМ, 700 пМ или 600 пМ. В некоторых вариантах воплощения изобретения специфический связывающий агент связывает B7-H1 с величиной Kd менее 500 пМ. В других вариантах воплощения специфический связывающий агент связывает B7-H1 с величиной Kd менее 400 пМ. В еще одних вариантах воплощения специфический связывающий агент связывает B7-H1 с величиной Kd менее 300 пМ. В некоторых других вариантах воплощения специфический связывающий агент связывает B7-H1 с величиной Kd менее 200 пМ. В некоторых других вариантах воплощения специфический связывающий агент связывает B7-H1 с величиной Kd менее 100 пМ. Дополнительно, в некоторых других вариантах воплощения антитела по изобретению связывает B7-H1 с величиной Kd, равной от примерно 900 пМ до примерно 100 пМ; или от примерно 900 пМ до примерно 200 пМ; или от примерно 900 пМ до примерно 300 пМ; или от примерно 900 пМ до примерно 400 пМ; или от примерно 900 пМ до примерно 500 пМ; или от примерно 900 пМ до примерно 600 пМ; или от примерно 900 пМ до примерно 700 пМ; или от примерно 200 пМ до примерно 100 пМ; или от примерно 300 пМ до примерно 200 пМ; или от примерно 400 пМ до примерно 300 пМ. В некоторых других вариантах воплощения специфический связывающий агент связывает B7-H1 с величиной Kd менее 90 пМ, 80 пМ, 70 пМ, 60 пМ, 55 пМ или 50 пМ. В некоторых других вариантах воплощения специфический связывающий агент связывает B7-H1 с величиной Kd менее 60 пМ. В некоторых других вариантах воплощения специфический связывающий агент связывает B7-H1 с величиной Kd менее 55 пМ. Дополнительно, в некоторых других вариантах воплощения антитела по изобретению связывает B7-H1 с величиной Kd, равной от примерно 100 пМ до примерно 50 пМ; или от примерно 100 пМ до примерно 70 пМ; или от примерно 100 пМ до примерно 80 пМ; или от примерно 100 пМ до примерно 90 пМ; или от примерно 70 пМ до примерно 50 пМ; или от примерно 60 пМ до примерно 50 пМ; или от примерно 55 пМ до примерно 50 пМ. Величину Kd можно оценить с помощью метода, описанного здесь или известного квалифицированному специалисту (например, анализ BIAcore, ELISA) (Biacore International AB, Uppsala, Sweden). Специфические связывающие агенты по изобретению имеют значительно улучшенные аффинности связывания B7-H1 по сравнению с антителами, описанными в предшествующем уровне техники.

Связывающие свойства специфического связывающего агента или антитела по изобретению также могут быть измерены путем сопоставления со скоростями диссоциации или ассоциации (k_off и k_on, соответственно).

В одном варианте воплощения изобретения специфический связывающий агент или антитело по изобретению может иметь константу скорости k_on (антитело (Ab) + антиген (Ag)^kon→Ab-Ag), равную по меньшей мере 10⁴ М^-1с^-1, по меньшей мере 5×10⁴ М^-1с^-1, по меньшей мере 10⁵ М^-1с^-1, по меньшей мере 2×10⁵ М^-1с^-1, по меньшей мере 5×10⁵ М^-1с^-1, по меньшей мере 10⁶ М^-1с^-1, по меньшей мере 5×10⁶ М^-1с^-1, по меньшей мере 10⁷ М^-1с^-1, по меньшей мере 5×10⁷ М^-1с^-1 или по меньшей мере 10⁸ М^-1с^-1 при измерении методом анализа BIAcore. Дополнительно, в некоторых других вариантах воплощения, антитела по изобретению имеют константу скорости k_on, равную от примерно 5×10⁴ М^-1с^-1 до примерно 5×10⁸ М^-1с^-1; или от примерно 5×10⁵ М^-1с^-1 до примерно 5×10⁸ М^-1с^-1; или от примерно 5×10⁶ М^-1с^-1 до примерно 5×10⁸ М^-1с^-1; или от примерно 5×10⁷ М^-1с^-1 до примерно 5×10⁸ М^-1с^-1, при измерении методом анализа BIAcore.

В другом варианте воплощения изобретения специфический связывающий агент или антитело может иметь константу скорости k_off ((Ab-Ag)^koff(→антитело (Ab) + антиген (Ag)) менее 5×10^-1 с^-1, менее 10^-1 с^-1, менее 5×10^-2 с^-1, менее 10^-2 с^-1, менее 5×10^-3 с^-1, менее 10^-3 с^-1, менее 5×10^-4 с^-1, менее 10^-4 с^-1, менее 5×10^-5 с^-1, менее 10^-5 с^-1, менее 5×10^-6 с^-1, менее 10^-6 с^-1, менее 5×10^-7 с^-1, менее 10^-7 с^-1, менее 5×10^-8 с^-1, менее 10^-8 с^-1, менее 5×10^-9 с^-1, менее 10^-9 с^-1 или менее 10^-10 с^-1 при измерении методом анализа BIAcore. Дополнительно, в некоторых других вариантах воплощения, антитела по изобретению имеют константу скорости k_off, равную от примерно 1×10^-4 с^-1 до примерно 1×10^-5 с^-1; или от примерно 1×10^-4 с^-1 до примерно 5×10^-4 с^-1, при измерении методом анализа BIAcore.

Специфический связывающий агент по изобретению специфически связывает человеческий B7-H1. В некоторых примерах специфический связывающий агент по изобретению не связывает другие иммунные комодулирующие белки, например, человеческий PD-L2, человеческий B7-H2, человеческий B7-H3, человеческий CD28, человеческий CTLA-4 и человеческий PD1.

В другом варианте воплощения специфический связывающий агент по изобретению является кросс-реактивным с другими белками B7-H1 от других видов. В одном варианте воплощения специфический связывающий агент по изобретению является кросс-реактивным с B7-H1 яванского макака (cynomolgus monkey). В другом варианте воплощения специфический связывающий агент по изобретению является кросс-реактивным с мышиным B7-H1, например, 2.7A4. В другом варианте воплощения специфический связывающий агент по изобретению является кросс-реактивным с B7-H1 яванского макака и с мышиным B7-H1, например, 2.7A4. В другом варианте воплощения специфический связывающий агент по изобретению является кросс-реактивным с B7-H1 яванского макака, но не с мышиным B7-H1, например, 2.9D10 и 2.14H9.

В одном варианте воплощения специфический связывающий агент или антитело включает последовательность, содержащую любую из последовательностей тяжелых цепей (VH), приведенных в Таблице 8. В другом варианте воплощения специфический связывающий агент или антитело включает последовательность, содержащую любую из последовательностей тяжелых цепей антител 2.9D10, 2.7A4, 2.14H9, 3.15G8, 2.20A8, 3.18G1, 2.7A4OPT или 2.14H9OPT. Способность легкой цепи к образованию случайных связей (promiscuity) хорошо известна специалистам, и, таким образом, специфический связывающий агент или антитело, включающие последовательность, содержащую любую из последовательностей тяжелых цепей антител 2.9D10, 2.7A4, 2.14H9, 3.15G8, 2.20A8, 3.18G1, 2.7A4OPT или 2.14H9OPT или другого антитела, раскрытого здесь, может дополнительно включать любую из последовательностей легких цепей (VL), приведенных в Таблице 9, или антител 2.9D10, 2.7A4, 2.14H9, 3.15G8, 2.20A8, 3.18G1, 2.7A4OPT или 2.14H9OPT или другого антитела, раскрытого здесь. В другом варианте воплощения специфический связывающий агент или антитело включает последовательность, содержащую любую из последовательностей тяжелых цепей антител 2.9D10, 2.7A4, 2.14H9, 3.15G8, 2.20A8, 3.18G1, 2.7A4OPT или 2.14H9OPT, и дополнительно включает соответствующую последовательность легкой цепи антитела 2.9D10, 2.7A4, 2.14H9, 3.15G8, 2.20A8, 3.18G1, 2.7A4OPT или 2.14H9OPT. В некоторых вариантах воплощения антитело представляет собой полностью человеческое моноклональное антитело.

В одном варианте воплощения специфический связывающий агент или антитело включает последовательность, содержащую любую из последовательностей легких цепей, приведенных в Таблице 9. В другом варианте воплощения специфический связывающий агент или антитело включает последовательность, содержащую любую из последовательностей легких цепей антител 2.9D10, 2.7A4, 2.14H9, 3.15G8, 2.20A8, 3.18G1, 2.7A4OPT или 2.14H9OPT. В некоторых вариантах воплощения антитело представляет собой полностью человеческое моноклональное антитело.

В другом варианте воплощения специфический связывающий агент или антитело включает последовательность, содержащую любую из последовательностей тяжелых цепей антитела 2.7A4, и дополнительно включает последовательность легкой цепи антитела 2.7A4. В другом варианте воплощения специфический связывающий агент или антитело включает последовательность, содержащую любую из последовательностей тяжелых цепей антитела 2.14H9, и дополнительно включает последовательность легкой цепи антитела 2.14H9. В другом варианте воплощения специфический связывающий агент или антитело включает последовательность, содержащую любую из последовательностей тяжелых цепей антитела 2.9D10, и дополнительно включает последовательность легкой цепи антитела 2.9D10. В другом варианте воплощения специфический связывающий агент или антитело включает последовательность, содержащую любую из последовательностей тяжелых цепей антитела 2.7A.4OPT, и дополнительно включает последовательность легкой цепи антитела 2.7A.4OPT. В другом варианте воплощения специфический связывающий агент или антитело включает последовательность, содержащую любую из последовательностей тяжелых цепей антитела 2.14H9OPT, и дополнительно включает последовательность легкой цепи антитела 2.14H9OPT.

В некоторых вариантах воплощения специфический связывающий агент представляет собой любое из моноклональных антител, приведенных в Таблице 1. В некоторых вариантах воплощения специфический связывающий агент представляет собой моноклональное антитело, выбранное из группы, состоящей из 2.7A4, 2.14H9, 2.9D10, 2.7A4OPT или 2.14H9OPT. В одном варианте воплощения специфический связывающий агент включает однл или несколько полностью человеческих моноклональных антител 2.7A4, 2.14H9, 2.9D10, 2.7A4OPT или 2.14H9OPT. В определенных вариантах воплощения специфический связывающий агент представляет собой моноклональное антитело 2.7A4. В определенных других вариантах воплощения специфический связывающий агент представляет собой моноклональное антитело 2.14H9. В еще одних вариантах воплощения специфический связывающий агент представляет собой моноклональное антитело 2.9D10. В определенных вариантах воплощения специфический связывающий агент представляет собой моноклональное антитело 2.7A4OPT. В определенных других вариантах воплощения специфический связывающий агент представляет собой моноклональное антитело 2.14H9OPT. В дополнительных вариантах воплощения специфический связывающий агент является производным от любого из вышеописанных моноклональных антител.

В другом варианте воплощения специфический связывающий агент может включать последовательность, содержащую любой из CDR1, CDR2 или CDR3 вариабельных последовательностей тяжелой цепи, кодируемых полинуклеотидом в плазмиде, обозначенной 2.7A4_G, 2.14H9_G, и 2.9D10_NG, которые были депонированы в NCIMB под номером 41598 19 ноября 2008 года, под номером 41597 19 ноября 2008 года и под номером 41599 19 ноября 2008 года, соответственно.

В другом варианте воплощения специфический связывающий агент может включать последовательность, содержащую любой из CDR1, CDR2 или CDR3 последовательностей вариабельного домена легкой цепи, кодируемых полинуклеотидом в плазмиде, обозначенной 2.7A4_G, 2.14H9_G и 2.9D10_NG, которые были депонированы под номером 41598 19 ноября 2008 года, под номером 41597 19 ноября 2008 года, или под номером 41599 19 ноября 2008 года, соответственно.

В одном варианте воплощения специфический связывающий агент или антитело по изобретению включают аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую CDR3, кодируемый полинуклеотидом в плазмиде, обозначенной 2.7A4_G, которая была депонирована в NCIMB под депозитарным номером 41598 19 ноября 2008 года, и аминокислотную последовательность вариабельного домена легкой цепи, содержащую CDR3, кодируемый полинуклеотидом в плазмиде, обозначенной 2.7A4_G, которая была депонирована в NCIMB под депозитарным номером 41598 19 ноября 2008 года.

В другом варианте воплощения специфический связывающий агент или антитело по изобретению включают аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую, по меньшей мере, один, по меньшей мере, два или, по меньшей мере, три CDR антитела, кодируемых полинуклеотидом в плазмиде, обозначенной 2.7A4_G, которая была депонирована в NCIMB под депозитарным номером 41598 19 ноября 2008 года.

В другом варианте воплощения специфический связывающий агент или антитело по изобретению включают аминокислотную последовательность вариабельного домена легкой цепи, содержащую, по меньшей мере, один, по меньшей мере, два или, по меньшей мере, три CDR антитела, кодируемых полинуклеотидом в плазмиде, обозначенной 2.7A4_G, которая была депонирована в NCIMB под депозитарным номером 41598 19 ноября 2008 года.

В другом варианте воплощения специфический связывающий агент или антитело по изобретению включают аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую, по меньшей мере один, по меньшей мере, два или, по меньшей мере, три CDR антитела, кодируемых полинуклеотидом в плазмиде, обозначенной 2.7A4_G, которая была депонирована в NCIMB под депозитарным номером 41598 19 ноября 2008 года, и аминокислотную последовательность вариабельного домена легкой цепи, содержащую, по меньшей мере один, по меньшей мере, два или, по меньшей мере, три CDR антитела, кодируемых полинуклеотидом в плазмиде, обозначенной 2.7A4_G, которая была депонирована в NCIMB под депозитарным номером 41598 19 ноября 2008 года.

В одном варианте воплощения специфический связывающий агент или антитело по изобретению включают аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую CDR3, кодируемый полинуклеотидом в плазмиде, обозначенной 2.14H9_G, которая была депонирована в NCIMB под номером 41597 19 ноября 2008 года.

В одном варианте воплощения специфический связывающий агент или антитело по изобретению включают аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую CDR3, кодируемый полинуклеотидом в плазмиде, обозначенной 2.14H9_G, которая была депонирована в NCIMB под номером 41597 19 ноября 2008 года, и аминокислотную последовательность вариабельного домена легкой цепи, содержащую CDR3, кодируемый полинуклеотидом в плазмиде, обозначенной 2.14H9_G, которая была депонирована в NCIMB под номером 41597 19 ноября 2008 года.

В другом варианте воплощения специфический связывающий агент или антитело по изобретению включают аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую, по меньшей мере, один, по меньшей мере, два или, по меньшей мере, три CDR антитела, кодируемых полинуклеотидом в плазмиде, обозначенной 2.14H9_G, которая была депонирована в NCIMB под номером 41597 19 ноября 2008 года.

В другом варианте воплощения специфический связывающий агент или антитело по изобретению включают аминокислотную последовательность вариабельного домена легкой цепи, содержащую, по меньшей мере, один, по меньшей мере, два или, по меньшей мере, три CDR антитела, кодируемых полинуклеотидом в плазмиде, обозначенной 2.14H9_G, которая была депонирована в NCIMB под номером 41597 19 ноября 2008 года.

В другом варианте воплощения специфический связывающий агент или антитело по изобретению включают аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую, по меньшей мере, один, по меньшей мере, два или, по меньшей мере, три CDR антитела, кодируемых полинуклеотидом в плазмиде, обозначенной 2.14H9_G, которая была депонирована в NCIMB под номером 41597 19 ноября 2008 года, и аминокислотную последовательность вариабельного до