Мышь с общей легкой цепью

Мышь с общей легкой цепью

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0001] Предоставлена генетически модифицированная мышь, экспрессирующая антитела с общей легкой цепью с вариабельной областью человека/константной областью мыши, ассоциированной с различными тяжелыми цепями с вариабельной областью человека/константной областью мыши. Предоставлен способ получения биспецифического антитела человека на основании генных последовательностей вариабельных областей человека B-клеток мыши.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0002] Как правило, антитела содержат компонент гомодимерных тяжелых цепей, где каждый мономер тяжелой цепи ассоциирован с идентичной легкой цепью. В качестве терапевтических антител желательны антитела, содержащие компонент гетеродимерных тяжелых цепей (например, биспецифические антитела). Но получение биспецифических антител с подходящим компонентом легкой цепи, который может удовлетворительно ассоциировать с каждой из тяжелых цепей биспецифического антитела оказалось проблематичным.

[0003] В одном из подходов легкую цепь можно выбирать, изучая статистику использования всех вариабельных доменов легких цепей, идентифицируя наиболее часто используемую в антителах человека легкую цепь и спаривая эту легкую цепь in vitro с двумя тяжелыми цепями с различной специфичностью.

[0004] В другом подходе легкую цепь можно выбирать, исследуя последовательности легких цепей в библиотеке фагового дисплея (например, в библиотеке фагового дисплея, содержащей последовательности вариабельных областей легких цепей человека, например, библиотека ScFv человека) и выбирая из библиотеки наиболее часто используемую вариабельную область легкой цепи. Затем легкую цепь можно тестировать на двух представляющих интерес различных тяжелых цепях.

[0005] В другом подходе легкую цепь можно выбирать, анализируя библиотеку фагового дисплея последовательностей вариабельных областей легких цепей с использованием в качестве зондов последовательностей вариабельных областей тяжелых цепей обеих представляющих интерес тяжелых цепей. В качестве легкой цепи для тяжелых цепей можно выбирать легкую цепь, ассоциирующую с обеими последовательностями вариабельных областей тяжелых цепей.

[0006] В другом подходе легкую цепь-кандидата можно выравнивать с легкими цепями, родственными тяжелым цепям, и в легкой цепи производят модификации для более близкого соответствия характеристик последовательности, общих с легкими цепями, родственными с тяжелыми цепями. Если необходимо минимизировать вероятность иммуногенности, модификации предпочтительно имеют результатом последовательности, которые присутствуют в известных последовательности легких цепей человека, так, что протеолитический процессинг на основе известных в данной области параметров и способов оценки вероятности иммуногенности (т.е., анализов in silico, а также "мокрых" анализов) приводит к T-клеточному эпитопу с минимальной вероятностью.

[0007] Все из указанных выше подходов основаны на способах in vitro, содержащих ряд априорных ограничений, например, идентичность последовательностей, способность к ассоциации с конкретными предварительно выбранными тяжелыми цепями и т.д. В данной области существует необходимость в композициях и способах, которые не основаны на регуляции условий in vitro, а в которых для получения связывающих эпитопы белков человека, содержащих общую легкую цепь, вместо этого используют более биологически разумные подходы.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

[0008] На фиг. 1 проиллюстрирована стратегия определения мишени для замены эндогенного участков гена вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина мыши генной областью Vκ1-39Jκ5 человека.

[0009] На фиг. 2 проиллюстрирована стратегия определения мишени для замены эндогенного участков гена вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина мыши генной областью Vκ3-20Jκ1 человека.

[0010] На фиг. 3 проиллюстрирована стратегия определения мишени для замены эндогенного участков гена вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина мыши генной областью VpreB/Jλ5 человека.

СУЩНОСТЬ

[0011] Предоставлены генетически модифицированные мыши, экспрессирующие вариабельные домены тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов человека, где у мышей существует ограниченный репертуар вариабельных областей легких цепей. Предоставлена биологическая система для получения вариабельна домена легкой цепи человека, ассоциирующего и экспрессирующегося с широким репертуаром вариабельных доменов тяжелых цепей человека с созревшей аффинностью. Предоставлены способы получения связывающих белков, содержащих вариабельные домены иммуноглобулинов, включающие иммунизацию мышей с ограниченным репертуаром легких цепей иммуноглобулинов представляющим интерес антигеном, и использование генной последовательности вариабельной области иммуноглобулина мыши для связывающего белка, который специфически связывает представляющий интерес антиген. Способы включают способы получения вариабельных доменов тяжелых цепей иммуноглобулинов человека, пригодных для использования в получении полиспецифичных антигенсвязывающих белков.

[0012] Предоставлены полученные генно-инженерными способами мыши, у которых происходит отбор подходящих вариабельных доменов тяжелых цепей иммуноглобулинов человека с созревшей аффинностью, получаемых из репертуара неперегруппированных генных сегментов вариабельных областей тяжелых цепей человека, где вариабельные домены тяжелых цепей человека с созревшей аффинностью ассоциируют и экспрессируются с единственным вариабельным доменом легкой цепи человека, получаемым из единственного генного сегмента вариабельной области легкой цепи человека. Также предоставлены полученные генно-инженерными способами мыши, обеспечивающие выбор из двух генных сегментов вариабельных областей легких цепей человека.

[0013] Предоставлены полученные генно-инженерными способами мыши, экспрессирующие ограниченный репертуар вариабельных доменов легких цепей человека или единственный вариабельный домен легкой цепи человека из ограниченного репертуара генных сегментов вариабельных областей легких цепей человека. Мыши получены генно-инженерными способами так, чтобы содержать единственный неперегруппированный генный сегмент вариабельной области легкой цепи человека (или два генных сегмента вариабельных областей легких цепей человека), который перестраивается, формируя перегруппированный ген вариабельной области легкой цепи человека (или два перегруппированных гена вариабельных областей легких цепей), экспрессирующий единственную легкую цепь (или экспрессирующий любую или обе из двух легких цепей). Перегруппированные вариабельные домены легких цепей человека способны к спариванию со множеством тяжелых цепей человека с созревшей аффинностью, отобранных мышами, где вариабельные области тяжелых цепей специфически связывают различные эпитопы.

[0014] В одном из аспектов предоставлена генетически модифицированная мышь, экспрессирующая единственный генный сегмент вариабельной (VL) области легкой цепи иммуноглобулина человека, способный к перегруппировке и кодирующий домен VL легкой цепи иммуноглобулина человека. В другом аспекте мышь несет не более двух генных сегментов VL человека, способных к перегруппировке и кодирующих домен VL легкой цепи иммуноглобулина человека.

[0015] В одном из аспектов предоставлена генетически модифицированная мышь, несущая единственный перегруппированный (V/J) сегмент вариабельной (VL) области легкой цепи иммуноглобулина человека (т.е., сегмент V/J), кодирующий домен VL легкой цепи иммуноглобулина человека. В другом аспекте мышь несет не более двух перегруппированных генных сегментов VL человека, способных к кодированию домена VL легкой цепи иммуноглобулина человека.

[0016] В одном из вариантов осуществления генный сегмент VL представляет собой генный сегмент Vκ1-39Jκ5 человека или генный сегмент Vκ3-20Jκ1 человека. В одном из вариантов осуществления мышь несет генный сегмент Vκ1-39Jκ5 человека и генный сегмент Vκ3-20Jκ1 человека.

[0017] В одном из вариантов осуществления генный сегмент VL человека функционально связан с лидерной последовательностью человека или мыши. В одном из вариантов осуществления лидерная последовательность представляет собой лидерную последовательность мыши. В конкретном варианте осуществления лидерная последовательность мыши представляет собой лидерную последовательность мыши Vκ3-7.

[0018] В одном из вариантов осуществления генный сегмент VL функционально связан с последовательность промотора иммуноглобулина. В одном из вариантов осуществления последовательность промотора представляет собой последовательность промотора человека. В конкретном варианте осуществления промотор иммуноглобулина человека представляет собой промотор Vκ3-15.

[0019] В одном из вариантов осуществления генетически модифицированная мышь несет локус VL, который не содержит эндогенный генный сегмент VL мыши, способный к перегруппировке с формированием гена легкой цепи иммуноглобулина, где локус VL содержит единственный генный сегмент VL человека, способный к перегруппировке с кодированием области VL гена легкой цепи. В конкретном варианте осуществления генный сегмент VL человека представляет собой генный сегмент Vκ1-39Jκ5 человека или генный сегмент Vκ3-20Jκ1 человека.

[0020] В одном из вариантов осуществления локус VL содержит лидерную последовательность, фланкированную на 5'-конце (относительно направления транскрипции генного сегмента VL) промотором иммуноглобулина человека, а на 3'-конце фланкированную генным сегментом VL человека, который перестраивается и кодирует домен VL обратной химерной легкой цепи, содержащей эндогенную константную область легкой цепи (CL) мыши. В конкретном варианте осуществления генный сегмент VL представляет собой локус VL каппа (κ) мыши, а CL мыши представляет собой CL κ мыши.

[0021] В одном из вариантов осуществления мышь несет нефункциональный локус легкой цепи иммуноглобулина лямбда (λ). В конкретном варианте осуществления локус λ содержит делецию одной или нескольких последовательностей из локуса, где одна или несколько делеций приводят локус λ в состояние неспособности к перегруппировке с формированием гена легкой цепи. В другом варианте осуществления удалены все или по существу все генные сегменты VL локуса λ.

[0022] В одном из вариантов осуществления локус VL модифицированной мыши представляет собой локус κ, а локус κ содержит интронный энхансер κ мыши, 3'-энхансер κ мыши или и интронный энхансер и 3'-энхансер.

[0023] В одном из вариантов осуществления у мыши образуется легкая цепь, содержащая соматически мутированный домен VL, образуемый из генного сегмента VL человека. В одном из вариантов осуществления легкая цепь содержит соматически мутированный домен VL, получаемый из генного сегмента VL человека, и область CL κ мыши. В одном из вариантов осуществления мышь не экспрессирует легкую цепь λ.

[0024] В одном из вариантов осуществления генетически модифицированная мышь способна к соматической гипермутации последовательности области VL человека. В конкретном варианте осуществления у мыши присутствует клетка, содержащая перегруппированный ген легкой цепи иммуноглобулина, получаемый из генного сегмента VL человека, способный к перегруппировке и к кодированию домена VL, и перегруппированный ген легкой цепи иммуноглобулина содержит соматически мутированный домен VL.

[0025] В одном из вариантов осуществления у мыши присутствует клетка, экспрессирующая легкую цепь, содержащую соматически мутированный домен VL человека, связанный с CL κ мыши, где легкая цепь ассоциирует с тяжелой цепью, содержащей соматически мутированный домен VH, получаемый из генного сегмента VH человека, и где тяжелая цепь содержит константную область тяжелой цепи мыши (CH).

[0026] В одном из вариантов осуществления у мыши присутствует замена эндогенных генных сегментов VH мыши одним или несколькими генными сегментами VH человека, где генные сегменты VH человека функционально связаны с геном области CH мыши так, что у мыши происходит перегруппировка генных сегментов VH человека и экспрессируется обратная химерная тяжелая цепь иммуноглобулина, содержащая домен VH человека и CH мыши. В одном из вариантов осуществления 90-100% неперегруппированных генных сегментов VH мыши замещены по меньшей мере одним неперегруппированным генным сегментом VH человека. В конкретном варианте осуществления все или по существу все эндогенные генные сегменты VH мыши замещены по меньшей мере одним неперегруппированным генным сегментом VH человека. В одном из вариантов осуществления замену производят по меньшей мере 19, по меньшей мере 39 или по меньшей мере 80 или 81 неперегруппированными генными сегментами VH человека. В одном из вариантов осуществления замену производят по меньшей мере 12 функциональными неперегруппированными генными сегментами VH человека, по меньшей мере 25 функциональными неперегруппированными генными сегментами VH человека или по меньшей мере 43 функциональными неперегруппированными генными сегментами VH человека. В одном из вариантов осуществления у мыши присутствует замена всех сегментов D и J мыши по меньшей мере одним неперегруппированным сегментом D человека и по меньшей мере одним неперегруппированным сегментом J человека. В одном из вариантов осуществления по меньшей мере один неперегруппированный сегмент D человека выбран из D1-7, D1-26, D3-3, D3-10, D3-16, D3-22, D5-5, D5-12, D6-6, D6-13, D7-27 и их сочетания. В одном из вариантов осуществления по меньшей мере один неперегруппированный сегмент J человека выбран из J1, J3, J4, J5, J6 и их сочетания. В конкретном варианте осуществления один или несколько генных сегментов VH человека выбраны из генных сегментов VH человека 1-2, 1-8, 1-24, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51, 6-1 и их сочетания.

[0027] В одном из вариантов осуществления у мыши присутствует B-клетка, экспрессирующая связывающий белок, специфически связывающийся с представляющим интерес антигеном, где связывающий белок содержит легкую цепь, получаемую на основе перегруппировки Vκ1-39/Jκ5 человека или перегруппировки Vκ3-20/Jκ1 человека, и где клетка содержит перегруппированный ген тяжелой цепи иммуноглобулина, получаемый на основе перегруппировки генных сегментов человека, выбранных из генных сегментов VH2-5, VH3-23, VH3-30, VH 4-39, VH4-59 и VH5-51. В одном из вариантов осуществления один или несколько генных сегментов VH человека подвергают перегруппировке с генным сегментом J тяжелой цепи человека, выбранным из J1, J3, J4, J5, и J6. В одном из вариантов осуществления один или несколько генных сегментов VH и J человека подвергают перегруппировке с генным сегментом D человека, выбранным из D1-7, D1-26, D3-3, D3-10, D3-16, D3-22, D5-5, D5-12, D6-6, D6-13 и D7-27. В конкретном варианте осуществления ген легкой цепи содержит 1, 2, 3, 4 или 5 или более соматических гипермутаций.

[0028] В одном из вариантов осуществления у мыши присутствует B-клетка, содержащая генную последовательность перегруппированной вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую генные сегменты VH, JH и DH, выбранные из VH2-5+JH1+D6-6, VH3-23+JH4+D3, VH3-23+JH4+D3-10, VH3-30+JH1+D6-6, VH3-30 +JH3+D6-6, VH3-30+JH4+D1-7, VH3-30+JH4+D5-12, VH3-30+JH4+D6-13, VH3-30+JH4+D6-6, VH3-30+JH4+D7-27, VH3-30+JH5+D3-22, VH3-30+JH5+D6-6, VH3-30+JH5+D7-27, VH4-39+JH3+D1-26, VH4-59+JH3+D3-16, VH4-59+JH3+D3-22, VH4-59+JH4+D3-16, VH5-51+JH3+D5-5, VH5-51+JH5+D6-13 и VH5-51+JH6+D3-16. В конкретном варианте осуществления B-клетка экспрессирует связывающий белок, содержащий вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина человека, слитую с константной областью тяжелой цепи мыши, и вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина человека, слитую с константной областью легкой цепи мыши,

[0029] В одном из вариантов осуществления генный сегмент VL человека представляет собой генный сегмент Vκ1-39Jκ5 человека, и мышь экспрессирует обратную химерную легкую цепь, содержащую (i) домен VL, получаемый из генного сегмента VL человека, и (ii) CL мыши; где легкая цепь ассоциирована с обратной химерной тяжелой цепью, содержащей (i) CH мыши и (ii) соматически мутированный домен VH человека, получаемый из генного сегмента VH человека, выбранного из генных сегментов VH человека 1-2, 1-8, 1-24, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51 и 6-1 и их сочетания. В одном из вариантов осуществления мышь экспрессирует легкую цепь, являющуюся соматически мутированной. В одном из вариантов осуществления CL представляет собой CL κ мыши.

[0030] В одном из вариантов осуществления генный сегмент VL человека представляет собой генный сегмент Vκ3-20Jκ1 человека, и мышь экспрессирует обратную химерную легкую цепь, содержащую (i) домен VL, получаемый из генного сегмента VL человека, и (ii) CL мыши; где легкая цепь ассоциирована с обратной химерной тяжелой цепью, содержащей (i) CH мыши и (ii) соматически мутированный VH человека, получаемый из генного сегмента VH человека, выбранного из генных сегментов VH человека 1-2, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 4-59 и 5-51 и их сочетания. В одном из вариантов осуществления мышь экспрессирует легкую цепь, являющуюся соматически мутированной. В одном из вариантов осуществления CL представляет собой CL κ мыши.

[0031] В одном из вариантов осуществления мышь несет генный сегмент Vκ1-39Jκ5 человека и генный сегмент Vκ3-20Jκ1 человека, и мышь экспрессирует обратную химерную легкую цепь, содержащую (i) домен VL, получаемый из генного сегмента Vκ1-39Jκ5 человека или генного сегмента Vκ3-20Jκ1 человека, и (ii) CL мыши; где легкая цепь ассоциирована с обратной химерной тяжелой цепью, содержащей (i) CH мыши и (ii) соматически мутированный VH человека, получаемый из генного сегмента VH человека, выбранного из генных сегментов VH человека 1-2, 1-8, 1-24, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51, 6-1 и их сочетания. В одном из вариантов осуществления мышь экспрессирует легкую цепь, являющуюся соматически мутированной. В одном из вариантов осуществления CL представляет собой CL κ мыши.

[0032] В одном из вариантов осуществления 90-100% эндогенных неперегруппированных генных сегментов VH мыши замещены по меньшей мере одним неперегруппированным генным сегментом VH человека. В конкретном варианте осуществления все или по существу все эндогенные неперегруппированные генные сегменты VH мыши замещены по меньшей мере одним неперегруппированным генным сегментом VH человека. В одном из вариантов осуществления замену производят по меньшей мере 18, по меньшей мере 39, по меньшей мере 80 или 81 неперегруппированными генными сегментами VH человека. В одном из вариантов осуществления замену производят по меньшей мере 12 функциональными неперегруппированными генными сегментами VH человека, по меньшей мере 25 функциональными неперегруппированными генными сегментами VH человека или по меньшей мере 43 неперегруппированными генными сегментами VH человека.

[0033] В одном из вариантов осуществления генетически модифицированная мышь представляет собой линию C57BL, в конкретном варианте осуществления, выбранную из C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr, C57BL/Ola. В конкретном варианте осуществления генетически модифицированная мышь представляет собой результат скрещивания указанных выше линий 129 и указанной выше линии C57BL/6. В другом конкретном варианте осуществления мышь представляет собой результат скрещивания указанных выше линий 129 или результат скрещивания указанных выше линий BL/6. В конкретном варианте осуществления линия 129 представляет собой результат скрещивания линии 129S6 (129/SvEvTac).

[0034] В одном из вариантов осуществления мышь экспрессирует обратное химерное антитело, содержащее легкую цепь, содержащую CL κ мыши и соматически мутированный домен VL человека, получаемый из генного сегмента Vκ1-39Jκ5 человека или генного сегмента Vκ3-20Jκ1 человека, и тяжелую цепь, содержащую CH мыши и соматически мутированный домен VH человека, получаемый из генного сегмента VH человека, выбранного из генных сегментов VH человека 1-2, 1-8, 1-24, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51 и 6-1, где мышь не экспрессирует полностью мышиного антитела и не экспрессирует полностью человеческого антитела. В одном из вариантов осуществления мышь несет локус легкой цепи κ, содержащий замену эндогенных генных сегментов VL κ мыши генным сегментом Vκ1-39Jκ5 человека или генным сегментом Vκ3-20Jκ1 человека, и у нее произведена замена всех или по существу всех эндогенных генных сегментов VH мыши полным или по существу полным репертуаром генных сегментов VH человека.

[0035] В одном из аспектов предоставлена клетка мыши, выделенная у мыши, как описано в настоящем документе. В одном из вариантов осуществления клетка представляет собой ES клетку. В одном из вариантов осуществления клетка представляет собой лимфоцит. В одном из вариантов осуществления лимфоцит представляет собой B-клетку. В одном из вариантов осуществления B-клетка экспрессирует химерную тяжелую цепь, содержащую вариабельный домен, получаемый из генного сегмента человека; и легкую цепь, получаемую из перегруппированного сегмента Vκ1-39/J человека, перегруппированного сегмента Vκ3-20/J человека или их сочетания; где вариабельный домен тяжелой цепи слит с константной областью мыши, и вариабельный домен легкой цепи слит с константной областью мыши или человека.

[0036] В одном из аспектов предоставлена гибридома, где гибридому получают с использованием B-клетки мыши, как описано в настоящем документе. В конкретном варианте осуществления B-клетку получают у мыши, как описано в настоящем документе, которую иммунизировали иммуногеном, содержащим представляющий интерес эпитоп, и B-клетка экспрессирует связывающий белок, который связывает представляющий интерес эпитоп, где связывающий белок содержит соматически мутированный домен VH человека и CH мыши и содержит домен VL человека, получаемый из генных сегментов Vκ1-39Jκ5 человека или Vκ3-20Jκ1 человека, и CL мыши.

[0037] В одном из аспектов предоставлен эмбрион мыши, где эмбрион содержит донорскую ES клетку, получаемую у мыши, как описано в настоящем документе.

[0038] В одном из аспектов предоставлен направленный вектор, содержащий в направлении транскрипции от 5' к 3' относительно последовательностей 5' и 3' участков гомологии вектора с последовательностями мыши, 5' участок гомологии с последовательностью мыши, промотор иммуноглобулина человека или мыши, лидерная последовательность человека или мыши и генный сегмент LCVR человека, выбранный из генных сегментов Vκ1-39Jκ5 человека или Vκ3-20Jκ1 человека, и 3' участок гомологии с последовательностью мыши. В одном из вариантов осуществления 5' и 3' участки гомологии направляют вектор к последовательности 5' относительно энхансерной последовательности, находящейся с 5'-конца и проксимально к гену константной области κ мыши. В одном из вариантов осуществления промотор представляет собой промотор генного сегмента вариабельной области иммуноглобулина человека. В конкретном варианте осуществления промотор представляет собой промотор Vκ3-15 человека. В одном из вариантов осуществления лидерная последовательность представляет собой лидерную последовательность мыши. В конкретном варианте осуществления лидерная последовательность мыши представляет собой лидерную последовательность Vκ3-7 мыши.

[0039] В одном из аспектов предоставлен направленный вектор, как описано выше, но вместо 5' участка гомологии с последовательностью мыши промотор человека или мыши на 5'-конце фланкирован участком распознавания сайт-специфической рекомбиназы (SRRS), и вместо 3' участка гомологии с последовательностью мыши генный сегмент LCVR человека на 3'-конце фланкирован SRRS.

[0040] В одном из аспектов обратное химерное антитело продуцирует мышь, как описано в настоящем документе, где обратное химерное антитело содержит легкую цепь, содержащую CL мыши и VL человека, и тяжелую цепь, содержащую VH человека и CH мыши.

[0041] В одном из аспектов предоставлен способ получения антитела, включающий экспрессию в одной клетке (a) первой генной последовательности VH иммунизированной мыши, как описано в настоящем документе, слитой с генной последовательностью CH человека; (b) генной последовательности VL иммунизированной мыши, как описано в настоящем документе, слитой с генной последовательностью CL человека; и (c) поддержание клетки в условиях, достаточных для экспрессии полностью человеческого антитела, и выделение антитела. В одном из вариантов осуществления клетка содержит вторую генную последовательность VH второй иммунизированной мыши, как описано в настоящем документе, слитую с генной последовательностью CH человека, где первая генная последовательность VH кодирует домен VH, распознающий первый эпитоп, а второй генная последовательность VH кодирует домен VH, распознающий второй эпитоп, где первый эпитоп и второй эпитоп не являются идентичными.

[0042] В одном из аспектов предоставлен способ получения эпитопсвязывающего белка, включающий воздействие на мышь, как описано в настоящем документе, иммуногеном, содержащим представляющий интерес эпитоп, содержание мыши в условиях, достаточных для мыши для получения молекулы иммуноглобулина, специфически связывающийся с представляющим интерес эпитопом, и выделение молекулы иммуноглобулина, специфически связывающейся с представляющим интерес эпитопом; где эпитопсвязывающий белок содержит тяжелую цепь, содержащую соматически мутированный VH человека и CH мыши, ассоциированную с легкой цепью, содержащей CL мыши и VL человека, получаемую из генных сегментов Vκ1-39Jκ5 человека или Vκ3-20Jκ1 человека.

[0043] В одном из аспектов предоставлена клетка, экспрессирующая эпитопсвязывающий белок, где клетка содержит: (a) нуклеотидную последовательность VL человека, кодирующую домен VL человека, получаемую из генных сегментов Vκ1-39Jκ5 человека или Vκ3-20Jκ1 человека, где нуклеотидная последовательность VL человека слита (непосредственно или через линкер) с последовательностью кДНК константного домена легкой цепи иммуноглобулина человека (например, с последовательностью ДНК константного домена κ человека); и (b) первую нуклеотидную последовательность VH человека, кодирующую домен VH человека, получаемую из первой нуклеотидной последовательности VH человека, где первая нуклеотидная последовательность VH человека слита (непосредственно или через линкер) с последовательностью кДНК константного домена тяжелой цепи иммуноглобулина человека; где эпитопсвязывающий белок распознает первый эпитоп. В одном из вариантов осуществления эпитопсвязывающий белок связывает первый эпитоп с константой диссоциации меньшей 10^-6 M, меньшей 10^-8 M, меньшей 10^-9 M, меньшей 10^-10 M, меньшей 10^-11 M или меньшей 10^-12 M.

[0044] В одном из вариантов осуществления клетка содержит вторую нуклеотидную последовательность VH человека, кодирующую второй домен VH человека, где вторая последовательность VH человека слита (непосредственно или через линкер) с последовательностью кДНК константного домена тяжелой цепи иммуноглобулина человека, и где второй домен VH человека специфически не распознает первый эпитоп (например, демонстрирует константу диссоциации например, 10^-6 M, 10^-5 M, 10^-4 M или более), и где эпитопсвязывающий белок распознает первый эпитоп и второй эпитоп, и где каждая из первой и второй тяжелых цепей иммуноглобулинов ассоциируют с идентичной легкой цепью (a).

[0045] В одном из вариантов осуществления второй домен VH связывает второй эпитоп с константой диссоциации меньшей 10^-6 M, меньшей 10^-7 M, меньшей 10^-8 M, меньшей 10^-9 M, меньшей 10^-10 M, меньшей 10^-11 M или меньшей 10^-12 M.

[0046] В одном из вариантов осуществления эпитопсвязывающий белок содержит первую тяжелую цепь иммуноглобулина и вторую тяжелую цепь иммуноглобулина, где каждая ассоциирована с идентичной легкой цепью, получаемой из генного сегмента VL человека, выбранного из генных сегментов Vκ1-39Jκ5 человека или Vκ3-20Jκ1 человека, где первая тяжелая цепь иммуноглобулина связывает первый эпитоп с константой диссоциации в диапазоне от наномолярного до пикомолярного, вторая тяжел цепь иммуноглобулина связывает второй эпитоп с константой диссоциации в диапазоне от наномолярного до пикомолярного, первый эпитоп и второй эпитоп являются неидентичными, первая тяжелая цепь иммуноглобулина не связывает второй эпитоп или связывает второй эпитоп с константой диссоциации, более слабой, чем в микромолярном диапазоне (например, в миллимолярном диапазоне), вторая тяжелая цепь иммуноглобулина не связывает первый эпитоп или связывает первый эпитоп с константой диссоциации, более слабой, чем в микромолярном диапазоне (например, в миллимолярном диапазоне) и один или несколько из VL, VH первой тяжелой цепи иммуноглобулина и VH второй тяжелой цепи иммуноглобулина являются соматически мутированными.

[0047] В одном из вариантов осуществления первая тяжелая цепь иммуноглобулина содержит связывающий белок A остаток, а во второй тяжелой цепи иммуноглобулина связывающий белок A остаток отсутствует.

[0048] В одном из вариантов осуществления клетка выбрана из CHO, COS, 293, HeLa и клетки сетчатки, экспрессирующей вирусную последовательность нуклеиновой кислоты (например, клетка PERC.6™).

[0049] В одном из аспектов предоставлено обратное химерное антитело, содержащее VH человека и константный домен тяжелой цепи мыши, VL человека и константный домен легкой цепи мыши, где антитело получают способом, включающим иммунизацию мыши, как описано в настоящем документе, иммуногеном, содержащим эпитоп, и антитело специфически связывается с эпитопом иммуногена, которым иммунизируют мышь. В одном из вариантов осуществления домен VL является соматически мутированным. В одном из вариантов осуществления домен VH является соматически мутированным. В одном из вариантов осуществления и домен VL, и домен VH являются соматически мутированными. В одном из вариантов осуществления VL связан с константным доменом κ мыши.

[0050] В одном из аспектов предоставлена мышь, несущая генные сегменты вариабельных областей тяжелых цепей человека, замещающие в эндогенном локусе мыши все или по существу все генные сегменты вариабельных областей тяжелых цепей мыши; не более чем один или два генных сегмента вариабельных областей легких цепей человека, выбранных из перегруппированного сегмента Vκ1-39/J и перегруппированного сегмента Vκ3-20/J или их сочетания, замещающих все генные сегменты вариабельных областей легких цепей мыши; где генные сегменты вариабельных областей тяжелых цепей человека связаны с геном константной области мыши, и генный сегмент(ы) вариабельной области легкой цепи человека связан с геном константной области человека или мыши.

[0051] В одном из аспектов ES клетка мыши, содержащая замену всех или по существу всех генных сегментов вариабельных областей тяжелых цепей мыши генными сегментами вариабельных областей тяжелых цепей человека, и не более чем один или два перегруппированных сегментов V/J легких цепей человека, где генные сегменты вариабельных областей тяжелых цепей человека связаны с геном константной области тяжелой цепи иммуноглобулина мыши, и сегменты V/J легких цепей человека связаны с геном константной области легкой цепи иммуноглобулина мыши или человека. В конкретном варианте осуществления ген константной области легкой цепи представляет собой ген константной области мыши.

[0052] В одном из аспектов предоставлен антигенсвязывающий белок, продуцируемый мышью, как описано в настоящем документе. В конкретном варианте осуществления антигенсвязывающий белок содержит вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина человека, слитую с константной областью мыши, и вариабельная область легкой цепи иммуноглобулина человека, получаемая из генного сегмента Vκ1-39 или генного сегмента Vκ3-20, где константная область легкой цепи представляет собой константную область мыши.

[0053] В одном из аспектов предоставлен полностью человеческий антигенсвязывающий белок, полученный из генной последовательности вариабельной области иммуноглобулина из мыши, как описано в настоящем документе, где антигенсвязывающий белок содержит полностью человеческую тяжелую цепь, содержащую вариабельную область человека, получаемую из последовательности мыши, как описано в настоящем документе, и полностью человеческую легкую цепь, содержащую вариабельную область Vκ1-39 или a Vκ3-20. В одном из вариантов осуществления вариабельная область легкой цепи содержит от одной до пяти соматических мутаций. В одном из вариантов осуществления вариабельная область легкой цепи представляет собой родственную вариабельную область легкой цепи, которая в B-клетке мыши спарена с вариабельной областью тяжелой цепи.

[0054] В одном из вариантов осуществления полностью человеческий антигенсвязывающий белок содержит первую тяжелую цепь и вторую тяжелую цепь, где первая тяжелая цепь и вторая тяжелая цепь независимо содержат неидентичные вариабельные области, получаемые у мыши, как описано в настоящем документе, и где каждая из первой и второй тяжелых цепей экспрессируется из клетки-хозяина в ассоциации с легкой цепью человека, получаемой из генного сегмента Vκ1-39 или генного сегмента Vκ3-20. В одном из вариантов осуществления первая тяжелая цепь содержит первую вариабельную область тяжелой цепи, специфически связывающуюся с первым эпитопом первого антигена, а вторая тяжелая цепь содержит вторую вариабельную область тяжелой цепи, специфически связывающуюся со вторым эпитопом второго антигена. В конкретном варианте осуществления первый антиген и второй антиген являются различными. В конкретном варианте осуществления первый антиген и второй антиген являются одинаковыми, а первый эпитоп и второй эпитоп не являются идентичными; в конкретном варианте осуществления связывание первого эпитопа первой молекулой связывающего белка не блокирует связывание второго эпитопа второй молекулой связывающего белка.

[0055] В одном из аспектов полностью человеческий связывающий белок, получаемый из последовательности иммуноглобулина человека у мыши, как описано в настоящем документе, содержит первую тяжелую цепь иммуноглобулина и вторую тяжелую цепь иммуноглобулина, где первая тяжелая цепь иммуноглобулина содержит первую вариабельную область, которая не идентична с вариабельной областью второй тяжелой цепи иммуноглобулина, и где первая тяжелая цепь иммуноглобулина содержит связывающую детерминанту белка A дикого типа, а во второй тяжелой цепи связывающая детерминанта белка A дикого типа отсутствует. В одном из вариантов осуществления первая тяжелая цепь иммуноглобулина в условиях выделения связывается с белком A, а вторая тяжел цепь иммуноглобулина в условиях выделения не связывается с белком A или связывается с белком A по меньшей мере в 10 раз, сто раз или тысячу раз слабее, чем с белком A связывается первая тяжелая цепь иммуноглобулина. В конкретном варианте осуществления первая и вторая тяжелые цепи представляют собой изотипы IgG1, где вторая тяжелая цепь содержит модификацию, выбранную из 95R (EU 435R), 96F (EU 436F) и их сочетания, и где у первой тяжелой цепи такая модификация отсутствует.

[0056] В одном из аспектов предоставлен способ получения биспецифического антигенсвязывающего белка, включающий воздействие на первую мышь, как описано в настоящем документе, первым представляющим интерес антигеном, содержащим первый эпитоп, воздействие на вторую мышь, как описано в настоящем документе, вторым представляющим интерес антигеном, содержащим второй эпитоп, обеспечение развития у каждой из первой и второй мышей иммунного ответа на представляющие интерес антигены, идентификацию у первой мыши первой вариабельной области тяжелой цепи человека, связывающей первый эпитоп первого представляющего интерес антигена, идентификацию у второй мыши второй вариабельной области тяжелой цепи человека, связывающей второй эпитоп второго представляющего интерес антигена, получение первого гена полностью человеческой тяжелой цепи, кодирующей первую тяжелую цепь, связывающую первый эпитоп первого представляющего интерес антигена, получение второго гена полностью человеческой тяжелой цепи, кодирующего вторую тяжелую цепь, связывающую второй эпитоп второго представляющего интерес антигена, экспрессию первой тяжелой цепи и второй тяжелой цепи в клетке, экспрессирующей единственную полностью человеческую легкую цепь, получаемую из генных сегментов Vκ1-39 человека или Vκ3-20 человека с формированием биспецифического антигенсвяз