2571207 - Гуманизированные антитела к cdcp1

Гуманизированные антитела к cdcp1

Иллюстрации

Показать все

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и раскрывает группу гуманизированных рекомбинантных антител, специфически связывающихся с человеческим CDCP1. Настоящее изобретение также раскрывает нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, экспрессионный вектор, содержащий указанную нуклеиновую кислоту и прокариотическую или эукариотическую клетку-хозяин, предназначенную для получения указанных антител. Предусмотрен способ получения указанных антител с применением указанной клетки-хозяина. Использованием в качестве активного указанного антитела получают фармацевтическую композицию для лечения рака, характеризующегося сверхэкспрессией CDCP1. Настоящее изобретение позволяет получить гуманизированные антитела с улучшенными CDCP1 связывающими свойствами. 10 н. и 10 з.п. ф-лы, 5 ил., 4 табл., 6 пр.

Реферат

Настоящее изобретение относится к гуманизированным антителам к человеческому CDCP1 (антитело к CDCP1), способам их получения, фармацевтическим композициям, содержащим указанные антитела, и к вариантам их применения.

Предпосылки создания изобретения

Человеческий CDCP1 ((содержащий CUB-домен белок 1, В345, CD318, SIMA135, TRASK; SEQ ID NO: 29 и варианты с мутацией R525Q (т.е. замена аргинина (R) на глутамин (Q) в положении 525 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 29) и/или с мутацией G709D (т.е. замена глицина (G) на аспарагиновую кислоту (D) в положении 709 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 29)) представляет собой трансмембранный белок, содержащий три внеклеточных CUB-домена. Обнаружена сверхэкспрессия этого белка при раке молочной железы, ободочной кишки и легкого. Уровни его экспрессии коррелируют с метастатической способностью клеток карцином (Uekita Т. и др.. Am. J. Pathol. 172, 2008, сс. 1729-1739). Установлено, что в линии раковых клеток он несет фосфорилированный тирозин (WO 2002/004508; Scherl-Mostageer М. и др., Oncogene 20, 2001, сс. 4402-4408; Hooper J. D. и др., Oncogene 22, 2003, сс. 1783-1794; Perry S.E. и др., FEBS Lett. 581, 2007, со. 1137-1142; Brown Т.А. и др., J. Biol. Chem. 279, 2004, сс. 14772-14783; Ota Т. и др., Nat. Genet. 36, 2004, сс. 40-45). Описаны образованные в результате альтернативного сплайсинга варианты транскриптов, кодирующие различные изоформы.

CDCP1 описан в WO 2002/004508 в качестве ассоциированного с опухолями антигена В345.

CDCP1 описан в WO 2004/074481 в качестве гликопротеинового антигена SIMA135, который экспрессируется в метастатических опухолевых клетках. CDCP1 описан в WO 2005/042102 в качестве белка, ассоциированного с раком яичника. В WO 2007/005502 описаны методы и композиции, предназначенные для лечения заболеваний, которые обеспечивают направленное воздействие на CDCP1.

В US 2004/0053343 (и у Conze Т. и др., Ann. N. Y. Acad. Sci. 996, 2003, сс. 222-226 и Buehring H.J. и др., Stem Cells 22, 2004, сс. 334-343) описаны антитела к CDCP1, предназначенные для идентификации определенных популяций стволовых клеток.

Краткое изложение сущности изобретения

Одним из объектов настоящего изобретения является антитело, специфически связывающееся с человеческим CDCP1, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи (VL), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 2, антитела CUB4 (депонировано под номером DSM ACC2551),

отличающееся тем, что оно а) является гуманизированным и б) содержит в VH-последовательности:

лизин (К) в положении 57 вместо треонина (Т) и валин (V) в положении 60 вместо пролина (Р) (нумерация всех положений дана по Кэботу).

Другим объектом настоящего изобретения является антитело, специфически связывающееся с человеческим CDCP1, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи (VL), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 2, антитела CUB4 (депонировано под номером DSM ACC2551),

отличающееся тем, что оно а) является гуманизированным и б) содержит в VL последовательности:

лейцин (L) в положении 33 вместо валина (V) и триптофан (W) в положении 47 (нумерация всех положений дана по Кэботу).

отличающееся тем, что оно а) является гуманизированным и б) содержит в VH-последовательности:

лизин (К) в положении 57 вместо треонина (Т) и валин (V) в положении 60 вместо пролина (Р);

и содержит в VL-последовательности:

лейцин (L) в положении 33 вместо валина (V) и триптофан (W) в положении 47 (нумерация всех положений дана по Кэботу).

Предпочтительно гуманизированное антитело, предлагаемое в изобретении, отличается тем, что вариабельная область тяжелой цепи (VH) имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3.

Предпочтительно гуманизированное антитело, предлагаемое в изобретении, отличается тем, что вариабельная область легкой цепи (VL) имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 18.

Предпочтительно гуманизированное антитело, предлагаемое в изобретении, отличается тем, что

вариабельная область тяжелой цепи (VH) имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3,

вариабельная область легкой цепи (VL) имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 или SEQ ID NO: 24.

Предпочтительно гуманизированное антитело, предлагаемое в изобретении, отличается тем, что

вариабельная область тяжелой цепи (VH) имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3,

вариабельная область легкой цепи (VL) имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 18.

Предпочтительно гуманизированное антитело, предлагаемое в изобретении, отличается тем, что относится к человеческим антителам IgGI-подкласса.

Предпочтительно гуманизированное антитело, предлагаемое в изобретении, отличается тем, что антитело является гликозилированным с помощью сахарной цепи на Asn297, при этом на долю фукозы в указанной сахарной цепи приходится 65% или менее.

Следующим вариантом осуществления изобретения является фармацевтическая композиция, которая содержит гуманизированное антитело, предлагаемое в изобретении.

Другим вариантом осуществления изобретения является фармацевтическая композиция, которая содержит гуманизированное антитело, предлагаемое в изобретении, предназначенная для лечения рака.

Изобретение относится также к гуманизированному антителу, предлагаемому в изобретении, которое предназначено для лечения рака.

Изобретение относится также к применению гуманизированного антитела, предлагаемого в изобретении, для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения рака.

Изобретение относится также к нуклеиновой кислоте, которая кодирует гуманизированное антитело, предлагаемое в изобретении. Изобретение относится также к экспрессионным векторам, которые содержат нуклеиновую кислоту, предлагаемую в изобретении, которые обладают способностью экспрессировать указанную нуклеиновую кислоту в прокариотической или эукариотической клетке-хозяине, и к клеткам-хозяевам, которые содержат указанные векторы, предназначенные для рекомбинантного производства антитела, предлагаемого в изобретении.

Изобретение относится также к прокариотической или эукариотической клетке-хозяину, которая содержит вектор, предлагаемый в изобретении.

Изобретение относится также к способу получения рекомбинантного гуманизированного антитела, предлагаемого в изобретении, отличающемуся тем, что экспрессируют нуклеиновую кислоту, предлагаемую в изобретении, в прокариотической или эукариотической клетке-хозяине и выделяют антитело из клетки или супернатанта клеточной культуры. Изобретение относится также к антителу, полученному с помощью указанного способа рекомбинации.

Изобретение относится также к способу лечения пациента, страдающего раком, заключающемуся в том, что вводят пациенту, у которого диагностировано наличие указанного заболевания (и который поэтому нуждается в такой терапии) в эффективном количестве антитело, предлагаемое в изобретении. Антитело вводят предпочтительно в составе фармацевтической композиции.

При создании изобретения неожиданно было установлено, что конкретные гуманизированные версии антитела к CDCP1 CUB4, предлагаемые в изобретении, отличаются улучшенными CDCP1-связывающими свойствами по сравнению с другими гуманизированными версиями, полученными в результате гуманизации, которые известны из существующего уровня техники. Это обусловлено конкретными аминокислотными заменами в CDRH2 и/или в CDRL1 и в каркасном участке легкой цепи. При создании изобретения неожиданно было установлено, что гуманизированные версии антитела к CDCP1 CUB4, предлагаемые в изобретении, отличаются повышенной способностью ингибировать рост опухолей in vivo по сравнению с химерными или мышиными антителами CUB4.

Подробное описание изобретения

Антитело CUB4 представляет собой антитело, депонированное под №DSM АСС2551 (DSMZ), описанное в DE 10242146 (ЕР 1396501, US 7541030), вариабельная область тяжелой цепи (VH) которого имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, вариабельная область легкой цепи (VL) которого имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2. Антитело CUB4 специфически связывается с человеческим CDCP1 (депонирование под номером DSM ACC2551 (DSMZ) осуществлено. Университетом Эберхарда-Карла г.Тюбингена, Университетской клиникой г.Тюбингена (Eberhard-Karls-University Tubingen, UniversitatskUnikum Tubingen, Geissweg 3 72076, Тюбинген)).

Понятие «является гуманизированным» в контексте настоящего описания означает антитело на основе мышиного антитела CUB4, в котором VH имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, и VL имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, в котором (после химеризации с использованием человеческой константной области) указанные VH и VL гуманизируют путем трансплантации мышиных CDR в каркасный участок человеческого антитела (см., например, Riechmann L., и др. Nature 332, 1988, сс. 323-327; nNeubergerM. S. и др.. Nature 314, 1985, сс. 268-270; Queen С.и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1989, сс. 10029-10033; US 5530101; US 5585089; US 5693761; WO 90/07861; и US 5225539). Каркасные участки вариабельных областей тяжелой и легкой цепей можно выводить из последовательностей одного и того же человеческого антитела или из различных человеческих антител. Последовательности человеческих антител могут представлять собой последовательности, которые встречаются в естественных условиях в человеческих антителах. Человеческие каркасные участки вариабельных областей тяжелой и легкой цепей перечислены, например, у Lefranc M.P., Current Protocols in Immunology, приложение IP A.I P.I-A. IP.37, 2000, и их можно получать через IMGT, международную информационную систему ImMunoGeneTics® (http://imgt.cines.fr) или на сайте http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk.

Гуманизированные антитела, предлагаемые в изобретении, имеют также

а) конкретные мутации в CDRH2 VH (мутации Т57К. и P60V) и/или

б) конкретные мутации в CDRL1 VL (мутация V33L) и в каркасном участке VL (обратная мутация, приводящая к замене в положении 47 человеческой аминокислоты в каркасном участке VL на мышиную аминокислоту W).

При создании изобретения неожиданно было установлено, что указанные мутации в гуманизированных антителах CUB4 приводят к улучшенным способностям к связыванию (по сравнению с гуманизированными антителами CUB4 без указанных модификаций). Кроме того, такие модификации в CDR и/или каркасном участке приводят к получению гуманизированных антител, предлагаемых в изобретении, обладающих повышенной способностью ингибировать рост опухолей in vivo (по сравнению с химерными и мышиными родительскими антителами).

отличающееся тем, что оно является гуманизированным и содержит в VH-последовательности: лизин (К) в положении 57 вместо треонина (Т) (в CDRH2) и валин (V) в положении 60 вместо пролина (Р) (в CDRH2) (нумерация всех положений дана по Кэботу). Это означает, что SEQ ID NO: 1 несет мутации Т57К и P60V в CDRH2 VH.

Другим объектом настоящего изобретения является антитело, специфически связывающееся с человеческим CDCP1, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 1 и вариабельную область легкой цепи (VL), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 2, антитела CUB4 (депонировано под номером DSM ACC2551),

отличающееся тем, что оно является гуманизированным и содержит в VL-последовательности:

лейцин (L) в положении 33 вместо валина (V) (в CDRL1) и триптофан (W) в положении 47 (вместо аминокислоты из человеческого каркасного участка VL) (нумерация всех положений дана по Кэботу). Это означает, что SEQ ID NO: 2 несет мутацию V33L в CDRL1 и обратную мутацию, приводящую к замене человеческой аминокислоты на мышиную аминокислоту W в положении 47 в каркасном участке VL.

Другим объектом настоящего изобретения является антитело, специфически связывающееся с человеческим CDCP1, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 1 и вариабельную область легкой цепи (VL), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 2, антитела CUB4 (депонировано под номером DSM ACC2551),

отличающееся тем, что оно является гуманизированным и содержит в VH-последовательности:

лизин (К) в положении 57 вместо треонина (Т) (в CDRH2) и валин (V) в положении 60 вместо пролина (Р) (в CDRH2);

и содержит в VL-последовательности:

лейцин (L) в положении 33 вместо валина (V) (в CDRL1) и триптофан (W) в положении 47 (нумерация всех положений дана по Кэботу). Это означает, что SEQ ID NO: 1 несет мутации Т57К и P60V в CDRH2 VH и SEQ ID NO: 2 несет мутацию V33L в CDRL1 и обратную мутацию, приводящую к замене человеческой аминокислоты на мышиную аминокислоту W в положении 47 в каркасном участке VL.

отличающееся тем, что оно является гуманизированным и содержит в VL-последовательности:

лейцин (L) в положении 33 вместо валина (V) (в CDRL1) и триптофан (W) в положении 47 (вместо аминокислоты из человеческого каркасного участка VL);

и отличающееся также тем, что (дополнительно) содержит в VL-последовательности:

метионин (М) в положении 21 (вместо аминокислоты из человеческого каркасного участка VL) (нумерация всех положений дана по Кэботу).

Другим объектом настоящего изобретения является антитело, специфически связывающееся с человеческим CDCP1, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 1 и вариабельную область легкой цепи (VL), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 2, антитела CUB4 (депонировано под номером DSM ACC2551),

отличающееся тем, что оно является гуманизированным и содержит в VH-последовательности:

лизин (К) в положении 57 вместо треонина (Т) (в CDRH2) и валин (V) в положении 60 вместо пролина (Р) (в CDRH2);

и содержит в VL-последовательности:

и отличающееся также тем, что (дополнительно) содержит в VL-последовательности:

Другим объектом настоящего изобретения является антитело, специфически связывающееся с человеческим CDCP1, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 1 и вариабельную область легкой цепи (VL), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 2, антитела CUB4 (депонировано под номером DSM ACC2551),

отличающееся тем, что оно является гуманизированным и содержит в VL-последовательности:

и отличающееся также тем, что (дополнительно) содержит в VL-последовательности:

метионин (М) в положении 21 (вместо аминокислоты из человеческого каркасного участка VL); глицин (G) или аргинин (R) в положении 24 вместо серина (S) (в CDRL1) и аланин (А) в положении 25 вместо валина (V) (в CDRL1) (нумерация всех положений дана по Кэботу).

отличающееся тем, что оно является гуманизированным и содержит в VH-последовательности:

лизин (К) в положении 57 вместо треонина (Т) (в CDRH2) и валин (V) в положении 60 вместо пролина (Р) (в CDRH2);

и содержит в VL-последовательности:

и отличающееся также тем, что (дополнительно) содержит в VL-последовательности:

метионин (М) в положении 21 (вместо аминокислоты из человеческого каркасного участка VL), глицин (G) или аргинин (R) в положении 24 вместо серина (S) (в CDRL1) и аланин (А) в положении 25 вместо валина (V) (в CDRH) (нумерация всех положений дана по Кэботу).

отличающееся тем, что оно является гуманизированным и содержит в VL-последовательности:

и отличающееся также тем, что (дополнительно) содержит в VL-последовательности:

аргинин (R) в положении 24 вместо серина (S) (в CDRL1) и аланин (А) в положении 25 вместо валина (V) (в CDRL1) (нумерация всех положений дана по Кэботу).

Другим объектом настоящего изобретения является антитело, специфически связывающееся с человеческим CDCP1, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 1 и вариабельную область легкой цепи (VL), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 2, антитела CUB4 (депонировано под номером DSM ACC2551),

отличающееся тем, что оно является гуманизированным и содержит в VH-последовательности:

лизин (К) в положении 57 вместо треонина (Т) (в CDRH2) и валин (V) в положении 60 вместо пролина (Р) (в CDRH2);

и содержит в VL-последовательности:

и отличающееся также тем, что (дополнительно) содержит в VL-последовательности:

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения гуманизированное антитело, предлагаемое в изобретении, отличается тем, что вариабельная область тяжелой цепи (VH) имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3.

Согласно другому варианту осуществления изобретения гуманизированное антитело, предлагаемое в изобретении, отличается тем, что

вариабельная область тяжелой цепи (VH) имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, и

вариабельная область легкой цепи (VL) имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14.

вариабельная область тяжелой цепи (VH) имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, и

вариабельная область легкой цепи (VL) имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15.

вариабельная область тяжелой цепи (VH) имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, и

вариабельная область легкой цепи (VL) имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 16.

вариабельная область тяжелой цепи (VH) имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, и

вариабельная область легкой цепи (VL) имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 17.

вариабельная область тяжелой цепи (VH) имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, и

вариабельная область легкой цепи (VL) имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 18.

вариабельная область тяжелой цепи (VH) имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, и

вариабельная область легкой цепи (VL) имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 23.

Согласно следующему варианту осуществления изобретения гуманизированное антитело, предлагаемое в изобретении, отличается тем, что относится к человеческим антителам IgGI-подкласса.

Согласно другому варианту осуществления изобретения гуманизированное антитело, предлагаемое в изобретении, отличается тем, что антитело является гликозилированным с помощью сахарной цепи на Asn297, при этом на долю фукозы в указанной сахарной цепи приходится 65% или менсс.

Согласно предпочтительным вариантам осуществления изобретения гуманизированное антитело, предлагаемое в изобретении, отличается наличием одной из следующих комбинаций гуманизированной вариабельной области тяжелой цепи VH и гуманизированной вариабельной области легкой цепи VL, которые представлены в таблице 1 (см. приведенные ниже номера примеров антител.).

Таблица 1:
Предпочтительные комбинации гуманизированной вариабельной области тяжелой цепи VH и гуманизированной вариабельной области легкой цепи VL
Гуманизированное антитело CUB4, пример антитела №	VL (SEQ ID NO:)	VL (SEQ ID NO:)
80	hHC4-H (SEQ ID NO: 3)	hLC-M (SEQ ID NO: 14)
69	hHC4-H (SEQ ID NO: 3)	hLC-L2 (SEQ ID NO: 15)
47	hHC4.H (SEQ ID NO: 3)	hLC-K (SEQ ID NO: 16)
58	hHC4.H(SEQ ID NO: 3)	hLC-L (SEQ ID NO: 17)
36	hHC4-H (SEQ ID NO: 3)	hLC.J (SEQ ID NO: 18)
102	hHC4.H (SEQ ID NO: 3)	hLC-b (SEQ ID NO: 19)
113	hHC4-H (SEQ ID NO: 3)	hLC-c (SEQ ID NO: 20)
91	hHC4.H (SEQ ID NO: 3)	hLC-a (SEQIDNO:21)
124	hHC4-H (SEQ ID NO: 3)	hLC-d (SEQ ID NO: 22)
135	hHC4-H (SEQ ID NO: 3)	hLC-e (SEQ ID NO: 23)
146	hHC4-H (SEQ ID NO: 3)	hLC-f (SEQIDNO:24)

Таким образом, одним из вариантов осуществления изобретения является антитело, специфически связывающееся с человеческим CDCP1, которое отличается тем, что содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 3.

Одним из вариантов осуществления изобретения является антитело, специфически связывающееся с человеческим CDCP1, которое отличается тем, что содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 3,

вариабельную область легкой цепи (VL), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 или SEQ ID NO: 24.

Одним из вариантов осуществления изобретения является антитело, специфически связывающееся с человеческим CDCP1, которое отличается тем, что содержит

вариабельную область тяжелой цепи (VH), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 3,

вариабельную область легкой цепи (VL), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 14.

вариабельную область тяжелой цепи (VH), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 3,

вариабельную область легкой цепи (VL), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 15.

вариабельную область тяжелой цепи (VH), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 3,

вариабельную область легкой цепи (VL), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 16.

вариабельную область тяжелой цепи (VH), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 3,

вариабельную область легкой цепи (VL), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 17.

вариабельную область тяжелой цепи (VH), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 3,

вариабельную область легкой цепи (VL), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 18.

вариабельную область тяжелой цепи (VH), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 3,

вариабельную область легкой цепи (VL), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 19.

вариабельную область тяжелой цепи (VH), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 3,

вариабельную область легкой цепи (VL), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 20.

вариабельную область тяжелой цепи (VH), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 3,

вариабельную область легкой цепи (VL), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 21.

вариабельную область тяжелой цепи (VH), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 3,

вариабельную область легкой цепи (VL), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 22.

вариабельную область тяжелой цепи (VH), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 3,

вариабельную область легкой цепи (VL), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 23.

вариабельную область тяжелой цепи (VH), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 3,

вариабельную область легкой цепи (VL), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 24.

Согласно другим предпочтительным вариантам осуществления изобретения гуманизированное антитело, предлагаемое в изобретении, отличается наличием одной из следующих комбинаций гуманизированной вариабельной области тяжелой цепи VH и гуманизированной вариабельной области легкой цепи VL, которые представлены в таблице 2. Указанные комбинации содержат человеческие последовательности, представленные в таблице 2 в примерах под соответствующими номерами.

Таблица 2:
Дополнительные предпочтительные комбинации гуманизированной вариабельной области тяжелой цепи VH и гуманизированной вариабельной области легкой цепи VL
Гуманизированное антитело CUB4, пример №	VL(SEQIDNO:)	VL (SEQ ID NO:)
80	hHC4-H (SEQIDNO: 3)	hLC-M (SEQ ID NO: 14)
69	hHC4-H (SEQ ID NO: 3)	hLC-L2 (SEQ ID NO: 15)
47	hHC4-H (SEQ ID NO: 3)	hLC-K (SEQ ID NO: 16)
58	hHC4-H (SEQ ID NO: 3)	hLC-L (SEQ ID NO: 17)
36	hHC4-H (SEQ ID NO: 3)	hLC-J (SEQ ID NO: 18)

Таким образом, одним из вариантов осуществления изобретения является антитело, специфически связывающееся с человеческим CDCP1, которое отличается тем, что содержит

вариабельную область тяжелой цепи (VH), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 3.

Одним из вариантов осуществления изобретения является антитело, специфически связывающееся с человеческим CDCP1, которое отличается тем, что содержит вариабельную область легкой цепи (VL), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 18.

вариабельную область тяжелой цепи (VH), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 3,

вариабельную область легкой цепи (VL), последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 18.

Понятие «нумерация по Кэботу» или «нумерация согласно Кэботу» или «EU-нумерация», если не указано иное, относится к нумерации остатков, например, в IgG, с помощью EU-нумерации, предложенной Kabat и др. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991).

Понятия «моноклональное антитело» или «композиция моноклонального антитела» в контексте настоящего описания относятся к препарату, содержащему молекулы антитела, которые имеют одинаковый аминокислотный состав.

Понятие «химерное антитело» относится к моноклональному антителу, содержащему вариабельную область, т.е. связывающую область, из мышиного антитела и по меньшей мере часть константной области, выведенную из другого источника или видов, которое, как правило, получают методами рекомбинантной ДНК. Наиболее предпочтительными являются химерные антитела, содержащие мышиную вариабельную область и человеческую константную область. Такие мышиные/человеческие химерные антитела являются продуктом экспрессируемых генов иммуноглобулина, содержащих сегменты ДНК, которые кодируют мышиные вариабельные области иммуноглобулина, и сегменты ДНК, которые кодируют человеческие константные области иммуноглобулина. Другими формами «химерных антител», подпадающими под объем настоящего изобретения, являются антитела, в которых класс или подкласс модифицирован или изменен по сравнению с исходным антителом. Такие «химерные» антитела называют также «антителами переключенного класса». Методы получения химерных антител основаны на общепринятых методиках рекомбинантной ДНК и методиках генной трансфекции, и в настоящее время являются хорошо известными в данной области (см., например, Morrison S.L. и др., Ргос.Natl. Acad Sci. USA 81, 1984, сс. 6851-6855; US 5202238 и US 5204244).

Человеческий CDCP1 ((содержащий CUB-домен белок 1, В345, CD318, SIMA135, TRASK; SEQ ID NO: 29 и варианты с мутацией R525Q (т.е. замена аргинина (R) на глутамин (Q) в положении 525 аминокислотной последовательности SEQ ID N0:29) и/или с мутацией G709D (т.е. замена глицина (G) на аспарагиновую кислоту (D) в положении 709 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 29)) представляет собой трансмембранный белок, содержащий три внеклеточных CUB-домена. Обнаружена сверхэкспрессия этого белка при раке молочной железы, ободочной кишки и легкого. Уровни его экспрессии коррелируют с метастатической способностью клеток карцином (Uekita Т. и др.. Am. J. Pathol. 172, 2008, сс. 1729-1739). Установлено, что в линии раковых клеток он несет фосфорилированный тирозин (WO 2002/004508; Scherl-Mostageer М. и др., Oncogene 20, 2001, сс. 4402-4408; Hooper J. D. и др., Oncogene 22, 2003, сс. 1783-1794; Perry S.E. и др FEBS Lett. 581, 2007, сс. 1137-1142; Brown T.A. и др., J. Biol. Chem. 279, 2004, сс. 14772-14783; Ota Т. и др., Nat. Genet. 36, 2004, сс. 40-45). Описаны образовавшиеся в результате альтернативного сплайсинга варианты транскриптов, кодирующие различные изоформы.

В контексте настоящего описания понятие «специфически связывающееся с человеческим CDCP1» относится к антителу, которое специфически связывается с человеческим антигеном CDCP1. Аффинность связывания характеризуется значением KD, составляющим 1,0 х 10 молей/л или ниже (например, от 1,0×10^-8 до 1,0×10^-8 молей/л), предпочтительно значение KD составляет 5,0×10^-9молей/л или ниже (например, от 5,0×10^-9 до 1,0×10^-13 молей/л). Аффинность связывания определяют стандартным анализом, таким как метод поверхностного плазмонного резонанса (Biacore®).

Понятие «эпитоп» относится к белковой детерминанте человеческого CDCP1, которая обладает способностью специфически связываться с антителом.

Эпитопы, как правило, состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как аминокислоты или сахарные боковые цепи, и, как правило, эпитопы обладают специфическими характеристиками трехмерной структуры, а также специфическими характеристиками заряда. Конформационные и неконформационнные эпитопы отличаются тем, что связывание с первыми, в отличие от последних, элиминируется в присутствии денатурирующих растворителей.

Понятия «вариабельная область» (вариабельная область легкой цепи (VL), вариабельная область тяжелой цепи (VH)) в контексте настоящего описания обозначают области каждой из пар легких и тяжелых цепей, которые принимают непосредственное участие в связывании антитела с антигеном. Вариабельные области легкой и тяжелой цепей имеют одинаковую общую структуру, и каждая область содержит четыре каркасных участка (FR), последовательности которых в значительной степени являются консервативными, соединенные тремя «гипервариабельными участками» (или определяющими комплементарность участками, CDR). Каркасные участки адаптированы к Р-складчатой конформации, и CDR могут образовывать петли, соединяющие Р-складчатую структуру. CDR в каждой цепи поддерживают свою трехмерную структуру с помощью каркасных участков и образуют вместе с CDR из другой цепи антигенсвязывающий центр. CDR3-участки тяжелой и легкой цепей антитела играют наиболее важную роль в специфичности/аффинности связывания антител, предлагаемых в изобретении, и поэтому они представляют собой еще один объект изобретения.

«Каркасные участки» или «РР»-участки представляют собой участки вариабельных областей, отличные от остатков гипервариабельных участков, как они определены в настоящем описании. Таким образом, легкая и тяжелая цепи антитела содержат в направлении от N- к С-концу следующие участки: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. CDR- и FR-участки определяют согласно стандартной номенклатуре, предложенной Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-е изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD., 1991) и/или как участки из «гипервариабельной петли».

В контексте настоящего описания понятие «антигенсвязывающий центр антитела» обозначает аминокислотные остатки антитела, ответственные за связывание антигена. Антигенсвязывающий центр антитела содержит аминокислоты из гипервариабельных участков или «CDR». «Антигенсвязывающий центр» антитела, предлагаемого в изобретении, содержит шесть гипервариабельных участков (CDR), которые вносят различный вклад в аффинность сайта связывания с антигеном. В вариабельной области тяжелой цепи присутствуют три CDR (CDRH1, CDRH2 и CDRH3) и в вариабельной области легкой цепи присутствуют три CDR (CDRL1, CDRL2 и CD

Гуманизированные антитела к cdcp1

Патент 2571207