Средства и способы получения высокоочищенного нейротоксина

Средства и способы получения высокоочищенного нейротоксина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к антителу, которое специфически связывается с непроцессированным и/или частично процессированным полипептидом нейротоксином, или антителу, которое специфически связывается с эпитопом, состоящим из пептида, имеющего аминокислотную последовательность, как показано на любой из SEQ ID NO:1-16. Более того, настоящее изобретение относится к способу получения полипептида нейротоксина, содержащему стадии контакта раствора, содержащего смесь протеолитически процессированных, частично процессированных и/или непроцессированных полипептидов нейротоксинов, с агентом, который специфически связывается с непроцессированными или частично процессированными полипептидами нейротоксинами, но не с процессированными полипептидами нейротоксинами, в условиях, которые допускают связывание указанного агента с непроцессированными или частично процессированными полипептидами нейротоксинами, посредством чего формируется комплекс антиген-агент, и удаления образовавшегося комплекса антиген-агент, посредством чего получается раствор, содержащий процессированный полипептид нейротоксин, свободный от непроцессированного или частично процессированного полипептида нейротоксина. Настоящее изобретение также относится к применению вышеуказанного антитела для отделения протеолитически процессированных полипептидов нейротоксинов от непроцессированных или частично процессированных полипептидов нейротоксинов. Настоящее изобретение относится к способу получения лекарственного средства, содержащему стадии вышеуказанного способа и следующую стадию формирования протеолитически процессированных полипептидов нейротоксинов в качестве лекарственного средства. Кроме того, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей протеолитически процессированный полипептид нейротоксин, получаемый вышеуказанным способом.

Clostridium botulinum и Clostridium tetani продуцируют высокоактивные ней-ротоксины, то есть ботулинический токсин (BoNTs) и столбнячный токсин (TeNT), соответственно. Эти клостридиальные нейротоксины (CNTs) специфически связываются с нервными клетками и нарушают выделение нейротрансмиттеров. Каждый токсин синтезируется в виде неактивного непроцессированного одноцепочечного белка, массой около 150 кДа. Посттрансляционная обработка включает образование дисульфидных мостиков и ограниченный протеолиз (одноцепочечный разрыв) посредством бактериальной протеазы (протеаз). Активный двухцепочечный нейротоксин состоит из двух цепей, N-терминальной легкой цепи, массой около 50 кДа, и тяжелой цепи, массой около 100 кДа, связанных дисульфидным мостиком. CNTs структурально состоят из трех доменов, то есть каталитической легкой цепи, тяжелой цепи, охватывающей транслокационный домен (N-терминальную половину), и связывающего рецептор домена (С-терминальная половина), смотрите Krieglstein 1990, Eur J Biochem 188, 39; Krieglstein 1991, Eur J Biochem 202, 41; Krieglstein 1994, J Protein Chem 13, 49.

Clostridium botulinum секретирует семь антигенно различных серотипов, обозначенных А-G, ботулинического нейротоксина (BoNT). Все серотипы вместе с родственным столбнячным нейротоксином (TeNT), секретируемым Clostridium tetani, представляют собой Zn²⁺-эндопротеазы, которые блокируют синаптический экзоцитоз, путем расщепления SNARE белков. CNTs вызывают атрофический паралич мышц, наблюдаемый при ботулизме и столбняке, смотрите Fischer 2007, PNAS 104, 10447.

Несмотря на его токсические эффекты, комплекс ботулинического токсина применялся в качестве терапевтического средства при большом числе заболеваний. Ботулинический токсин серотипа А был одобрен для применения на людях в Соединенных штатах Америки в 1989, а именно для лечения косоглазия, блефароспазма и других заболеваний. Он коммерчески доступен в качестве белкового препарата ботулинического токсина А, например, под торговым названием BOTOX (Allergan Inc) и под торговым названием DYSPORT (Ipsen Ltd). При терапевтическом применении комплекс вводится непосредственно в подлежащую лечению мышцу. При физиологическом pH токсин высвобождается из белкового комплекса, и достигается желаемый фармакологический эффект. Усовершенствованный BoNT/A препарат, свободный от комплексообразующих белков, доступен под торговым названием XEOMIN (Merz Pharmaceuticals GmbH). Эффект ботулинического токсина является лишь временным, что является причиной того, что может потребоваться повторное введение ботулинического токсина для поддержания терапевтического эффекта.

Клостридиальные нейротоксины уменьшают силу произвольного сокращения мышц и представляют собой эффективное средство лечения косоглазия, фокальной дистонии, включая цервикальную дистонию, и доброкачественной эссенциальной блефароспазмы. Кроме того, как было показано, они уменьшают гемифациальный спазм и фокальную спастичность, и, более того, эффективны при широком ряде других случаев, таких как нарушения в работе желудочно-кишечного тракта, гипергидроз и косметическая коррекция морщин, смотрите Jost 2007, Drugs 67, 669.

Для получения клостридиальных нейротоксинов особенно важное значение имеет очищение нейротоксина, содержащего ферментационный раствор. В связи с этим, как правило, применяются различные стадии осаждения и экстракции, сопровождаемые стадией концентрации и следующими отдельными хроматографическими стадиями, для того чтобы получить очищенный нейротоксин, смотрите DasGupta 1984, Toxicon 22, 415; Sathyamoorthy 1985, J Biol Chemistry 260, 10461. В настоящее время доступные препараты нейротоксина содержат, в дополнение к желательному активному (процессированному) нейротоксину, протеолитически непроцессированный предшественник и/или частично процессированный поли-пепитд нейротоксин. Протеолитически непроцессированный предшественник или частично процессированный полипепитд отличается от активного (процессированного) полипептида нейротоксина последовательностью только некоторых аминокислот. Поэтому их едва можно различить по их химическим и физическим свойствам. С другой стороны, доля протеолитически непроцессированного предшественника и/или частично процессированного полипептида нейротоксина от общей доли белка все еще является значительной в таких препаратах. Указанная доля обусловлена биологической системой, и определяется биосинтезом и условиями процесса ферментации. Таким образом, количество нежелательного протеолитически непроцессированного предшественника и/или частично процессированного полипептида нейротоксина в препаратах нейротоксина предопределено, и, в настоящее время, его довольно сложно уменьшать.

Средства и способы уменьшения количества непроцессированных и/или частично процессированных полипептидов нейротоксинов и, таким образом, улучшения качества препаратов нейротоксина являются весьма желательными, но еще не доступными.

Таким образом, техническая задача, которая решается посредством настоящего изобретения, может быть сформулирована как обеспечение средств и способов усовершенствования получения полипепитдов нейротоксинов в соответствии с вышеуказанными требованиями. Данная техническая задача решается посредством вариантов выполнения настоящего изобретения, охарактеризованных в формуле изобретения, как указано ниже.

Настоящее изобретение относится к антителу, которое специфически связывается с эпитопом, состоящим из пептида, имеющего аминокислотную последовательность, как показано на любой из SEQ ID NO:1-16.

Термин ″антитело″, как применяется в настоящем изобретении, охватывает моноклональное антитело, поликлональное антитело, одноцепочечное антитело, человеческое, гуманизированное, приматизированное или химерное антитело, биспецифическое антитело, синтетическое антитело, химически или ферментативно модифицированные производные, фрагмент любого из указанных антител или аптамеры, состоящие из нуклеиновы кислот природного происхождения и/или химически модифицированных нуклеиновых кислот. Фрагменты указанных антител включают F(ab)₂, F(ab), Fv или scFv фрагменты или химически или ферментативно модифицированные производные любого из этих фрагментов. Антитело по настоящему изобретению должно специфически связываться с эпитопом, состоящим из вышеупомянутого пептида, если указанный пептид содержится частично процессированным или непроцессированным полипептидом нейротоксином.

Термин ″эпитоп″, согласно настоящему изобретению, относится к антигенной детерминанте, которая распознается антителом по настоящему изобретению. Она состоит из пептида, имеющего аминокислотную последовательность, как показано на любой из SEQ ID NO:1-16. Согласно настоящему изобретению вышеупомянутые эпитопы представляют собой пептиды, которые фланкируются сайтами расщепления для ферментов процессинга нейротоксина или которые охватывают сайт расщепления (сайты), смотрите таблицы 1 и 2, приведенные ниже. Согласно настоящему изобретению эпитоп содержится протеолитически непроцессированным полипептидом нейротоксином или частично процессированным полипептидом нейротоксином. Частично процессированный полипептид нейротоксин может либо представлять собой легкую цепь полипептида нейротоксина, удлиненную пептидными последовательностями, как показано на любой из SEQ ID NO:1-8, либо тяжелую цепь полипептида нейротоксина, удлиненную пептидными последовательностями, как показано на любой из SEQ ID NO:1-8. Благодаря присутствию указанного эпитопа, непроцессированные или частично процессированные полипепитды нейротоксины могут специфически связываться антителом.

Таблица 1: Аминокислотные последовательности эпитопов и полипептидов полной длины серотипов нейротоксина

Таблица 2: Аминокислотные последовательности, включающие сайты расщепления серотипов нейротоксина

Термин ″специфически связывается″ означает, что антитело по настоящему изобретению не вступает в значительной степени в перекрестную реакцию с другими эпитопами либо на указанных частично процессированных, либо на указанных непроцессированных полипептидах нейротоксинах, или на других полипептидах в общем. Согласно одному варианту выполнения настоящего изобретения, антитело по настоящему изобретению не вступает в перекрестную реакцию с указанным активным полностью процессированным полипептидом нейротоксином. Специфичность эпитопа является важным отличительным признаком антитела по настоящему изобретению Специфичность антитела в отношении частично процессированного или непроцессированного нейротоксина по сравнению с процессированным нейротоксином должна составлять, согласно настоящему изобретению, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%. Специфическое связывание можно протестировать различными хорошо известными методиками, включая, например, конкурентные исследования. Другим важным отличительным признаком является чувствительность к антителу. Чувствительность, согласно настоящему изобретения, должна быть такой, чтобы связывалось по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% процессированного нейротоксина, содержащегося образцом. Чувствительность может быть протестирована хорошо известными методиками. Специалисты в данной области техники смогут определить рабочие и оптимальные условия анализа для каждого определения, путем выполнения обычной экспериментальной работы. Обычные методики для изучения связывания включают радиоиммуноанализ, твердофазный иммуноферментный анализ ELISA, равновесный диализ, изотермическую микрокалориметрию, BIACORE^® анализы (поверхностный плазмонный резонанс, SPR) или другие способы на основе поверхностного поглощения. BIACORE^® SPR система измеряет взаимодействие антитело-антиген. Ответ SPR отражает изменение массовой концентрации на поверхности детектора, так как аналиты связываются или диссоциируют. На основании SPR, BIACORE^® измерения в реальном масштабе времени позволяют контролировать взаимодействия сразу после того как они происходят, смотрите BIAapplications Handbook, версия АВ (переиздано в 1998), BIACORE^® code No: BR-1001-86; BIAtechnology Handbook, версия АВ (переиздано в 1998), BIACORE^® code No: BR-1001-84. Свойства связывания, такие как чувствительность антитела по настоящему изобретению, могут, в принципе, быть определены посредством изучений связывания с применением иммобилизованного антигена (лиганда), помещенного на сенсорную поверхность. Антитело, подлежащее тестированию (аналит), представляют в виде подвижной фазы, то есть в виде раствора. В некоторых случаях антиген прикрепляется непосредственно к поверхности через связывание с другой иммобилизованной молекулой, которая упоминается как захватывающая молекула. Когда антитело вводится в виде дискретного импульса по поверхности с иммобилизованными антигенами, можно выделить, по существу, три фазы: (i) связывание антитела с антигеном в ходе ввода образца; (ii) равновесное или установившееся состояние в ходе введения образца, когда скорость связывания антитела сбалансирована диссоциацией из комплекса антитело-антиген; (iii) диссоциация антитела с поверхности в ходе течения буфера. Будет понятно, что такой анализ может быть осуществлен альтернативным образом с иммобилизованными антителами, подлежащими исследованию, и раствором, содержащим антиген, в качестве подвижной фазы. Фазы связывания и диссоциации обеспечивают информацию о кинетике взаимодействия аналит-лиганд (k_a и k_d, скорости образования и диссоциации комплекса, k_d/k_a=K_D). Равновесная фаза обеспечивает информацию об аффинности взаимодействия аналит-лиганд (K_D). Согласно настоящему изобретению антитело по настоящему изобретения имеет KD менее 0.5 мкМ, согласно одному варианту выполнения настоящего изобретения менее 0.05 мкМ и согласно другому варианту выполнения настоящего изобретения менее 0.02 мкМ.

Согласно настоящему изобретению антитело может быть получено путем применения способов, которые описываются, например, в Harlow and Lane ″Antibodies, A Laboratory Manual″, CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988. Моноклональные антитела могут быть получены согласно способам, первоначально описанным в Kohler 1975, Nature 256, 495, и Galfre 1981, Meth Enzymol 73, 3. Указанные методики содержат слияние миеломных клеток мышей с клетками селезенки, полученными у иммунизированных млекопитающих. Антитела могут быть далее усовершенствованы с помощь методик, хорошо известных в данной области техники. Например, поверхностный плазмонный резонанс, как применяется в системе BIACORE^®, может применяться для увеличения эффективности фаговых антител, которые связываются с вышеупомянутым эпитопом внутри протеолитически непроцессированного полипептида нейротоксина, смотрите Schier 1996, Human Antibodies Hybridomas 7, 97; Malmborg 1995, J. Immunol Methods 183, 7.

Согласно настоящему изобретению антитело в соответствии с антителом по настоящему изобретению, в одном варианте выполнения настоящего изобретения, получают путем применения олигопептида, содержащего вышеупомянутый эпитоп. Такой олигопептид может быть получен синтетически или посредством рекомбинантной экспрессии. Альтернативно, антитело по настоящему изобретению может быть получено путем применения непроцессированного или частично процессированного полипептида нейротоксина природного происхождения. В последнем случае необходимо понимать, что полученные антитела должны быть далее протестированы на специфичность в отношении непроцессированного и/или частично процессированного полипептида(ов) нейротоксина. Согласно следующему варианту выполнения настоящего изобретения, моноклональное антитело по настоящему изобретению получают путем применения частично процессированного или непроцессированного полипептида нейротоксина, который может быть обработан детергентом, для того чтобы создать иммунологически доступный эпитоп. Однако будет понятно, что в случае, когда антитело должно быть направлено против конформационного эпитопа, никакая такая обработка детергентом не должна быть осуществлена. Согласно следующему варианту выполнения настоящего изобретения, средства стимуляции иммунитета, такие как гемоцианин лимфы улитки (KLH), также могут применяться в таком способе, особенно при применении синтетического олигопептида.

Антитело согласно настоящему изобретению может применяться, например, для аффинной хроматографии, иммунопреципитации и иммунолокализации частично процессированного и/или непроцессированного полипептида нейротоксина, а также для контроля присутствия указанного полипептида в образцах или в рекомбинантных организмах.

Согласно настоящему изобретению частично процессированный и/или не-процессированный полипептид нейротоксина происходит из Clostridium sp.. В другом варианте выполнения настоящего изобретения он происходит из Clostridium botulinum, выбранного из группы, состоящей из Clostridium botulinum АТСС 3502, Clostridium botulinum АТСС 3502 - Hall штамм. Первичная структура указанного непроцессированного полипептида нейротоксин из Clostridium botulinum раскрывается в Krieglstein 1994, J Protein Chem 13, 49.

Clostridium spp., как упоминается в настоящем изобретении, относится к роду грамположительных формирующих эндоспоры облигатных анаэробных бактерий, которые принадлежат типу Firmicutes. Клостридиальные нейротоксины могут продуцироваться фенотипически и генетически различными клостридиями, принадлежащими видам Clostridium botulinum, Clostridium butyricum, Clostridium barati и Clostridium tetani. Clostridium botulinum, как поменяется в настоящем изобретении, представляет собой вид палочковидной грамположительной облигатной анаэробной бактерии, которая продуцирует, помимо нейротоксинов, овальные субтерминальные эндоспоры, и, как правило, обнаруживается в почве.

Кроме того, в следующем варианте выполнения настоящего изобретения указанное антитело связывается с полипептидным носителем. Согласно антителу по настоящему изобретению указанный полипептидный носитель выбирается из группы, состоящей из: FC-связывающего белка, белка А и белка G, и антитела, которое специфически связывается с антителом по настоящему изобретению. Согласно настоящему изобретению это, например, может быть антитело, которое является специфическим в отношении видов. Такое антитело специфически связывается с FC частью или F(ab) антитела по изобретению. Согласно другому варианту антитела по настоящему изобретению указанный полипептидный носитель представляет собой белок А из Staphylococcus aureus. Согласно настоящему изобретению указанный полипептидный носитель может применяться для выделения антитела по настоящему изобретению.

Более того, в следующем варианте выполнения антитела по настоящему изобретению, указанное антитело связывается с матрицей. Согласно настоящему изобретению указанная матрица представляет собой твердую матрицу.

Термин ″связывание″, как применяется в настоящем изобретении, относится к любому типу соединения между антителом и матрицей, до тех пор, пока указанное соединение существенно не мешает связыванию антитела с частично процессированным и/или непроцессированным полипептидом нейротоксином. Указанное соединение может быть получено путем взаимодействий, включая непрямые или прямые, необратимые или обратимые, физические и химические, электростатические и/или ковалентные связи. Согласно настоящему изобретению антитело ковалентно связывается с матрицей, либо напрямую, либо через линкерную молекулу.

Термин ″матрица″, как применяется согласно настоящему изобретению, относится к трехмерной структуре или пространственному расположению, способным к связыванию антигена или антитела. Хорошо известные матрицы содержат полипептиды, стекло, полистирол, полипропилен, полиэтилен, полиэтиленгликоль (ПЭГ), декстран, нейлон, амилазы, природные и модифицированные целлюлозы, полиакриламиды, габбро и магнетит. Твердая матрица согласно настоящему изобретению представляет собой полисахаридную матрицу, выбранную из группы, состоящей из: сефарозы, сефадекса; агарозы, сефацели, микроцеллюлозы и шариков альгината. В другом варианте выполнения настоящего изобретения указанная твердая матрица может состоять из стеклянных шариков и/или полипептидных матриц.

Антитело может связываться с указанной матрицей через линкер, включая низкомолекулярные соединения, пептидные линкерные молекулы и шарики. Матрица может иметь фактически любую возможную структурную конфигурацию или расположение, до тех пор, пока связанное антитело способно связываться с его антигеном. Таким образом, матрица может быть сферической, как в шарике, или цилиндрической, как во внутренней поверхности пробирки, или внешней поверхности прута. Альтернативно, поверхность может быть искривленной или плоской, такой как лист, индикаторная полоска и т.д. Согласно одному варианту выполнения настоящего изобретения указанные подложки включают шарики полистирола.

Вышеуказанная матрица согласно настоящему изобретению имеет по меньшей мере один сайт связывания для антитела по настоящему изобретению. Согласно другому варианту выполнения настоящего изобретения, указанная матрица имеет дополнительные сайты связывания для следующих антител, которые распознают другие эпитопы. Согласно настоящему изобретению указанные эпитопы представляют собой другие эпитопы, которые допускают специфическое связывание частично процессированного и/или непроцессированного полипептида нейротоксина. Следующие антитела, иммобилизованные на матрице, также охватывают антитела, которые распознают бактериальные полипептиды, отличные от полипептидов нейротоксинов. Такие следующие антитела, содержащиеся матрицей, могут применяться для удаления дальнейших нежелательных полипептидов и, таким образом, в целях дальнейшей очистки препарата нейротоксина. Однако должно быть понятно, что согласно следующему аспекту настоящего изобретения процессированный нейротоксин не должен специфически связываться антителами, иммобилизованными на матрице.

Вышеупомянутое антитело по настоящему изобретению подходит для получения процессированного полипептида нейротоксина, потому что оно специфически связывается с охарактеризованным выше эпитопом, таким образом, обеспечивая возможность связывания частично процессированного или непроцессированного полипептида нейротоксин и дальнейшего отделения его от активного процессированного полипептида нейротоксина. Антитело, которое способно к связыванию и удалению нежелательного частично процессированного и непроцессированного полипептида нейротоксина, избегает, согласно настоящему изобретению, взаимодействия с активным процессированным полипептидом нейротоксином, который сохраняет свою биологическую активность. Благодаря настоящему изобретению возможно очищение нейротоксина, при котором на активность желательного активного полипептида воздействие по существу не оказывается. Специалист в данной области техники знает, что ″активность″ появляется только после протеолитического расщепления непроцессированного полипептида предшественника нейротоксина, даже, несмотря на то, что указанный непроцессированный предшественник может осуществлять некоторые биологические функции. Таким образом, ″протеолитически процессированный полипептид нейротоксин″, согласно настоящему изобретению, является биологически активным полипептидом нейротоксином. Термин ″биологически активный″, как применяется в настоящем изобретении, относится к способности полипептида нейротоксина к связыванию последовательности рецептора, интернализации, транслокации через эндосомальную мембрану в цитозоль и/или эндопротеолитическому расщеплению одного или более белков, которые участвуют в слиянии синаптических везикул с мембраной.

Необходимо понимать, что определения и примеры терминов, приведенные выше, применяются, с учетом необходимых поправок, для всех объектов и вариантов выполнения настоящего изобретения, далее раскрытых в описании настоящего изобретения, если иного не указано.

Другим объектом настоящего изобретения является способ получения антитела, которое специфически связывается с непроцессированным и/или частично процессированным полипептидом нейротоксином, где указанный способ содержит стадии:

а) контакта поликлональной антисыворотки из не принадлежащего к человеческому роду животного, которое было иммунизировано с применением пептидного иммуногена, содержащего аминокислотную последовательность, как показано на SEQ ID NO:25, с пептидом, имеющим SEQ ID NO:25, в условиях, которые допускают образование комплекса, содержащего вышеупомянутый пептид и антитело, которое специфически связывается с непроцессированным или частично процессированным полипептидом нейротоксином;

b) удаления комплекса, сформировавшегося на стадии а), из антисыворотки; и

c) высвобождения антитела, которое специфически связывается с непроцессированным или частично процессированным полипептидом нейротоксином, из указанного комплекса.

Термин ″пептидный иммуноген″, как применяется в настоящем изобретении, относится к олигопептиду, имеющему аминокислотную последовательность, как показано на SEQ ID NO:25, который вводится некоторым образом, позволяющим вызывать иммунный ответ в не принадлежащем к человеческому роду животном. Согласно одному варианту выполнения настоящего изобретения указанный иммуноген, кроме того, содержит KLH, и, согласно еще одному варианту выполнения настоящего изобретения, указанный KLH связан через цистеин и, согласно одному варианту выполнения настоящего изобретения, через С-терминальный цистеин, с пептидом, имеющим последовательность SEQ ID NO:25, через линкер сложный эфир N-[гамма-малеимидобутирилокси]сукцинимида (GMBS). В области техники хорошо известно как связать KLH с пептидом с помощью линкерной молекулы, такой как GMBS, и это также описывается в приведенных ниже примерах. В другом варианте выполнения настоящего изобретения не принадлежащее к человеческому роду животное представляет собой млекопитающее, в вариантах выполнения настоящего изобретения крысу, мышь, кролика, овцу или козла. До осуществления способа по настоящему изобретению не принадлежащее к человеческому роду животное, которое должно стать источником поликлональной антисыворотки, иммунизируют, применяя вышеупомянутый пептидный иммуноген. В области техники хорошо известно как иммунизировать не принадлежащее к человеческому роду животное, и это также описывается в приведенных ниже примерах. В результате указанной иммунизации не принадлежащее к человеческому роду животное продуцирует поликлональные антитела против пептидного иммуногена.

Поликлональная антисыворотка может быть получена из не принадлежащего к человеческому роду животного с помощью различных методик. В вариантах выполнения настоящего изобретения ее получают из крови, сыворотки или плазмы стандартными способами, хорошо известными в данной области техники и описанными в приведенных ниже примерах. Термин ″поликлональная антисыворотка″, таким образом, включает очищенную и частично очищенную сыворотку указанного животного. Такая указанная антисыворотка представляет собой исходный материал для вышеупомянутого способа. В дополнение к желательному антителу (или антителам), которые специфически связываются с непроцессированным и/или частично процессированным полипептидом нейротоксином, поликлональная антисыворотка может содержать дополнительные антитела, которые не специфически связываются с непроцессированным и/или частично процессированным полипептидом нейротоксином. Эти антитела отделяют от желательных специфических антител посредством контакта антисыворотки с пептидом, также имеющим аминокислотную последовательность, как показано на SEQ ID NO:25. Согласно настоящему изобретения указанный пептид иммобилизован на носителе, что подробно описывается в настоящем описании. В результате указанного контакта формируется комплекс пептида и специфических антител, который затем может быть удален из поликлональной сыворотки. Специфические антитела затем могут быть высвобождены из удаленного комплекса. Подходящие методики высвобождения антител из таких комплексов приведены в описании настоящего изобретения.

В другом варианте выполнения настоящего изобретения указанный способ, кроме того, содержит перед стадией а) стадии:

i) контакта указанной поликлональной антисыворотки из не принадлежащего к человеческому роду животного, которое было иммунизировано с применением пептидного иммуногена, содержащего аминокислотную последовательность, как показано на SEQ ID NO:25, со следующими пептидами захвата SLD, LDK и YNK, в условиях, которые допускают формирование комплексов захваты, содержащих неспецифические антитела, содержащиеся поликлональной антисывороткой, и пептиды захвата; и

ii) удаления комплексов захваты из поликлональной антисыворотки.

При осуществлении основополагающих исследований по настоящему изобретению поликлональную антисыворотку приводили в действие против ботулинического нейротоксина типа A (BoNT/A), применяя линкерный пептид, связанный с KLH, в качестве иммуногена (антилинкерный пептид scBoNT/A-сыворотка), исследования проводили на козлах. Даже после аффинного очищения сыворотка проявляла перекрестную реакционную способность в отношении процессированного BoNT/A при Вестерн-блот анализе. Было продемонстрировано, что перекрестная реакционная способность зависит от распознавания трипептидов (SLD, LDK и YNK), которые встречаются в линкерном пептиде, а также в легкой и тяжелой цепях процессированного BoNT/A. Вторую порцию козлиной иммуносыворотки очистили с помощью двухступенчатой аффинной хроматографии, удаляя антитела с перекрестной реакционной способностью в отношении трипептидов. Вторая антилинкерный пептид scBoNT/A-сыворотка не показала никакой перекрестной реакционной способности в отношении процессированного BoNT/A при Вестерн-блот анализе. Согласно настоящему изобретению трипептиды могут применяться для аффинного очищения в форме производных, как показано на любой из SEQ ID No. 26-28.

В вариантах выполнения способа по настоящему изобретению стадии а)-с) осуществляются посредством аффинной хроматографии.

Аффинная хроматография, как применяется в настоящем изобретении, относится к способу разделения молекул в подвижной фазе на основе их различной аффинности по отношению к стационарной фазе, применяемой в хроматографии. Согласно настоящему изобретению указанный способ относится к селективной адсорбции и последующему отделению соединения от иммобилизованного лиганда. Согласно другому варианту выполнения настоящего изобретения указанный способ предназначен для высокоспецифического и эффективного очищения белков и родственных соединений, применяя соответствующие селективные лиганды на четковидных и пористых матрицах для связывания желательных соединений, которые могут затем быть удалены при мягких условиях. Указанный способ основывается на высокоспецифическом взаимодействии, таком как взаимодействие между антигеном и антителом, ферментом и субстратом или рецептором и лигандом. В другом варианте выполнения настоящего изобретения аффинная хроматография осуществляется в виде колоночной хроматографии. Аффинная хроматография, как подробно описано выше, представляет собой, в одном варианте выполнения настоящего изобретения, иммуноабсорбционную хроматографию, хроматографию гидрофобных взаимодействий (HIC), обращено-фазную хроматографию и, в другом варианте выполнения настоящего изобретения, иммуноаффинную хроматографию с применением связывающего агента, который, в вариантах выполнения настоящего изобретения, представляет собой антитело по настоящему изобретению. Стационарная фаза, как упоминается в настоящем изобретении, состоит из вышеупомянутого агента в качестве твердой матрицы. Указанный агент, в одном варианте выполнения настоящего изобретения, связывается с полипептидным носителем, связанным с твердой матрицей, и, в другом варианте выполнения настоящего изобретения, связывается с белком А, связанным с твердой матрицей.

В следующем варианте выполнения настоящего изобретения стадии i) и ii) осуществляются посредством аффинной хроматографии..

Настоящее изобретение также относится к способу идентификации антитела, которое специфически связывается с непроцессированным и/или частично процессированным полипептидом нейротоксином, содержащему стадии:

a) определения связалось ли антитело с пептидом, имеющим аминокислотную последовательность, как показано на SEQ ID NO:25; и

b) определения связалось ли антитело с пептидом, имеющим следующие аминокислотные последовательности SLD, LDK и YNK,

где антитело, которое связывается с пептидом, имеющим аминокислотную последовательность, как показано на SEQ ID NO:25, но не с пептидами, имеющими следующие аминокислотные последовательности SLD, LDK и YNK, идентифицируется как антитело, которое специфически связывается с непроцессированным и/или частично процессированным полипептидом нейротоксином.

Термин ″обнаружение″, как применяется в соответствии со способом идентификации антитела, охватывает хорошо установившиеся методики определения связывания антитела с данным пептидом, такие как методики иммуноблоттинга (Вестерн-блот или Дот-блот методики), аффинную хроматографию, способы на основе поверхностного плазмонного резонанса (BIACORE^® анализы) и тому подобное. Должно быть понятно, что согласно настоящему изобретению вышеупомянутое связывание антитела с пептидом или пептидами является специфическим связыванием (то есть, связыванием без перекрестной реакционной способности).

Согласно настоящему изобретению вышеупомянутый способ идентификации антитела осуществляется для моноклональных антител. Согласно одному варианту выполнения настоящего изобретения способ применяется для скрининга гибридомных клеточных линий и последующего продуцирования моноклональных антител, которые специфически связываются с непроцессированным и/или частично процессированным полипептидом нейротоксином. В другом варианте выполнения настоящего изобретения способ может применяться для скрининга поликлональных антител, например пептидных антител, которые специфически связываются с непроцессированным и/или частично процессированным полипептидом нейротоксином. Согласно одному варианту выполнения настоящего изобретения способ может применяться для подтверждения специфичности антитела, полученного способом по настоящему изобретению, описанным в описании настоящего изобретения.

Настоящее изобретение также относится к антителу, которое может быть получено вышеупомянутым способом. В одном варианте выполнения настоящего изобретения антитело представляет собой поликлональное антитело. В следующем варианте выполнения настоящего изобретения указанное антитело связано с твердой подложкой

Антитело по настоящему изобретению, согласно одному варианту выполнения настоящего изобретения, позволяет обнаружить частично процессированный и/или непроцессированный полипептид нейротоксин с высокой чувствительностью и специфичностью, в одном варианте выполнения настоящего изобретения с пределом обнаружения 50-80 пг/мл, в другом варианте выполнения настоящего изобретения с пределом обнаружения 69 пг/мл.

В принципе, вышеупомянутое антитело может применяться для удаления частично процессированного и/или непроцессированного полипептида нейротоксина из процессированного полипептида нейротоксина или для обнаружения частично процессированного и/или непроцессированного BoNT/A в образце.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения полипептида нейротоксина, содержащего стадии:

a) контакт раствора, содержащего смесь процессированных и частично процессированных и/или непроцессированных полипептидов нейротоксинов, с агентом, который специфически связывается с непроцессированными или частично процессированными полипептидами нейротоксинами, но не с процессированными полипептидами нейротоксинами, в условиях, которые допускают связывание указанного агента с непроцессированными или частично процессированными полипептидам