Способ лечения рака антагонистом dll4 и химиотерапевтическим средством

Способ лечения рака антагонистом dll4 и химиотерапевтическим средством

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Область изобретения

Данное изобретение относится к способам лечения раков или опухолей антагонистом дельта-подобного лиганда 4 (Dll4), в частности, антителами человека или их фрагментами, которые специфически связывают Dll4 человека, в комбинации с одним или несколькими химиотерапевтическими средствами, и к фармацевтическим композициям, содержащим антагонист Dll4 и химиотерапевтическое средство.

Описание связанной области

Dll4 является членом семейства Delta лигандов Notch, который проявляет высоко избирательную экспрессию в эндотелии сосудов (Shutter et al., 2000, Genes Develop. 14:1313-1318). Dll4 является лигандом для рецепторов Notch, Notch 1 и Notch 4. Антагонисты Dll4 можно использовать для ингибирования роста опухоли в различных раках. Последовательности нуклеиновых кислот и аминокислот Dll4 человека (hDll4) представлены в SEQ ID №№ 1 и 2, соответственно. Антитела, специфичные к Dll4 человека, и лечение раков/опухолей с использованием антител к Dll4 раскрыты в публикациях международных патентных заявок WO 2007/143689, WO 2008/042236 и WO 2007/070671.

Химиотерапевтические средства широко используют для лечения раков как отдельно, так и в комбинации с хирургическим лечением и/или лучевой терапией. Способы комбинированного лечения с использованием антагониста Dll4 и химиотерапевтических средств раскрыты в публикациях патентных заявок США US 2008/0014196 и US 2008/0107648.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В первом аспекте изобретение отличается способом лечения рака у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту антагониста Dll4 в комбинации с химиотерапевтическим средством, которым лечат рак. Субъекты, подлежащие лечению способом по изобретению, могут включать млекопитающих любых видов, но предпочтительно человека, страдающего раком.

Способы комбинированного лечения по настоящему изобретению в частности можно использовать в Dll4-ассоциированном или Dll4-опосредованном состоянии или заболевании, которое находится под влиянием непосредственной или опосредованной модуляции активности Dll4. Более конкретно поскольку сейчас показано, что Dll4 вовлечен в рост и развитие кровеносных сосудов, ингибирование или уменьшение Dll4-опосредованного роста или развития или созревания кровеносных сосудов с использованием антагонистов Dll4 является эффективным лечением рака/опухоли, которое требует достаточного кровоснабжения для своего роста и выживания. Кроме того, комбинации антагонистов Dll4 с химиотерапевтическими средствами, включая ингибирующие рост средства и другие цитотоксические средства, синергически усиливает их эффекты против рака/опухолей. Рак/опухоли, поддающиеся лечению способами по настоящему изобретению, включают, но без ограничения, различные солидные злокачественные опухоли, включая рак яичников, рак матки, рак молочной железы, рак легких, рак печени, рак толстой кишки, рак мочевого пузыря, рак почки, рак предстательной железы, рак поджелудочной железы, рак желудка, рак кости, рак кожи, включая меланому, злокачественную саркому мягких тканей, включая в качестве неограничивающих примеров саркому Юинга, рабдомиосаркому, лейомиосаркому, адипоцитную саркому, синовиальную саркому, злокачественную фиброзную гистиоцитоксантому, эпителиоидную гемангиоэндотелиому, ангиосаркому, фибросаркому и неклассифицированные саркомы, лейкемию, включая миелому, и т.п.

В одном из вариантов осуществления антагонист Dll4 представляет собой антитело к Dll4 или его фрагмент («Dll4 Ab»), который специфически связывает Dll4 с высокой аффинностью и блокирует связывание Dll4 с рецепторами Notch и/или нейтрализует активности Dll4. Антитело может представлять собой поликлональное, моноклональное, химерное, гуманизированное антитело или полностью антитело человека. Предпочтительно антитело полностью представляет собой моноклональное антитело или фрагмент моноклонального антитела человека. Фрагмент антитела может представлять собой одноцепочечное антитело, Fab или (Fab')₂.

В другом варианте осуществления Dll4 Ab связывает эпитоп в N-концевом домене (S27-R172), или домен DSL (V173-C217), или N-концевой домен DSL (S27-C217) в Dll4 (SEQ ID № 2). Dll4 Ab, подлежащие использованию в способах по изобретению, способны связывать Dll4 человека с высокой аффинностью и его константа диссоциации (K_D) составляет приблизительно 500 пМ или менее, включая приблизительно 300 пМ или менее и включая приблизительно 200 пМ или менее, как измеряют посредством поверхностного плазменного резонанса. Например, Dll4 Ab имеет вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), которая содержит три CDR тяжелой цепи (H-CDR), и вариабельную область легкой цепи (LCVR), которая содержит три CDR легкой цепи (L-CDR), где три CDR тяжелой цепи содержат CDR1, CDR2 и CDR3 из аминокислотной последовательности SEQ ID № 20, а три CDR легкой цепи содержат CDR1, CDR2 и CDR3 из аминокислотной последовательности SEQ ID № 28. В другом варианте осуществления CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи Dll4 Ab содержат аминокислотные последовательности SEQ ID №№ 22, 24 и 26, соответственно. В другом варианте осуществления CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи Dll4 Ab содержат аминокислотные последовательности SEQ ID №№ 30, 32 и 34, соответственно. В еще одном другом варианте осуществления Dll4 Ab содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, которые содержат SEQ ID № 22, 24 и 26, соответственно, и последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, которые содержат SEQ ID № 30, 32 и 34, соответственно. В еще одном другом варианте осуществления Dll4 Ab содержит HCVR, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID № 20 или 116, или LCVR, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID № 28 или 118. В еще одном другом варианте осуществления Dll4 Ab содержит комбинацию HCVR/LCVR из SEQ ID № 20/28 (REGN281) или 116/118 (REGN421).

В другом варианте осуществления Dll4 Ab содержит комбинацию CDR1/CDR2/CDR3 тяжелой цепи и комбинацию CDR1/CDR2/CDR3 легкой цепи, выбранные из: SEQ ID № 6/8/10 и SEQ ID № 14/16/18, соответственно; SEQ ID № 38/40/42 и SEQ ID № 46/48/50, соответственно; SEQ ID № 54/56/58 и SEQ ID № 62/64/66, соответственно; SEQ ID № 70/72/74 и SEQ ID № 78/80/82, соответственно; SEQ ID № 86/88/90 и SEQ ID № 94/96/98, соответственно; и SEQ ID № 102/104/106 и SEQ ID № 110/112/114, соответственно. В другом варианте осуществления Dll4 Ab содержит HCVR, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID № 4, 36, 52, 68, 84 или 100, или LCVR, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID № 12, 44, 60, 76, 92 или 108. В еще одном другом варианте осуществления Dll4 Ab содержит комбинацию HCVR/LCVR, выбранную из: SEQ ID № 4/12 (REGN279); SEQ ID № 36/44 (REGN290); SEQ ID № 52/60 (REGN306); SEQ ID № 68/76 (REGN309); SEQ ID № 84/92 (REGN310); и SEQ ID № 100/108 (REGN289).

Нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотные последовательности SEQ ID №№ 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116 и 118, представлены в виде SEQ ID №№ 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115 и 117, соответственно.

В одном из вариантов осуществления химиотерапевтическое средство представляет собой антимитотическое средство, такое как доцетаксел, паклитаксел и т. п.; химиотерапевтическое соединение на основе платины, такое как цисплатин, карбоплатин, ипроплатин, оксалиплатин и т. п.; или другие стандартные цитотоксические средства, такие как 5-фторурацил (5-FU), капецитабин, иринотекан, лейковорин, гемцитабин; ингибиторы рецепторных тирозинкиназ и/или ангиогенеза, таких как ингибиторы ErbB, ингибиторы RTK класса III, ингибиторы VEGFR и т. п., а антагонист Dll4 представляет собой антитело к Dll4 или его фрагмент, как описано выше.

Во втором аспекте изобретение отличается способом уменьшения, снижения или остановки роста опухоли у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту антагониста Dll4 в комбинации с химиотерапевтическим средством, которое рост опухоли уменьшает, снижает или останавливает.

В третьем аспекте изобретение отличается способом снижения количества химиотерапевтического средства или антагониста Dll4, которое необходимо для достижения желаемого терапевтического эффекта, по сравнению с введением каждого средства отдельно, который содержит введение химиотерапевтического средства с антагонистом Dll4. В одном из вариантов осуществления количество химиотерапевтического средства для достижения желаемого терапевтического эффекта, такого как, например, остановка или снижение роста опухоли, составляет по меньшей мере на 10% меньше, по меньшей мере на 20% меньше, по меньшей мере на 30% меньше, по меньшей мере на 40% меньше или по меньшей мере на 50% меньше в присутствие совместно введенного антагониста Dll4, или наоборот. В основном, желательно, чтобы количество химиотерапевтического средства или антагониста Dll4 можно было снизить на приблизительно от 30% приблизительно до 50%. Таким образом, способы по изобретению, в частности, полезны для пациентов с раком, которые имеют низкую переносимость побочных эффектов, вызываемых высокими дозами, необходимыми для лечения отдельно любым средством, за счет способности снизить эффективные дозировки.

В четвертом аспекте изобретение отличается фармацевтической композицией, которая содержит антагонист Dll4, химиотерапевтическое средство и фармацевтически приемлемый носитель. В одном из вариантов осуществления антагонист Dll4 представляет собой Dll4 Ab или его фрагмент, который специфически связывает Dll4 с высокой аффинностью и нейтрализует активности Dll4, а химиотерапевтическое средство представляет собой любое из тех, что описаны в настоящем документе.

В пятом аспекте изобретение отличается набором, содержащим контейнер, содержащий фармацевтическую композицию по настоящему изобретению, и вкладыш в упаковку с инструкцией по использованию. В одном из вариантов осуществления набор может содержать контейнер, который содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывает hDll4, один или несколько дополнительных контейнеров, которые содержат по меньшей мере одно любое химиотерапевтическое средство, выбранное из тех, что описаны в настоящем документе, и вкладыш в упаковку с инструкцией по использованию.

Другие цели и преимущества видны при рассмотрении следующего подробного описания.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ

На фиг. 1 представлены эффекты Dll4 Ab в комбинации с цисплатином, оказываемые на рост опухолей VMCub1 человека (карцинома мочевого пузыря), имплантированных мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (ТКИД), которые экспрессируют гуманизированный белок Dll4 (гуманизированные Dll4 ТКИД мыши) (пример 1). Контрольный Fc человека (♦ и сплошная линия); REGN421 (Dll4 Ab) 2 мг/кг/инъекция (♦ и штриховая линия); цисплатин 0,5 мг/кг/инъекция (□); цисплатин 2 мг/кг/инъекция (■); REGN421 2 мг/кг/инъекция + цисплатин 0,5 мг/кг/инъекция (○); и REGN421 2 мг/кг/инъекция + цисплатин 2 мг/кг/инъекция (●).

На фиг. 2 представлены эффекты Dll4 Ab в комбинации с цисплатином, оказываемые на рост опухолей A549 человека (немелкоклеточный рак легких), имплантированных гуманизированным Dll4 ТКИД мышам (пример 2). Контрольный Fc человека (●); REGN421 6 мг/кг суммарная доза (○); цисплатин 5 мг/кг суммарная доза (Δ); цисплатин 9 мг/кг суммарная доза (▲); REGN421 6 мг/кг + цисплатин 5 мг/кг суммарные дозы (◊); и REGN421 6 мг/кг + цисплатин 9 мг/кг суммарные дозы (♦).

На фиг. 3 представлены эффекты Dll4 Ab в комбинации с 5-FU, оказываемые на рост HCT116 человека (колоректальная карцинома), имплантированной гуманизированным Dll4 ТКИД мышам (пример 5). Контрольный Fc человека (●); REGN421 6 мг/кг суммарная доза (○); 5-FU 45 мг/кг суммарная доза (Δ); 5-FU 75 мг/кг суммарная доза (▲); REGN421 6 мг/кг + 5-FU 45 мг/кг суммарные дозы (◊); и REGN421 6 мг/кг + 5-FU 75 мг/кг суммарные дозы (♦).

На фиг. 4 представлены эффекты Dll4 Ab в комбинации с иринотеканом, оказываемые на рост опухолей HCT116 человека, имплантированных гуманизированным Dll4 ТКИД мышам (пример 6). Контрольный Fc человека (●); REGN421 6 мг/кг суммарная доза (○); иринотекан 22,5 мг/кг суммарная доза (Δ); иринотекан 75 мг/кг суммарная доза (▲); REGN421 6 мг/кг + иринотекан 22,5 мг/кг суммарные дозы (◊); и REGN421 6 мг/кг + иринотекан 75 мг/кг суммарные дозы (♦).

На фиг. 5 представлена средняя (4 мышей/группа) кратность изменения экспрессии гена Hey1 в колоректальных опухолевых клетках человека Colo205, имплантированных гуманизированным Dll4 ТКИД мышам, при однократной дозе REGN421 0,5, 5 или 15 мг/кг по сравнению с hFc 15 мг/кг, измеренная через 5, 10, 24, 72 часа и 7 суток после дозы.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Прежде чем перейти к описанию настоящих способов, следует понимать, что это изобретение не ограничено конкретными способами, и что описаны экспериментальные условия, поскольку такие способы и состояния могут варьировать. Также следует понимать, что используемая в настоящем документе терминология служит цели описания только конкретных вариантов осуществления и не предназначена быть ограничением, поскольку объем настоящего изобретения ограничен только приложенной формулой изобретения.

Как используют в этом описании и приложенной формуле изобретения, формы единственного числа включают формы множественного числа до тех пор, пока в контексте явно не указано иное. Таким образом, например, упоминание о «способе» включает один или несколько способов и/или стадий того типа, который описан в настоящем документе и/или который станет очевидным специалистам в данной области после прочтения этого раскрытия.

Пока не определено иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют то же значение, в каком их обычно понимает специалист в той области, к которой принадлежит это изобретение. Несмотря на то, что любые способы и вещества, схожие или эквивалентные тем, что описаны в настоящем документе, можно использовать при практическом применении или тестировании настоящего изобретения, предпочтительные способы и вещества описаны далее.

Определения

«Дельта-подобный лиганд 4», «Dll4», «hDll4» используют взаимозаменяемо в отношении белка, кодируемого последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID № 1, и белка, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID № 2.

Антагонисты Dll4 включают антитела к Dll4 и их фрагменты, способные блокировать связывание Dll4 с рецептором Notch (таким как Notch1 и Notch4), слитые белки, содержащие внеклеточный домен Dll4, слитый с мультимеризующим компонентом, или их фрагменты (см. например, публикации патентных заявок США №№ 2006/0134121 и 2008/0107648) и пептиды и пептидные антитела (см. например, публикацию патентной заявки США № 2003/0229023).

Если конкретно не указано иное, то термин «антитело», как применяют в настоящем документе, следует понимать охватывающим молекулы антител, содержащие две тяжелые цепи иммуноглобулинов и две легкие цепи иммуноглобулинов (т.е., «целые молекулы антител»), а также их антигенсвязывающие фрагменты. Термины «антигенсвязывающая часть» антитела, «антигенсвязывающий фрагмент» антитела и т. п., как применяют в настоящем документе, включают любые встречающиеся в природе, получаемые ферментативно, синтетически или генетически сконструированные полипептиды или гликопротеины, которые специфически связывают антиген с образованием комплекса. Антигенсвязывающие фрагменты антитела можно получить, например, из целой молекулы антитела, используя любые подходящие стандартные способы, такие как протеолитическое расщепление или рекомбинантные способы генетической инженерии, которые включают манипуляции и экспрессию ДНК, кодирующей вариабельные и необязательно константные домены антитела. Такая ДНК известна и/или ее легко получить, например, из коммерческих источников, библиотек ДНК (включая, например, библиотеки фаг-антитело), или ее можно синтезировать. ДНК можно секвенировать и манипулировать химически или посредством использования способов молекулярной биологии, например, чтобы расположить один или несколько вариабельных и/или константных доменов в подходящей конфигурации, или чтобы ввести кодоны, создать остатки цистеина, модифицировать, добавить или удалить аминокислоты и т.д.

Неограничивающие примеры антигенсвязывающих фрагментов включают: (i) фрагменты Fab; (ii) фрагменты F(ab')₂; (iii) фрагменты Fd; (iv) фрагменты Fv; (v) одноцепочечные молекулы Fv (scFv); (vi) фрагменты dAb; и (vii) минимальные распознающие единицы, состоящие из аминокислотных остатков, которые имитируют гипервариабельную область антитела {например, выделенную определяющую комплементарность область (CDR)). Другие сконструированные молекулы, такие как диатела, триатела, тетратела и миниантитела, также входят в выражение «антигенсвязывающий фрагмент», как применяют в настоящем документе.

Антигенсвязывающий фрагмент антитела типично содержит по меньшей мере один вариабельный домен. Вариабельный домен может иметь любой размер или аминокислотный состав и, как правило, содержит по меньшей мере один CDR, который расположен смежно или в рамке считывания с одним или несколькими каркасными последовательностями. В антигенсвязывающих фрагментах, имеющих домен V_H, связанный с доменом V_L, домены V_H и V_L можно расположить друг относительно друга в любом подходящем порядке. Например, вариабельная область может быть димерной и содержать димеры V_H-V_H, V_H-V_L или V_L-V_L. Альтернативно антигенсвязывающий фрагмент антитела может содержать мономерный домен V_H или V_L.

В определенных вариантах осуществления антигенсвязывающий фрагмент антитела может содержать по меньшей мере один вариабельный домен, ковалентно связанный с по меньшей мере одним константным доменом. Без ограничения, образцовые конфигурации вариабельных и константных доменов, которые можно найти в антигенсвязывающем фрагменте антитела по настоящему изобретению, включают: (i) V_H-C_H1; (ii) V_H-C_H2; (iii) V_H-C_H3; (iv) V_H-C_H1-C_H2; (v) V_H-C_H1-C_H2-C_H3; (vi) V_H-C_H2-C_H3; (vii) V_H-C_L; (viii) V_L-C_H1; (ix) V_L-C_H2; (x) V_L-C_H3; (xi) V_L-C_H1-C_H2; (xii) V_L-C_H1-C_H2-C_H3; (xiii) V_L-C_H2-C_H3; и (xiv) V_L-C_L. В любой конфигурации вариабельных и константных доменов, включая любые образцовые конфигурации, перечисленные выше, вариабельные и константные домены могут быть или непосредственно связаны друг с другом или могут быть связаны посредством целой шарнирной или линкерной области или ее части. Шарнирная область может состоять из по меньшей мере 2 (например, 5, 10, 15, 20, 40, 60 или более) аминокислот, что ведет к гибкому или полугибкому соединению между смежными вариабельными и/или константными доменами в одной полипептидной молекуле. Кроме того, антигенсвязывающий фрагмент антитела по настоящему изобретению может содержать гомодимер или гетеродимер (или другой мультимер) согласно любой перечисленной выше конфигурации вариабельных и константных доменов в нековалентном соединении друг с другом и/или с одним или несколькими мономерными доменами V_H или V_L (например, посредством дисульфидной связи(ей)).

Как и в случае целых молекул антител, антигенсвязывающие фрагменты могут быть моноспецифическими или мультиспецифическими (например, биспецифическими). Мультиспецифический антигенсвязывающий фрагмент антитела типично содержит по меньшей мере два различных вариабельных домена, где каждый вариабельный домен способен специфически связывать отдельный антиген или другой эпитоп на том же антигене. Любой формат полиспецифического антитела, включая образцовые форматы биспецифических антител, описанные в настоящем документе, можно адаптировать для использования в контексте антигенсвязывающего фрагмента антитела по настоящему изобретению, используя стандартные способы, доступные в данной области.

Подразумевают, что термин «антитело человека», как применяют в настоящем документе, включает антитела, содержащие вариабельные и константные области, полученные из зародышевых последовательностей иммуноглобулинов человека. mAb человека по изобретению могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые зародышевыми последовательностями иммуноглобулинов человека (например, мутации, введенные посредством случайного или сайт-специфического мутагенеза in vitro или посредством соматических мутаций in vivo), например, в CDR, и в частности в CDR3. Однако не подразумевают, что термин «антитело человека», как применяют в настоящем документе, включает mAb, в которых последовательности CDR, полученные из зародышевых линий млекопитающих других видов (например, мышь), встроены в последовательности FR человека.

Полные антитела человека против Dll4, описанные в настоящем документе, могут содержать одну или несколько замен, инсерций и/или делеций аминокислот в каркасной области и/или CDR вариабельных доменов тяжелых и легких цепей по сравнению с соответствующими зародышевыми последовательностями. Такие мутации можно легко выявить посредством сравнения аминокислотных последовательностей, описанных в настоящем документе, с зародышевыми последовательностями, доступными, например, в публичных базах данных о последовательностях антител. Настоящее изобретение относится к антителам и их антигенсвязывающим фрагментам, которые получают из любой аминокислотной последовательности, описанной в настоящем документе, где одну или несколько аминокислот в одной или нескольких каркасных областях и/или CDR подвергают мутации к первоначальному состоянию, соответствующему зародышевому остатку(ам) или консервативной аминокислотной замене (естественной или не естественной) соответствующего зародышевого остатка(ов) (такие изменения последовательности обозначают в настоящем документе как «зародышевые обратные мутации»). Специалист в данной области, начиная с последовательностей вариабельных областей тяжелой и легкой цепей, описанных в настоящем документе, может легко получить множество антител и антигенсвязывающих фрагментов, которые содержат одну или несколько отдельных зародышевых обратных мутаций или их комбинации. В определенных вариантах осуществления все остатки каркаса и/или CDR в доменах V_H и/или V_L подвергают обратной мутации в зародышевую последовательность. В других вариантах осуществления только определенные остатки подвергают обратной мутации в зародышевую последовательность, например, только мутировавшие остатки, найденные в первых 8 аминокислотах FR1 или в последних 8 аминокислотах FR4, или только мутировавшие остатки, найденные в CDR1, CDR2 или CDR3. Кроме того, антитела по настоящему изобретению могут содержать любую комбинацию из двух или более зародышевых обратных мутаций в каркасных областях и/или CDR, т.е., где определенные отдельные остатки подвергают обратной мутации в зародышевую последовательность, тогда как сохраняют определенные другие остатки, которые отличаются от зародышевой последовательности. После получения, антитела и антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат одну или несколько зародышевых обратных мутаций, можно легко тестировать по одному или нескольким желаемым свойствам, таким как улучшенная специфичность связывания, повышенная аффинность связывания, улучшенные или усиленные антагонистические или агонистические биологические свойства (в зависимости от случая), сниженная иммуногенность и т.д. Антитела и антигенсвязывающие фрагменты, полученные этим основным способом, включены в настоящее изобретение.

Настоящее изобретение также относится к антителам против Dll4, содержащим варианты любой из аминокислотных последовательностей HCVR, LCVR и/или CDR, описанных в настоящем документе, которые содержат одну или несколько консервативных замен. Например, настоящее изобретение относится к антителам против Dll4, которые содержат аминокислотные последовательности HCVR, LCVR и/или CDR, например, с 10 или менее, 8 или менее, 6 или менее, 4 или менее, 2 или 1 консервативную аминокислотную замену(ы), относительно любой из аминокислотных последовательностей HCVR, LCVR, и/или CDR, описанных в настоящем документе. В одном из вариантов осуществления CVR содержит аминокислотную последовательность SEQ ID № 116 с 10 или менее консервативными аминокислотными заменами в ней. В другом варианте осуществления HCVR содержит аминокислотную последовательность SEQ ID № 116 с 8 или менее консервативными аминокислотными заменами в ней. В другом варианте осуществления HCVR содержит аминокислотную последовательность SEQ ID № 116 с 6 или менее консервативными аминокислотными заменами в ней. В другом варианте осуществления HCVR содержит аминокислотную последовательность SEQ ID № 116 с 4 или менее консервативными аминокислотными заменами в ней. В еще одном другом варианте осуществления HCVR содержит аминокислотную последовательность SEQ ID № 116 с 2 или 1 консервативной аминокислотной заменой(ами) в ней. В одном из вариантов осуществления LCVR содержит аминокислотную последовательность SEQ ID № 118 с 10 или менее консервативными аминокислотными заменами в ней. В другом варианте осуществления LCVR содержит аминокислотную последовательность SEQ ID № 118 с 8 или менее консервативными аминокислотными заменами в ней. В другом варианте осуществления LCVR содержит аминокислотную последовательность SEQ ID № 118 с 6 или менее консервативными аминокислотными заменами в ней. В другом варианте осуществления LCVR содержит аминокислотную последовательность SEQ ID № 118 с 4 или менее консервативными аминокислотными заменами в ней. В еще одном другом варианте осуществления LCVR содержит аминокислотную последовательность SEQ ID № 118 с 2 или 1 консервативной аминокислотной заменой(ами) в ней.

«Нейтрализующее» или «блокирующее» антитело предназначено для обозначения антитела, связывание которого с Dll4 ведет к ингибированию биологической активности Dll4. Это ингибирование биологической активности Dll4 можно оценить посредством измерения одного или нескольких показателей биологической активности Dll4. Эти показатели биологической активности Dll4 можно оценить посредством одного или более из нескольких стандартных анализов in vitro или in vivo, известных в данной области. Например, способность антитела нейтрализовать активность Dll4 оценивают посредством ингибирования связывания Dll4 с рецептором Notch.

Термин «специфически связывает» или ему подобное обозначает, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент образует комплекс с антигеном, который относительно стабилен при физиологических условиях. Специфическое связывание можно охарактеризовать посредством равновесной константы диссоциации, равной по меньшей мере приблизительно 1×10⁶ M или менее (например, меньшее значение K_D означает более прочное связывание). Способы определения способности двух молекул специфически связываться, хорошо известны в данной области и включают, например, равновесный диализ, поверхностный плазменный резонанс и т.п. Однако, выделенное антитело, которое специфически связывает hDll4, может проявлять перекрестную реактивность с другими антигенами, такими как молекулы Dll4 других видов. Кроме того, мультиспецифические антитела (например, биспецифические), которые связывают hDll4 и один или несколько дополнительных антигенов, тем не менее рассматривают в качестве антител, которые «специфически связывают» hDll4, как применяют в настоящем документе.

Термин «K_D», как применяют в настоящем документе, предназначен для обозначения константы диссоциации для взаимодействия конкретного антитела-антигена.

Термин антитело с «высокой аффинностью» относится к тем антителам, которые связывают Dll4 с K_D менее чем приблизительно 500 пМ, менее чем приблизительно 400 пМ, менее чем приблизительно 300 пМ, или менее чем приблизительно 200 пМ, как измеряют посредством поверхностного плазменного резонанса, например, BIACORE™ или анализ аффинности в растворе ELISA, с использованием, например, мономерного Dll4; или K_D менее чем приблизительно 100 пМ, менее чем приблизительно 50 пМ, или менее чем приблизительно 20 пМ, как измеряют посредством поверхностного плазменного резонанса, с использованием димерного Dll4.

Термин «поверхностный плазменный резонанс», как применяют в настоящем документе, относится к оптическому феномену, который делает возможным анализ биоспецифических взаимодействий в реальном времени посредством обнаружения изменений в концентрациях белка в матрице биосенсора, например, с использованием системы BIACORE™ (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, N.J.).

Термин «эпитоп» обозначает область антигена, которую связывает антитело. Эпитопы можно определять как структурные или функциональные. Функциональные эпитопы, как правило, представляют собой поднабор структурных эпитопов, и содержат те остатки, которые непосредственно вносят вклад в аффинность взаимодействия. Также эпитопы могут быть конформационными, то есть состоять из нелинейных аминокислот. В определенных вариантах осуществления эпитопы могут содержать детерминанты, которые представляют собой химически активные поверхностные группировки молекул, таких как аминокислоты, сахарные боковые цепи, фосфорильные группы или сульфонильные группы, и в определенных вариантах осуществления могут обладать конкретными трехмерными структурными характеристиками и/или конкретными зарядовыми характеристиками.

Химиотерапевтические средства представляют собой химические соединения, которые можно использовать в лечении рака и они включают ингибирующие рост средства или другие цитотоксические средства. Примеры химиотерапевтических средств, которые можно использовать в настоящих способах, включают алкилирующие средства, такие как тиотепа и циклофосфамид (CYTOXAN®); алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метиламеламины, включая алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилоломеламин; азотистые иприты, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, хлорфосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлоретамин, гидрохлорид мехлоретаминоксида, мелфалан, новэмбихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урацил иприт; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорзотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин, ранимустин; антибиотики, такие как аклациномизины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, калихеамицин, карабицин, карминомицин, карцинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубицин, эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, роторубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-FU; аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пурина, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидина, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин; андрогены, такие как калустерон, пропионат дромостанолона, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; антиадреналовые средства, такие как аминоглутетимид, митотан, трилостан; восполнитель фолиевой кислоты, такой как фролиновая кислота; ацеглатон; альдофосфамид гликозид; аминолевулиновая кислота; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазихин; элфорнитин; ацетат эллиптиния; этоглуцид; нитрат галлия; гидроксимочевина; лентинан; лонидамин; митогуазон; митоксантрон; мопидамол; нитракрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; подофиллиновая кислота; 2-этилгидразид; прокарбазин; PSK®; разоксан; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновая кислота; триазихин; 2,2',2''-трихлортриэтиламин; уретан; виндесин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид («Ara-C»); циклофосфамид; тиотепа; члены семейства таксоида или таксана, такие как паклитаксел (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N. J.), доцетаксел (TAXOTERE®; Aventis Antony, France) и их аналоги; хлорамбуцил; гемцитабин; 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин; платина; этопозид (VP-16); ифосфамид; митомицин C; митоксантрон; винкристин; винорельбин; навельбин; новантрон; тенипозид; дауномицин; аминоптерин; кселода; ибандронат; CPT-11; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO); ретиноевая кислота; эсперамицины; капецитабин; ингибиторы рецепторных тирозинкиназ и/или ангиогенеза, включая сорафениб (NEXAVAR® компании Bayer Pharmaceuticals Corp.), сунитиниб (SUTENT® компании Pfizer), пазопаниб (VOTRIENT™ компании GlaxoSmithKline), тоцераниб (PALLADIA™ компании Pfizer), вендетаниб (ZACTIMA™ компании AstraZeneca), цедираниб (RECENTIN® компании AstraZeneca), регорафениб (BAY 73-4506 компании Bayer), акситиниб (AG013736 компании Pfizer), лестауртиниб (CEP-701 компании Cephalon), эрлотиниб (TARCEVA® компании Genentech), гефинитиб (IRESSA™ компании AstraZeneca), BIBW 2992 (TOVOK™ компании Boehringer Ingelheim), лапатиниб (TYKERB® компании GlaxoSmithKline), нератиниб (HKI-272 компании Wyeth/Pfizer), и т. п., и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого указанного выше. Также в это определение входят противогормональные средства, которые действуют на регуляцию или ингибируют действие гормонов на опухоли, такие как антиэстрогены, включая, например, тамоксифен, ралоксифен, ингибирующие ароматазу 4(5)-имидазолы, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY 117018, онапристон и торемифен (FARESTON®); и антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид, бикалутамид, лейпролид и гозерелин; и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого указанного выше. Другие стандартные цитотоксичные химические соединения, такие как раскрытые в Wiemann et al., 1985, in Medical Oncology (Calabresi et al., eds.), Chapter 10, McMillan Publishing, также можно применять в способах по настоящему изобретению.

Термин «ингибирующие рост средства» относится к соединению или композиции, которая ингибирует рост клеток, в частности, раковых клеток in vitro или in vivo. Примеры ингибирующих рост средств, включают средства, которые блокируют прохождение клеточного цикла (в месте, отличном от фазы S), такие как средства, которые индуцируют задержку в фазе G1 и задержку в фазе M. Классические блокаторы фазы M включают барвинок (винкристин и винбластин), члены семейства таксана, включая в качестве неограничивающих примеров паклитаксел (TAXOL®), доцетаксел (TAXOTERE®) и их аналоги (например, XRP9881 и XRP6258; см. Ojima et al., Curr Opin Investig Drugs 4:737, 2003), и ингибиторы топоизомеразы, такие как иринотекан, топотекан, камптотецин, ламелларин D, доксорубицин, эпирубицин, даунорубицин, этопозид и блеомицин. Те средства, которые задерживают фазу G1, также задерживают фазу S, например, ДНК алкилирующие средства, такие как тамоксифен, преднизон, дакарбазин, мехлоретамин, цисплатин, метотрексат, 5-FU и ara-C.

Общее описание

Настоящее изобретение основано на наблюдении того, что совместное введение антагониста Dll4, например, антитела к Dll4 или его фрагмента, который специфически связывает Dll4 и блокирует активности Dll4, с химиотерапевтическим средством, например, цисплатином или доцетакселом, ведет к более сильному ингибированию роста опухоли, чем любое средство отдельно. Описание полного Dll4 Ab человека, включая рекомбинантные Dll4 Ab человека, см. в публикации международной патентной заявки № WO 2008/076379.

Способы получения Dll4 Ab

Способы получения антител известны в данной области. См., например, Kohler & Milstein (1975) Nature 256:495-497; Harlow & Lane (1988) Antibodies: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY). Антитела, которые выделяют из организмов, отличных от человека, таких как мыши, крысы, кролики, коровы, можно сделать более похожими на антитела человека посредством химеризации или гуманизации.

«Гуманизированные» или химерные формы не относящихся к человеку (например, мышиных) антител представляют собой иммуноглобулины, цепи иммуноглобулинов или их фрагменты (такие как Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ или другие антигенсвязывающие подпоследовательности антител), которые содержат минимальные последовательности, необходимые для связывания антигена, полученные не из иммуноглобулина человека. Они обладают такой же или схожей специфичностью и аффинностью связывания, как у антител мыши или других относящихся к человеку антител, которые предоставляют начальный материал для конструирования химерного или гуманизированного антитела. Химерные антитела представляют собой антитела, гены легких и тяжелых цепей которых сконструированы, типично, посредством генетической инженерии, из сегме