Гуманизированные антитела против axl

Гуманизированные антитела против axl

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение касается гуманизированных моноклональных антител, которые связываются с внеклеточным доменом рецепторной тирозинкиназы AXL и которые, по меньшей мере, частично ингибируют активность AXL.

Уровень техники

Рецепторная тирозинкиназа AXL (Ark, UFO, Tyro-7) является членом семейства киназ Туrо-3, другими членами которого являются Mer (Eyk, Nyk, Tyro-12) и Sky (Rse, Tyro-3, Dtk, Etk, Brt, Tif). Она активируется при связывании гетерофильного лиганда Gas6, 70 кДа белка, гомологичного антикоагуляционному фактору - белку S. В отличие от других рецепторных протеинкиназ, фосфорилирование тирозина AXL может также индуцироваться посредством гомофильного связывания. Активация AXL приводит к включению сигнального пути через РI-3-киназу/Akt (Franke et al., Oncogene 22: 8983-8998, 2003) и других основных сигнальных путей, таких как Ras/Erk и β-катенин/TCF (Goruppi et al., Mol. Cell Biol. 21: 902-915, 2001).

AXL слабо экспрессируется в ряде нормальных тканей, включая мозг, сердце, скелетные мышцы, оболочки органов и соединительные ткани некоторых других органов, а также в моноцитах, но не в лимфоцитах. Индуцируемое AXL фосфорилирование Akt было описано в выживающих фибробластах (Goruppi et al., Mol Cell Biol 17: 4442-4453 1997), эндотелиальных клетках (Hasanbasic et al., Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2004), клетках гладких мышц сосудов (Melaragno et al., J. Mol. Cell Cardiol. 37: 881-887, 2004) и нейронах (Alien et al., Mol. Endocrinol. 13: 191-201 1999). Более того, AXL играет роль в клеточной адгезии и хемотаксисе. Нокаут AXL демонстрирует ослабленную стабилизацию агрегатов тромбоцитов и образование тромба как результат пониженной активации интегрина IIb3 тромбоцитов.

Сверхэкспрессия AXL была продемонстрирована в различных типах раковых клеток, например, в клетках рака молочной железы (Meric et al., Clin. Cancer Res. 8: 361-367, 2002; Berclaz et al., Ann. Oncol. 12: 819-824, 2001), толстого кишечника (Chen et al., Int. J. Cancer 83: 579-584, 1999; Craven et al., Int. J. Cancer 60: 791-797, 1995), простаты (Jacob et al., Cancer Detect. Prev.23: 325-332, 1999), легких (Wimmel et al., Eur J Cancer 37: 2264-2274, 2001), желудка (Wu et al., Anticancer Res 22: 1071-1078, 2002), яичников (Sun et al., Oncology 66: 450-457, 2004), эндометрия (Sun et al., Ann. Oncol. 14: 898-906, 2003), почек (Chung et al., DNA Cell Biol. 22: 533-540, 2003), клеток печени (Tsou et al., Genomics 50:331-340, 1998), щитовидной железы (Ito et al., Thyroid 12:971-975, 2002; Ito et al., Thyroid 9: 563-567, 1999) и карциномы пищевода (Nemoto et al., 1997), кроме того, в клетках CML (хронической гранулоцитарной лейкемии) (Janssen et al., A novel putative tyrosine kinase receptor with oncogenic potential. Oncogene, 6: 2113-2120, 1991; Braunger et al., Oncogene 14:2619-2631 1997; O'Bryan et al., Mol Cell Biol 11:5016-5031,1991), AML (острой миелобластной лейкемии) (Rochlitz et al., Leukemia 13: 1352-1358, 1999), остеосаркомы (Nakano et al., J. Biol. Chem. 270:5702-5705, 2003), меланомы (van Ginkel et al., Cancer Res 64:128-134, 2004) и клетках плоскоклеточной карциномы головы и шеи (Green et al., Br J Cancer. 2006 94:1446-5, 2006).

Более того, AXL был идентифицирован как ген, ассоциированный с метастазами, активность которого повышена в агрессивных клеточных линиях рака молочной железы по сравнению с неинвазивными клетками. Было обнаружено, что in vitro активность AXL необходима для миграции и инвазии, и эта активность может быть заингибирована путем обработки антителами (WO 04008147). Подобно этому, подавление активности AXL in vivo, либо путем экспрессии доминантной негативной версии AXL (Vajkoczy, P., et al., Proc. Natl. Acad. Science U.S.A. 103: 5799-5804. 2005), либо путем опосредованного siPHK снижения активности AXL (Holland et al., Cancer Res. 65: 9294-9303, 2005), предотвращает подкожный или ортотопический рост клеток у мышей в экспериментах с ксенотрансплантатами.

К настоящему времени описаны антитела, которые связываются с AXL и обладают биологической активностью. Например, одно известное антитело способно снижать опосредованную AXL инвазию клеток (WO 04008147), тогда как другое антитело, как сообщалось, снижает эффективность взаимодействия AXL/Лиганд. Однако все известные антитела являются поликлональными или негуманизированными моноклональными антителами. Негуманизированные антитела, поликлональные или моноклональные, быстро удаляются из циркуляции и обычно вызывают системные воспалительные эффекты, что делает их непригодными для терапевтического применения.

Таким образом, в плане терапевтического потенциала AXL, существует острая потребность в моноклональных гуманизированных антителах против AXL, фрагментах антител или их производных, которые эффективно и специфически блокируют опосредуемую AXL передачу сигнала и которые являются пригодными для терапевтического лечения.

В соответствии с этим, первый аспект настоящего изобретения касается моноклонального гуманизированного антитела, включая его фрагмент или производное, которое связывается с внеклеточным доменом AXL, в частности AXL человека, и, по меньшей мере, частично ингибирует активность AXL.

Предпочтительно гуманизированное антитело настоящего изобретения обладает, по меньшей мере, одним или более из следующих свойств: способностью снижать или блокировать опосредуемую AXL передачу сигнала, способностью снижать или блокировать фосфорилирование AXL, способностью снижать или блокировать пролиферацию клеток, способностью снижать или блокировать ангиогенез, способностью снижать или блокировать миграцию клеток, способностью снижать или блокировать метастазирование опухоли и способностью снижать или блокировать опосредуемый AXL анти-апоптоз, увеличивая, таким образом, например, чувствительность клеток к обработке антинеопластическим агентом.

В соответствии с наиболее предпочтительным воплощением настоящего изобретения, описанные здесь гуманизированные антитела демонстрируют способность снижать и/или блокировать лиганд-индуцируемое фосфорилирование молекул, находящихся ниже в сигнальном пути AXL, таких как ERK1/2, АКТ, GSK-3P, TSC2, mTOR и/или S6K1.

Более того, гуманизированные антитела настоящего изобретения могут проявлять высокую специфичность к AXL, в частности AXL человека, и незначительно распознавать других членов семейства Tyro-3, например, MER и/или SKY, и/или AXL млекопитающих, не являющихся приматами, такой как AXL мыши.

Термин «активность» в используемом здесь значении относится к биологической функции AXL, которая оказывает влияние на фенотип клетки, в частности, но этим не ограничиваясь, на раковые фенотипы, такие как устойчивость к апоптозу, самодостаточность в отношении ростовых сигналов, клеточная пролиферация, инвазия в ткани и/или метастазирование, нечувствительность к противоростовым сигналам (анти-апоптоз) и/или устойчивый ангиогенез.

Термин «опосредуемая AXL передача сигнала» означает активацию сигнальных путей с участием вторичного мессенжера, таких как расположенный ниже сигнальный путь, запускаемый прямым или непрямым взаимодействием AXL с молекулами вторичного мессенжера.

Термин «фосфорилирование AXL» относится к фосфорилированию аминокислотных остатков, предпочтительно остатков тирозина, либо вторым белком AXL (трансфосфорилирование), либо другим белком, обладающим протеинкиназной активностью.

Термин «пролиферация клеток» относится ко всем процессам с участием AXL, лежащим в основе размножения клеток человека, в частности, но ими не ограничиваясь, раковых клеток человека. Эти процессы вносят свой вклад или приводят к репликации клеточной ДНК, разделению дуплицированной ДНК на две группы хромосом равного размера и физическое деление (называемое цитокинезом) целых клеток, и должны стимулироваться или быть опосредованными некаталитическими или каталитическими активностями AXL, предпочтительно включая фосфорилирование AXL и/или опосредуемую AXL передачу сигнала.

Термин «ангиогенез» относится ко всем процессам с участием AXL, которые вносят вклад в рост новых кровеносных сосудов из ранее существующих сосудов, в частности, но этим не ограничиваясь, новых кровеносных сосудов, снабжающих опухоль. Эти процессы включают множественные клеточные события, такие как пролиферация, выживание, миграция и прорастание эндотелиальных клеток сосудов, привлечение и миграция перицитов, а также образование базальной мембраны для стабилизации сосудов, кровоснабжение сосудов или секреция ангиогенных факторов клетками стромы или опухолевыми клетками, и должны стимулироваться или быть опосредованы некаталитической или каталитической активностями AXL, предпочтительно включая фосфорилирование AXL и/или опосредуемую AXL передачу сигнала.

Термин «метастазирование» относится ко всем процессам с участием AXL, которые обеспечивают распространение раковых клеток из первичной опухоли, проникновение в лимфатические и/или кровеносные сосуды, циркуляцию в кровотоке, и рост в отдаленном участке (метастазы) в нормальных тканях в другом месте в теле. В частности, этот термин относится к клеточным событиям в опухолевых клетках, таким как пролиферация, миграция, независимость в «заякоривании», избегание апоптоза или секреция ангиогенных факторов, что лежит в основе метастазирования и стимулируется или опосредуется некаталитической или каталитической активностями AXL, предпочтительно включая фосфорилирование AXL и/или опосредуемую AXL передачу сигнала.

Термин «опосредуемый AXL анти-апоптоз» относится ко всем процессам с участием AXL, которые защищают клетки человека, предпочтительно, но ими не ограничиваясь, раковые клетки человека, от программируемой гибели клеток (апоптоза). В частности, это относится к процессам, которые защищают клетки человека, предпочтительно, но ими не ограничиваясь, раковые клетки человека, от индукции апоптоза через удаление факторов роста, гипоксию, подвергание действию химиотерапевтических агентов или радиации, или инициацию сигнального каскада, опосредуемого рецептором Fas/Apo-1, и стимулируются или опосредуются некаталитической или каталитической активностями AXL, предпочтительно включая фосфорилирование AXL и/или опосредуемую AXL передачу сигнала.

Термин «участок» или «домен» являются в настоящем изобретении взаимозаменяемыми.

Антитела, обозначаемые как "11В7" и "11D5" в настоящем изобретении могут также обозначаться как "#11В7" и "#11D5" соответственно.

Согласно второму аспекту настоящего изобретения гуманизированные антитела, описываемые здесь, являются производными от одного из химерных (крыса/человек) антител против AXL 11B7 (аминокислотная последовательность его легкой и тяжелой цепей представлена SEQ ID NO: 135 и 136 соответственно), 11D5 (аминокислотная последовательность его легкой и тяжелой цепей представлена SEQ ID NO: 137 и 138 соответственно), или 10D12 или антитела, распознающего тот же самый эпитоп на внеклеточном домене AXL человека. Особенно предпочтительно, чтобы гуманизированные антитела являлись производными от 11B7 и 11D5. Предпочтительно гуманизированное антитело содержит, по меньшей мере, одну мутацию в каркасном участке, по меньшей мере, одного вариабельного домена. Такие мутации могут быть введены любым методом, известным специалисту в данной области техники, для изменения аминокислотных последовательностей. Данная мутация заменяет предпочтительно аминокислоту в каркасном участке 11B7 или 11D5 на аминокислоту, которая является консервативной в каркасных участках антител человека. Методы для выявления консервативных или консенсусных аминокислот в каркасных участках антител человека, такие как, например, моделирование по гомологии с применением программ, таких как IgBLAST, известны специалисту в данной области техники.

Согласно другому предпочтительному воплощению гуманизированные антитела настоящего изобретения являются производными от антител против AXL, предпочтительно антител 11В7 или 11D5 против AXL человека, где каркасные участки, по меньшей мере, одного вариабельного домена антитела, предпочтительно 11B7 или 11D5, заменены на каркасные участки антитела человека или являются гуманизированными.

Связывающая активность антитела настоящего изобретения по отношению к AXL может быть определена методами, известными специалистам в данной области техники. Например, эта активность может быть определена с помощью поверхностного плазменного резонанса на приборе Biacore и/или методами ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), EIA (ферментативный иммуноанализ), RIA (радиоиммуноанализ) или методами с использованием флуоресцентно-меченых антител, например, FACS.

Предпочтительно гуманизированные антитела настоящего изобретения являются менее иммуногенными по сравнению с поликлональными или моноклональными негуманизированными антителами против AXL, такими как 11В7 или 11D5 крысы. Наряду с другими методами, известными специалистам в данной области техники, пониженная иммуногенность может быть определена методами НАНА или НАМА на основе ELISA (IBL-America, Minnesota / LiSrarFish, Italy). Более того, предпочтительно антитела настоящего изобретения не удаляются быстро из кровотока и не вызывают системных воспалительных ответов при введении пациенту.

Антитела настоящего изобретения могут иметь, по меньшей мере, один антиген-связывающий участок, например, один или два антиген-связывающих участка. Кроме того, антитело предпочтительно включает, по меньшей мере, одну тяжелую цепь иммуноглобулина и, по меньшей мере, одну легкую цепь иммуноглобулина. Цепь иммуноглобулина включает вариабельный домен и, не обязательно, константный домен. Вариабельный домен может включать участки, определяющие комплементарность (CDRs), например, участок CDR1, CDR2 и/или CDR3, и каркасные участки. Термин «участок, определяющий комплементарность» (complementary determining region, CDR) хорошо известен в данной области техники (смотри, например, Harlow and Lane, "Antibodies, a Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbour, 1988) и обозначает последовательность аминокислот в пределах вариабельного участка антитела, которая в основном обеспечивает контакт с антигеном.

Согласно другому воплощению гуманизированные антитела настоящего изобретения являются производными от антитела 11В7 против AXL и могут включать аминокислотную последовательность тяжелой цепи, выбираемую из группы, состоящей из последовательностей от SEQ ID NO:40 до SEQ ID NO:48, или, по меньшей мере, их вариабельный домен, или имеют аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 90% идентичную этим последовательностям и представляющую вариабельный участок, обладающий связывающей активностью в отношении AXL, которая эквивалентна таковой вариабельного участка, имеющего идентичность последовательности 100%,

или аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи выбирается из группы, состоящей из последовательностей от SEQ ID NO:80 до SEQ ID NO:82, или вариабельный домен имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 90% идентичную этим последовательностям и представляющую вариабельный участок, обладающий связывающей активностью в отношении AXL, которая эквивалентна таковой вариабельного участка, имеющего идентичность последовательности 100%,

и/или аминокислотная последовательность легкой цепи выбирается из группы, состоящей из последовательностей от SEQ ID NO:18 до SEQ ID NO:30, или, по меньшей мере, вариабельный домен этой последовательности, или аминокислотная последовательность имеет, по меньшей мере, 90% идентичность с этими последовательностями и представляет собой вариабельный участок, обладающий связывающей активностью в отношении AXL, которая эквивалентна таковой вариабельного участка, имеющего идентичность последовательности 100%,

или аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи выбирается из группы, состоящей из последовательностей от SEQ ID NO:73 до SEQ ID NO:79, или аминокислотная последовательность имеет, по меньшей мере, 90% идентичность с этими последовательностями и представляет собой вариабельный участок, обладающий связывающей активностью в отношении AXL, которая эквивалентна таковой вариабельного участка, имеющего идентичность последовательности 100%,

или фрагмент этой последовательности, распознающий тот же самый эпитоп на внеклеточном домене AXL. Описание последовательностей согласно настоящему изобретению приведено ниже в разделе «Описание Последовательностей» и в Списке Последовательностей.

Согласно другому дополнительному аспекту гуманизированные антитела настоящего изобретения являются производными от антитела 11В7 против AXL и могут включать аминокислотную последовательность тяжелой цепи, выбираемую из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:150 и SEQ ID NO:151, или, по меньшей мере, вариабельный домен этой последовательности, или аминокислотная последовательность имеет, по меньшей мере, 90% идентичность с этими последовательностями и представляет собой вариабельный участок, обладающий связывающей активностью в отношении AXL, которая эквивалентна таковой вариабельного участка, имеющего идентичность последовательности 100%,

и/или аминокислотную последовательность легкой цепи, выбираемую из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:146 и SEQ ID NO:147, или, по меньшей мере, вариабельный домен этой последовательности, или аминокислотная последовательность имеет, по меньшей мере, 90% идентичность с этими последовательностями и представляет собой вариабельный участок, обладающий связывающей активностью в отношении AXL, которая эквивалентна таковой вариабельного участка, имеющего идентичность последовательности 100%.

В конкретном предпочтительном воплощении гуманизированные антитела h#HB7 выбираются из группы, состоящей из антител h#l 1B7-T1, h#l 1B7-T2, h#l 1B7-T3, h#l 1B7-T4, h#HB7-T5, h#HB7-T6, h#HB7-T7, h#HB7-T8, ЫШВ7-Т9, h#HB7-T10, h#l 1B7-T11, h#HB7-T12, h#HB7-T13, h#HB7-T14, h#HB7-T15, h#HB7-T16, h#HB7-T17, h#HB7-T18, ЫЛ1В7-Т19, h#HB7-T20, h#HB7-T21, h#HB7-T22, M11B7-T23, h#HB7-T24, h#HB7-T25, h#HB7-T26, и h#HB7-T27. Таблица 1 (Пример 10) суммирует, какими комбинациями специфических гуманизированных аминокислотных последовательностей тяжелых и легких цепей, соответственно, и какой комбинацией соответствующих экспрессионных векторов характеризуются указанные выше гуманизированные антитела h#l 1B7 в настоящем изобретении.

В другом конкретном предпочтительном воплощении гуманизированные антитела h#HB7 выбираются из группы, состоящей из антител h#HB7-T28, h#HB7-T29, h#HB7-Т30 и h#HB7-T31. Таблица 2 (Пример 22) суммирует, какими комбинациями специфических гуманизированных аминокислотных последовательностей тяжелых и легких цепей, соответственно, и какой комбинацией соответствующих экспрессионных векторов характеризуются указанные выше гуманизированные антитела h#HB7 в настоящем изобретении.

Гуманизированное антитело, происходящее от моноклонального антитела #11В7 крысы против AXL человека, не ограничивается специфическими антителами, показанными в качестве примеров в предшествующих абзацах, до тех пор, пока указанное гуманизированное антитело содержит все шесть участков CDRs и проявляет связывающую активность в отношении антигена AXL. Указанное гуманизированное антитело содержит CDRH1 (SNYWG; SEQ ID NO:124), CDRH2 (YITYSGSTSYNPSLKS; SEQ ID NO:125) и CDRH3 (TTFYY; SEQ ID NO:126) в своей тяжелой цепи, и CDRL4 (RASQDIGNYLR; SEQ ID NO:121), CDRL5 (GATNLAA; SEQ ID NO:122) и CDRL6 (LQSKESPWT; SEQ ID NO:123) в своей легкой цепи соответственно.

Согласно дополнительному воплощению гуманизированные антитела настоящего изобретения являются производными от 11D5 и включают аминокислотную последовательность тяжелой цепи, выбираемую из группы, состоящей из последовательностей от SEQ ID NO:67 до SEQ ID NO:72, или, по меньшей мере, вариабельного домена этой последовательности, или аминокислотной последовательности, имеющей, по меньшей мере, 90% идентичность с этими последовательностями и представляющей собой вариабельный участок, обладающий связывающей активностью в отношении AXL, которая эквивалентна таковой вариабельного участка, имеющего идентичность последовательности 100%,

или аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи выбирается из группы, состоящей из последовательностей от SEQ ID NO:114 до SEQ ID NO:120, или аминокислотной последовательности, имеющей, по меньшей мере, 90% идентичность с этими последовательностями и представляющей собой вариабельный участок, обладающий связывающей активностью в отношении AXL, которая эквивалентна таковой вариабельного участка, имеющего идентичность последовательности 100%,

и/или аминокислотная последовательность легкой цепи выбирается из группы, состоящей из последовательностей от SEQ ID NO:55 до SEQ ID NO:60, или, по меньшей мере, вариабельного домена этой последовательности, или аминокислотной последовательности, имеющей, по меньшей мере, 90% идентичность с этими последовательностями и представляющей собой вариабельный участок, обладающий связывающей активностью в отношении AXL, которая эквивалентна таковой вариабельного участка, имеющего идентичность последовательности 100%,

или аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи выбирается из группы, состоящей из последовательностей от SEQ ID NO:83 до SEQ ID NO:113,

или аминокислотной последовательности, имеющей, по меньшей мере, 90% идентичность с этими последовательностями и представляющей собой вариабельный участок, обладающий связывающей активностью в отношении AXL, которая эквивалентна таковой вариабельного участка, имеющего идентичность последовательности 100%, или его фрагмент, распознающий тот же самый эпитоп на внеклеточном домене AXL.

В конкретном предпочтительном воплощении гуманизированные антитела h#HD5 выбираются из группы, состоящей из антител h#11D5-T1, h#11D5-T2, h#11D5-T3, h#11D5-T4, h#HD5-T5 или h#HD5-T6. Примеры 11, 12 и 14 показывают, какими комбинациями специфических гуманизированных аминокислотных последовательностей тяжелых и легких цепей, соответственно, и какой комбинацией соответствующих экспрессионных векторов характеризуются указанные выше гуманизированные антитела h#11D5.

Одним из предпочтительных воплощений настоящего изобретения является гуманизированное антитело, имеющее относительно высокую среднюю точку термоденатурации (Тm). В настоящем изобретении гуманизированное антитело имеет Тm, по меньшей мере, 70°С, предпочтительно Тm, по меньшей мере, 75°С, более предпочтительно Тm, по меньшей мере, 78°С, еще более предпочтительно Тm, по меньшей мере, 80°С, все еще более предпочтительно 82°С. Или в настоящем изобретении гуманизированное антитело имеет Тm, эквивалентную Тm его предшественника - антитела крысы или химерного антитела, но предпочтительно Тm, по меньшей мере, на 3°С выше, более предпочтительно Тm, по меньшей мере, на 6°С выше, еще более предпочтительно Tm, по меньшей мере, на 8°С выше, все еще более предпочтительно Тm, по меньшей мере, на 10°С выше, чем Тm его предшественника - антитела крысы или химерного антитела. Такое предпочтительное, более предпочтительное, еще более предпочтительное или все еще более предпочтительное гуманизированное антитело является менее склонным к денатурации (разворачиванию) или инактивации и является пригодным для приготовления в форме растворов, которые могут стабильно храниться в течение длительного времени.

Гуманизированное антитело, происходящие от моноклонального антитела #11D5 крысы против AXL человека, не ограничивается специфическими антителами, показанными в качестве примеров в предшествующих абзацах, до тех пор, пока указанное гуманизированное антитело содержит все шесть участков CDRs и проявляет связывающую активность в отношении антигена AXL. Указанное гуманизированное антитело содержит CDRH1 (SNYWG; SEQ ID NO:130), CDRH2 (HITNSGNTTYNPSLKS; SEQ ID NO:131) и CDRH3 (GAFDY; SEQ ID NO:132) в своей тяжелой цепи и CDRL4 (RASQDIGNYLS; SEQ ID NO:127), CDRL5 (GAIKLAV; SEQ ID NO:128) и CDRL6 (LQYIQFPLT; SEQ ID NO:129) в своей легкой цепи соответственно.

Другое предпочтительное воплощение настоящего изобретения представляет собой антитело, которое (специфически) связывает или распознает один из IG-доменов около С-конца (домен, включающий аминокислотные остатки аминокислот NOS. 129-220 в базе данных белков NCBI, ACCESSION No.P_30530: SEQ ID NO:139; Фигура 30А), Такое предпочтительное антитело не ограничивается гуманизированным антителом, но может быть антителом человека или функциональным фрагментом одного из них. Более предпочтительно, такое предпочтительное антитело ингибирует, по меньшей мере, одну из биологических активностей, которыми обладает AXL.

Антитело (полноразмерное) настоящего изобретения может быть получено, например, путем выполнения следующих стадий: конструирование вектора для экспрессии тяжелых цепей и вектора для экспрессии легких цепей, где каждый из указанных векторов содержит вставку, включающую вариабельный участок и константный участок; введение указанных векторов в клетку-хозяина; культивирование указанной клетки; выделение полипептидов антитела из культурального супернатанта (кондиционированной среды), как описано в Примерах с 9 по 12.

В используемом здесь значении «идентичность последовательностей» между двумя полипептидными последовательностями указывает процент аминокислот, которые являются идентичными в данных последовательностях. Методы для определения «идентичности последовательностей» между двумя данными полипептидными последовательностями известны специалистам в данной области техники. Предпочтительные полипептидные последовательности настоящего изобретения имеют идентичность последовательностей, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95% и еще более предпочтительно, по меньшей мере, 98%. Идентичность последовательностей можно определить, например, с помощью программы BLAST, алгоритма, предложенного Karlin и Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, pp5873 (1993)) или FASTA (Methods in Enzymol., 183, pp63 (1990)). Доступна программа, называемая BLASTN или BLASTX (J. Mol. BioL, 215, рр403 (1990)).

Антитело настоящего изобретения может быть антителом IgA-, IgD-, IgE, IgG- или IgM-типа, предпочтительно IgG- или IgM-типа, включая, но ими не ограничиваясь, IgG1-, IgG2-, IgG3-, IgG4-, IgM1- и IgM2-тип.

Антитела настоящего изобретения могут быть предпочтительно сконструированы путем гомологичного моделирования с применением любого пригодного метода, известного специалисту в данной области техники. Более того, гуманизированные формы данных антител, такие как 11В7 или 11D5, могут быть получены согласно методам, известным в данной области техники, таким как химеризация или прививка CDR. Альтернативные методы для получения гуманизированных антител хорошо известны в данной области техники и описаны, например, в ЕР-А1 0239400 и WO 9007861. Обычно гуманизированное антитело содержит один или более аминокислотных остатков, которые введены в него из источника, который не является человеком. Эти не относящиеся к человеку аминокислотные остатки часто обозначаются как «импортные» остатки, которые обычно берутся из «импортного» вариабельного домена. Гуманизирование может быть проведена, например, по методу Winter и соавторов (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), путем замены CDRs или последовательностей CDR, происходящих не из человека, на соответствующие последовательности антитела человека. В соответствии с этим, такие «гуманизированные» антитела представляют собой химерные антитела (U.S. Pat. No. 4,816,567), где значительно меньший участок, чем интактный вариабельный домен человека, заменен на соответствующую последовательность из видов, не являющихся человеком. На практике гуманизированные антитела обычно представляют собой антитела человека, в которых некоторые остатки в CDR и, возможно, некоторые остатки FR заменены на остатки из аналогичных участков в антителах, происходящих не из человека.

Антитело человека может быть получено из библиотеки фагового дисплея антител человека (Wormstone, I.M. et.al, Investigative Ophthalmology & Visual Science. (2002) 43 (7), p.2301-2308; Carmen, S. et.al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1 (2), p.189-203; Siriwardena, D. et.al., Opthalmology (2002) 109 (3), p.427-431), что хорошо известно специалисту в данной области техники.

Например, может использоваться метод фагового дисплея, который включает получение вариабельного участка антитела человека, экспрессирующегося на поверхности фага в виде одноцепочечного антитела, scFv, и отбор фага, который связывается с антигеном (Nature Biotechnology (2005), 23, (9), p.1105-1116).

С помощью анализа гена выбранного фага может быть определена последовательность ДНК, кодирующая вариабельный участок антитела человека, связывающегося с антигеном.

После того, как определена последовательность ДНК scFv, антитело человека может быть получено путем конструирования экспрессионного вектора, включающего указанную последовательность, и введения указанного вектора в подходящую клетку-хозяина для экспрессии антитела (WO 92001047, WO 92020791, WO 93006213, WO 93011236, WO 93019172, WO 95001438, WO 95015388 и Annu.Rev.Immunol (1994) 12, р.433-455 и Nature Biotechnology (2005) 23 (9), p.1105-1116).

Любое антитело человека, независимо от способа его получения, может являться воплощением настоящего изобретения, если указанное антитело обладает связывающей активностью по отношению к антигену - AXL человека, и содержит все шесть следующих CDRs: CDRH1 (SNYWG; SEQ ID NO:130), CDRH2 (HITNSGNTTYNPSLKS; SEQ ID NO:131) и CDRH3 (GAFDY; SEQ ID NO:132) в своей тяжелой цепи и CDRL4 (RASQDIGNYLS; SEQ ID NO:127), CDRL5 (GAIKLAV; SEQ ID NO:128) и CDRL6 (LQYIQFPLT; SEQ ID NO:129) в своей легкой цепи соответственно, альтернативно этому, если указанное антитело человека обладает связывающей активностью по отношению к антигену - AXL человека, и содержит все шесть следующих CRDs: CDRH1 (SNYWG; SEQ ID NO:124), CDRH2 (YITYSGSTSYNPSLKS; SEQ ID NO:125) и CDRH3 (TTFYY; SEQ ID NO:126) в своей тяжелой цепи и CDRL4 (RASQDIGNYLR; SEQ ID NO:121), CDRL5 (GATNLAA; SEQ ID NO:122) и CDRL6 (LQSKESPWT; SEQ ID NO:123) в своей легкой цепи соответственно.

Для терапевтических целей антитело может быть конъюгировано с терапевтической эффекторной группой, например, с радиоактивной группой или цитотоксической группой.

Для диагностических целей антитело может быть меченым. Пригодные метки включают радиоактивные метки, флуоресцентные метки или ферментативные метки.

Как говорилось выше, антитело настоящего изобретения может существовать во множестве форм помимо полных антител; включая, например, Fv, Fab, Fab' и F(ab')₂, диабоди, минибоди, двухвалентное или поливалентное антитело, включающее фрагмент более чем одного антитела, а также в виде одиночных цепей (scFV); смотри, например, WO 8809344.

Антитело настоящего изобретения может представлять собой би-специфичное или мульти-специфичное антитело, которое является специфичным по отношению более чем к одному антигену или эпитопу.

Одноцепочечный вариабельный фрагмент scFv может быть получен путем слияния вариабельного участка тяжелой цепи иммуноглобулина с вариабельным участком легкой цепи иммуноглобулина через полипептидный линкер (Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 113, edited by Rosenburg and Moore, Springer Verlag, New York, p.269-315 (1994) и Nature Biotechnology (2005), 23, p.1126-1136). Биспецифичный фрагмент BiscFv может быть получен путем слияния двух разных scFV через полипептидный линкер.

Методы для получения scFv хорошо известны специалисту в данной области техники (US 4,946,778, US 5,260,203, US 5,091,513, US 5,455,030 и т.д.). Предпочтительно линкер между двумя вариабельными участками не должен образовывать конъюгат (Huston, J.S.et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. (1988) 85, р.5879-5883). Вариабельный участок scFV тяжелой цепи иммуноглобулина и вариабельный участок scFV легкой цепи иммуноглобулина могут происходить из идентичного антитела или из двух антител, одно из которых отличается от другого. Полипептидный линкер может представлять собой одноцепочечный пептид, состоящий из, например, от 12 до 19 аминокислотных остатков.

ДНК, кодирующая scFV, может быть получена с помощью ПЦР, которая включает амплификацию фрагмента ДНК с использованием ДНК, кодирующей полноразмерный или часть вариабельного участка тяжелой цепи иммуноглобулина или вариабельного участка легкой цепи, и двух олигонуклеотидов, соответствующих каждому из двух концов, в качестве матрицы и в качестве пары праймеров, соответственно, и последующую амплификацию с использованием пары праймеров, которые сконструированы таким образом, что вариабельный участок тяжелой цепи и вариабельный участок легкой цепи являются присоединенными к одному концу и к другому концу полипептидного линкера соответственно.

Функциональный фрагмент антитела, включающий scFv, может быть получен путем введения ДНК, кодирующей указанный scFv, в клетку-хозяина и культивирования указанной клетки, как описано в другом месте в настоящем изобретении.

Одно из воплощений настоящего изобретения представляет собой мультимерное антитело, которое имеет более высокое сродство при связывании с антигеном по сравнению с мономерным антителом. Единицы указанного мультимерного антитела могут быть одинаковыми или отличаться друг от друга, когда одна единица связывается с одним эпитопом антигена и другая единица связывается с другим эпитопом того же самого антигена. Для получения мультимерного антитела может применяться связывание домена СН3 IgG и двух scFv, связывание со стрептавидином и введение мотива спираль-поворот-спираль.

Если это желательно, антитела настоящего изобретения могут быть мутированы в вариабельных доменах тяжелых и/или легких цепей для изменения связывающих свойств антитела. Например, может быть сделана мутация в одном или более участках CDR для увеличения или уменьшения Kd антитела и AXL, или для изменения связывающей специфичности антитела. Методы сайт-направленного мутагенеза хорошо известны в данной области техники. Смотри, например, Sambrook et al. и Ausubel et al., supra. Кроме того, в вариабельном участке антитела против AXL могут быть сделаны мутации по аминокислотному остатку, который, как известно, изменен по сравнению с зародышевой линией.

В другом аспекте, помимо мутаций, связанных с гуманизированием, могут быть введены дополнительные мутации в один или более каркасных участков. Мутация может быть сделана в каркасном участке или в константном домене для увеличения времени полу-жизни антитела против AXL. Смотри, например, WO 0009560. Мутация в каркасном участке или в константном домене может быть также сделана для изменения иммуногенности антитела, для создания участка для ковалентного или нековалентного связывания с другой молекулой, или для изменения таких свойств, как связывание комплемента. Мутации могут быть сделаны в каждом из каркасных участков, константном домене и вариабельных доменах единственного мутированного антитела. Альтернативно этому, мутации могут быть сделаны только в одном из каркасных участков, вариабельных участков или в константном домене единственного мутированного антитела.

Одно из воплощений настоящего изобретения представляет собой поликлональное антитело, включающее более чем одно антитело настоящего изобретения.

Одно из воплощений настоящего изобретения представляет собой химическую модификацию антитела настоящего изобретения или его функционального фрагмента. Для создания модифицированного антитела или модифицированного функционального фрагмента могут использоваться молекулы, такие как полимер (полиэтиленгликоль и тому подобное).

В дополнительном воплощении гуманизированное антитело согласно настоящему изобретению может содержать константный домен с эффекторными функциями, вследствие чего клетки, экспрессирующие AXL, которые будут связывать антитело, фрагмент антитела или его производное на клеточной поверхности, могут быть атакованы иммунной системой. Например, антитело может обладать способностью связывать комплемент и участвовать в комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC). Более того, антитело может обладать способностью связываться с Fc рецепторами на эффекторных клетках, таких как моноциты и клетки-натуральные киллеры (NK), и участвовать в антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC).

В еще одном дополнительном аспекте описываемые здесь антитела являются применимыми для терапевтического лечения, предпочтительно для лечения гиперпролиферативных заболеваний, сердечнососудистых заболеваний, в частности, атеросклероза и тромбоза, связанных с диабетом заболеваний, в частности, гломерулярной гипертрофии или диабетической нефропатии, и особенно заболеваний, связанных с, сопровождающихся или вызываемых экспрессией, сверхэкспрессией или гиперактивностью AXL. Гиперпролиферативные заболевания предпочтительно выбираются из заболеваний, связанных с, сопровождающихся или вызываемых экспрессией, сверхэкспрессией или гиперактивностью AXL, таких как рак, например, рак молочной железы, рак толстой кишки, рак легких, рак почек, фолликулярная лимфома, миелоидная лейкемия, рак/меланома кожи, глиобластома, рак яичников, рак простаты, рак поджелудочной железы, рак пищевода Барретта и рак пищевода, рак желудка, рак мочевого пузыря, рак шейки матки, рак печени, рак щитовидной железы, рак головы и шеи, или гиперпластические и неопластические заболевания или другие Гиперпролиферативные заболевания, связанные с экспрессией или сверхэкспрессией AXL.

Применимость антител настоящего изобретения для лечения любых связанных с AXL заболеваний, таких как Гиперпролиферативные заболевания, может быть продемонстрирована, показана или предположена с помощью экспериментов in vitro, m vivo или ex vivo, включая таковые по лиганд-индуцированному автофосфо