Способ сбора функциональных клеток in vivo с высокой эффективностью

Способ сбора функциональных клеток in vivo с высокой эффективностью

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Техническая область

Настоящее изобретение относится к новым высокоэффективным и минимально инвазивным способам сбора функциональных клеток, таких как стволовые клетки, которые существуют in vivo в крайне малом количестве.

Уровень техники

Общепринятые способы сбора высокофункциональных клеток из живого организма включают, например, способы сбора гемопоэтических стволовых клеток костного мозга, в которых осуществляют взятие костномозговой жидкости из костного мозга трубчатой кости или кости таза путем прямого введения иглы в костный мозг, и для введения человеку популяцию стволовых клеток концентрируют центрифугированием, и с помощью клеточного сортера собирают и подтверждают флуоресцентно меченные клетки с использованием в качестве индикатора поверхностных маркеров стволовых клеток; способы сбора стволовых клеток периферической крови, в которых осуществляют вовлечение гемопоэтических стволовых клеток в периферическую кровь путем введения G-CSF, отбирают периферическую кровь и выделяют гемопоэтические стволовые клетки из крови; и способы сбора мезенхимальных стволовых клеток, в которых мезенхимальные стволовые клетки выделяют путем сбора прикрепленных пролиферирующих клеток из прямой культуры жидкости костного мозга, или мезенхимальные стволовые клетки выделяют и культивируют из взятых хирургическим путем периферических тканей, таких как жировые ткани. Однако взятие костномозговой жидкости из костного мозга является в высокой степени инвазивным и болезненным, и вовлекает риск миелита вследствие внутрикостномозговой инфекции. Таким образом, данная процедура требует строгого медицинского контроля экспертами, и ее нельзя проводить часто. Взятие хирургическими способами периферических тканей также имеет такой же риск. Мобилизация гемопоэтических стволовых клеток с использованием G-CSF налагает большое экономическое бремя, и ее также нельзя проводить часто.

Совершенно очевидно, что создание эффективных и безопасных способов сбора биологически функциональных клеток может стать обнадеживающей новостью для многих пациентов, которые страдают трудноизлечимыми заболеваниями и нуждаются в таких клетках.

Документы уровня техники

Непатентные документы

Непатентный документ 1: Transplantation of hematopoietic stem cells from the peripheral blood. J. Cell Mol. Med. 2005; 9: 37-50

Непатентный документ 2: Role of mesenchymal stem cells in regenerate medicine: application to bone and cartilage repair. Expert Opin. Biol. Ther. 2008; 8: 255-268

Описание изобретения

Задачи, решаемые изобретением

Задачей настоящего изобретения является предоставление новых высокоэффективных и минимально инвазивных способов сбора функциональных клеток, таких как стволовые клетки, которые существуют in vivo в крайне малом количестве.

Средства для решения задач

Настоящее изобретение относится к совершенно новым высокоэффективным способам взятия биологически функциональных клеток путем только имплантации трубки в живой организм минимально инвазивным способом.

Конкретно, цилиндрические трубки (которые имеют длину 10 мм и площадь поперечного сечения 2 мм² и являются открытыми с одной стороны и закрытыми с другой стороны), изготовленные из биологически гипоаллергенного силикона, заполняли каждым из HMGB1, гиалуроновой кислоты, фосфатного буфера или сходными с ними, а затем имплантировали под кожу спины мышей с трансплантатом костного мозга с GFP. Трубки извлекали через две недели после имплантации, и клетки, иммобилизованные и скопившиеся в трубках, собирали. Некоторые из клеток культивировали, а другие анализировали в отношении маркеров клеточной поверхности посредством FACS. Результат показывает, что по сравнению с трубками, заполненными фосфатным буфером, значительно большее количество PDGFRα-положительных клеток собирали из пробирок, заполненных средством, отличным от фосфатного буфера, и эти популяции клеток содержали мезенхимальные стволовые клетки, способные дифференцироваться в кость и хрящ.

Исходя из описанных выше открытий, настоящее изобретение относится к следующему:

[1] способ сбора популяции клеток из емкости, удаленной из-под кожи организма;

[2] способ сбора популяции клеток из емкости, извлеченной из-под кожи организма, где клеточная популяция вовлечена в емкость одним из материалов (a)-(r), описанных ниже, или смесью любых двух или более из материалов согласно (a)-(r), описанным ниже:

(a) белок HMGB1;

(b) клетка, которая секретирует белок HMGB1;

(c) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок HMGB1;

(d) белок HMGB2;

(e) клетка, которая секретирует белок HMGB2;

(f) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок HMGB2;

(g) белок HMGB3;

(h) клетка, которая секретирует белок HMGB3; и

(i) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок HMGB3;

(j) белок S100A8;

(k) клетка, которая секретирует белок S100A8;

(l) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок S100A8;

(m) белок S100A9;

(n) клетка, которая секретирует белок S100A9;

(o) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок S100A9;

(p) гиалуроновая кислота;

(q) экстракт клетки или ткани; и

(r) гепарин-связывающая фракция экстракта клеток или тканей;

[3] способ сбора клетки костного мозга, который включает стадию выделения клетки костного мозга из популяции клеток, собранной из емкости, имплантированной под кожу;

[4] способ сбора клетки костного мозга, который включает стадию выделения клетки костного мозга из популяции клеток, собранной из емкости, имплантированной под кожу, где популяция клеток вовлечена в емкость с помощью любого из материалов (a)-(r), описанных ниже, или смеси любых двух или более из материалов (a)-(r), описанных ниже:

(a) белок HMGB1;

(b) клетка, которая секретирует белок HMGB1;

(c) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок HMGB1;

(d) белок HMGB2;

(e) клетка, которая секретирует белок HMGB2;

(f) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок HMGB2;

(g) белок HMGB3;

(h) клетка, которая секретирует белок HMGB3; и

(i) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок HMGB3;

(j) белок S100A8;

(k) клетка, которая секретирует белок S100A8;

(l) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок S100A8;

(m) белок S100A9;

(n) клетка, которая секретирует белок S100A9;

(o) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок S100A9;

(p) гиалуроновая кислота;

(q) экстракт клетки или ткани; и

(r) гепарин-связывающая фракция экстракта клеток или тканей;

[5] способ согласно [3] или [4], который включает стадию сбора популяции клеток из емкости, извлеченной из организма, перед стадией выделения клетки костного мозга из популяции клеток;

[6] способ согласно [2] или [4], где экстракт клетки или ткани получают способом, включающим стадию погружения клетки или ткани в растворитель;

[7] способ согласно [2] или [4], где гепарин-связывающую фракцию экстракта клетки или ткани получают способом, включающим стадии

(a) погружения клетки или ткани в растворитель;

(b) контактирования иммобилизованного гепарина с экстрактом, полученным на стадии (a); и

(c) элюирования гепарин-связывающей фракции с иммобилизованного гепарина;

[8] популяция клеток, собранная способом согласно любому из [1], [2], [6] и [7];

[9] клетка костного мозга, выделенная способом по любому из [3]-[7];

[10] средство для регенерации тканей, содержащее популяцию клеток согласно [8];

[11] средство для регенерации тканей, содержащее клетку костного мозга согласно [9];

[12] способ сбора популяции клеток, который включает стадии

(I) имплантации емкости под кожу; и

(II) сбора популяции клеток из емкости;

[13] способ согласно [12], который включает стадию введения любого из (a)-(r) или смеси любых двух или более из (a)-(r) в кровеносный сосуд или мышцу после стадии (I):

(a) белок HMGB1;

(b) клетка, которая секретирует белок HMGB1;

(c) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок HMGB1;

(d) белок HMGB2;

(e) клетка, которая секретирует белок HMGB2;

(f) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок HMGB2;

(g) белок HMGB3;

(h) клетка, которая секретирует белок HMGB3;

(i) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок HMGB3;

(j) белок S100A8;

(k) клетка, которая секретирует белок S100A8;

(l) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок S100A8;

(m) белок S100A9;

(n) клетка, которая секретирует белок S100A9;

(o) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок S100A9;

(p) гиалуроновая кислота;

(q) экстракт клетки или ткани; и

(r) гепарин-связывающая фракция экстракта клетки или ткани;

[14] способ согласно [12], в котором емкость содержит любой один или смесь любых двух или более из следующего:

(a) белок HMGB1;

(b) клетка, которая секретирует белок HMGB1;

(c) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок HMGB1;

(d) белок HMGB2;

(e) клетка, которая секретирует белок HMGB2;

(f) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок HMGB2;

(g) белок HMGB3;

(h) клетка, которая секретирует белок HMGB3;

(i) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок HMGB3;

(j) белок S100A8;

(k) клетка, которая секретирует белок S100A8;

(l) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок S100A8;

(m) белок S100A9;

(n) клетка, которая секретирует белок S100A9;

(o) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок S100A9;

(p) гиалуроновая кислота;

(q) экстракт клетки или ткани; и

(r) гепарин-связывающая фракция экстракта клетки или ткани;

[15] способ сбора клетки костного мозга, который включает стадии

(I) имплантации емкости под кожу;

(II) сбора популяции клеток из емкости; и

(III) выделения клетки костного мозга из собранной популяции клеток;

[16] способ согласно [15], который включает стадию введения любого одного из (a)-(r) или смеси любых двух или более из (a)-(r) в кровеносный сосуд или мышцу после стадии (I):

(a) белок HMGB1;

(b) клетка, которая секретирует белок HMGB1;

(c) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок HMGB1;

(d) белок HMGB2;

(e) клетка, которая секретирует белок HMGB2;

(f) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок HMGB2;

(g) белок HMGB3;

(h) клетка, которая секретирует белок HMGB3;

(i) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок HMGB3;

(j) белок S100A8;

(k) клетка, которая секретирует белок S100A8;

(l) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок S100A8;

(m) белок S100A9;

(n) клетка, которая секретирует белок S100A9;

(o) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок S100A9;

(p) гиалуроновая кислота;

(q) экстракт клетки или ткани; и

(r) гепарин-связывающая фракция экстракта клеток или тканей;

[17] способ согласно [15], в котором емкость содержит любой один, или смесь любых двух или более из следующего:

(a) белок HMGB1;

(b) клетка, которая секретирует белок HMGB1;

(c) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок HMGB1;

(d) белок HMGB2;

(e) клетка, которая секретирует белок HMGB2;

(f) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок HMGB2;

(g) белок HMGB3;

(h) клетка, которая секретирует белок HMGB3;

(i) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок HMGB3;

(j) белок S100A8;

(k) клетка, которая секретирует белок S100A8;

(l) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок S100A8;

(m) белок S100A9;

(n) клетка, которая секретирует белок S100A9;

(o) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок S100A9;

(p) гиалуроновая кислота;

(q) экстракт клетки или ткани; и

(r) гепарин-связывающая фракция экстракта клеток или тканей;

[18] способ согласно любому из [13], [14], [16] и [17], в котором экстракт клетки или ткани получают способом, включающим стадию погружения клетки или ткани в растворитель;

[19] способ согласно любому из [13], [14], [16] и [17], в котором гепарин-связывающую фракцию экстракта клетки или ткани получают способом, включающим стадии

(a) погружения клетки или ткани в растворитель;

(b) контактирования иммобилизованного гепарина с экстрактом, полученным на стадии (a); и

(c) элюирования гепарин-связывающей фракции с иммобилизованного гепарина;

[20] популяция клеток, собранная способом согласно любому из [12]-[14];

[21] клетка костного мозга, выделенная способом согласно любому из [15]-[17];

[22] средство для регенерации тканей, содержащее популяцию клеток согласно [20]; и

[23] средство для регенерации тканей, содержащее клетку костного мозга согласно [21].

Краткое описание фигур

На фиг.1 представлена схема высокоэффективного способа сбора биологически функциональных клеток. Гипоаллергенную трубку (силиконовую трубку или сходную с ней), заполненную фактором, который специфично привлекает биологически функциональные клетки, помещают в организм. В результате функциональные клетки селективно вовлекаются в трубку из периферического кровотока или ткани.

На фиг.2 представлена фотография, на которой показано, что клетки, скопившиеся в трубке (улавливающиеся в трубку клетки; TEC), являются GFP-положительными.

На фиг.3 представлен набор фотографий TEC через 24 часа после начала культивирования. На левой фотографии показано изображение светового поля с пролиферирующими фибробластоподобными клетками и клетками, подобными эпителиальными клеткам, прикрепившимися к пластмассовой культуральной чашке. На правой фотографии представлено изображение флуоресценции GFP в темном поле.

На фиг.4 представлен набор фотографий для оценки TEC, собранных из трубки, в отношении их способности дифференцироваться в остеобласты. Клетки, собранные из трубки, культивировали в индуцирующей дифференцировку остеобластов культуральной среде, и было подтверждено, что они дифференцируются в остеобласты, положительные по красителю ализарину красному, приблизительно за две недели.

На фиг.5 представлен набор фотографий для оценки TEC, собранных из трубки, в отношении их способности дифференцироваться в адипоциты. Клетки, собранные с трубки, культивировали в индуцирующей дифференцировку адипоцитов культуральной среде, и было подтверждено, что они дифференцируются в адипоциты, положительные по красителю масляному красному, приблизительно за две недели.

На фиг.6 представлен набор фотографий для оценки TEC, собранных с трубки, в отношении их способности дифференцироваться в эпидермальные клетки. Клетки, собранные с трубки, культивировали в индуцирующей рост эпидермальных клеток культуральной среде, и было подтверждено, что они дифференцируются в эпидермальные клетки, экспрессирующие кератиноцит-специфический кератин 5, приблизительно за две недели.

На фиг.7 представлен набор диаграмм для оценки экспрессии PDGFRα и CD44 на TEC. Подтверждено получение из трубки двойных положительных по PDGFRα и CD44 клеток.

На фиг.8 представлен набор фотографий, на которых показана детекция вестерн-блоттингом семейства HMGB в экстракте кожи новорожденной мыши.

На фиг.9 представлена схема экспрессирующего вектора HMGB1.

На фиг.10 представлен набор фотографий результатов вестерн-блоттинга для семейства очищенных рекомбинантных слитых белков метка Flag-HMGB, экспрессированных в клетках HEK293.

На фиг.11 представлен набор графиков, на которых показана хемотаксическая активность рекомбинантного HMGB1/HMGB2/HMGB3 в отношении костномозговых мезенхимальных стволовых клеток с использованием камеры Бойдена. Все рекомбинантные белки показали более высокую хемотаксическую активность по сравнению с контрольными группами.

На фиг.12 представлен набор графиков, на которых показан результат лечения в модели лечения кожных язв у мышей с использованием белков семейства HMGB. Все из HMGB1, HMGB2 и HMGB3 показали значимые эффекты в отношении снижения площади язвы по сравнению с контрольными группами.

На фиг.13 представлена фотография, на которой показана активность HMGB1 человека и экстракта кожи человека в отношении индукции миграции происходящих из костного мозга человека мезенхимальных стволовых клеток, подтвержденная с использованием камеры Бойдена.

На фиг.14 представлен набор фотографий, на которых показана активность активаторов, очищенных на колонке с гепарином, из экстрактов сердца, головного мозга и кожи мыши в отношении индукции мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, подтвержденная с использованием камеры Бойдена.

На фиг.15 представлен набор фотографий, на которых показана активность экстракта культивированной клеточной линии HEK293 или HeLa в отношении индукции миграции мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека, подтвержденная с использованием камеры Бойдена. Обе культивированные клеточные линии показали хемотаксическую активность в отношении мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека.

На фиг.16A представлена фотография, на которой показана мышь, фиксированная к стереотаксическому устройству для головного мозга с разрезом головы по средней линии скальпелем, с последующей трепанацией с использованием бура. На фиг.16B представлена фотография, на которой показан головной мозг, к которому применяют отрицательное давление с использованием шприца для отсасывания части ткани головного мозга. На фиг.16C представлена фотография мыши после инъекции 5 мкл очищенной на колонке с гепарином фракции экстракта кожи, растворенного в фибриновом адгезивном составе (фибриноген), и последующей инъекции 5 мкл состава фибринового клея (тромбин). На фиг.16D и 16E представлены фотографии модели повреждения головного мозга, полученные через 2 недели после лечения. Более высокое накопление положительных по GFP клеток наблюдали в группе лечения с использованием очищенной на колонке с гепарином фракции экстракта кожи, на E, по сравнению с контролем, на D. На фиг.16F и 16G представлены фотографии модели повреждения головного мозга, полученные через 6 недель после лечения. Более высокое накопление GFP-положительных клеток наблюдали в группе лечения с использованием очищенной на колонке с гепарином фракции экстракта кожи, на G, по сравнению с контролем, на F.

На фиг.17 представлена фотография, на которой показаны результаты анализа измерения активности в отношении миграции происходящих из костного мозга мезенхимальных стволовых клеток в экстрактах кожи с использованием камеры Бойдена. На этих изображениях показаны окрашенные синим цветом мезенхимальные стволовые клетки костного мозга, мигрировавшие из верхнего отделения камеры Бойдена через микропоры размером 8 мкм мембранного фильтра из поликарбоната в нижнее отделение, содержащее экстракты кожи, и прикрепившиеся к мембране со стороны нижнего отделения. В нижние отделения были помещены экстракты кожи, взятой от мышей в возрасте двух дней или шести недель.

На фиг.18 представлен набор фотографий детекции посредством вестерн-блоттинга белков S100A8 и S100A9 в экстрактах кожи.

На фиг.19 представлена фотография, на которой показано элюирование гепарин-связывающего белка кожных экстрактов, элюированного с аффинной колонки с гепарином посредством градиента концентрации NaCl. Белки в каждой фракции разделяли посредством SDS-PAGE и подвергали детекции окрашиванием серебром.

На фиг.20 представлена фотография, на которой показаны результаты анализа по измерению активности в отношении миграции происходящих из костного мозга мезенхимальных стволовых клеток в экстракты кожи с использованием камеры Бойдена. На изображении показаны окрашенные синим цветом мезенхимальные стволовые клетки костного мозга, которые мигрировали из верхнего отделения камеры Бойдена через микропоры фильтра к каждой гепарин-связывающей фракции в экстрактах (в нижнее отделение) и прикреплялись к мембране со стороны нижнего отделения.

На фиг.21 представлен набор фотографий, на которых показана детекция вестерн-блоттингом белков S100A8 и S100A9 в каждой гепарин-связывающей фракции экстрактов кожи.

На фиг.22 представлена схема экспрессирующего вектора для S100A8 или S100A9.

На фиг.23 представлена фотография, на которой показаны результаты измерения активности в отношении миграции происходящих из костного мозга мезенхимальных стволовых клеток в экстракты кожи с использованием камеры Бойдена. На этих изображениях показаны окрашенные синим цветом мезенхимальные стволовые клетки костного мозга, которые мигрировали из верхнего отделения камеры Бойдена через микропоры фильтра в нижнее отделение, содержащее рекомбинантный GST-S100A8, GST-S100A9 или экстракты кожи, и прикреплялись к мембране со стороны нижнего отделения.

На фиг.24A представлен набор диаграмм с результатами FACS для CD44, PDGFRα и PDGFRβ в отрицательной по CD45 фракции клеток в периферической крови через 12 часов после введения GST-S100A8 или GST-S100A через хвостовую вену мыши. На фиг.24B представлены графики, на которых показан количественный анализ популяций CD45-отрицательных, CD44-положительных, PDGFRα-положительных клеток или CD45-отрицательных, CD44-положительных, PDGFRβ-положительных клеток в периферической крови через 12 часов после введения GST-S100A8 или GST-S100A, исходя из результатов FACS.

На фиг.25 представлен график, на котором показан терапевтический эффект S100A8 на кожную язву у нормальных мышей.

На фиг.26 представлен график, на котором показан терапевтический эффект S100A8 на кожную язву у диабетических мышей.

На фиг.27 представлен график, на котором показан терапевтический эффект клеток, которые привлечены в устройство с использованием экстрактов кожи или экстрактов периферической крови, на кожную язву.

На фиг.28 представлен набор фотографий, на которых показана детекция на флуоресцентном микроскопе клеток костного мозга, привлеченных в устройство с использованием связывающихся с аффинной колонкой с гепарином компонентов экстрактов периферической крови.

На фиг.29 представлен график, на котором показана детекция клеток костного мозга, привлеченных в устройство с использованием связывающихся с аффинной колонкой с гепарином компонентов экстрактов периферической крови, с помощью флуоресцентной микроскопии, и определение количества клеток костного мозга с использованием программного обеспечения для анализа изображений.

На фиг.30 представлен график, на котором показана детекция происходящих из костного мозга клеток (GFP-положительных клеток), привлеченных в устройство с использованием S100A8, HMGB1, HMGB2 или HMGB3 (A, S100A8; B, HMGB1; C, HMGB2; D, HMGB3; E, отрицательный контроль) посредством флуоресцентной микроскопии.

На фиг.31 представлен набор фотографий, на которых показан терапевтический эффект на кожную язву, развившуюся у мышей BALB/cAJcl-nu/nu, происходящих из костного мозга клеток, привлеченных в устройство с использованием S100A8, HMGB1 или HMGB2.

На фиг.32 представлена схема экспрессирующего вектора для HMGB1.

На фиг.33 представлена схема введения экстракта кожи (SE) мыши через хвостовую вену с последующим взятием периферической крови.

На фиг.34 показана диаграмма, на которой показано фракционирование посредством проточной цитометрии фракции мононуклеарных клеток периферической крови, флуоресцентно меченных антителом против PDGFRα мыши и антителом против CD44 мыши через 12 часов после введения экстракта кожи (SE). Верхние три диаграммы соответствуют группе введения PBS (n=3) в качестве отрицательного контроля, а нижние три диаграммы соответствуют группе введения экстракта кожи (SE) (n=3). Вертикальная ось указывает на уровень экспрессии CD44, а горизонтальная ось указывает на уровень экспрессии PDGFRα. Область, заключенная в рамку, соответствует популяции двойных положительных по CD44 и PDGFRα клеток. Популяция была увеличена в группе введения экстракта кожи (SE) по сравнению с группой введения PBS.

На фиг.35 представлена схема введения HMGB1 мыши через хвостовую вену с последующим взятием периферической крови.

На фиг.36 представлена схема, на которой показано фракционирование проточной цитометрией фракции мононуклеарных клеток периферической крови, флуоресцентно меченных антителом против PDGFRα мыши и антителом против CD44 мыши через 12 часов после введения HMGB1. Левая диаграмма соответствует мышам, которым вводили PBS в качестве отрицательного контроля, а правая диаграмма соответствует мышам, которым вводили HMGB1. Вертикальная ось указывает на уровень экспрессии CD44, а горизонтальная ось указывает на уровень экспрессии PDGFRα. Область, заключенная в рамку, соответствует популяции двойных положительных по CD44 и PDGFRα клеток. У мышей, которым вводили HMGB1, популяция была увеличена по сравнению с мышами, которым вводили PBS.

На фиг.37A представлена диаграмма результата проточной цитометрии, на которой показано присутствие клеток, имеющих CD44 и PDGFRα. Введение HMGB1 приводило к увеличению популяций как двойных положительных по PDGFRα и CD44 клеток, так и положительных PDGFRα, отрицательных по CD44 клеток, в периферической крови. На фиг.37B и 37C представлены результаты сравнения между группами введения PBS и HMGB1 в отношении присутствия двойных положительных по PDGFRα и CD44 клеток и положительных по PDGFRα, отрицательных по CD44 клеток в периферической крови, соответственно. Обе популяции клеток были на статистически значимом уровне увеличены в группе введения HMGB1.

Способы осуществления изобретения

Настоящее изобретение относится к способу сбора популяции клеток из емкости, извлеченной из-под кожи организма.

Также настоящее изобретение относится к способу сбора клеток костного мозга, который включает стадию выделения клетки костного мозга из популяции клеток, собранной из емкости, имплантированной под кожу. Указанный выше способ может включать стадию сбора популяции клеток из емкости, извлеченной из организма, до стадии выделения клеток костного мозга из популяции клеток.

Настоящее изобретение относится к способу сбора популяции клеток, который включает стадии

(I) имплантации емкости под кожу; и

(II) сбора популяции клеток из емкости.

Более того, настоящее изобретение относится к способу сбора клеток костного мозга, который включает стадии

(I) имплантации емкости под кожу;

(II) сбора популяции клеток из емкости; и

(III) выделения клеток костного мозга из собранной популяции клеток.

Альтернативно способы, описанные выше, могут включать после стадии (I) стадию извлечения емкости из-под кожи.

Предпочтительные материалы для описанной выше емкости включают, но не ограничиваются ими, силикон, винил, пластмассу и другие биологически гипоаллергенные материалы. При этом размер емкости, использованной в примерах, составлял 10 мм в длину × площадь поперечного сечения 2 мм (с объемом 20 мл; для мышей); однако размер не ограничен указанным выше примером при условии, что емкость можно имплантировать под кожу. Толщина стенки емкости, использованной в примерах, составляла приблизительно 0,5 мм; однако толщина не ограничена указанными выше примерами при условии, что она является достаточной для поддержания надлежащей прочности. Форма емкости, использованной в примерах, представляла собой цилиндрическую форму, открытую только с одной стороны; однако форма конкретно не ограничена при условии, что она не повреждает биологические ткани; и форма включает цилиндрическую, веретенообразную, сферическую и яйцевидную формы. Емкости, использованные по настоящему изобретению, включают силиконовые трубки, виниловые мешки и постоянные инъекционные иглы. Емкости конкретно не ограничены при условии, что они представляют собой имплантируемые медицинские материалы или устройства in vivo.

В настоящем изобретении популяции клеток, собранные из емкости, включают происходящие из костного мозга клетки.

Клетки костного мозга по настоящему изобретению представляют собой клетки, отличные от гемопоэтических стволовых клеток, или клеток, происходящих из них, таких как лейкоциты, эритроциты и тромбоциты, и они включают стволовые клетки, которым соответствуют клетки, до настоящего времени называемые мезенхимальными стволовыми клетками костного мозга, стромальными плюрипотентными стволовыми клетками костного мозга или плюрипотентными стволовыми клетками костного мозга и ткани, и популяции клеток-предшественников, существующие в костном мозге. Клетки костного мозга по настоящему изобретению можно выделять из коллекции костного мозга (коллекции клеток костного мозга) или коллекции периферической крови. Гемопоэтические стволовые клетки являются неприкрепяющимися, в то время как клетки костного мозга по настоящему изобретению получают в качестве прикрепляющихся клеток посредством клеточной культуры фракции мононуклеарных клеток крови, полученных из коллекции костного мозга (коллекции клеток костного мозга) или коллекции периферической крови. Более того, клетки костного мозга по настоящему изобретению включают мезенхимальные стволовые клетки, и они обладают потенциалом к дифференцировке, предпочтительно, в остеобласты (эту индукцию дифференцировки можно идентифицировать путем выявления кальцификации), хондроциты (которые можно идентифицировать по положительному окрашиванию альциановым синим, по положительному окрашиванию сафранином O, или сходными с ними), адипоциты (которые можно идентифицировать по положительному окрашиванию суданом III), и другие мезенхимальные клетки, такие как фибробласты, гладкомышечные клетки, стромальные клетки и клетки сухожилий; и, кроме того, нервные клетки, эпителиальные клетки (например, эпидермальные кератиноциты и эпителиальные клетки кишечника экспрессируют семейство цитокератинов), и сосудисто-эндотелиальные клетки. Однако, клетки, в которые может происходить дифференцировка, не ограничиваются указанными выше клетками, и также они включают клетки, имеющие потенциал к дифференцировке в клетки паренхиматозных органов, таких как печень, почка и поджелудочная железа.

В настоящем изобретении происходящие из костного мозга мезенхимальные стволовые клетки, плюрипотентные стромальные стволовые клетки костного мозга или плюрипотентные стволовые клетки костного мозга относятся к клеткам, существующим в костном мозге, которые непосредственно получают из костного мозга или опосредованно получают из других тканей (крови, кожи, жировой ткани и других тканей), и их можно культивировать/они могут пролиферировать в качестве прикрепляющихся клеток на культуральной чашке (изготовленной из пластмассы или стекла). Эти клетки характеризуются наличием потенциала к дифференцировке в мезенхимальные ткани (мезенхимальные стволовые клетки), такие как кость, хрящ и жировая ткань, или скелетные мышцы, сердечная мышца, кроме того, нервные ткани, эпителиальные ткани (плюрипотентные стволовые клетки) и их можно получать из коллекции крови костного мозга, периферической крови или мезенхимальных тканей, таких как жировая ткань, эпителиальные ткани, такие как кожа, нервные ткани, такие как головной мозг. Происходящие из костного мозга мезенхимальные стволовые клетки, происходящие из костного мозга плюрипотентные стволовые клетки или плюрипотентные стволовые клетки костного мозга также характеризуются наличием потенциала к дифференцировке в эпителиальные ткани, такие как кератиноциты, которые образуют кожу, или в нервные ткани, которые образуют головной мозг, путем введения клеток, которые прикрепились к культуральной чашке, в область повреждения живого организма.

Мезенхимальные стволовые клетки костного мозга, стромальные плюрипотентные стволовые клетки костного мозга или плюрипотентные стволовые клетки костного мозга по настоящему изобретению представляют собой мультипотентные стволовые клетки, и они способны дифференцироваться предпочтительно в остеобласты (индукцию дифференцировки можно идентифицировать путем выявления кальцификации), хондроциты (которые можно идентифицировать по положительному окрашиванию альциановым синим, по положительному окрашиванию сафранином O, или сходными с ними), адипоциты (которые можно идентифицировать по положительному окрашиванию суданом III или т.п.), и другие мезенхимальные клетки, такие как фибробласты, гладкомышечные клетки, клетки скелетных мышц, стромальные клетки и клетки сухожилий; нервные клетки, пигментные клетки, эпидермальные клетки, клетки волосяного фолликула (которые экспрессируют семейство цитокератинов, семейство кератина волос или сходные с ними), эпителиальные клетки (например, эпидермальные кератиноциты и эпителиальные клетки кишечника экспрессируют семейство цитокератинов или сходные с ним), и эндотелиальные клетки; и, кроме того, предпочтительно в клетки паренхиматозных органов, таких как печень, почка и поджелудочная железа. Однако дифференцированные клетки не ограничены указанными выше клетками.

Клетки-предшественники тканей определяют как недифференцированные клетки, имеющие однонаправленную способность к дифференцировке в клетки конкретных тканей, отличных от кроветворной системы, и они включают недифференцированные клетки, способные дифференцироваться в мезенхимальную ткань, эпителиальную ткань, нервную ткань, паренхиматозные органы и сосудистый эндотелий, как упоминалось выше.

Между тем, клетки костного мозга по настоящему изобретению включают, но не ограничиваются ими, например, клетки костного мозга, положительные по меньшей мере по одному из маркеров клеточной поверхности: CD44, PDGFRα и PDGFRβ.

В настоящем изобретении стадию имплантации емкости под кожу проводят путем проведения надреза на коже размером несколько миллиметров скальпелем после общей (или местной) анестезии; создания необходимого пространства в подкожной жировой ткани путем тупого отделения с использованием металлического стержня с округлым концом (кровоостанавливающий зажим "Москит" или сходные с ним); имплантации емкости для сбора клеток, такой как силиконовая трубка, в пространство; и, наконец, закрытия надреза швом или скобками.

Возможные альтернативные способы помещения емкостей под кожей включают способы, в которых под кожу помещают внутреннюю часть и наружную оболочку инъекционной иглы, а затем удаляют внутреннюю часть (инъекционную иглу), оставляя наружную оболочку внутри; и способы, в которых помещают баллонный катетер поверх направляющей проволоки под кожей, и оставляют катетер после удаления направляющей проволоки путем расширения баллона фармацевтической жидкостью.

Индивиды, которым имплантируют емкость, включают людей и не являющихся человеком животных, включая, например, людей, мышей, крыс, обезьян, свиней, собак, кроликов, хомяков и морских свинок. Предпочтительным индивидом является человек.

В настоящем изобретении стадия сбора популяций клеток из емкостей может представлять собой либо стадию сбора популяций клеток из емкостей, имплантированных под кожу, либо стадию удаления емкостей из-под кожи с последующим сбором популяций клеток из удаленных емкостей. Например, в примерах настоящего документа описано, что силиконовые трубки, имплантированные под кожу, извлекали через надрез в коже и клетки собирали из трубок аспирированием с использованием пипеток. Однако также доступны другие способы.

Способы сбора популяций клеток из емкостей, имплантированных под кожу, проводят следующим образом: емкость, подлежащую имплантации под кожу, модифицируют так, чтобы она была удлиненной, образуя конец в форме трубки; подобную трубке часть фиксируют снаружи организма; к трубке во время сбора клеток присоединяют шприц; и клетки собирают вакуумным аспирированием. Затем в трубку, имплантированную в организм, повторно инъецируют индуцирующий клетки раствор, такой как раствор HMGB1. Это обеспечивает многократный сбор клеток из емкости, имплантированной под кожу. В организм имплантируют емкости, форма которых пригодны для этих способов.

В настоящем изобретении стадию выделения клеток костного мозга из собранных популяций клеток проводят, например, путем выделения клеток, прикрепленных к культуральным чашкам, из популяций собранных клеток.

В другом способе, например, клетки собирают пипетированием из трубок, извлеченных из организма; проведением реакции по меньшей мере одного из маркеров клеточной поверхности, CD44, PDGFRα и PDGFRβ, с антителами, меченными различными типами флуоресцентных меток; а затем использованием клеточного сортера для выделения популяций клеток, имеющих конкретные маркеры клеточной поверхности, в присутствии каждого типа флуоресценции в качестве индикатора.

Существует альтернативный способ (MACS), который проводят, например, следующим образом: маркеры клеточной поверхности подвергают реакции аналогичным образом с антителами, меченными металлическими частицами вместо флуоресцентных меток; клетки, связавшиеся со связанными с металлом антителами, привлекают и иммобилизуют на внутренней стенке одной стороны тр