Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с3 комплемента человека по способности связываться с лизоцимом

Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с3 комплемента человека по способности связываться с лизоцимом

Реферат

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах.

Наиболее перспективным из современных методов определения белков сыворотки крови является метод иммуноферментного анализа благодаря своей чувствительности, избирательности и возможности автоматизации аналитического процесса.

Известен способ определения функциональной активности компонента C3 [1], который предусматривает сорбцию в лунках микропанели лизоцима - активатора альтернативного пути и реагента R3, как источника факторов B и D человека, необходимых для формирования C3 конвертазы альтернативного пути комплемента.

Недостатком этого способа является участие в процессе активации компонента C3, C3 конвертазы, формируемой из компонентов или факторов комплемента реагента R3, поскольку при проведении определения активности компонента C3 в сыворотках крови неизбежно создаются условия активации комплемента по альтернативному пути, что затрагивает и другие компоненты комплемента и может приводить к их неспецифической сорбции на поверхности лунок микропанели.

Задачей заявленного изобретения является разработка способа и набора на основе иммуноферментного метода, позволяющего определять функциональную активность компонента C3 комплемента человека в условиях отсутствия активации ни одного из путей комплемента и не требующих участия других компонентов комплемента и не затрагивающих их, если они присутствуют в анализируемой пробе.

Поставленная задача достигается путем разработки способа определения и набора. Способ определения предусматривает сорбцию в лунках микропанели препаратов, содержащих лизоцим, затем внесение в лунки микропанели раствора, содержащего компонент С3 комплемента человека с неизвестной активностью, проведение инкубации в присутствии ЭДТА для блокирования всех путей активации комплемента, в ходе которой происходит связывание С3 на сорбированном лизоциме, выливание содержимого лунок, а затем внесение конъюгата фермента с антителами против компонента С3 человека, отмывание несвязавшегося конъюгата, внесение субстрата конъюгированного фермента и проведение расчета активности компонента С3 по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции. Тем самым достигается определение функциональной активности С3 иммуноферментным методом, пригодным для стандартизации.

Набор содержит плоскодонную микропанель с сорбированным лизоцимом, конъюгат фермента с антителами к компоненту С3 комплемента человека, субстратный буфер и донорскую сыворотку крови с известной активностью С3 в качестве стандарта.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка способа и набора для иммуноферментного определения функциональной активности компонента С3 комплемента человека, обладающего хорошей воспроизводимостью результатов и отсутствием необходимости активации всей системы комплемента за счет использования обнаруженной способность препаратов лизоцима прочно и одинаково связывать (по-видимому, ковалентно) только функционально активные молекулы компонента С3.

Обнаруженная способность препаратов лизоцима не зависит от наличия в среде солей кальция и магния, необходимых для активации классического и лектинового путей, только магния для альтернативного пути, а также в среде с ЭДТА, когда отсутствие ионов кальция и магния полностью блокирует возможность активации комплемента.

Пример 1. Определение функциональной активности компонента С3 комплемента человека. Аптечный препарат лизоцим в 0,05 М натрий-карбонатном буфере, pH 9,5, с конечной концентрацией 5-20 мкг/мл вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонного полистиролового 96-луночного планшета. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4°C. Три раза отмывают микропанель 0,2 М натрий-фосфатным буферным раствором, pH 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 50 мМ ЭДТА (этилендиаминтетраацетат натрия), заливая по 150 мкл в каждую лунку, затем микропанель осушают путем вытряхивания остатка жидкости. В лунки микропанели вносят по 100 мкл раствора, содержащего определяемый компонент С3 в том же буфере. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°C, трехкратной отмывки фосфатным буфером, pH 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 0,05% Твин-20, и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами против С3 человека в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°C, пятикратной отмывки с детергентом и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного буфера (3,3′,5,5′-тетраметилбензидин в 15 мл цитратно-фосфатного буфера, pH 5,0, и 50 мкл 3% перекиси водорода). После 15-30 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 450 нм. Количество активного компонента С3 рассчитывают по стандартной кривой (рис. 1).

Пример 2. Набор для определения функциональной активности компонента C3. Набор содержит плоскодонную микропанель с сорбированным препаратом лизоцима, конъюгат пероксидазы с антителами к компоненту C3 комплемента человека, субстратный буфер и донорскую сыворотку крови с известным содержанием активного компонента C3 в качестве стандарта. Данный набор используется в соответствии с примером 1.

Из приведенных результатов следует, что измеряемая оптическая плотность линейно (R²=0.99) зависит от концентрации активного компонента C3 и позволяет достоверно определять функциональную активность компонента C3 в количествах от 1 нг описанным способом с использованием описанного набора (рис. 1).

ЛИТЕРАТУРА

1. Л.В. Козлов, Гора Н.В. Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента C3 комплемента человека по альтернативному пути активации. Патент 2380707. 27.01.2010.

1. Способ иммуноферментного определения функциональной активности компонента С3 комплемента человека по способности связываться с лизоцимом, характеризующийся тем, что аптечный препарат лизоцим сорбируют в лунках микропанели для иммуноферментного анализа, затем в лунки микропанели вносят раствор анализируемой пробы, содержащий компонент С3 комплемента с неизвестной активностью, проводят инкубацию с сорбированным лизоцимом в присутствии только ЭДТА и после осушения планшета и отмывки в лунки вносят конъюгат фермента с антителами против компонента С3 человека и субстрат этого фермента, после чего проводят расчет активности компонента С3 по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции.

2. Набор для определения функциональной активности компонента С3 комплемента человека, характеризующийся тем, что он содержит плоскодонную микропанель с сорбированным препаратом лизоцима, ЭДТА, конъюгат фермента с антителами к компоненту С3 комплемента человека, субстратный буфер и донорскую сыворотку крови с известной активностью С3 в качестве стандарта.