Иммунобиологическое средство для терапии рака мочевого пузыря на основе бцж и способ его использования

Иммунобиологическое средство для терапии рака мочевого пузыря на основе бцж и способ его использования

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Изобретение относится к препаратам, созданным на основе вакцин для использования их в онкоурологии, и может быть использовано для терапии рака мочевого пузыря, а также для профилактики рецидивов рака мочевого пузыря после оперативного лечения.

Предшествующий уровень техники

В настоящее время рак мочевого пузыря (РМП) по данным Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) является одной из самых распространенных форм рака в мире. Частота встречаемости РМП среди опухолей различных локализаций составляет от 3 до 5%. Ежегодно в России рак мочевого пузыря диагностируется у 11-15 тысяч людей, при этом более 7 тысяч людей погибают.

Известно, что основным методом лечения РМП является трансуретальная резекция (ТУР) опухоли (в кн.: «Современная диагностика и хирургия рака мочевого пузыря» / Под ред. Когана М.И. и Перепечай В.А. - Изд-во РГМУ, г. Ростов-на-Дону, 2002 г. - С. 61-66), однако у большинства больных (более 60%) возникают рецидивы и РМП начинает прогрессировать заново, на большей глубине инвазии и с более агрессивным течением.

Одной из важнейших задач современной онкоурологии является поиск методов, которые бы позволили улучшить результаты оперативного лечения.

Известен способ лечения РМП, в котором авторы предлагают проводить послеоперационную иммунопрофилактику различными противоопухолевыми препаратами и химиопрепаратами после оперативного удаления опухоли (Матвеев Б.П., Фигурин К.М. и Карякин О.Б. "Рак мочевого пузыря", Москва, 2001 г.). Однако недостатком указанного метода является зависимость эффективности лечения от дозы иммуномодуляторов, а также высокая токсичность химиопрепаратов, которые действуют на стенку мочевого пузыря. Также к недостаткам метода можно отнести относительно низкую эффективность проникновения иммуномодуляторов и химиопрепаратов через слизистый слой мочевого пузыря.

Известно решение (патент РФ № RU 2290096), при котором предлагается способ введения химиопрепаратов с помощью микроирригаторов, которые вшивают в подслизистый слой мочевого пузыря пациентов после оперативного вмешательства. Данный способ позволяет уменьшить общую токсичность химиопрепаратов за счет локального введения, однако имеет недостаток, связанный с высокой травматичностью метода, поскольку требует дополнительного оперативного вмешательства для удаления микроирригаторов.

Известно решение согласно клиническим исследованиям компании Halozyme Therapeutics, Inc. № HZ2-08-01 (вторичный № NCT00782587), где заявлено использование гиалуронидазы совместно с химиопрепаратом митомицином С, которые вводятся в мочевой пузырь после трансуретальной резекции неинвазивной опухоли. В данном случае гиалуронидаза используется для повышения эффективности проникновения противоопухолевого антибиотика в клетки мочевого пузыря. Авторы отмечают снижение рецидивов, представленных только неинвазивными опухолями мочевого пузыря, в течение первого года с 50% (при обработке только митомицином С) до 30% (при совместной обработке митомицином С и гиалуронидазой).

Известно решение (патент US 8,273,721 В2), в котором предлагается способ использования препарата вальрубицина совместно с ферментами, разрушающими слизь (трипсин и гиалуронидаза). В указанном решении ферменты, разрушающие слизь мочевого пузыря, используются для повышения эффективности проникновения противоопухолевого препарата вальрубицина в клетки мочевого пузыря.

Известно также решение по патенту US 5194257, где заявлено использование бацилл Кальмета-Герена (БЦЖ), которые вводятся в мочевой пузырь после оперативного удаления опухоли. Данное решение основывается на том, что БЦЖ является мощным неспецифическим иммуностимулятором, вызывающим комплекс локальных иммунных реакций, в котором задействованы Т- и В-лимфоциты, макрофаги и целый ряд цитотоксичеких цитокинов, что обеспечивает ее противоопухолевую активность.

Данное техническое решение как наиболее близкое к заявляемому по составу действующего вещества и способу его использования выбрано авторами заявляемого изобретения за прототип.

К недостаткам прототипа можно отнести следующее:

1) Низкая эффективность проникновения БЦЖ в уротелий мочевого пузыря при внутрипузырном введении.

2) Относительно низкая иммуностимулирующая активность, требующая введения высоких доз БЦЖ, что приводит к увеличению токсичности.

Таким образом, в уровне техники существует острая потребность в разработке эффективного иммунобиологического средства для лечения рака мочевого пузыря вообще, а также после оперативного удаления опухолей, которое было бы лишено указанных недостатков.

Сущность изобретения

Задачей настоящего изобретения является создание иммунобиологического средства для терапии рака мочевого пузыря на основе БЦЖ, которое способно высокоэффективно проникать в уротелий мочевого пузыря через секрет слизистого слоя, в то же время иммунобиологическое средство должно обладать высокой иммуностимулирующей активностью.

Задача решается за счет создания нового иммунобиологического средства. Сущность созданного иммунобиологического средства для лечения рака мочевого пузыря на основе БЦЖ состоит в том, что оно дополнительно содержит фермент с обеспечением расщепления секрета слизистой оболочки мочевого пузыря и буфер, взятые в терапевтически эффективном соотношении. При этом в иммунобиологическом средстве в качестве фермента используют гиалуронидазу, или нейраминидазу, или гиалуронидазу и нейраминидазу. В иммунобиологическом средстве в дозе на одну инсталляцию в мочевой пузырь содержится:

БЦЖ - от 10³ КОЕ/дозу до 10¹⁰ КОЕ/дозу;

Фермент, расщепляющий секрет слизистой оболочки мочевого пузыря, а именно:

гиалуронидазы от 1 до 100000 единиц/дозу;

нейраминидазы от 0,001 до 100 единиц/дозу;

или их смесь в любых соотношениях;

Буфер - остальное.

Способ использования иммунобиологического средства для лечения рака мочевого пузыря заключается во введении заявленного иммунобиологического средства в мочевой пузырь. При этом в мочевой пузырь вводится только иммунобиологическое средство. Или в мочевой пузырь предварительно вводится фермент, расщепляющий секрет слизистой оболочки мочевого пузыря, в заявленном для иммунобиологического средства количестве, а затем иммунобиологическое средство. Указанный способ используют у пациента, страдающего раком мочевого пузыря. При этом указанный способ используют для лечения пациента, страдающего раком мочевого пузыря, самостоятельно, без хирургического вмешательства, или после трансуретальной резекции рака мочевого пузыря. При введении фермента перед введением иммунобиологического средства в качестве фермента, расщепляющего секрет слизистой оболочки мочевого пузыря, используют гиалуронидазу, или нейраминидазу, или гиалуронидазу и нейраминидазу.

Раскрытие изобретения

Указанная выше задача настоящего изобретения решается за счет того, что создано иммунобиологическое средство для лечения рака мочевого пузыря на основе БЦЖ, при этом данное иммунобиологическое средство дополнительно включает фермент(ы), расщепляющий(ие) полисахариды секрета слизистого слоя мочевого пузыря. Также разработан комбинированный способ лечения мочевого пузыря, позволяющий решить указанную задачу.

В качестве ферментов используют гиалуронидазу, нейраминидазу или их композиции. При этом 1 терапевтическая доза препарата включает:

БЦЖ - от 10³ КОЕ/дозу до 10¹⁰ КОЕ/дозу

Гиалуронидазу от 1 до 100000 условных единиц активности (УЕ)

Нейраминидазу от 0,001 до 100 Международных единиц активности (ME)

Буфер - остальное.

Заявленное иммунобиологическое средство используют в эффективном количестве для терапии рака мочевого пузыря.

Противоопухолевое действие БЦЖ связано с тем, что она обладает иммуностимулирующими свойствами. Известно, что в состав данных бактерий входят структуры, которые являются лигандами рецепторов врожденной иммунной системы (TLR4, TLR5 и др.). Взаимодействие компонентов БЦЖ с данными рецепторами приводит к активации различных транскрипционных факторов (например, транскрипционного фактора NF-kB), контролирующих экспрессию целого ряда провоспалительных молекул.

Так, было показано, что введение БЦЖ усиливает экспрессию адгезионных и костимуляторных молекул, включая внутриклеточные адгезионные молекулы ICAM-1, которые влияют на связывание Т-лимфоцитов и нейтрофилов с опухолевыми клетками. Также есть литературные данные, указывающие на то, что при введении данных бактерий увеличивается экспрессия HLAII, CD80, CD1b молекул, происходит индукция экспрессии ряда цитокинов, таких как интерлейкин-8 (ИЛ-8), интерлейкин-6 (ИЛ-6), фактор некроза опухолей альфа (TNFα), гранулоцитарно-макрофагальный фактор роста (GM-CSF).

Актуальной проблемой, ограничивающей использование БЦЖ-вакцины для лечения опухолевых образований в мочевом пузыре, является низкая эффективность их проникновения через секрет слизистой оболочки мочевого пузыря, состоящий из гликозамингликанов. Для более эффективной доставки различных веществ в клетки мочевого пузыря необходимо хотя бы частично разрушить секрет слизистой оболочки. Данная проблема решается в заявляемом иммунобиологическом средстве за счет включения в его состав ферментов или их композиций (гиалуронидаза, нейраминидаза), которые расщепляют секрет слизистой оболочки мочевого пузыря, тем самым способствуя прикреплению и проникновению БЦЖ в клетки мочевого пузыря. Так гиалуронидаза расщепляет кислые мукополисахариды (в т.ч. муцин, гиалуроновую кислоту, хондроитин-сульфат, дерматан-сульфат, которые входят в состав секрета слизистой оболочки мочевого пузыря). Нейраминидаза гидролизует сиаловые кислоты в олигосахаридах, гликопротеинах, гликолипидах, что также способствует проникновению БЦЖ через слизистый слой мочевого пузыря, богатый сиаловой кислотой.

Более того, известно, что при развитии рака любой этиологии опухолевые клетки имеют более выраженный гликокаликс по сравнению с нормальными клетками, что приводит к снижению эффективности распознавания таких клеток иммунной системой, а также снижению эффективности доставки различных препаратов внутрь этих клеток. Известно решение (патент US 6,977,169 В2), где предлагается использовать периодические введения раствора нейраминидазы для лечения широкого спектра новообразований, что способствует частичной деградации гликокаликса опуолевых клеток и повышению эффективности распознавания таких клеток иммунной системой.

Исследования, показывающие эффективность иммунобиологического средства, разработанного авторами, включают: оценку эффективности проникновения БЦЖ в клетки мочевого пузыря; оценку влияния схем введения иммунобиологического средства на эффективность проникновения БЦЖ в клетки мочевого пузыря; сравнительный анализ способности индуцировать иммунные реакции; оценку противоопухолевой активности и токсичности.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 представлена гистограмма, показывающая изменение титра КОЕ БЦЖ в клетках RT-4 при добавлении к ним иммунобиологического средства, содержащего различное количество ферментов, расщепляющих секрет слизистого слоя мочевого пузыря: гиалуронидазы и нейраминидазы.

Ось ординат - титр КОЕ БЦЖ.

Ось абсцисс - концентрация гиалуронидазы (УЕ/дозу).

Ось аппликат - концентрация нейраминидазы (МЕ/дозу).

На фиг. 2 представлена гистограмма, показывающая изменение концентрации цитокинов ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-13, ФНОальфа, ИФНгамма в клетках RT-4 при добавлении иммунобиологического средства на основе вакцины БЦЖ.

Ось ординат - концентрация цитокинов, пг/мл.

Ось абсцисс: 1 - ИЛ-2, 2 - ИЛ-6, 3 - ИЛ-8, 4 - ИЛ-13, 5 - ФНО альфа, 6 - гамма интерферон.

- Фосфатный буфер

- БЦЖ в количестве 10⁸ КОЕ/дозу

- БЦЖ в количестве 10¹¹ КОЕ/дозу

- Иммунобиологическое средство на основе вакцины БЦЖ (10⁸ КОЕ/дозу), при этом оно включает фермент гиалуронидазу в количестве 10000 УЕ/дозу

- Иммунобиологическое средство на основе вакцины БЦЖ (10⁸ КОЕ/дозу), при этом оно включает фермент нейраминидазу в количестве 10 МЕ/дозу

- Иммунобиологическое средство на основе вакцины БЦЖ (10⁸ КОЕ/дозу), при этом оно включает ферменты гиалуронидазу в количестве 10000 УЕ/дозу и нейраминидазу в количестве 10 МЕ/дозу

На фиг. 3 представлена схема исследования противоопухолевой активности иммунобиологического средства на основе БЦЖ. По оси абсцисс указано время от начала эксперимента (дни),

А - введение клеток рака мочевого пузыря мышиМВ49,

В - введение стандартной вакцины БЦЖ,

С - введение иммунобиологического средства на основе БЦЖ, в качестве фермента используют гиалуронидазу,

D - введение иммунобиологического средства основе БЦЖ, в качестве фермента используют нейраминидазу,

Ε - введение иммунобиологического средства на основе БЦЖ, отличающейся тем, что в качестве фермента используют гиалуронидазу и нейраминидазу,

F - введение физиологического раствора.

На фиг. 4 представлены результаты исследования противоопухолевой активности иммунобиологического средства.

По оси абсцисс указано время от начала эксперимента (дни), по оси ординат - выживаемость животных (%),

1 - БЦЖ в количестве 10⁸ КОЕ/дозу,

2 - иммунобиологическое средство на основе БЦЖ, при этом в качестве фермента используют гиалуронидазу,

3 - иммунобиологическое средство на основе БЦЖ, при этом в качестве фермента используют нейраминидазу,

4 - иммунобиологическое средство на основе БЦЖ, при этом в качестве фермента используют гиалуронидазу и нейраминидазу,

5 - физиологический раствор.

На фиг. 5 представлена схема введения препаратов в исследовании влияния различных схем введения на эффективность проникновения БЦЖ в клетки мочевого пузыря.

По оси абсцисс указано время (минуты) введения препаратов,

А - введение стандартной вакцины БЦЖ,

В - введение иммунобиологического средства на основе вакцины БЦЖ, при этом она включает ферменты гиалуронидазу и нейраминидазу, С - введение смеси ферментов гиалуронидазы и нейраминидазы.

Примеры осуществления настоящего изобретения

Пример 1

Определение эффективных доз ферментов, расщепляющих секрет слизистой оболочки мочевого пузыря, в составе разрабатываемого иммунобиологического средства на основе БЦЖ.

Поскольку одной из основных проблем использования БЦЖ-вакцины для лечения опухолевых новообразований в мочевом пузыре является низкая эффективность проникновения бактерий в подслизистый слой, целью данного эксперимента было определение доз ферментов, расщепляющих секрет слизистой оболочки мочевого пузыря, в составе разрабатываемого иммунобиологического средства (на основе БЦЖ) по способности БЦЖ проникать в обработанные ферментами опухолевые клетки мочевого пузыря в условиях in vitro. Для этого были использованы клетки рака мочевого пузыря человека RT-4, т.к. известно, что эти клетки обладают весьма выраженным гликокаликсом, сходным по своему составу и структуре с секретом слизистого слоя мочевого пузыря. Клетки культивировали на минимальной ростовой среде DMEM с 10% эмбриональной телячьей сывороткой и в присутствии необходимого количества заменимых и незаменимых аминокислот, при температуре 37°С и содержании CO₂ 5%. Далее клетки помещали на 48-луночный планшет в концентрации 4×10⁴ клеток/лунку и инкубировали 16 часов (до конфлюентности 70-80%).

Далее был получен ряд иммунобиологических средств на основе вакцины БЦЖ (10⁸ КОЕ/дозу), гиалуронидазы (в следующих концентрациях: 1 УЕ/дозу, 10 УЕ/дозу, 100 УЕ/дозу, 1000 УЕ/дозу, 10000 УЕ/дозу, 100000 УЕ/дозу, 1000000 УЕ/дозу) и нейраминидазы (в следующих концентрациях: 0,001 МЕ/дозу, 0,01 МЕ/дозу, 0,1 МЕ/дозу, 1 МЕ/дозу, 10 МЕ/дозу, 100 МЕ/дозу, 1000 МЕ/дозу). Под дозой понимается количество препарата, предназначенное для единовременного (за 1 инсталляцию) введения в мочевой пузырь. Объем препарата, рекомендованный для одной инсталляции в мочевой пузырь, составляет 50 мл (инструкции к препаратам «Иммурон-вак», «Уро-БЦЖ медак»). Поскольку иммунобиологическое средство содержит живые бактериальные клетки, для разведения может быть использован любой изотонический растворитель надлежащего фармацевтического качества. В данном случае нами использовался физиологический раствор.

После разведения иммунобиологического средства 20 мкл из каждого образца было добавлено в соответствующие лунки планшета. Через три часа после добавления иммунобиологического средства клетки промывали трижды ростовой средой, чтобы избавиться от неприкрепившихся бактерий, и заливали свежей ростовой средой. Далее клетки инкубировали 18 часов. Затем клетки снимали с планшета, гомогенизировали с помощью керамических бус, готовили разведения и высевали на плотные питательные среды Левенштейна-Иенсена для определения титра КОЕ БЦЖ.

В таблице 1 представлены результаты анализа титра КОЕ БЦЖ, полученные с помощью высевов гомогенатов клеток RT-4, обработанных различными иммунобиологическими средствами на основе БЦЖ, отличающимися концентрациями ферментов, расщепляющих секрет слизистой оболочки мочевого пузыря.

Для наглядности полученные данные представлены также в виде трехмерной гистограммы (см. фиг. 1), где ось ординат - титр КОЕ БЦЖ, ось абсцисс - концентрация гиалуронидазы (УЕ/дозу), ось аппликат - концентрация нейраминидазы (МЕ/дозу).

Как видно из представленных данных, эффективность проникновения БЦЖ в опухолевые клетки рака мочевого пузыря человека RT-4 значительно выше при использовании иммунобиологического средства на основе БЦЖ в диапазоне концентраций гиалуронидазы от 100 до 1000000 УЕ/дозу и нейраминидазы от 1 до 1000 МЕ/дозу, чем при использовании стандартной вакцины БЦЖ.

Пример 2

Определение эффективных доз БЦЖ в составе разрабатываемого иммунобиологического средства на основе БЦЖ.

Целью данного эксперимента являлось определение эффективных доз БЦЖ в составе разрабатываемого иммунобиологического средства. Для этого были использованы клетки рака мочевого пузыря человека RT-4, т.к. известно, что эти клетки обладают весьма выраженным гликокаликсом, сходным по своему составу и структуре с секретом слизистого слоя мочевого пузыря. Клетки культивировали на минимальной ростовой среде DMEM с 10% эмбриональной телячьей сывороткой и в присутствии необходимого количества заменимых и незаменимых аминокислот, при температуре 37°С и содержании СО₂ 5%. Далее клетки помещали на 48-луночный планшет в концентрации 4×10⁴ клеток/лунку и инкубировали 16 часов (до конфлюентности 70-80%). Для исследования были выбраны дозы ферментов, расщепляющих секрет слизистой оболочки мочевого пузыря, которые лежат в середине исследованного в примере 1 рабочего диапазона концентраций: гиалуронидаза - 10000 УЕ/дозу, нейраминидаза - 10 УЕ/дозу.

Далее был получен ряд иммунобиологических средств на основе вакцины БЦЖ (в следующих концентрациях: 10³ КОЕ/дозу, 10⁴ КОЕ/дозу, 10⁵ КОЕ/дозу, 10⁶ КОЕ/дозу, 10⁷ КОЕ/дозу, 10⁸ КОЕ/дозу, 10⁹ КОЕ/дозу, 10¹⁰ КОЕ/дозу, 10¹¹ КОЕ/дозу), гиалуронидазы (10000 УЕ/дозу) и нейраминидазы (10 МЕ/дозу). В качестве контроля использовали вакцину БЦЖ в концентрациях: 10³ КОЕ/дозу, 10⁴ КОЕ/дозу, 10⁵ КОЕ/дозу, 10⁶ КОЕ/дозу, 10⁷ КОЕ/дозу, 10⁸ КОЕ/дозу, 10⁹ КОЕ/дозу, 10¹⁰ КОЕ/дозу, 10¹¹ КОЕ/дозу. Под дозой понимается количество препарата, предназначенное для единовременного (за 1 инсталляцию) введения в мочевой пузырь. Объем препарата, рекомендованный для одной инсталляции в мочевой пузырь, составляет 50 мл (инструкции к препаратам «Иммурон-вак», «Уро-БЦЖ медак»). Поскольку иммунобиологическое средство содержит живые бактериальные клетки, для разведения можно использовать любой изотонический растворитель надлежащего фармацевтического качества. В данном случае нами использовался физиологический раствор.

После разведения иммунобиологического средства и вакцины БЦЖ, 20 мкл из каждого образца было добавлено в соответствующие лунки планшета. Через три часа после добавления иммунобиологического средства клетки промывали трижды ростовой средой, чтобы избавиться от неприкрепившихся бактерий, и заливали свежей ростовой средой.

Далее клетки инкубировали 18 часов. Затем клетки снимали с планшета, гомогенизировали с помощью керамических бус, готовили разведения и высевали на плотные питательные среды Левенштейна-Иенсена для определения титра КОЕ БЦЖ.

В таблице 2 представлены результаты анализа титра КОЕ БЦЖ, полученные с помощью высевов гомогенатов клеток RT-4, обработанных различными иммунобиологическими средствами на основе БЦЖ, отличающимися концентрациями БЦЖ.

Как видно из представленных в таблице 2 данных, эффективность проникновения БЦЖ в опухолевые клетки рака мочевого пузыря человека RT-4 значительно выше при использовании иммунобиологического средства на основе БЦЖ в диапазоне концентраций БЦЖ от 10⁴ до 10¹¹ КОЕ/дозу, чем при использовании стандартной вакцины БЦЖ.

Пример 3

Оценка способности БЦЖ проникать в клетки мочевого пузыря в условиях in vivo.

Целью данного эксперимента являлось определение способности БЦЖ в составе иммунобиологического средства проникать в подслизистый слой мочевого пузыря, обработанного ферментами, расщепляющими секрет слизистого слоя мочевого пузыря, в условиях in vivo. Для этого были использованы мыши линии BALB/c, самки, весом 18-20 г. Для исследования были выбраны иммунобиологические средства на основе БЦЖ, содержащие ферменты, расщепляющие секрет слизистой оболочки мочевого пузыря, в дозах, которые лежат в середине исследованного в примере 1 рабочего диапазона концентраций: гиалуронидаза - 10000 УЕ/дозу, нейраминидаза - 10 УЕ/дозу; а также БЦЖ в дозе, которая находится в середине исследованного в примере 2 рабочего диапазона концентраций - 10⁸ КОЕ/дозу. В качестве контроля использовалась стандартная вакцина БЦЖ в следующих концентрациях: 10⁸ КОЕ/дозу, 10⁹ КОЕ/дозу, 10¹⁰ КОЕ/дозу, 10¹¹ КОЕ/дозу.

Все животные были катетеризованы по стандартной методике (С. Hung, K. Dodson, S. Hultgren, A murine model of urinary tract infection, Nature protocols, 4, 1230-1243, 2009). Далее все животные были разделены на семь групп, которым вводили

1) БЦЖ в количестве 10⁸ КОЕ/дозу.

2) БЦЖ в количестве 10⁹ КОЕ/дозу.

3) БЦЖ в количестве 10¹⁰ КОЕ/дозу.

4) БЦЖ в количестве 10¹¹ КОЕ/дозу.

5) Иммунобиологическое средство на основе вакцины БЦЖ (10⁸ КОЕ/дозу), при этом оно включает фермент гиалуронидазу в количестве 10000 УЕ/дозу.

6) Иммунобиологическое средство на основе вакцины БЦЖ (10⁸ КОЕ/дозу), при этом оно включает фермент нейраминидазу в количестве 10 МЕ/дозу.

7) Иммунобиологическое средство на основе вакцины БЦЖ (10⁸ КОЕ/дозу), при этом оно включает ферменты гиалуронидазу в количестве 10000 УЕ/дозу и нейраминидазу в количестве 10 МЕ/дозу.

Объем препарата, рекомендованный для одной инсталляции в мочевой пузырь, составляет 50 мл (инструкции к препаратам «Иммурон-вак», «Уро-БЦЖ медак»). Поскольку иммунобиологическое средство содержит живые бактериальные клетки, для разведения может быть использован любой изотонический растворитель надлежащего фармацевтического качества. В данном случае нами использовался физиологический раствор.

После разведения исследуемые образцы вводились мышам в мочевой пузырь в объеме 50 мкл с помощью катетера. Через 18 часов животные были усыплены.

Далее с помощью керамических бус были подготовлены гомогенаты мочевых пузырей. Для определения количества БЦЖ были приготовлены серии разведений гомогенатов мочевых пузырей и далее высеяны на скошенные среды Левенштейна-Йенсена. Косяки инкубировали при 37°С в течение 72 дней. Учет количества БЦЖ велся один раз в неделю.

В таблице 3 представлены результаты анализа титра КОЕ БЦЖ, полученные с помощью высевов гомогенатов мочевых пузырей мышей, обработанных различными иммунобиологическими средствами на основе БЦЖ.

Как видно из результатов эксперимента, представленных в таблице 3, ферменты, разрушающие секрет слизистого слоя в мочевом пузыре, повышают эффективность проникновения БЦЖ, поскольку количество БЦЖ в гомогенатах мочевых пузырей мышей, получавших иммунобиологическое средство на основе БЦЖ и ферментов, расщепляющих секрет слизистой оболочки мочевого пузыря, превышает количество БЦЖ в гомогенатах мочевых пузырей мышей, получавших вакцину БЦЖ, от 81 до 1136 раз. Сравнимый эффект достигается при введении дозы стандартной вакцины БЦЖ, в 1000 раз превышающей дозу разработанного иммунобиологического средства на основе БЦЖ. При этом специалисту среднего уровня очевидно, что высокие концентрации вакцины БЦЖ (10¹¹ КОЕ/дозу и более) являются токсичными.

Пример 4

Оценка иммуностимулирующих свойств иммунобиологического средства на основе вакцины БЦЖ.

Целью данного эксперимента являлось исследование иммуностимулирующих свойств разработанного иммунобиологического средства в сравнении со стандартной вакциной БЦЖ по способности индуцировать выброс цитокинов. Для этого была выбрана модель культуры клеток рака мочевого пузыря человека RT-4, обладающая выраженным гликокаликсом, сходным по своему строению с секретом слизистого слоя мочевого пузыря.

Для оценки уровня экспрессии цитокинов были выбраны тест-системы фирмы eBioscience (BMS822FF, BMS821FF) для мультиплексного анализа, которые позволяют одновременно измерять уровень экспрессии 19 цитокинов и хемокинов.

Клетки пассировались на 25 см² культуральных матрасах. Клетки линии RT-4 культивировали на минимальной ростовой среде DMEM с 10% эмбриональной телячьей сывороткой и в присутствии необходимого количества заменимых и незаменимых аминокислот, при температуре 37°С и содержании СО₂ 5%. Для проведения анализа клетки были рассеяны на 96 луночный планшет в количестве 10⁵ клеток на лунку. После рассева клеток планшет инкубировали при +37°С в присутствии 5% СО₂ в течение 24 часов.

Через сутки к клеткам были добавлены исследуемые образцы, которые представляли собой

1) БЦЖ в количестве 10⁸ КОЕ/дозу.

2) БЦЖ в количестве 10¹¹ КОЕ/дозу.

3) Иммунобиологическое средство на основе вакцины БЦЖ (10⁸ КОЕ/дозу), отличающееся тем, что она включает фермент гиалуронидазу в количестве 10000 УЕ/дозу.

4) Иммунобиологическое средство на основе вакцины БЦЖ (10⁸ КОЕ/дозу), отличающееся тем, что она включает фермент нейраминидазу в количестве 10 МЕ/дозу.

5) Иммунобиологическое средство на основе вакцины БЦЖ (10⁸ КОЕ/дозу), отличающееся тем, что она включает ферменты гиалуронидазу в количестве 10000 УЕ/дозу и нейраминидазу в количестве 10 МЕ/дозу.

Объем препарата, рекомендованный для одной инсталляции в мочевой пузырь, составляет 50 мл (инструкции к препаратам «Иммурон-вак», «Уро-БЦЖ медак»). Поскольку исследуемые образцы содержат живые бактериальные клетки, для разведения рекомендуется использовать любой изотонический растворитель надлежащего фармацевтического качества. В данном случае нами использовался физиологический раствор.

После разведения исследуемых образцов 10 мкл из каждого образца было добавлено в соответствующие лунки планшета.

Далее клетки инкубировали 18 часов. Затем определяли уровень экспрессии цитокинов с помощью коммерческого набора. Полученные результаты представлены на фиг. 2, где

ось ординат - концентрация цитокинов, пг/мл

ось абсцисс: 1 - ИЛ-2, 2 - ИЛ-6, 3 - ИЛ-8, 4 - ИЛ-13, 5 - ФИО альфа, 6 - гамма интерферон.

- Фосфатный буфер

- БЦЖ в количестве 10⁸ КОЕ/дозу

- БЦЖ в количестве 10¹¹ КОЕ/дозу

- Иммунобиологическое средство на основе вакцины БЦЖ (10⁸ КОЕ/дозу), отличающееся тем, что она включает фермент гиалуронидазу в количестве 10000 УЕ/дозу

- Иммунобиологическое средство на основе вакцины БЦЖ (10⁸ КОЕ/дозу), отличающееся тем, что она включает фермент нейраминидазу в количестве 10 МЕ/дозу

- Иммунобиологическое средство на основе вакцины БЦЖ (10⁸ КОЕ/дозу), отличающееся тем, что она включает ферменты гиалуронидазу в количестве 10000 УЕ/дозу и нейраминидазу в количестве 10 МЕ/дозу

Было показано, что разработанные иммунобиологические средства для терапии рака мочевого пузыря на основе БЦЖ по сравнению с прототипом (вакциной БЦЖ) вызывают более сильную индукцию ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-13, ФИО альфа, ИФНгамма.

Сравнимый эффект достигается при введении дозы вакцины БЦЖ, в 1000 раз превышающей дозу разрабатываемого иммунобиологического средства на основе БЦЖ. При этом специалисту среднего уровня очевидно, что высокие концентрации вакцины БЦЖ (10¹¹ КОЕ/дозу и более) являются токсичными.

Пример 5

Оценка токсичности иммунобиологического средства на основе вакцины БЦЖ.

Целью данного исследования являлось определение безопасности и потенциальных токсических эффектов иммунобиологического средства на основе вакцины БЦЖ.

Исследование токсичности проводили на клетках эмбриональной почки человека HEK293. Клетки пассировались на 25 см² культуральных флаконах в ростовой среде DMEM с 10% эмбриональной сывороткой. Для проведения анализа клетки были рассеяны на 96 луночный планшет в количестве 10⁵ клеток на лунку. После рассева клеток планшет инкубировали при +37°С и 5% СО₂ в течение 24 часов. Далее к клеткам были добавлены иммунобиологические средства на основе БЦЖ с теми же концентрациями действующих веществ, как и в примере 1: БЦЖ (10⁸ КОЕ/дозу), гиалуронидаза (в следующих концентрациях: 0 УЕ/дозу, 1 УЕ/дозу, 10 УЕ/дозу, 100 УЕ/дозу, 1000 УЕ/дозу, 10000 УЕ/дозу, 100000 УЕ/дозу, 1000000 УЕ/дозу) и нейраминидаза (в следующих концентрациях: 0 МЕ/дозу, 0,001 МЕ/дозу, 0,01 МЕ/дозу, 0,1 МЕ/дозу, 1 МЕ/дозу, 10 МЕ/дозу, 100 МЕ/дозу, 1000 МЕ/дозу); а также иммунобиологические средства на основе БЦЖ с теми же концентрациями действующих веществ, как и в примере 2: БЦЖ (в следующих концентрациях: 10³ КОЕ/дозу, 10⁴ КОЕ/дозу, 10⁵ КОЕ/дозу, 10⁶ КОЕ/дозу, 10⁷ КОЕ/дозу, 10⁸ КОЕ/дозу, 10⁹ КОЕ/дозу, 10¹⁰ КОЕ/дозу, 10¹¹ КОЕ/дозу), гиалуронидазы (10000 УЕ/дозу) и нейраминидазы (10 МЕ/дозу). В качестве контроля использовали вакцину БЦЖ в концентрациях: 10³ КОЕ/дозу, 10⁴ КОЕ/дозу, 10⁵ КОЕ/дозу, 10⁶ КОЕ/дозу, 10⁷ КОЕ/дозу, 10⁸ КОЕ/дозу, 10⁹ КОЕ/дозу, 10¹⁰ КОЕ/дозу, 10¹¹ КОЕ/дозу.

Под дозой понимается количество препарата, предназначенное для единовременного (за 1 инсталляцию) введения в мочевой пузырь. Объем препарата, рекомендованный для одной инсталляции в мочевой пузырь, составляет 50 мл. Поскольку исследуемые образцы содержат живые бактериальные клетки, для разведения рекомендуется использовать любой изотонический растворитель надлежащего фармацевтического качества. В данном случае был использован физиологический раствор.

После разведения исследуемых образцов 10 мкл из каждого образца было добавлено в соответствующие лунки планшета. Через сутки после добавления исследуемых образцов был произведен анализ количества живых клеток методом МТТ-теста. В среду к клеткам добавляли 1/10 объема концентрированного МТТ (10х МТТ, 5 мг/мл). Инкубировали три часа в CO₂-инкубаторе при 37°С, затем отбирали всю среду, лизировали клетки в 100 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) и измеряли оптическую плотность при 540 нм и 630 нм. Затем рассчитывали истинное значение оптической плотности (OD_ист) по формуле:

OD_ист=OD_540нм-OD_630нм,

где OD_540нм - оптическая плотность, измеренная при длине волны 540 нм, а ОD_630нм - оптическая плотность, измеренная при длине волны 630 нм.

Далее процент выживших клеток рассчитывали по формуле:

Количество выживших клеток (%) = (OD_{ист.исслед.}/OD_{ист.контр.})*100%,

где ОD_{ист.исслед} - истинная оптическая плотность клеток, обработанных иммунобиологическим средством, a OD_{ист.контр} - истинная оптическая плотность контрольных клеток.

Затем рассчитывали коэффициент токсичности образца Т:

Τ = (количество выживших контрольных клеток, %) - (количество выживших клеток в исследуемом образце, %).

При этом Т=0 означает, что препарат не токсичен и не влияет на выживаемость данной клеточной культуры, а Т=100% означает,что препарат токсичен и в лунке планшета нет живых клеток.

Результаты исследования токсичности иммунобиологических средств, отличающихся концентрациями ферментов, расщепляющих секрет слизистой оболочки мочевого пузыря, представлены в таблице 4. Результаты исследования токсичности иммунобиологических средств, отличающихся концентрациями БЦЖ, представлены в таблице 5.

Как видно из результатов, представленных в таблице 4, Иммунобиологические средства на основе БЦЖ, содержащие гиалуронидазу в концентрации 1000000 УЕ/дозу и нейраминидазу в концентрации 100 МЕ/дозу, обладали наибольшей токсичностью. Другие иммунобиологические средства на основе БЦЖ, содержащие только гиалуронидазу (1-1000000 УЕ/дозу) или нейраминидазу (0,001-1000 МЕ/дозу), а также иммунобиологические средства, содержащие гиалуронидазу (1-100000 УЕ/дозу) и нейраминидазу (0,001-100 МЕ/дозу), либо не имели токсического эффекта, либо обладали незначительной токсичностью. Исходя из этого, можно сделать вывод о том, что данные концентрации ферментов могут быть использованы для создания иммунобиологического средства на основе БЦЖ.

Как видно из результатов, представленных в таблице 5, наибольшей токсичностью обладало иммунобиологическое средство, содержащее БЦЖ в количестве 10¹¹ КОЕ/дозу. Другие иммунобиологические средства на основе БЦЖ, содержащие БЦЖ в количестве от 10³ до 10¹⁰ КОЕ/дозу либо не обладали токсичностью, либо имели незначительный токсический эффект. Также следует заметить, что введение вакцины БЦЖ в дозах, превышающих рекомендованные (10¹⁰ КОЕ/дозу и более), приводит к увеличению токсичности, коррелирующей с увеличением дозы. Исходя из результатов, представленных в таблице 5, можно сделать вывод о том, что указанные концентрации БЦЖ (10³ до 10¹⁰ КОЕ/дозу) могут быть использованы для создания иммунобиологического средства на основе БЦЖ.

Далее было проведено исследование токсичности иммунобиологического средства на основе БЦЖ, содержащей максимальные концентрации действующих веществ, которые по отдельности либо не обладают токсичностью, либо обладают минимальной токсичностью.

Исследование токсичности проводили на клетках эмбриональной почки человека HEK293. Клетки пассировались на 25 см² культуральных флаконах в ростовой среде DMEM с 10% эмбриональной сывороткой. Для проведения анализа клетки были рассеяны на 96 луночный планшет в количестве 10⁵ клеток на лунку. После рассева клеток планшет инкубировали при +37°С и 5% CO₂ в течение 24 часов.

Далее был получен ряд иммунобиологических средств на основе вакцины БЦЖ, содержащих БЦЖ (в концентрациях: 10⁹ КОЕ/дозу, 10¹⁰ КОЕ/дозу), гиалуронидазу (в концентрациях: 100000 УЕ/дозу, 1000000 УЕ/дозу) и нейраминидазу (в концентрациях: 100 МЕ/дозу, 1000 МЕ/дозу). Под дозой понимается количество препарата, предназначенное для единовременного (за 1 инсталляцию) введения в мочевой пузырь. Объем препарата, рекомендованный для одной инсталляции в мочевой пузырь, составляет 50 мл. Поскольку исследуемые образцы содержат живые бактериальные клетки, для разведения рекомендуется использовать любой изотонически