Моноклональные антитела против клаудина-18 для лечения рака

Моноклональные антитела против клаудина-18 для лечения рака

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Уровень техники

Способы лечения рака на основе антител обладают потенциалом к более высокой специфичности и меньшей совокупности побочных эффектов, чем традиционные лекарства. В основе этого лежит точное различение антителами нормальных и неопластических клеток и то, что их механизм действия основан на менее токсичных иммунологических противоопухолевых механизмах, таких как активация комплемента и мобилизация цитотоксических иммунных клеток.

Мишени для терапии на основе антител должны обладать особыми свойствами, которые лежат в основе правильного различения нормальных и неопластических клеток. Очевидно, для разработки эффективных и безопасных лечебных антител будет идеальной такая мишень, которая ограничивается исключительно раковыми клетками и совсем не обнаруживается на нормальных тканях. С другой стороны, основанием для терапевтического индекса и уменьшения побочных эффектов может служить высокий уровень суперэкспрессии на примере рецептора фактора роста эпидермиса человека 2-го типа (HER-2), который в результате амплификации гена является хорошей мишенью для антитела трастузумаб (Herceptin).

Другие мишени для антител, которые либо уже одобрены, либо находятся в клинической разработке для терапии опухолей, обладают особыми свойствами, которые не основываются на количественной суперэкспрессии молекул мишени на опухолевых клетках. В случает антител к протеогликану MUC-1, эпитоп из пептидного повтора на остове мишени недостаточно гликозилирован в опухолевых клетках, поэтому он изменен по сравнению с нормой. В случает антител к CD20 (ритуксимаб), CD52 (Campath-1H) и CD22 (эпратузумаб) антитела-мишени имеют сравнимые уровни экспрессии в раковых клетках и нормальных лимфоцитах. При этом устранение нормальных клеток антителами допустима, так как отрицательные по отношению к мишени стволовые клетки восстанавливают нормальный репертуар лимфоцитов. Другими примерами различной доступности мишеней антител являются онкофетальный антиген (СЕА) и карбоангидраза IX (СА9). Оба антигена экспрессируются в нормальном эпителии толстой кишки и почек, соответственно. Однако интроскопия с помощью радиоактивно меченых антител хорошо отличает опухолевые и нормальные ткани, а цитотоксические антитела хорошо переносятся. Это скорее всего обусловлено ограниченной экспрессией СА9 и СЕА со стороны просвета нормальной ткани эпителия, куда антитела типа IgG не имеют доступа. К той же категории относится и антиген молекул адгезии клеток эпителия (Ер-САМ). Как гомотипическая молекула клеточной адгезии для эпителиальных клеток, она локализуется в межклеточном пространстве. Интересно, что хотя высокоаффинные антитела к Ер-САМ очень токсичны, но антитела с промежуточной аффинностью хорошо переносятся. Это предполагает доступность мишени Ер-САМ на нормальных клетках, но также свидетельствует о том, что кинетика связывания антител может открыть терапевтическое окно.

Одна из возможностей состоит в том, что для антительных подходов могут оказаться привлекательными и другие специфичные к эпителиальным клеткам белки, участвующие в межклеточной адгезии, так как они едва ли доступны антителам в хорошо структурированном эпителии, но могут стать доступными на опухолевых клетках. Поэтому мы проанализировали белки, участвующие в организации архитектуры эпителиальных тканей, на предмет их пригодности в качестве мишеней для лечебных антител. Наше внимание особенно привлек белок клаудин-18.

Молекула клаудина-18 (CLD18) (номера доступа в Genbank: сплайс-вариант 1 (CLD18A1): NP_057453, NM_016369, и сплайс-вариант 2 (CLD18A2): NM_001002026, NP_001002026)) представляет собой интегральный трансмембранный белок с молекулярным весом примерно 27,9/27,72 кД. Клаудины являются интегральными мембранными белками, локализованными в плотных контактах (tight junctions) эпителия и эндотелия. Плотные контакты образуют сеть переплетенных нитей внутримембранных частиц между соседними клетками. Наиболее заметными компонентами в плотных контактах являются трансмембранные белки окклюдин и клаудины. Благодаря своим свойствам сильной межклеточной адгезии они образуют первичный барьер, предотвращающий и контролирующий парацеллюлярный транспорт растворимых веществ и ограничивающий латеральную диффузию мембранных липидов и белков для поддержания клеточной полярности. Белки, образующие плотные контакты, решающим образом участвуют в организации архитектуры эпителиальных тканей. Мы предположили, что такие белки едва ли доступны антителам в хорошо структурированном эпителии, но могут стать доступными на опухолевых клетках.

CLD18 является тетраспанином и поэтому содержит 4 гидрофобных участка. Мы получили данные, свидетельствующие о том, что CLD18 проявляет несколько различных конформаций, которые могут быть избирательно атакованы антителами. Одна из конформаций (конформация-1 CLD18) предполагает, что все 4 гидрофобных участка служат в качестве обычных трансмембранных доменов (ТМ), причем образуются 2 внеклеточные петли (петля 1, окруженная гидрофобным участком 1 и гидрофобным участком 2, и петля 2, окруженная гидрофобными участками 3 и 4), как это описано для подавляющего большинства представителей семейства клаудинов. Вторая конформация (конформация-2 CLD18) предполагает, как это описано для РМР22, другого представителя семейства тетраспанинов (Taylor et al., J. Neurosc. Res. 62:15-27, 2000), что второй и третий гидрофобные домены не полностью пересекают плазматическую мембрану с тем, что участок (петля D3), находящийся между первым и четвертым трансмембранным доменом, является внеклеточным. Третья конформация (конформация-3 CLD18) предполагает наличие большого внеклеточного домена с двумя внутренними гидрофобными участками, окруженными первым и четвертым трансмембранными участками, которые служат в качестве обычных трансмембранных доменов. Благодаря наличию классического сайта N-гликозилирования в петле D3, варианты топологии клаудина-18 - топология-2 CLD18 и топология-3 CLD18 - содержат дополнительный внеклеточный сайт N-гликозилирования.

Еще один уровень сложности в молекулу CLD18 вносит наличие двух разных сплайс-вариантов, которые описаны у мышей и у человека (Niimi, Mol. Cell. Biol. 21:7380-90, 2001). Сплайс-варианты CLD18A1 и CLD18A2 отличаются по первым 21 N-концевым аминокислотам, составляющим первый ТМ и петлю 1, тогда как первичная последовательность белка на С-конце идентична.

CLD18A1 избирательно экспрессируется в нормальном эпителии легких и желудка, тогда как CLD18A2 экспрессируется только в клетках желудка (Niimi, Mol. Cell. Biol. 21:7380-90, 2001). Наиболее важно то, что CLD18A2 приурочен к дифференцированным короткоживущим клеткам эпителия желудка, но отсутствует в районе стволовых клеток желудка. Используя чувствительный метод ОТ-ПЦР, мы показали, что оба варианта совсем не обнаруживаются в других нормальных органах человека, но сильно экспрессируются при некоторых типах рака, включая рак желудка, пищевода, поджелудочной железы и легких, а также линии раковых клеток человека. Экспрессия наиболее заметна у подтипов аденокарциномы этих заболеваний.

Молекулярный вес белка отличается в некоторых опухолях и соседней нормальной ткани. Белок с большим молекулярным весом, наблюдавшийся в здоровой ткани, можно довести до того же молекулярного веса, что наблюдается при раке, путем обработки лизатов тканей дегликозилирующим соединением PNGase F. Это говорит о том, что CLD18 менее гликозилирован при раке, чем в нормальной ткани. Это структурное отличие, вероятно, вызывает изменение эпитопа. Классический мотив N-гликозилирования находится в положении а.к. 116 в домене петли D3 этой молекулы.

Термины "CLD18" и "вариант CLD18 " согласно изобретению должны охватывать: (i) сплайс-варианты CLD18, (ii) варианты по N-гликозилированию CLD18, (iii) варианты по конформации CLD18, (iv) свободные и гомотипически/гетеротипически ассоциированные варианты CLD18, локализованные в межклеточных плотных контактах, и (v) варианты CLD18 раковых и нераковых клеток.

Молекулярные и функциональные характеристики CLD18 делают эту молекулу очень интересной мишенью для антительной терапии рака. В частности, это (i) отсутствие CLD18 в подавляющем большинстве подверженных токсичности нормальных тканей, (ii) приуроченность экспрессии варианта CLD18A2 к восполнимой популяции клеток типа дифференцированных клеток желудка, которые можно восполнить за счет лишенных мишени стволовых клеток желудка, (iii) данные о возможных отличиях по гликозилированию между нормальными и неопластическими клетками, и (iv) наличие различных конформационных топологий. Более того, роль CLD18 в качестве белка плотных контактов может дополнительно способствовать и хорошему терапевтическому индексу. Поскольку раковые клетки экспрессируют клаудины, но часто не образуют классических плотных контактов путем гомотипической и гетеротипической ассоциации клаудинов, как это происходит в нормальной ткани эпителия, то раковые клетки могут содержать значительный пул свободного клаудина, который поддается связыванию с внеклеточными антителами и иммунотерапии. Возможно, что у клаудина эпитопы для связывания в здоровом эпителии экранированы внутри плотных контактах от доступа таких антител.

Кроме того, высокий уровень экспрессии в плазматических мембранах, наблюдавшийся согласно изобретению не только в первичных опухолях, но и в метастазах от экспрессирующих CLD18A2 первичных опухолей, в частности опухолей желудка, делают специфичные к CLD18A2 антитела ценным инструментом для предотвращения, лечения и/или диагностики раковых метастазов, в частности метастазов от опухолей желудка, как-то метастазов лимфатических узлов, перитонеальных метастазов и опухолей Крукенберга.

Целью настоящего изобретения является получение антител, применимых для терапии таких заболеваний, при которых экспрессируется CLD18, как-то раковых заболеваний. Описанные в нем антитела также обладают полезностью в диагностике таких заболеваний.

Раскрытие изобретения

Настоящим изобретением в целом предусмотрены антитела, применимые в качестве лечебных средств для лечения и/или предотвращения заболеваний, связанных с клетками, экспрессирующими CLD18, включая такие раковые заболевания, как рак желудка, рак пищевода, рак поджелудочной железы, рак легких типа немелкоклеточного рака легких (NSCLC), рак яичников, рак толстой кишки, рак печени, рак головы и шеи, рак желчного пузыря и их метастазы, в частности метастазы от рака желудка, как-то опухоли Крукенберга, перитонеальные метастазы и метастазы лимфатических узлов.

В одном аспекте изобретение касается антител, обладающих способностью к связыванию с CLD18. Предпочтительно антитела обладают способностью к связыванию с CLD18, экспрессированным на поверхности клеток, и предпочтительно связываются с одним или несколькими эпитопами, расположенными во внеклеточных участках CLD18, предпочтительно в первом внеклеточном домене (положения аминокислот 29-70 у CLD18). Предпочтительно антитела по изобретению связываются с одним или несколькими пептидами, выбранными из группы, состоящей из SEQ ID NO: 151, 153, 155, 156 и 157. Предпочтительно антитела связываются с раковыми клетками, в частности клетками тех видов рака, что приведены выше, и предпочтительно практически не связываются с нераковыми клетками. Предпочтительно связывание данных антител с клетками, экспрессирующими CLD18, как-то раковыми клетками, вызывает гибель клеток, экспрессирующих CLD18. Предпочтительно антитела связываются с CLD18A1 и CLD18A2, более предпочтительно они связываются с CLD18A2, но не связываются с CLD18A1. Предпочтительно антитела по изобретению связываются с и проявляют специфичность к петле-1 или петле-2 в конформации-1 CLD. В других предпочтительных воплощениях антитела по изобретению связываются с и проявляют специфичность к петле D3 в конформации-2 CLD, в частности, связываются на или около потенциального сайта N-гликозилирования в положении 116 на петле D3. В других воплощениях антитела по изобретению проявляют специфичность к негликозилированной форме потенциального сайта N-гликозилирования в положении 116 на петле D3.

Предпочтительно в связывании антител по изобретению с CLD18A2 участвует одна или несколько аминокислот, выбранных из группы, состоящей из Ala в положении 42, Asn в положении 45 и Glu в положении 56 у CLD18A2 (SEQ ID NO: 2). Предпочтительно антитела по изобретению не связываются с такими вариантами CLD18A2 или их фрагментами, у которых одна или несколько аминокислот, а предпочтительно все аминокислоты в этих положениях заменены другими аминокислотами, в частности теми аминокислотами, которые находятся в соответствующих положениях у CLD18A1 (SEQ ID NO: 8) (Ala42Ser, Asn45Gln и Glu56Gln).

Гибель клеток предпочтительно вызывается антителами по изобретению при связывании антител с CLD18, экспрессированным данными клетками, более предпочтительно при связывании антител с CLD18A2, экспрессированным данными клетками. В одном воплощении связывание антител по изобретению с CLD18A1, экспрессированным данными клетками, не вызывает гибели данных клеток. Такая гибель клеток может использоваться в терапии, как описано в настоящем изобретении. В частности, гибель клеток может использоваться для лечения или предотвращения рака, в частности раковых метастазов и метастазирования раковых клеток.

Клетки, экспрессирующие CLD18, предпочтительно являются раковыми клетками, в частности, они выбираются из группы, состоящей из опухолевых клеток рака желудка, пищевода, поджелудочной железы, легких, яичников, толстой кишки, печени, головы и шеи и желчного пузыря.

Предпочтительно антитела по изобретению вызывают гибель клеток, индуцируя лизис по механизму обусловленной комплементом цитотоксичности (CDC), лизис по механизму антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC), апоптоз, гомотипическую адгезию и/или фагоцитоз, предпочтительно вызывая лизис по механизму CDC и/или ADCC.

В одном воплощении антитела по изобретению не вызывают лизиса клеток по механизму CDC.

Предпочтительно лизис клеток по механизму ADCC происходит в присутствии эффекторных клеток, которые в предпочтительных воплощениях выбираются из группы, состоящей из моноцитов, мононуклеаров, NK-клеток и PMN, а фагоцитоз осуществляется макрофагами.

Антитела по изобретению могут представляет собой моноклональные, химерные, гуманизированные или антитела человека либо фрагменты антител и выбираются из группы, состоящей из антител типа IgG1, IgG2, предпочтительно IgG2a и IgG2b, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, секреторных IgA, IgD и IgE.

В соответствии со всеми аспектами изобретения, CLD18 предпочтительно означает CLD18 человека, предпочтительно CLD18A2 человека, причем CLD18A2 предпочтительно имеет аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 2, а CLD18A1 предпочтительно имеет аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 8.

В особенно предпочтительных воплощениях антитела по изобретению связываются с нативными эпитопами CLD18, находящимися на поверхности живых клеток. В других предпочтительных воплощениях антитела по изобретению специфичны к раковым клеткам, предпочтительно клеткам рака желудка.

В некоторых воплощениях изобретения CLD18 экспрессируется на поверхности клеток.

Антитела по изобретению могут быть получены способом, включающим стадию иммунизации животного белком или пептидом, включающим аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 16, 18, 20, 21-23, 26-31, 151, 153 и 155-157, либо его иммуногенным фрагментом или производным, либо нуклеиновой кислотой или клетками-хозяевами, экспрессирующими данный белок или пептид либо его иммуногенный фрагмент или производное. Предпочтительно антитела по изобретению специфичны к вышеуказанным белкам, пептидам либо их иммуногенным фрагментам или производным. В связи с белками или пептидами, используемыми при иммунизации, производное означает такой вариант данного белка или пептида, который имеет такие же или близкие иммуногенные свойства, как и белкок или пептид, из которого он происходит. В частности, производное белка или пептида при использовании при иммунизации для получения антител, в частности моноклональных антител, дает антитела с такой же специфичностью, как и антитела, полученные при использовании этого белка или пептида при иммунизации. Например, такое производное может включать делецию, замену или вставку одной или нескольких аминокислот. В частности, оно может включать добавление одной или нескольких аминокислот типа цистеина на N-конец или С-конец или на оба конца либо замену остатков цистеина остатками серина. Данные, представленные в настоящем изобретении, раскрывают те аминокислоты в CLD18, которые не являются критическими для связывания с антителами. Соответственно, белки и пептиды CLD, их иммуногенные фрагменты или производные, описанные в настоящем изобретении, используемые для иммунизации, могут содержать одну или несколько замен аминокислот в тех положениях, которые не являются критическими для связывания с антителами.

В особенно предпочтительном воплощении антитела по изобретению вырабатываются клоном, имеющим номер доступа DSM ACC2737 (182-D1106-055), DSM АСС2738 (182-D1106-056), DSM ACC2739 (182-D1106-057), DSM ACC2740 (182-D1106-058), DSM ACC2741 (182-D1106-059), DSM ACC2742 (182-D1106-062). DSM ACC2743 (182-D1106-067), DSM ACC2745 (182-D758-035), DSM ACC2746 (182-D758-036), DSM ACC2747 (182-D758-040), DSM ACC2748 (182-D1106-061), DSM ACC2808 (182-D1106-279), DSM ACC2809 (182-D1106-294) или DSM ACC2810 (182-D1106-362).

В одном воплощении антитела по изобретению конъюгированы с таким лечебным средством, как токсин, радиоизотоп, лекарственный препарат или цитотоксический агент.

В другом аспекте изобретение касается гибридом, способных вырабатывать антитела по изобретению. Предпочтительными гибридомами являются те, которые имеют номер доступа DSM ACC2737 (182-D1106-055), DSM ACC2738 (182-D1106-056), DSM ACC2739 (182-D1106-057), DSM ACC2740 (182-D1106-058), DSM ACC2741 (182-D1106-059), DSM ACC2742 (182-D1106-062), DSM ACC2743 (182-D1106-067), DSM ACC2745 (182-D758-035), DSM ACC2746 (182-D758-036), DSM ACC2747 (182-D758-040), DSM ACC2748 (182-D1106-061), DSM ACC2808 (182-D1106-279), DSM ACC2809 (182-D1106-294) или DSM ACC2810 (182-D1106-362).

Антитела по изобретению обозначаются по названию антитела, напр., 182-D758-035, и/или по названию клона, вырабатывающего это антитело, напр., 26D12.

Изобретение также касается фармацевтических композиций, содержащих антитела по изобретению и/или их конъюгаты с лечебными средствами, а также фармацевтически приемлемые носители.

В следующем аспекте изобретение касается способа ингибирования роста и/или уничтожения клеток, экспрессирующих CLD18, предпочтительно CLD18A2, который включает контактирование клеток с эффективным количеством антитела по изобретению и/или его конъюгата с лечебным средством. CLD18 предпочтительно экспрессируется на поверхности данных клеток.

В следующем аспекте изобретение касается способа лечения или предотвращения заболеваний с участием клеток, экспрессирующих CLD18, предпочтительно CLD18A2, который включает введение субъекту антител по изобретению, их конъюгатов с лечебным средством или фармацевтических композиций, содержащих антитела по изобретению или их конъюгаты с лечебными средствами. Предпочтительно заболевания представляют собой раковые заболевания, которые в предпочтительных воплощениях выбираются из группы, состоящей из рака желудка, рака пищевода, рака поджелудочной железы, рака легких, рака яичников, рака толстой кишки, рака печени, рака головы и шеи, рака желчного пузыря и их метастазов. CLD18 предпочтительно экспрессируется на поверхности данных клеток.

Предпочтительно антитела по изобретению обладают способностью к различению вариантов CLD18, экспрессирующихся различными типами клеток, включая раковые клетки и нераковые клетки. В особенно предпочтительном воплощении антитела по изобретению обладают способностью к связыванию с CLD18A2, но не связываются с CLD18A1 или же связываются с CLD18A1 с меньшей специфичностью по сравнению со специфичностью связывания с CLD18A2.

Термин "связывание" по изобретению предпочтительно относится к специфическому связыванию. "Специфическое связывание" означает, что агент типа антитела связывается с мишенью типа эпитопа, к которому он специфичен, сильнее, чем с другой мишенью. Агент связывается с одной мишенью сильнее, чем с другой мишенью, если он связывается с первой мишенью с меньшей константой диссоциации (K_D), чем константа диссоциации для второй мишени. Предпочтительно константа диссоциации (K_D) для мишени, с которой агент связывается специфически, более чем в 10 раз, предпочтительно более чем в 20 раз, более предпочтительно более чем в 50 раз, еще более предпочтительно более чем в 100 раз, 200 раз, 500 раз или 1000 раз меньше, чем константа диссоциации (K_D) для мишени, с которой агент не связывается специфически.

Предпочтительно у антител по изобретению константа диссоциации для CLD18, предпочтительно для CLD18A2, составляет 10^-6 М или меньше, предпочтительно 10^-7 М или меньше, предпочтительно 10^-8 М или меньше либо предпочтительно 10^-9 М или меньше. Предпочтительно у антител по изобретению константа диссоциации для CLD18, предпочтительно для CLD18A2, находится в пределах от 10^-8 М до 10^-9 М.

Антитела по изобретению вызывают гибель клеток, экспрессирующих CLD18, предпочтительно CLD18A2, при связывании с CLD18, предпочтительно экспрессирующегося на поверхности данных клеток. В одном воплощении антитела по изобретению индуцируют обусловленную комплементом цитотоксичность (CDC), напр., вызывают лизис по механизму CDC у 20-40% клеток, предпочтительно у 40-50% клеток, более предпочтительно у более чем 50% клеток, экспрессирующих CLD18. Такие антитела в настоящем изобретении представлены следующими антителами: 37Н8, 38G5, 38НЗ, 39F11, 61С2, 26 В5, 26D12, 28D10, 163Е12, 175D10, 45С1, 125Е1, ch-163E12 и ch-175D10. Вместо или вместе с индуцированном CDC, антитела по изобретению могут индуцировать антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в отношении клеток, экспрессирующих CLD18, в присутствии эффекторных клеток (напр., моноцитов, мононуклеаров, NK-клеток и PMN). Такие антитела в настоящем изобретении представлены следующими антителами: 37G11, 37Н8, 38G5, 38Н3, 39F11, 43А11, 61С2, 26 В5, 26D12, 28D10, 42Е12, 163Е12, 175D10, 45С1 и125Е1. Антитела по изобретению могут обладать способностью индуцировать апоптоз клеток, экспрессирующих CLD18, индуцировать гомотипическую адгезию клеток, экспрессирующих CLD18, и/или индуцировать фагоцитоз клеток, экспрессирующих CLD18, в присутствии макрофагов. Антитела по изобретению могут обладать одним или несколькими из вышеописанных функциональных свойств. Предпочтительно антитела по изобретению индуцируют лизис клеток, экспрессирующих CLD18, по механизму CDC и по механизму ADCC, а более предпочтительно они индуцируют лизис клеток, экспрессирующих CLD18, по механизму ADCC, но не индуцируют лизиса данных клеток по механизму CDC. Примеры клеток-мишеней для антител по изобретению включают раковые клетки, экспрессирующие CLD18, предпочтительно CLD18A2, как-то опухолеродные раковые клетки желудка, поджелудочной железы, пищевода и легких. В особенно предпочтительном воплощении гибель клеток, вызванная антителами по изобретению, специфична по отношению к CLD18A2, т.е. антитела по изобретению вызывают гибель клеток, предпочтительно лизис клеток, экспрессирующих CLD18A2, по механизму CDC и/или ADCC, однако они не вызывают гибели клеток, экспрессирующих CLD18A1, но не экспрессирующих CLD18A2. Вышеописанные антитела могут применяться для уничтожения опухолевых клеток при лечении или профилактике рака, как-то рака желудка, рака пищевода, рака поджелудочной железы, рака легких, рака яичников, рака толстой кишки, рака печени, рака головы и шеи, рака желчного пузыря и/или их метастазов.

Антитела по изобретению можно отнести к различным классам по их свойствам связывания и по их способности опосредовать эффекторные функции на клетках, экспрессирующих CLD18. Антитела по изобретению можно классифицировать по:

- свойствам связывания с клетками, экспрессирующими либо CLD18A1, либо CLD18A2, и/или опосредованию эффекторных функций на клетках, экспрессирующих либо CLD18A1, либо CLD18A2 (различение сплайс-вариантов CLD18),

- свойствам связывания с клетками, экспрессирующими либо гликозилированные, либо негликозилированные варианты CLD18, и/или опосредованию эффекторных функций на клетках, экспрессирующих либо гликозилированные, либо негликозилированные варианты CLD18 (различение вариантов CLD18 с N-гликозилированием или без него),

- свойствам связывания либо с раковыми клетками, либо с нормальными типами клеток, и/или опосредованию эффекторных функций либо на раковых клетках, либо на нормальных типах клеток (различение вариантов CLD18, экспрессируемых раковыми клетками или нормальными нераковыми клетками),

- свойствам связывания с эпитопами CLD18, экранируемыми при образовании плотных контактов,

- способности индуцировать образование агрегатов CLD18 на живых клетках, и

- способности к связыванию с другими вариантами CLD18, чем у человека, в особенности с вариантами CLD18 у мышей, крыс, кроликов и приматов.

Антитела по изобретению могут иметь одно или несколько из следующих свойств, которые приводятся на конкретных примерах описанных в нем антител (24Н5, 26В5, 26D12, 28D10, 37G11, 37Н8, 38G5, 38Н3, 39F11, 41С6, 42Е12, 43А11, 44Е10, 47D12, 61С2, 75В8, 85А3, 9Е8, 19В9, 45С1, 125Е1, 163Е12, 166Е2, 175D10, ch-43A11, ch-45C1, ch-125E1, ch-163E12, ch-166E2, ch-175D10):

a) связывание как с CLD18A2, так и с CLD18A1 (напр., 26D12, 28D10, 37Н8, 38H3, 39F11, 61C2, 41C6);

b) связывание с CLD18A2, но не с CLD18A1 (напр., 26В5, 37G11, 38G5, 42Е12, and 43А11, 45С1, 125Е1, 163Е12, 166Е2, 175D10, ch-43A11, ch-45C1, ch-125E1, ch-163E12, ch-166E2, ch-175D10);

c) связывание с CLD18, естественным образом экспрессирующимся раковыми клетками, но не с CLD18, естественным образом экспрессирующимся нераковыми клетками или тканями, как-то клетками желудка и легких (напр., 26В5, 75В8, 24Н5, 39F11, 45С1, 125Е1, 163Е12, 166Е2, 175D10);

d) опосредование по механизму CDC гибели клеток, экспрессирующих CLD18A2, но не клеток, экспрессирующих CLD18A1 (напр., 26D12, 28D10, 37Н8, 39F11, 163Е12, ch-125El, ch-163E12, ch-175D10);

e) опосредование по механизму ADCC гибели клеток, экспрессирующих CLD18 (напр., 26В5, 37G11, 37Н8, 38G5, 38Н3, 39F11, 43А11, 47D12, 61С2, ch-163E12, ch-175D10);

f) опосредование по механизму ADCC, но не по механизму CDC гибели клеток, экспрессирующих CLD18 (напр., 37G11, 42Е12, 43А11);

g) опосредование и по механизму ADCC, и по механизму CDC гибели клеток, экспрессирующих CLD18A2 (напр., 37Н8, 38Н3, 39F11, ch-163E12, ch-175D10).

Как изложено в настоящем изобретении, антитела по изобретению также охватывают молекулы, которые:

a) связываются с дифференцированными клетками нормального желудка, но не со стволовыми клетками желудка (напр., 39F11)

b) не связываются с нормальной тканью желудка, а также других нормальных органов, а только с раковыми клетками (напр., 26В5)

c) связываются с эпитопом, охватывающим негликозилированный Asn в положении 116 у CLD18

d) связываются и с CLD18 человека, и с CLD18 мыши, что дает возможность проводить тщательные доклинические исследования по токсичности на мышах.

Антитела по изобретению могут происходить из различных видов, в том числе мыши, крысы, кролика, морской свинки и человека. Антитела по изобретению также включают химерные молекулы, в которых константная область антитела из одного вида, предпочтительно человека, сочетается с антигенсвязывающим сайтом из другого вида. Кроме того, антитела по изобретению включают и гуманизированные молекулы, в которых антигенсвязывающие сайты антител из другого вида, чем человек, сочетаются с константными и каркасными областями антител человека.

Антитела по изобретению включают поликлональные и моноклональные антитела и включают антитела типа IgG2a (напр., IgG2a, κ, λ), IgG2b (напр., IgG2b, κ, λ), IgG3 (напр., IgG3, κ, λ) и IgM. Однако изобретение охватывает и другие изотипы антител, включая антитела типа IgG1, IgA1, IgA2, секреторного IgA, IgD и IgE. Антитела могут представлять собой целые антитела либо их антигенсвязывающие фрагменты, включая, к примеру, фрагменты Fab, F(ab')₂, Fv, одноцепочечные Fv-фрагменты и биспецифичные антитела. Кроме того, антигенсвязывающие фрагменты включают слитые белки связывающих доменов иммуноглобулина, содержащие: (i) полипептид связывающего домена (как-то вариабельной области тяжелой цепи или вариабельной области легкой цепи), слитый с полипептидом шарнирного участка иммуноглобулина, (ii) константную область C_H3 тяжелой цепи иммуноглобулина, слитую с константной областью C_H2. Такие слитые белки связывающих доменов иммуноглобулина более подробно раскрыты в US 2003/0118592 and US 2003/0133939.

Антитела настоящего изобретения предпочтительно диссоциируют от CLD18 со значением равновесной константы диссоциации (K_D) примерно 1-100 нМ или меньше. Предпочтительно антитела по изобретению не дают перекрестной реакции с родственными антигенами поверхности клеток и поэтому не ингибируют их функционирование.

В предпочтительных воплощениях антитела настоящего изобретения могут характеризоваться одним или несколькими из следующих свойств:

a) специфичностью к CLD18, в частности специфичностью к CLD18A2;

b) сродством связывания с CLD18, в частности CLD18A2, составляющим около 100 нМ или меньше, предпочтительно 5-10 нМ или меньше, более предпочтительно 1-3 нМ или меньше;

c) способностью опосредовать высокий уровень CDC на CD55/59-отрицательных либо CD55/59-положительных клетках;

d) способностью ингибировать рост клеток, экспрессирующих CLD18;

e) способностью индуцировать апоптоз клеток, экспрессирующих CLD18;

f) способностью индуцировать гомотипическую адгезию клеток, экспрессирующих CLD18;

g) способностью индуцировать ADCC на клетках, экспрессирующих CLD18, в присутствии эффекторных клеток;

h) способностью продлевать жизнь у субъектов с раковыми клетками, экспрессирующими CLD18;

i) способностью устранять клетки, экспрессирующие CLD18;

j) способностью устранять клетки, экспрессирующие CLD18 на низком уровне;

k) способностью вызывать агрегацию CLD18 на поверхности живых клеток.

Антитела настоящего изобретения против CLD18 можно подвергать дериватизации, присоединять к или экспрессировать вместе с другими специфичностями связывания. В предпочтительном воплощении изобретения предусмотрены биспецифичные или мультиспецифичные молекулы, содержащие по меньшей мере одну первую специфичность связывания с CLD18 (напр., антитело к CLD18 или его аналог) и вторую специфичность связывания с эффекторными клетками, как-то специфичность связывания с Fc-рецептором (напр., Fcγ-рецептором, как-то FcγRI или иным Fc-рецептором) либо с Т-клеточным рецептором, напр., CD3.

Соответственно, настоящее изобретение включает биспецифичные и мультиспецифичные молекулы, которые связываются и с CLD18, и с Fc-рецептором либо Т-клеточным рецептором, напр., CD3. Примерами Fc-рецепторов являются IgG-рецепторы, Fcγ-рецепторы (FcγR), как-то FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) и FcγRIII (CD16). Мишенями могут служить и другие Fc-рецепторы, как-то IgA-рецепторы (напр., FcαRI). Fc-рецепторы предпочтительно находятся на поверхности эффекторных клеток, напр., моноцитов, макрофагов или активированных мононуклеаров. В предпочтительном воплощении биспецифичные и мультиспецифичные молекулы связываются с Fc-рецептором по сайту, который отличается от сайта связывания иммуноглобулина (напр., IgG or IgA) у Fc-рецептора. Следовательно, связывание биспецифичных и мультиспецифичных молекул не будет блокироваться физиологическими уровнями иммуноглобулинов.

В следующем аспекте антитела против CLD18 по изобретению подвергаются дериватизации, присоединяются к или экспрессируются вместе с другой функциональной молекулой, напр., другим пептидом или белком (напр., Fab'-фрагментом). Например, антитело по изобретению можно функционально соединить (напр., путем химического конъюгирования, генетического слияния, нековалентной ассоциации или иным способом) с одной или несколькими разновидностями молекул, как-то с другим антителом (напр., для получения биспецифичных или мультиспецифичных антител), цитотоксином, клеточным лигандом или антигеном (напр., для получения иммуноконъюгата, как-то иммунотоксина). Антитела настоящего изобретения можно присоединять к другим лечебным молекулам, напр., радиоизотопам, противораковым препаратам из небольших молекул, рекомбинантным цитокинам или хемокинам. Соответственно, настоящее изобретение охватывает широкий спектр конъюгатов антител, биспецифичных и мультиспецифичных молекул и слитых белков, которые все связываются с экспрессирующими CLD18 клетками и могут применяться для доставки других молекул к таким клеткам.

В следующем аспекте изобретением также предусмотрены связывающие CLD18 белки, происходящие из доменов не иммуноглобулинов, в частности, одноцепочечные белки. Такие связывающие белки и способы их получения описаны, к примеру, в Binz et al. (2005) Nature Biotechnology 23 (10): 1257-1268, включенном в настоящее изобретение путем ссылки. Следует иметь в виду, что изложенные в настоящем изобретении положения в отношении иммуноглобулинов или происходящих из иммуноглобулинов связывающих молекул, соответственно, также применимы к связывающим молекулам, происходящим из доменов не иммуноглобулинов. В частности, с помощью таких связывающих молекул, происходящих из доменов не иммуноглобулинов, можно блокировать CLD18 у клеток, экспрессирующих данную мишень, и тем самым осуществить терапевтические эффекты, изложенные в настоящем изобретении в отношении антител по изобретению, в частности ингибировать пролиферацию раковых клеток. Необязательно таким неиммуноглобулиновым связывающим молекулам можно придать эффекторные функции антител, напр., путем слияния с областью Fc антител.

В следующем аспекте изобретением предусмотрены композиции, напр., фармацевтические и диагностические композиции/наборы, включающие фармацевтически приемлемый носитель вместе с одним или с комбинацией антител по изобретению. В предпочтительном воплощении композиция включает комбинацию антител, связывающихся с разными эпитопами или обладающими различными функциональными характеристиками, как-то индуцирование CDC и/или ADCC и индуцирование апоптоза. В этом воплощении изобретения антитела могут применяться в комбинации, напр., в виде фармацевтической композиции, содержащей два или несколько моноклональных антител к CLD18. Например, в одной терапии можно объединить антитела к CLD18, обладающие различными, но дополняющими друг друга активностями для достижения требуемого терапевтического эффекта. В предпочтительном воплощении композиция включает антитело к CLD18, вызывающее CDC, в сочетании с другим антителом к CLD18, вызывающим апоптоз. В другом воплощении композиция включает антитело к CLD18, очень эффективно вызывающее гибель клеток мишени в присутствии эффекторных клеток, в сочетании с другим антителом к CLD18, ингибирующим рост клеток, экспрессирующих CLD18.

Настоящее изобретение также включает одновременное или последовательное введение двух или нескольких антител к CLD18 по изобретению, при котором по меньшей мере одно из данных антител является химерным антителом к CLD18, а по меньшей мере одно другое антитело является антителом человека к CLD18, причем эти антитела связываются с одними и теми же либо различными эпитопами CLD18. Предпочтительно сначала вводится химерное антитело к CLD18 по изобретению, а затем вводится антитело человека к CLD18 по изобретению, при этом антитело человека к CLD18 предпочтительно вводится в течение длительного периода времени, т.е. в качестве поддерживающей терапии.

Антитела, иммуноконъюгаты, биспецифичные и мультиспецифичные молекулы и композиции настоящего изобретения могут применяться в целом ряде способов ингибирования роста клеток, экспрессирующих CLD18, в частности CLD18A2, и/или избирательного уничтожения клеток, экспрессирующих CLD18, в частности CLD18A2, путем контактирования клеток с эффективным количеством антитела, иммуноконъюгата, биспецифичной/мультиспецифичной молекулы или композиции с тем, чтобы рост клеток ингибировался и/или клетки погибали. В одном воплощении способ включает уничтожение клеток, экспрессирующих CLD18, необязательно в присутствии эффекторных клеток, например, по механизму CDC, апоптоза, ADCC, фагоцитоза или комбинации двух или нескольких из этих механизмов. Экспрессирующие CLD18 клетки, которые можно ингибировать или уничтожить с помощью антител по изобретению, включают раковые клетки, как-то опухолеродные клетки желудка, поджелудочной железы, пищевода, легких, яичников, толстой кишки, печени, головы и шеи, желчного пузыря.

Соответственно, антитела настоящего изобретения могут применяться для лечения и/или предотвращения целого ряда заболеваний с участием клеток, экспрессирующих CLD18, путем введения антител пациентам, страдающим такими заболеваниями. Примеры заболеваний, которые можно лечить (напр., облегчить) или предотвращать, включают и опухолеродные заболевания. Примеры опух