Применение дендримерной нанотехнологии для доставки биомолекул в растительные клетки

Применение дендримерной нанотехнологии для доставки биомолекул в растительные клетки

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПРИТЯЗАНИЕ НА ПРИОРИТЕТ

По данной заявке испрашивается приоритет по предварительной заявке на патент США № 61/252607, поданной 16 октября 2009 г., "ПРИМЕНЕНИЕ ДЕНДРИМЕРНОЙ НАНОТЕХНОЛОГИИ ДЛЯ ДОСТАВКИ БИОМОЛЕКУЛ В РАСТИТЕЛЬНЫЕ КЛЕТКИ".

Предшествующий уровень техники

Наночастицы обладают уникальными свойствами, которые применяются для использования для доставки ДНК в клетки. Металлические наночастицы, такие как наночастицы золота (Au), используются для доставки ДНК из-за их низкой цитотоксичности и простоты функционализации с различными лигандами биологического назначения. В дополнение к металлическим наночастицам также в качестве носителей для доставки молекул в клетки используются полупроводниковые наночастицы (например, квантовые точки) ("QD") в пределах размеров 3-5 нм. ДНК и белки могут быть связаны с лигандом, прикрепленным к поверхности QD (см., например, F. Patolsky et al., J. Am. Chem. Soc. 125, 13918 (2003)).

Наночастицы используют для доставки плазмидной ДНК в разнообразные клетки животных. Было обнаружено, при инкубации покрытых ДНК наночастиц с клетками, не имеющими клеточной стенки, клетки поглощают наночастицы и начинают экспрессию любых генов, кодируемых ДНК. Тем не менее в настоящее время генная доставка в растения затруднительна из-за наличия растительных клеточных стенок, что приводит к повсеместному использованию средств для инвазивной доставки для генетической трансформации растений. Если требуется опосредованная наночастицами доставка в обычно имеющие клеточную стенку клетки, то стенку клеток разрушают перед добавлением частиц к протопластам растения (см., F. Torney et al., Nature Nanotechnol. 2, (2007)). В растительных клетках клеточная стенка служит в качестве барьера для доставки экзогенно вносимых молекул. Многие инвазивные способы, такие как генная пушка (биолистика), микроинъекция, электропорация и агробактерия, применяются для того, чтобы осуществить доставку гена и малой молекулы в эти имеющую стенку растительные клетки, но доставка белков осуществляется только посредством микроинъекции. Задача доставки малых молекул и белков при наличии растительной клеточной стенки остается неразрешенной, и было бы полезно разработать эффективные технологии, которые могут быть применены по отношению к интактной растительной клетке/ткани или органу в in vitro и in vivo манипуляциях.

Проникающие в клетку пептиды (CPP) являются новым и быстро растущим классом коротких пептидов, про которые известно, что они играют важную роль в переносе широкого спектра комплексов грузов, включая белки и ДНК через биомембраны в млекопитающих и человеческих клеточных линиях J. Schwartz and S. Zhang (2000), Peptide-Mediated Cellular Delivery, Curr. Opin. Mol. Ther. 2:162-167; Ü Langel (2002), Preface in: Cell Penetrating Peptides; Processes and Applications, Ü. Langel, Editor, CRC Press, Boca Raton; E. Vives and B. Lebleu (2002), The Tat-Derived Cell-Penetrating Peptide in: Cell-Penetrating Peptides; Processes and Applications, Ü. Langel, Editor, CRC Press, Boca Raton: pp. 3-22. Несмотря на то, что было продемонстрировано, что CPP облегчают доставку грузов в клетки млекопитающих, использование CPP в растительных клетках для исследования трансфекции было ограничено рядом факторов. Главным препятствием для адаптации этой технологии к растениям является то, что в отличие от клеток животных в растительных клетках имеется система с двойным барьером (клеточная стенка и цитоплазматическая мембрана) для интернализации CPP и их грузов. По этой причине CPP должны преодолеть эти два барьера для эффективного переноса. CPP используют в растительных клетках, но, как правило, применяют на основе использования пермеабилизирующих агентов и технологий с использованием CPP для осуществления доставки грузов в растительные клетки. Трансдукционный домен (PTD) TAT белка HIV-1 является одним из наиболее изученных транслоцирующихся пептидов. Последние сообщения продемонстрировали способность TAT-PTD и их олигомеров к доставке плазмиды посредством образования комплекса с отрицательно заряженной ДНК в клетках млекопитающих. I. Ignatovich, E. Dizhe, A. Pavlotskaya, B. Akifiev, S. Burov, S. Orlov, and A. Perevozchikov (2003), Complexes of Plasmid DNA with Basic Domain 47-57 of the HIV-1 Tat Protein Are Transferred to Mammalian Cells by Endocytosis-mediated Pathways, J. Biol. Chem. 278:42625-42636; C. Rudolph, C. Plank, J. Lausier, U. Schillinger, R.H. Müller, and J. Rosenecker (2003), Oligomers of the Arginine-Rich Motif of the HIV-1 TAT Protein are Capable of Transferring Plasmid DNA into Cells, J. Biol. Chem. 278:11411-11418; Z. Siprashvili, F. Scholl, S. Oliver, A. Adams, C. Contag, P. Wender, and P. Khavari (2003), Gene Transfer via Reversible Plasmid Condensation with Cysteine-Flanked, Internally Spaced Arginine-Rich Peptides, Hum. Gene. Ther. 14 (13):1225-33; I. Hellgren, J. Gorman, and С. Sylvén (2004), Factors Controlling the Efficiency of Tat-mediated Plasmid DNA Transfer, J. Drug. Target. 12 (l):39-47.

Дендримеры являются "каскадными молекулами" с необычной окклюдантной макромолекулярной архитектурой. Дендримеры были впервые приготовлены в лаборатории в 1979 году Дональдом Томалиа (D.A. Tomalia et al., Preprints of the 1^st SPSJ Int'l Polymer conference, Society of Polymer Science, Japan, Kyoto, 1984, p. 65; см. также патент США № 6316694). Дендримеры используются для доставки ДНК и других биомолекул в клетки животных. Тем не менее наличие растительной клеточной стенки представляет сложности для генетической доставки в растения. Кроме того, нет сообщений или доказательств устойчивой геномной интеграции трансгенов с использованием основанной на дендримерах доставки в растения. Таким образом, все еще существует необходимость в способе устойчивого включения генов и других молекул, представляющих интерес, в растения посредством использования основанной на дендримерах доставки.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Следующие варианты осуществления описаны в сочетании с системами, средствами и способами, которые, как подразумевается, являются примерными и иллюстративными и не ограничивающими объем изобретения.

Данное изобретение относится к способам использования дендримеров и, необязательно, одного или более CPP для неинвазивной доставки молекулярных веществ в клетки, имеющие клеточную стенку, для устойчивого включения в них молекулярных веществ.

Один из вариантов осуществления изобретения включает способ внесения представляющей интерес молекулы в растительную клетку, имеющую клеточную стенку, для осуществления устойчивой трансформации растений и семян. Способ включает предоставление растительной клетки, имеющей клеточную стенку, и взаимодействие дендримера и, необязательно, одного или более CPP с представляющей интерес молекулой для образования активированной дендримерной структуры. Клетка и активированная дендримерная структура приводятся в контакт друг с другом в условиях, допускающих проникновение в клетку, имеющую клеточную стенку.

Другой вариант осуществления изобретения включает способ стабильной экспрессии гена. Способ включает предоставление растительной клетки, имеющей клеточную стенку, и взаимодействие дендримера и, необязательно, одного или более CPP с геном для образования активированной дендримерной структуры. Растительная клетка, имеющая клеточную стенку, и активированная дендримерная структура приводятся в контакт друг с другом, и дендримеры и ген помещаются в условия, допускающие их проникновение в растительную клетку, имеющую клеточную стенку. После этого ген экспрессируется в потомстве растений, имеющих растительную клетку.

Еще один вариант осуществления изобретения включает в себя способ переноса молекулярного соединения в растительную клетку. Способ включает в себя взаимодействие одного дендримера и, необязательно, одного или более CPP с плазмидной ДНК для образования активированной дендримерной структуры. Активированная дендримерная структура вводится в контакт с интактной имеющей стенку растительной клеткой при условиях, допускающих проникновение дендримера и гена из плазмидной ДНК в растительную клетку.

Вдобавок к примерным аспектам и вариантам осуществления, описанным выше, дополнительные аспекты и варианты осуществления будут понятны в свете дальнейших описаний.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

На фиг.1 представлена плазмида pDAB3831.

На фиг.2 представлена плазмида pDAB7331.

На фиг.3 представлено изображение геля, окрашенного бромидом этидия, демонстрирующего ПЦР амплификацию PAT из геномной ДНК трансгенного растения Arabidopsis: маркер длин ДНК 100 (Promega Inc) 1; трансгенная линия Arabidopsis от SUPERFECT™ с обработкой 2 pDAB3831; Плазмидная ДНК pDAB3831 в качестве положительного контроля; Звездочки указывают на ПЦР-ампликон PAT.

На фиг.4 представлено изображение геля, демонстрирующего ПЦР амплификацию геномной ДНК трансгенной растительной Arabidopsis: маркер длин ДНК 100 (Promega Inc) 1; трансгенная линия Arabidopsis от SUPERFECT™ с обработкой 2 pDAB3831; плазмидная ДНК pDAB3831 в качестве положительного контроля; звездочки указывают на ПЦР-ампликон YFP.

На фиг.5 продемонстрированы PAT уровни экспрессии белков из листовых тканей дендример-опосредовано (SUPERFECT™) трансформированных растений Arabidopsis; с использованием коммерчески доступного набора ELISA, Белок PAT детектировали в дендример-опосредованных трансгенных растениях и сравнивали с растениями, которые были трансформированы с помощью Agrobacterium tumefaciens.

ВАРИАНТ(Ы) ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В описании и последующих таблицах использован ряд терминов. Для того чтобы обеспечить отчетливое и подходящее истолкование описания и формулы изобретения, включая пределы, в рамках которых использованы такие термины, предоставлены следующие определения:

Обратное скрещивание. Обратное скрещивание может быть процессом, в котором селекционер повторно скрещивает гибридное потомство с одним из родителей, например, гибрид первого поколения F₁ с одним из родительских генотипов F₁ гибрида.

Эмбрион. Эмбрион может быть небольшим растением, содержащимся в зрелом семени.

Дендример. Дендримеры являются трехмерными, сверхразветвленными, монодисперсными наномерными макромолекулами, полученными посредством повторяющейся последовательности реакций. Дендримеры синтезируют обычным путем как перестраиваемые "наноструктуры", которые могут быть разработаны и регулироваться в зависимости от их размера, формы, поверхностной химии и внутреннего свободного пространства. Дендримеры могут быть получены с таким же подходом к структурному контролю, что и для общепринятых биомакромолекул, таких как DNNPNA или белки, и различаются их определенной наноразмерной подложкой и наноконтейнерными свойствами. Дендримеры являются микроскопическими частицами с по меньшей мере одним наноразмерным измерением, обычно менее 100 нм. Дендримеры, пригодные для использования в данном изобретении, могут иметь размер 1 нм - 0,4 мкм.

Резистентный к глифосату. Резистентность к дозировке глифосата относится к способности растения выживать (т.е. растение не может быть уничтожено) при такой дозировке глифосата. В некоторых случаях устойчивые растения могут временно становиться желтыми или иным образом проявлять некоторое вызванное глифосатом повреждение (например, избыточное ветвление и/или ингибирование роста), но восстанавливаться.

Устойчивый. Устойчивый относится к характеристикам растения, которые воспроизводимо передаются от одного поколения следующему поколению инбредных растений одного сорта.

Проникновение. Проникновение относится к переносу частицы, такой как дендример, через клеточную стенку или клеточную мембрану, где перенос не происходит только лишь в результате импульса, переданного частице, чем-либо отличным от клетки, в которую частица внедряется. Неограничивающими примерами устройств или способов, которые вызывают перенос частиц через клеточную стенку или клеточную мембрану только лишь в результате импульса, переданного частице, являются технологии биолистики, генной пушки, микроинъекции и/или импалефекции.

В конкретных способах осуществления изобретение относится к применению дендримера в качестве варианта для нанопроектирования для конструирования переносчика грузов для того, чтобы сформировать материалы для применения в синтетических препаратах, доставке биомолекул, генной доставке, визуализации и различных биотехнологических диагностических средствах и для измерительных функций. Конструкция дендримера обеспечивает ряд отличительных свойств, которые отличают их от других полимеров и наночастиц, таких как последовательный поэтапный способ синтеза, который может обеспечить строго определенный размер и структуру со сравнительно низким коэффициентом полидисперсности. Кроме того, дендримерная химия может быть адаптирована и, таким образом, будет облегчен синтез большого диапазона молекул с различными функциональностями. Применение дендримеров в соответствии с конкретными способами данного изобретения способствует доставке биомолекул и генов посредством использования высокой плотности концевых групп.

В других вариантах осуществления изобретения множественные сайты присоединения или дополнение "добавочной" или "гостевой" молекулы могут быть сконструированы на дендримерах в различных и/или множественных сайтах. Это свойство может быть применено, например, в специфическом направлении и редактировании молекулярных сайтов внутри клетки в таких областях, как биомиметика, направленные способы доставки, для опций, связанных с негенетически модифицированным организмом, и опций, связанных с временной трансформацией различных деревьев или овощных культур для придания признаков и опций, связанных с резистентностью к болезни. Варианты осуществления изобретения могут также быть применены для разработки пригодных биосенсоров. Кроме того, со способами изобретения могут быть применены искусственные хромосомы (ACES) в качестве альтернативы современным эукариотическим векторам для необязательностей точного направления и гомологичной рекомбинации.

В соответствии с вариантами осуществления изобретения может быть предоставлен способ внесения представляющей интерес молекулы в растительную клетку, содержащую клеточную стенку, при этом способ содержит приведение дендримера, содержащего представляющую интерес молекулу, в контакт с растительной клеткой и предоставление возможности проникновения дендримера через растительную клеточную стенку. В конкретных аспектах изобретения дендример может быть любым дендримером и может обратимо или необратимо включать в себя, может взаимодействовать или иным образом быть связанным с и/или нести молекулу, представляющую интерес. В некоторых вариантах осуществления представляющая интерес молекула может быть введена в дендример перед контактом с растительной клеткой, имеющей клеточную стенку, или одновременно с введением дендримера в растительную клетку, имеющую клеточную стенку.

В соответствии с вариантами осуществления данного изобретения, растительная клетка, имеющая клеточную стенку, может быть любой растительной клеткой, содержащей интактную и целую клеточную стенку. Примеры клеток, имеющих клеточную стенку, включают в себя, но не ограничены ими, клетки водорослей, табака, моркови, маиса, канолы, рапсового семени, хлопка, пальмового дерева, арахиса, сои, сахарного тростника, Oryza sp., Arabidopsis sp. и Ricinus sp., предпочтительно табака, моркови, маиса, хлопка, канолы, сои и сахарного тростника; более предпочтительно табака и моркови. Варианты осуществления изобретения могут включать в себя клетки, содержащие клеточную стенку, из любой ткани или всего, где они обнаружены, включая, но не ограничиваясь этим, эмбрионы, меристему, каллюс, пыльцу, листья, пыльники, корни, корневые кончики, цветы, семена, стручки, стебли и тканевые культуры.

В вариантах осуществления изобретения представляющая интерес молекула может быть любой молекулой, которая может быть доставлена в растительную клетку в соответствии с данным изобретением. Молекулы, представляющие интерес, или компоненты молекул, представляющих интерес, могут содержать, но не ограничены ими, нуклеиновые кислоты, ДНК, РНК, молекулы РНКи, гены, плазмиды, космиды, искусственные дрожжевые хромосомы, искусственные бактериальные хромосомы, растительные искусственные хромосомы, растительные минихромосомы, сконструированную растительную ДНК характерных локусов; полипептиды, ферменты, гормоны, гликопептиды, сахара, жиры, сигнальные пептиды, антитела, витамины, мессенджеры, вторичные мессенджеры, аминокислоты, цАМФ, лекарственные препараты, гербициды, фунгициды, антибиотики и/или их комбинации.

Варианты осуществления изобретения включают в себя способы предотвращения или лечения заболевания. Неограничивающие показательные варианты осуществления включают в себя доставку фунгицидов, антибиотиков и/или других лекарственных средств в клетки, нуждающиеся в этом, используя способы данного изобретения.

В аспектах изобретения дендример может быть внедрен в различные части клеток. Примеры компартментов, в которые может быть внедрен дендример, включают в себя, но не ограничены ими, цитозоль, ядро, тонопласты, пластиды, этиопласты, хромопласты, лейкопласты, элайопласты, протеинопласты, амилопласты, хлоропласты и просвет двойной мембраны. В других вариантах осуществления изобретения проникновение дендримера в клетку, содержащую клеточную стенку, может происходить через симпластический или апопластический путь.

Дополнительные варианты осуществления изобретения включают в себя генетически модифицированные растительные клетки и способы их генерирования, в которых в растительные клетки введена одна или более нуклеиновых кислот посредством способов данного изобретения. В одном примере варианта осуществления плазмида, содержащая ген, представляющий интерес, и селектируемый маркер, может быть введена в растительную клетку, имеющую клеточную стенку посредством дендримера в соответствии с данным изобретением. В дополнительных вариантах осуществления могут быть отобраны устойчивые трансформанты, которые содержат устойчиво интегрированный ген, представляющий интерес, и/или селектируемый маркер. В альтернативных вариантах осуществления растительная клетка, в настоящее время содержащая ген, представляющий интерес, может быть размножена для выработки других клеток, содержащих представляющую интерес молекулу. В других вариантах осуществления растительные клетки, в настоящее время содержащие представляющую интерес молекулу, могут являться способной к регенерации клеткой, которая может быть использована для регенерирования всего растения, включая представляющую интерес молекулу.

В другом аспекте данное изобретение обеспечивает способы создания регенерируемых растительных клеток, содержащих представляющую интерес молекулу, для использования в тканевой культуре. Выращивание живой ткани предпочтительно будет предоставлять необязательность регенерации растений, имеющих практически такой же генотип, как регенерируемые клетки. Регенерируемые клетки в таких тканевых культурах могут быть эмбрионами, протопластами, меристематическими клетками, каллюсом, пыльцой, листьями, пыльниками, корнями, корневыми кончиками, цветами, семенами, стручками или стеблями. Еще один дополнительный вариант осуществления изобретения обеспечивает растения, регенерированные из тканевой культуры изобретения.

Альтернативно данное изобретение обеспечивает способ внесения требуемого признака в растительную клетку, имеющую клеточную стенку, где способ включает приведение дендримера и представляющей интерес молекулы, способной обеспечивать требуемый признак в растительной клетке, в контакт с клеткой, и предоставление возможности проникновения дендримера через клеточную стенку. Примеры требуемых признаков включают в себя, но не ограничены ими, признаки, выбранные из мужской стерильности, гербицидной устойчивости, резистентности к насекомым и резистентности к бактериальному заболеванию, грибковому заболеванию и/или вирусному заболеванию.

Дополнительные аспекты изобретения предоставляют способы генерирования устойчивых линий растений, содержащих требуемый признак или представляющую интерес молекулу, в которых требуемый признак или представляющая интерес молекула могут быть первоначально введены проникновением дендримера через растительную клеточную стенку. Способы генерирования устойчивых растительных линий хорошо известны рядовым специалистам в данной области и могут включать в себя технологии, такие как, но не ограничиваясь ими, самоопыление, возвратное скрещивание, генерация гибридов, скрещивание популяций и тому подобное. Все растения и растительные клетки, содержащие требуемый признак или представляющую интерес молекулу, первоначально введенную в растительную клетку (или ее предшественники) проникновением дендримера через клеточную стенку, попадают в объем данного изобретения. Предпочтительно растительные клетки, содержащие требуемый признак или представляющую интерес молекулу, первоначально введенную в растение или клетку (или ее предшественники) проникновением дендримера через клеточную стенку, могут быть использованы в скрещиваниях с другими, различными растительными клетками для выработки первого поколения (F₁) гибридных клеток, семян и/или растений с превосходящими характеристиками.

В вариантах осуществления, в которых представляющая интерес молекула содержит один или более генов, ген(ы) может быть доминантным или рецессивным аллелем. В качестве примера, ген(ы) будет обеспечивать такие признаки, как устойчивость к гербицидам, устойчивость к насекомым, устойчивость к бактериям, устойчивость к грибам, устойчивость к вирусному заболеванию, мужская плодовитость, мужская стерильность, улучшенные питательные качества и промышленная утилизация.

С появлением молекулярно-биологических технологий, которые позволили выделение и характеризацию генов, которые кодируют конкретный белок, или РНК продуктов (например, молекулы РНКи), у ученых в области растительной биологии появилась большая заинтересованность в конструировании генома клеток так, чтобы он включал в себя и экспрессировал чужеродные гены или дополнительные или модифицированные варианты природных или эндогенных генов (быть может направляемых различными промоторами) для того, чтобы изменять признаки клетки определенным образом. Такие чужеродные дополнительные и/или модифицированные гены в настоящем документе собирательно называются "трансгены". На протяжении последних пятнадцати-двадцати лет было разработано несколько способов выработки трансгенных клеток, и в конкретных вариантах осуществления данное изобретение относится к трансформированным вариантам клеток и способам их получения посредством внесения в клетку, имеющую клеточную стенку, трансгена посредством проникновения дендримера через клеточную стенку. В вариантах осуществления изобретения трансген может быть включен в состав экспрессионного вектора.

Трансформация клетки может содержать создание экспрессионного вектора, который будет функционировать в конкретной клетке. Такой вектор может содержать ДНК, которая включает в себя ген под контролем или функционально связанный с регуляторным элементом (например, промотором). Экспрессионный вектор может включать в себя одну или более таких функционально связанных комбинаций ген/регуляторный элемент. Вектор(ы) может быть в форме плазмиды и может быть использован отдельно или в комбинации с другими плазмидами для обеспечения трансформированных клеток, используя способы трансформации, описанные в данном документе, для включения трансген(ов) в состав генетического материала растительной клетки, содержащей клеточную стенку.

В конкретных вариантах осуществления изобретения прототип многоцелевого дендримера STARBURST® РАМАМ (полиамидоамин) проявляет свойства, пригодные для использования в качестве: (i) направленных контрастных веществ для диагностической MRI (магнитно-резонансная томография) INIR (ближний-IR), (ii) и/или для регулируемой доставки противораковых средств. Среди этого ведущим вариантом является внутренняя часть: 1,4-диаминобутан; G (generation) [PAMAM(CO2Na)64J. Эта дендритовая наноструктура (т.е. -5,0 нм в диаметре) была отобрана на основе очень благоприятного профиля биосовместимости, в Лаборатории Нанотехнологической Характеризации (NCL), отделении Национального института рака (NCI), были выполнены обширные in vitro исследования ведущего вещества и было обнаружено, что оно является достаточно безвредным и биологически совместимым и продемонстрировало направляющие свойства, при этом полагают, что оно будет проявлять требуемые свойства почечной экскреции у млекопитающих. Дендримеры, используемые в соответствии со способами изобретения, представляют класс полимеров, характеризуемый их строго определенной структурой с высоким уровнем молекулярной однородности и низкой полидисперсностью. Кроме того, было показано, что эти дендримеры способны к проникновению без эффлюксных переносчиков.

Использование дендримеров в соответствии со способами данного изобретения привело к образованию устойчиво трансформированных растений и продемонстрировало экспрессию устойчиво трансформированного гербицидного гена с фенотипом, где высокая гербицидная устойчивость была передана трансгенному растению T1. Было продемонстрировано, что это растение является плодовитым, так как оно продуцировало семена T2.

В конкретных способах осуществления был использован реагент для трансфекции SUPERFECT™. Этот реагент является поликатионом, имеющим определенные форму и диаметр, доступный как реагент SUPERFECT™ от Qiagen (Qiagen Catalog #301307) в виде раствора специфически сконструированных активированных дендримеров. Дендримеры являются сферическими полиамидоаминовыми молекулами с ветвями, исходящими из центрального части и заканчивающимися на заряженных концевых аминогруппах. Химическая активация обеспечивает эффективное проникновение ДНК в эукариотические клетки. Без привязки к какой-либо конкретной теории предполагается, что этот реагент формирует из ДНК компактные структуры, тем самым оптимизируя поступление ДНК в клетки. Для стабилизации комплексов SUPERFECT™-ДНК во время их транспорта в ядро, реагент SUPERFECT™ сконструирован так, чтобы буферизовать лизосому после слияния с эндосомой, приводя к pH ингибированию лизосомальных нуклеаз.

Экспрессионные векторы для проникновения посредством дендримера: Маркерные гены

Экспрессионные векторы могут включать в себя по меньшей мере один генетический маркер, функционально связанный с регуляторным элементом (промотором, например), что позволяет трансформированным клеткам, содержащим маркер, быть или регенерированными негативным отбором (т.е. ингибируя рост клеток, которые не включают в себя селектируемый маркерный ген), или позитивным отбором (т.е. скринингом на продукт, кодируемый генетическим маркером). Многие селектируемые маркерные гены для трансформации хорошо известны в области трансформации и включают в себя, например, гены, которые кодируют ферменты, которые метаболически дезинтоксицируют селективное химическое вещество, которое может быть антибиотиком или гербицидом, или гены, которые кодируют измененную мишень, которая может быть невосприимчивой к ингибитору. Также в данной области известно несколько способов позитивного отбора.

Один из широко используемых селектируемых маркерных генов, пригодных для растительной трансформации, может содержать в себе ген - неомицин-фосфотрансферазу II (nptII) под контролем растительных регуляторных сигналов, который предоставляет резистентность к канамицину. См., например, Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80:4803 (1983). Другим широко используемым селектируемым маркерным геном может быть ген - гигромицин-фосфотрансфераза, который предоставляет резистентность к антибиотику гигромицину. См., например, Vanden Elzen et al., Plant Mol. Biol., 5:299 (1985).

Дополнительные селектируемые маркерные гены бактериального происхождения, которые предоставляют резистентность к антибиотикам, включают в себя гентамицин-ацетилтрансферазу, стрептомицин фосфотрансферазу, аминогликозид-3'-аденил трансферазу и детерминанту резистентности к блеомицину. См. Hayford et al., Plant Physiol. 86:1216 (1988); Jones et al., Mol. Gen. Genet., 210:86 (1987); Svab et al., Plant Mol. Biol. 14:197 (1990); Hille et al., Plant Mol. Biol. 7:171 (1986). Другие селектируемые маркерные гены предоставляют резистентность к гербицидам, таким как глифосат, глюфосинат или бромоксинил. См. Comai et al., Nature 317:741-744 (1985); Gordon-Kamm et al., Plant cell 2:603-618 (1990); и Stalker et al., Science 242:419-423 (1988).

Другие селектируемые маркерные гены, пригодные для трансформации растений, имеют не бактериальное происхождение. Эти гены включают в себя, например, мышиную дигидрофолатредуктазу, растительную 5-енолпирувил-шикимат-3-фосфат-синтазу и растительную ацетолактатсинтазу. См. Eichholtz et al., Somatic cell Mol. Genet. 13:67 (1987); Shah et al., Science 233:478 (1986); Charest et al., Plant Cell Rep. 8:643 (1990).

Для другого класса маркерных генов, пригодных для растительной трансформации, в большей степени необходим скрининг предположительно трансформированных растительных клеток, чем прямой генетический отбор трансформированных клеток на резистентность к токсичному веществу, такому как антибиотик. Эти гены особенно подходят для количественного определения или визуализации пространственной структуры экспрессии гена в определенных тканях и часто называются репортерными генами, потому что они могут быть слиты с геном или регуляторной последовательностью гена для исследования экспрессии гена. Широко используемые гены для скрининга трансформированных клеток включают в себя β-глюкуронидазу (GUS), β-галактозидазу, люциферазу и хлорамфеникол ацетилтрансферазу. См. Jefferson, R.A, Plant Mol. Biol. Rep. 5:387 (1987); Teeri et al., EMBO J. 8:343 (1989); Koncz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:131 (1987); DeBlock et al., EMBO J. 3:1681 (1984).

Недавно стали доступны способы визуализации in vivo GUS активности, для которых не требуется разрушение растительной ткани. Molecular Probes publication 2908, Imagene Green™, p. 1-4(1993); и Naleway et al., J. Cell Biol. 115:151a (1991). Тем не менее, не была продемонстрирована пригодность этих способов к in vivo визуализации GUS активности для регенерации трансформированных клеток из-за низкой чувствительности, высокого флуоресцентного фона и ограничений, связанных с использованием люциферазных генов в качестве селектируемых маркеров.

В последнее время гены, кодирующие флуоресцентные белки (например, GFP, EGFP, EBFP, ECFP и YFP), используются в качестве маркеров экспрессии генов в прокариотических и эукариотических клетках. См. Chalfie et al., Science 263:802 (1994). Флуоресцентные белки и мутации флуоресцентных белков могут быть использованы в качестве позволяющих проводить отбор маркеров.

Экспрессионные векторы для проникновения посредством дендримера: Промоторы

Гены, включенные в состав экспрессионных векторов, должны быть направлены нуклеотидной последовательностью, содержащей регуляторный элемент, например, промотором. Несколько типов промоторов в настоящее время хорошо известны в области трансформации, как и другие регуляторные элементы, которые могут быть использованы отдельно или в комбинации с промоторами.

В используемом в данном документе значении "промотор" включает в себя ссылку на область ДНК, которая может быть расположена перед началом транскрипции и которая может быть вовлечена в распознавание и связывание РНК полимеразы и других белков для инициации транскрипции. "Растительный промотор" может быть промотором, способным к инициированию транскрипции в растительных клетках. Примеры промоторов под контролем развития включают в себя промоторы, которые предпочтительно инициируют транскрипцию в некоторых тканях, таких как листья, корни, семена, волокна, сосуды ксилемы, трахеиды или склеренхима. Такие промоторы называются "ткане-предпочтительные". Промоторы, которые инициируют транскрипцию только в некоторых тканях называются "ткане-специфичные". Специфичный к "типу клетки" промотор первоначально запускает экспрессию в некоторых типах клеток в одном или более органов, например, в васкулярных клетках в корнях или листьях. "Индуцируемый" промотор может быть промотором, который может быть под контролем окружающей среды. Примеры связанных с окружающей средой условий, которые могут воздействовать на транскрипцию посредством индуцируемых промоторов, включают в себя анаэробные условия или наличие света. Ткане-специфичные, ткане-предпочтительные, специфичные к типу клетки и индуцируемые промоторы составляют класс "неконститутивных" промоторов. "Конститутивный" промотор может быть промотором, который может быть активным при большинстве внешних условий.

A. Индуцируемые промоторы

Индуцируемый промотор может быть функционально связан с геном для экспрессии в клетке. Если требуется, индуцируемый промотор может быть функционально связан с нуклеотидной последовательностью, кодирующей сигнальную последовательность, которая может быть функционально связана с геном для экспрессии в клетке. При наличии индуцируемого промотора уровень транскрипции повышается под влиянием индуцирующего агента.

В данном изобретении может быть использован любой индуцируемый промотор. См. Ward et al., Plant Mol. Biol. 22:361-366 (1993). Типичные индуцируемые промоторы включают в себя, но не ограничены ими: промотор из системы ACEI, который реагирует на медь (Mett et al., PNAS 90:4567-4571 (1993)); ген In2 из маиса, который реагирует на бензолсульфонамидные антидоты для гербицидов (Hershey et al., Mol. Gen. Genetics 227:229-237 (1991); и Gatz et al., Mol. Gen. Genetics 243:32-38 (1994)); и репрессор Tet из Tn10 (Gatz et al., Mol. Gen. Genetics 227:229-237 (1991)). Особенно пригодным индуцируемым промотором может быть промотор, который реагирует на индуцирующий агент, на который растения обычно не реагируют. Типичным индуцируемым промотором может быть индуцируемый промотор из гена стероидного гормона, транскрипционная активность которого может быть вызвана глюкокортикостероидным гормоном. Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:0421 (1991).

B. Конститутивные промоторы

Конститутивный промотор может быть функционально связан с геном для экспрессии в клетке или конститутивный промотор может быть функционально связан с нуклеотидной последовательностью, кодирующей сигнальную последовательность, которая может быть функционально связана с геном для экспрессии в клетке.

В данном изобретении могут быть использованы различные конститутивные промоторы. Типичные конститутивные промоторы включают в себя, но не ограничены ими: промоторы из растительных вирусов, такие как промотор 35S из CaMV (Odell et al., Nature 313:810-812 (1985)); промоторы из гена актина риса (McElroy et al., Plant Cell 2:163-171 (1990)); убиквитина (Christensen et al., Plant Mol. Biol. 12:619-632 (1989); и Christensen et al., Plant Mol. Biol. 18:675-689 (1992)); pEMU (Last et al., Theor. Appl. Genet. 81:581-588 (1991)); MAS (Velten et al., EMBO J. 3:2723-2730 (1984)); и гистона H3 маиса (Lepetit et al., Mol. Gen. Genetics 231:276-285 (1992); и Atanassova et al., Plant Journal 2 (3):291-300 (1992)). Промотор ALS, Xba1/NcoI фрагмент 5'-структурного гена ALS3 Brassica napus (или сходная с указанным Xba1/NcoI фрагментом нуклеотидная последовательность), представляет особенно подходящий конститутивный промотор. См. заявку PCT WO 96/30530.

C. Ткане-специфичные или ткане-предпочтительные промоторы

Ткане-специфичный промотор может быть функционально связан с геном для экспрессии в клетке. Необязательно ткане-специфичный промотор может быть функционально связан с нуклеотидной последовательностью, кодирующей сигнальную последовательность, которая может быть функционально связана с геном для экспрессии в клетке. Растения, трансформированные геном, представляющим интерес, функционально связанным с ткане-специфичным промотором, могут продуцировать белковый продукт трансгена исключительно или предпочтительно в определенной ткани.

В данном изобретении может быть использован любой ткане-специфичный или ткане-предпочтительный промотор. Типичные ткане-специфичные или ткане-предпочтительные промоторы включают в себя, но не ограничены ими, предпочтительный по отношению к корню промотор - такой как промотор из гена фазеолина (Murai et al., Science 23:476-482 (1983); и Sengupta-Gopalan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:3320-3324 (1985)); специфичный по отношению к листу и свет-индуцированный промотор, такой как промотор из cab или rubisco (Simpson et al., EMBO J. 4(11):2723-2729 (1985); и Timko et al., Nature 318:579-582 (1985)); специфичный по отношению к пыльнику промотор, такой как промотор из LAT52 (Twell et al., Mol. Gen. Genetics 217:240-245(1989)); специфичный по отношению к пыльце промотор, такой как промотор Zm13 (Guerrero et al., Mol. Gen. Genetics 244:161-168 (1993)) или предпочтительный по отношению к микроспоре промотор, такой как промотор из apg (Twell et al., Sex. Plant Reprod. 6:217-224(1993)).

Генерируемый трансгенами транспорт белка в субклеточный компартмент, такой как хлоропласт, вакуоль, пероксисома, глиоксисома, клеточная стенка или митохондрия или для секреции в апопласт, может