Мутации braf, обеспечивающие резистентность к ингибиторам braf

Мутации braf, обеспечивающие резистентность к ингибиторам braf

Иллюстрации

Показать все

Реферат

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Для настоящей заявки испрашивается преимущество приоритета по заявке USSN 61/308275, поданной 25 февраля 2010 года. Содержание данной заявки включено в настоящий документ в качестве ссылки.

ПОДДЕРЖКА ПРАВИТЕЛЬСТВА

Данное изобретение выполнено при поддержке правительства на основе Гранта № K08 CA115927, предоставленного Национальными институтами здравоохранения. Правительство обладает определенными правами на изобретение.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Лечение злокачественных опухолей представляет собой одну из самых сложных задач современной медицины. Хотя химиотерапевтические средства, как правило, представляют собой эффективные средства лечения или облегчения симптомов, ассоциированных со злокачественной опухолью, в некоторых случаях во время лечения появляется резистентность к одному или нескольким химиотерапевтическим средствам. В результате конкретное химиотерапевтическое средство может становиться неэффективным для определенных индивидуумов. Молекулярные механизмы, отвечающие за развитие резистентности различных типов злокачественной опухоли, изучены недостаточно. Выяснение механизмов, обуславливающих резистентность к определенным средствам, необходимо для обнаружения способов лечения, которые помогают эффективно решать проблему резистентности к лекарственным средствам.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к обусловленной мутациями резистентности к химиотерапевтическому лечению злокачественных опухолей. В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к мутациям, обнаруженным в полипептидах RAF (например, полипептиды BRAF), и к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим полипептиды RAF. Эти мутации обеспечивают резистентность к ингибиторам RAF, применяемым в терапевтических целях. Обнаружение этих мутаций позволяет разрабатывать ингибиторы RAF второго поколения, которые проявляют активность против полипептидов RAF, содержащих одну или несколько мутаций, таких как мутации, описываемые в настоящем документе. Такие ингибиторы RAF второго поколения используют во многих клинических и терапевтических областях применения, включая лечение злокачественных опухолей.

Таким образом, в первом аспекте изобретение раскрывает изолированную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую мутантный полипептид BRAF, проявляющий активность BRAF, где указанный мутантный полипептид BRAF содержит аминокислотную последовательность, содержащую, по меньшей мере, одну аминокислотную замену по сравнению с полипептидом BRAF дикого типа (SEQ ID NO: 2) или полипептидом BRAF V600E (SEQ ID NO:4), где, по меньшей мере, одна аминокислотная замена обеспечивает резистентность к одному или нескольким ингибиторам BRAF мутантного полипептида BRAF. В определенных вариантах осуществления данного аспекта, по меньшей мере, одна аминокислотная замена расположена в одной или нескольких следующих аминокислотных позициях: A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, K483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 и C748. В иллюстративных вариантах осуществления, по меньшей мере, одна аминокислотная замена представляет собой одну или несколько из следующих: A29V, H72N, S113I, S124F, P162H, C194*, L227F, P231T, C251F, V291F, Q329K, K483E, L485F, T521K, V528F, D587E, P655T, S657*, S683R, P686Q, P686T, C696*, L697I, P722T, F738L и C748F.

В одном из вариантов осуществления приведенного выше аспекта мутантный полипептид BRAF содержит от одной до пяти аминокислотных замен по сравнению с полипептидом BRAF дикого типа или полипептидом BRAF V600E. В иллюстративных вариантах осуществления мутантный полипептид BRAF содержит одну аминокислотную замену. В другом варианте осуществления мутантный полипептид BRAF представляет собой BRAF, содержащий замену в одной или нескольких следующих аминокислотных позициях SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4: V528, T521, и/или P686. В некоторых вариантах осуществления приведенного выше аспекта ингибитор BRAF представляет собой RAF-265.

Изолированные молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие мутантные полипептиды RAF, можно встраивать в экспрессирующий вектор и экспрессировать в клетке-хозяине. Таким образом, в другом аспекте изобретение раскрывает экспрессирующий вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, предоставленную в настоящем документе. В другом аспекте изобретение раскрывает клетку-хозяин, содержащую предоставленный экспрессирующий вектор. В другом аспекте изобретение раскрывает способ получения мутантного полипептида BRAF, содержащий культивирование клетки-хозяина, содержащей экспрессирующий вектор, кодирующий мутантный полипептид BRAF, где, таким образом, клетка производит мутантный полипептид BRAF.

В других вариантах осуществления изобретение раскрывает изолированные мутантные полипептиды BRAF, где мутантные полипептиды BRAF содержат аминокислотную последовательность, содержащую, по меньшей мере, одну аминокислотную замену по сравнению с полипептидом BRAF дикого типа (SEQ ID NO: 2) или полипептидом BRAF V600E (SEQ ID NO: 4), где, по меньшей мере, одна аминокислотная замена обеспечивает резистентность к одному или нескольким ингибиторам BRAF мутантного полипептида BRAF. В предпочтительных вариантах осуществления изолированные мутантные полипептиды BRAF проявляют активность полипептида BRAF дикого типа. В одном из вариантов осуществления приведенного выше аспекта, по меньшей мере, одна аминокислотная замена находится в одной или нескольких аминокислотных позициях, выбранных из следующих: A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, K483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 и C748. В иллюстративных вариантах осуществления, по меньшей мере, одна аминокислотная замена выбрана из следующих: A29V, H72N, S113I, S124F, P162H, С194*, L227F, Р231Т, C251F, V291F, Q329K, K483E, L485F, Т521К, V528F, D587E, P655T, S657*, S683R, P686Q, P686T, С696*, L697I, P722T, F738L и C748F. В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид BRAF содержит от одной до пяти аминокислотных замен по сравнению с полипептидом BRAF дикого типа или полипептидом BRAF V600E. В иллюстративных вариантах осуществления мутантный полипептид BRAF содержит одну аминокислотную замену по сравнению с полипептидом BRAF дикого типа. В других иллюстративных вариантах осуществления приведенного выше аспекта ингибитор BRAF представляет собой RAF-265.

В другом аспекте изобретение раскрывает способ обнаружения соединения, эффективного для лечения злокачественной опухоли, который включает предоставление анализируемой композиции, содержащей мутантный полипептид BRAF и субстрат BRAF, контактирование анализируемой композиции с тестируемым соединением в условиях, обеспечивающих фосфорилирование субстрата BRAF в отсутствие тестируемого соединения, и определение воздействия соединения на фосфорилирование субстрата BRAF, где снижение уровня фосфорилирования субстрата BRAF по сравнению с подходящим контролем указывает на то, что соединение представляет собой соединение, эффективное для лечения злокачественной опухоли. В некоторых вариантах осуществления анализируемая композиция представляет собой клеточный экстракт.

В другом аспекте изобретение раскрывает способ обнаружения соединения, представляющего собой ингибитор BRAF второго поколения, который включает предоставление анализируемой композиции, содержащей мутантный полипептид BRAF и субстрат BRAF, контактирование анализируемой композиции с тестируемым соединением в условиях, обеспечивающих фосфорилирование субстрата BRAF в отсутствие тестируемого соединения, и определение воздействия соединения на фосфорилирование субстрата BRAF, где снижение уровня фосфорилирования субстрата BRAF по сравнению с подходящим контролем указывает на то, что соединение представляет собой ингибитор BRAF второго поколения. В некоторых вариантах осуществления анализируемая композиция представляет собой клеточный экстракт.

В другом аспекте изобретение раскрывает способ обнаружения соединения, эффективного для лечения злокачественной опухоли, который включает предоставление клетки, содержащей мутантный полипептид BRAF, контактирование клетки с тестируемым соединением и определение воздействия соединения на фосфорилирование субстрата BRAF, где снижение уровня фосфорилирования субстрата BRAF по сравнению с подходящим контролем указывает на то, что соединение представляет собой соединение, эффективное для лечения злокачественной опухоли.

В другом аспекте изобретение раскрывает способ обнаружения соединения, которое представляет собой ингибитор BRAF второго поколения, включающий предоставление клетки, содержащей мутантный полипептид BRAF, контактирование клетки с тестируемым соединением и определение воздействия соединения на фосфорилирование субстрата BRAF, где снижение уровня фосфорилирования субстрата BRAF по сравнению с подходящим контролем указывает на то, что соединение представляет собой ингибитор BRAF второго поколения.

В одном из вариантов осуществления приведенных выше аспектов субстрат BRAF представляет собой MEK1 или MEK2. В иллюстративном варианте осуществления фосфорилирование MEK1 или MEK2 определяют с применением фосфоспецифических антител MEK. В другом иллюстративном варианте осуществления фосфорилирование MEK1 или MEK2 определяют посредством измерения фосфорилирования основного миелинового белка (MBP). В другом иллюстративном варианте осуществления фосфорилирование MEK1 или MEK2 определяют посредством измерения фосфорилирования ERK1 или ERK2.

В другом аспекте изобретение раскрывает способ определения соединения, эффективного для лечения злокачественной опухоли, который включает предоставление клетки, содержащей мутантный полипептид BRAF, контактирование клетки с тестируемым соединением и определение воздействия соединения на клеточную пролиферацию, где уменьшение клеточной пролиферации по сравнению с подходящим контролем указывает на то, что соединение эффективно для лечения злокачественной опухоли.

В другом аспекте изобретение раскрывает способ определения соединения, которое представляет собой ингибитор BRAF второго поколения, включающий предоставление клетки, содержащей мутантный полипептид BRAF, контактирование клетки с тестируемым соединением и определение воздействия соединения на клеточную пролиферацию, где уменьшение клеточной пролиферации по сравнению с подходящим контролем указывает на то, что соединение представляет собой ингибитор BRAF второго поколения.

В другом аспекте изобретение раскрывает клеточное тестирование для определения тестируемого соединения в качестве ингибитора BRAF второго поколения, где способ включает контактирование клетки-хозяина, содержащей мутантный полипептид BRAF, с тестируемым соединением, где чувствительность клетки-хозяина к тестируемому соединению по сравнению с подходящим контролем указывает на то, является ли соединение ингибитором BRAF второго поколения. В одном из вариантов осуществления чувствительность клетки-хозяина к тестируемому соединению измеряют с применением анализа, выбранного из группы, состоящей из анализа клеточной пролиферации, анализа жизнеспособности клеток и анализа фосфорилирования MEK, где уменьшение клеточной пролиферации, жизнеспособности клеток или фосфорилирования MEK в присутствии тестируемого соединения указывает на то, что соединение представляет собой ингибитор BRAF второго поколения.

В другом аспекте изобретение относится к способу определения ингибитора BRAF второго поколения, который включает выбор предполагаемого лекарственного средства с применением компьютерного моделирования с трехмерной кристаллической или растворенной формой мутантного полипептида BRAF, где указанный мутантный полипептид BRAF содержит аминокислотную последовательность, содержащую, по меньшей мере, одну аминокислотную замену по сравнению с полипептидом BRAF дикого типа или полипептидом BRAF V600E, где, по меньшей мере, одна аминокислотная замена обеспечивает резистентность к одному или нескольким ингибиторам BRAF мутантного полипептида BRAF; контактирование указанного предполагаемого лекарственного средства с мутантным полипептидом BRAF; и определение контактирования указанного предполагаемого лекарственного средства с мутантным полипептидом BRAF; где соединение, способное к контактированию с мутантным полипептидом BRAF, определяют как ингибитор BRAF второго поколения. В одном из вариантов осуществления тестируемое соединение входит в библиотеку соединений.

В другом аспекте изобретение раскрывает изолированное соединение, которое представляет собой ингибитор BRAF второго поколения, или соединение, эффективное для лечения злокачественной опухоли, где соединение определяют как ингибитор BRAF второго поколения или соединение, эффективное для лечения злокачественной опухоли согласно способам, описываемым в настоящем документе.

В другом аспекте изобретение раскрывает способ ингибирования активности мутантного полипептида BRAF, который включает контактирование мутантного полипептида BRAF с соединением, которое представляет собой ингибитор BRAF второго поколения. В предпочтительных вариантах осуществления представленного выше аспекта соединение далее ингибирует активность полипептида BRAF дикого типа и/или полипептида BRAF V600E. В некоторых вариантах осуществления контактирование мутантного полипептида BRAF с ингибитором BRAF второго поколения происходит in vitro. В других вариантах осуществления контактирование происходит in vivo. В иллюстративных вариантах осуществления контактирование происходит у субъекта, например, у субъекта со злокачественной опухолью. В некоторых вариантах осуществления субъект представляет собой субъект с рецидивом после лечения RAF-265. В иллюстративных вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой меланому.

В другом аспекте изобретение раскрывает способ лечения злокачественной опухоли у субъекта, включающий введение субъекту соединения, которое представляет собой ингибитор BRAF второго поколения. В иллюстративных вариантах осуществления злокачественная опухоль содержит одну или несколько мутаций BRAF, где одна или несколько мутаций обеспечивают резистентность к RAF-265 полипептида BRAF. В предпочтительных вариантах осуществления приведенного выше аспекта соединение далее ингибирует активность полипептида BRAF дикого типа и/или полипептида BRAF V600E. В некоторых вариантах осуществления субъект представляет собой субъект с рецидивом после лечения RAF-265. В иллюстративных вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой меланому.

В другом аспекте изобретение раскрывает способ проверки субъекта со злокачественной опухолью на наличие мутаций BRAF, обеспечивающих резистентность к лечению ингибитором RAF, который включает получение субъекта образца, содержащего злокачественную клетку, и выявление в образце молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид BRAF, содержащий одну или несколько мутаций по сравнению с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид BRAF дикого типа (SEQ ID NO: 1) или полипептид BRAF V600E (SEQ ID NO: 3), где мутации наблюдаются в позициях, кодирующих одну или несколько аминокислот полипептида BRAF и выбранных из группы, состоящей из A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, K483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 и C748, где присутствие молекулы нуклеиновой кислоты в образце, содержащем злокачественную клетку, указывает на то, что субъект является резистентным к лечению ингибитором RAF. В иллюстративных вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты кодирует полипептид BRAF, содержащий одну или несколько аминокислотных замен по сравнению с полипептидом BRAF дикого типа (SEQ ID NO: 2) или полипептидом BRAF V600E (SEQ ID NO: 4), выбранных из группы, состоящей из A29V, H72N, S113I, S124F, P162H, C194*, L227F, P231T, C251F, V291F, Q329K, K483E, L485F, T521K, V528F, D587E, P655T, S657*, S683R, P686Q, P686T, C696*, L697I, P722T, F738L и C748F. В некоторых вариантах осуществления присутствие молекулы нуклеиновой кислоты в образце, содержащем злокачественную клетку, указывает на то, что субъект характеризуется относительно высоким риском рецидива при лечении ингибитором BRAF первого поколения. В других вариантах осуществления присутствие молекулы нуклеиновой кислоты в образце, содержащем злокачественную клетку, указывает на то, что субъект не отвечает на лечение ингибитором BRAF первого поколения. В иллюстративных вариантах осуществления ингибитор BRAF первого поколения представляет собой RAF-265. В некоторых вариантах осуществления присутствие молекулы нуклеиновой кислоты в образце, содержащем злокачественную клетку, указывает на то, что субъекту необходимо лечение ингибитором BRAF второго поколения. В иллюстративных вариантах осуществления присутствие молекулы нуклеиновой кислоты в образце, содержащем злокачественную клетку, определяют способом, который включает определение последовательности молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид BRAF. В других вариантах осуществления присутствие молекулы нуклеиновой кислоты в образце, содержащем злокачественную клетку, определяют посредством выявления полипептида, кодируемого молекулой нуклеиновой кислоты, с применением антитела, которое специфически распознает полипептид BRAF, содержащий мутацию в позиции, выбранной из группы, состоящей из A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, K483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 и C748. В иллюстративном варианте осуществления способы, описанные в представленных выше аспектах, дополнительно содержат введение ингибитора BRAF второго поколения субъекту, у которого обнаружили присутствие одной или нескольких мутаций BRAF.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг. 1 показана нуклеотидная последовательность BRAF дикого типа человека (SEQ ID NO: 1) (NCBI Reference Sequence No.: NM_004333,4; gi 187608632).

На фиг. 2 показана последовательность полипептида BRAF дикого типа человека (SEQ ID NO: 2) (NCBI Reference Sequence No.: NP_004324.2; gi 33188459).

На фиг. 3 показана нуклеотидная последовательность BRAF V600E человека (SEQ ID NO: 3). Замена тимидина на аденозин, которая обуславливает аминокислотную замену V600E по сравнению с последовательностью BRAF дикого типа, подчеркнута.

На фиг. 4 показана последовательность полипептида BRAF V600E человека (SEQ ID NO: 4). Замена V600E по сравнению с последовательностью BRAF дикого типа подчеркнута.

На фиг. 5 показана мутационная картина BRAF после отбора RAF265. Показаны аминокислотные замены, возникшие вследствие мутаций высокой частоты.

На фиг. 6 показана мутационная картина BRAF после отбора PLX4720. Показаны аминокислотные замены, возникшие вследствие мутаций высокой частоты.

На фиг. 7 показано структурное положение трех аминокислотных замен, характерных для RAF265 и PLX4720.

На фиг. 8 показаны результаты иммуноблоттинга уровней BRAF, p-MEK1/2 и p-ERK1/2 после лечения увеличивающимися концентрациями PLX4720 для клеток, содержащих BRAF дикого типа, BRAF-V600E, BRAF-V600E-T521K, BRAF-V600E-V528F или BRAF-V600E-P686Q.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

I. Биологическая активность BRAF

Семейство белков RAF включает три члена: BRAF, ARAF и CRAF (также известный как RAF-1). Каждый из белков RAF содержит аминоконцевой регуляторный домен, активационную петлю и C-концевой киназный домен. Регуляция RAF включает фосфорилирование регуляторного и каталитического доменов. После активации молекулы RAF функционируют как серин/треонин киназы, способные активировать сигнальные молекулы посредством фосфорилирования.

RAF вовлечен в активацию клеточной пролиферации посредством контактирования с сигнальным путем митогенактивируемой протеинкиназы (MAPK). В частности, белки RAF представляют собой основные эффекторы сигнального пути Ras. Активированный Ras напрямую взаимодействует с RAF и переносит RAF к клеточной мембране из цитоплазмы. После переноса к клеточной мембране связанный с Ras RAF подвергает серии последовательных фосфорилирований и изменений конформации, нужной для активации серин/треонин киназной активности RAF. RAF может также активироваться посредством Ras-зависимых путей, включающих интерферон бета, протеинкиназу C (PKC) альфа, антиапоптические белки, такие как Bcl-2, различные поддерживающие белки, ультрафиолетовое излучение, ионизирующее излучение, ретиноиды, эритропоэтин и димеризацию изоформ RAF.

После активации RAF модулирует участки нижележащего сигнального пути посредством фосфорилирования киназ MEK1 и MEK2, которые содержат богатую пролином последовательность, которая обеспечивает узнавание RAF. BRAF представляет собой гораздо более сильный активатор MEK1 и MEK2, чем ARAF или RAF-1. MEK1 и MEK2, в свою очередь, фосфорилируют и активируют ERK1 и ERK2, которые затем перемещаются в ядро. Ядерные ERK1 и ERK2 активируют факторы транскрипции, такие как Elk-1, Fos, Jun, AP-1 и Myc, в итоге индуцируя транскрипцию генов, вовлеченных в клеточную пролиферацию, дедифференциацию и выживание, включая, например, циклин D1, циклин E и активатор фосфатазу cdc25.

Положительная регуляция сигнального пути RAF, возникающая вследствие присутствия активирующих мутаций в RAF или аберрантного сигнального пути Ras, стимулирует онкогенез посредством активирования упомянутого выше сигнального пути, что приводит к повышенной клеточной пролиферации и выживанию. Активирующие мутации в полипептидах RAF, особенно в BRAF, связывают с высокой частотой возникновения рака у человека. Одна их таких мутаций BRAF представляет собой единичную замену тимидина на аденозин, которая обуславливает замену валина в аминокислотной позиции 600 на глутамат. Приблизительно две трети случаев меланомы связаны с этой онкогенной мутацией BRAF V600E, которая способствует изменению меланоцитов посредством активации сигнального пути MAPK. Многие другие виды злокачественной опухоли, включая в качестве неограничивающих примеров рак прямой кишки, яичника и рак щитовидной железы, также связаны с мутацией BRAF V600E. Таким образом, выбор RAF и, в частности, BRAF V600E, в качестве мишени для воздействия, представляет собой перспективный подход в лечении злокачественной опухоли. BRAF представляет собой хорошую мишень для лечения вследствие высокой степени специфичности, показанной для его субстратов MEK1 и MEK2. Несколько ингибиторов BRAF в настоящее время проходят клинические испытания. Один такой ингибитор представляет собой соединение RAF-265, который является эффективным против всех трех изоформ RAF, а также против BRAF V600E. Показано, что RAF-265 является перспективным для клинического применения, что указывает на то, что выбор RAF в качестве цели воздействия представляет собой многообещающий способ лечения злокачественной опухоли.

Как взаимозаменяемо используют в настоящем документе, термины "активность RAF", "биологическая активность RAF" и "функциональная активность RAF" включают активность, которую проявляет белок RAF, например, BRAF, по отношению к отвечающей на воздействие RAF клетке или ткани, например, злокачественной клетке или злокачественной опухоли, или по отношению к молекуле-мишени RAF, что определяют in vivo или in vitro с применением стандартных способов. Активность RAF может представлять собой прямую активность, такую как контактирование с молекулой-мишенью RAF, например, MEK1 или MEK2, или фосфорилирование субстрата RAF, например, MEK1 или MEK2. Альтернативно, активность RAF может представлять собой непрямую активность, такую как модулирование нижележащего участка сигнального пути посредством контактирования белка RAF с молекулой-мишенью RAF, например, MEK1 или MEK2. Поскольку RAF вовлечен в сигнальный путь, включающий MEK1 и MEK2, такие нижележащие участки сигнального пути включают в качестве неограничивающих примеров, например, фосфорилирование MBP, фосфорилирование ERK1 или ERK2, изменения регуляции генов-мишеней ERK1 или ERK2 и изменения клеточной пролиферации или жизнеспособности.

II. Мутации BRAF, обеспечивающие резистентность

Хотя лечение злокачественной опухоли ингибиторами RAF, например, ингибиторами BRAF, представляет собой перспективный терапевтический подход, пациенты, получающие такое лечение, могут демонстрировать рецидивы или не отвечать на лечение, вследствие чего заболевание пациента прогрессирует. Как описано в настоящем документе, настоящее изобретение относится к раскрытию мутаций BRAF, обеспечивающих резистентность к ингибиторам RAF, которые в настоящее время проходят клинические исследования. При наличии таких мутаций в злокачественных клетках пациенты становятся резистентными к лечению определенными ингибиторами RAF. В иллюстративных вариантах осуществления изобретение относится к развитию резистентности к ингибитору RAF RAF-265.

(A) Определение мутаций BRAF, обеспечивающих резистентность к ингибиторам RAF

В различных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам определения мутаций в полипептиде BRAF или мутаций в молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид BRAF, которые обеспечивают резистентность полипептида BRAF к лекарственным средствам, ингибирующим активность RAF. "Мутантный полипептид BRAF," как применяют в настоящем документе, включает полипептид BRAF, содержащий одну или несколько мутаций, обеспечивающих резистентность к одному или нескольким известным ингибиторам BRAF. В дополнение к одной или нескольким мутациям, обеспечивающим резистентность к ингибитору BRAF, мутантный полипептид BRAF может содержать замены V600E. Полипептид BRAF, содержащий только замену V600E в отсутствие других мутаций по сравнению с последовательностью полипептида BRAF дикого типа, не рассматривают как "мутантный полипептид BRAF", как определено в настоящем документе. "Мутантная молекула нуклеиновой кислоты BRAF", как применяют в настоящем документе, включает молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует мутантный полипептид BRAF. Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие полипептиды BRAF и содержащие одну или несколько мутаций, можно получать с применением любого подходящего известного в данной области способа, включая, например, случайный мутагенез или сайт-специфический мутагенез последовательности нуклеиновой кислоты BRAF дикого типа или последовательности нуклеиновой кислоты BRAF V600E, что можно осуществлять с применением E. coli. В иллюстративных вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты BRAF дикого типа представляет последовательность нуклеиновой кислоты BRAF человека (SEQ ID NO: 1), и последовательность нуклеиновой кислоты BRAF V600E представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты BRAF V600E человека (SEQ ID NO:3). Мутантные молекулы нуклеиновой кислоты BRAF можно затем обнаруживать в клетках, в отсутствие таких молекул отвечающих на лечение ингибитором BRAF, для определения нуклеиновой кислоты, кодирующей мутантный полипептид BRAF, резистентный к воздействию ингибитора RAF.

Для изучения мутантных нуклеиновых кислот BRAF и мутантных полипептидов BRAF на предмет резистентности к воздействию ингибитором RAF, например, RAF-265, можно применять ряд подходящих способов. Во всех случаях мутантный полипептид BRAF, резистентный к воздействию ингибитором RAF, проявляет более высокую активность BRAF в присутствии ингибитора RAF, чем полипептид BRAF дикого типа или полипептид BRAF V600E в присутствии ингибитора RAF. В одном иллюстративном способе молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую мутантный полипептид BRAF, можно экспрессировать в клетках, в отсутствие таких молекул отвечающую на воздействие ингибитора RAF. Клеточная линия, применяемая для таких целей, представляет собой, например, клеточную линии меланомы A375. После экспрессии мутантного полипептида BRAF клетки можно обрабатывать ингибитором RAF. Затем можно измерять активность мутантного полипептида BRAF и сравнивать ее с активностью полипептида BRAF дикого типа (или полипептида BRAF V600E), таким же способом экспрессированных и обработанных ингибитором RAF.

Активность полипептида BRAF можно определять, например, посредством измерения пролиферации или жизнеспособности клеток после обработки ингибитором BRAF, где пролиферация или жизнеспособность положительно коррелируют с активностью BRAF. Рост клеток, пролиферацию или жизнеспособность можно оценивать с применением любого подходящего известного в данной области способа. В одном из вариантов осуществления рост клеток можно определять с применением анализов клеточной пролиферации/жизнеспособности, таких как MTS или Cell Titer GLo, в которых рост клеток в присутствии ингибитора RAF выражают в виде процента от того значения, которое наблюдается у необработанных клеток, культивированных в отсутствие ингибитора RAF. В определенных вариантах осуществления резистентность определяют как изменение значения GI50, по меньшей мере, в 2 раза, более предпочтительно - по меньшей мере, в 3 раза, наиболее предпочтительно - по меньшей мере, в 4-5 раз, в отношении подходящего контроля. В других вариантах осуществления резистентность определяют как значение GI50, составляющее ~1 мкМ. Активность полипептида BRAF также можно измерять посредством, например, определения относительного количества фосфорилированного MEK1/2 или ERK1/2, присутствующего в клетке после обработки ингибитором BRAF. Активность полипептида BRAF дикого типа или мутантного полипептида BRAF можно также определять посредством анализа фосфорилирования in vitro, в котором активность BRAF определяют посредством измерения соотношения фосфорилированного MEK1/2 или ERK1/2 в анализе после обработки ингибитором BRAF. Как указано выше, MEK1/2 представляет собой субстрат BRAF, в то время как ERK1/2 представляет собой субстрат MEK1/2, и служит индикатором активности BRAF нижележащего участка сигнального пути. Мутантный полипептид BRAF, проявляющий более высокую активность, чем полипептид BRAF дикого типа или полипептид BRAF V600E после обработки ингибитором RAF, определяют как содержащий мутацию, обеспечивающую резистентность к ингибитору RAF. Мутацию, обеспечивающую резистентность к ингибитору RAF, можно обнаруживать посредством секвенирования нуклеиновой кислоты, кодирующей мутантный полипептид BRAF, или непосредственного секвенирования мутантного полипептида BRAF.

(B) Мутации BRAF, обеспечивающие резистентность к RAF-265

Посредством приведенного выше способа идентифицировали несколько аминокислотных остатков полипептида BRAF человека, которые при мутировании обеспечивают резистентность к ингибитору RAF RAF-265. Эти аминокислотные остатки включают один или несколько из следующих: A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, K483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 и C748. В определенных вариантах осуществления мутантные полипептиды BRAF содержат мутацию по сравнению с последовательностью полипептида BRAF человека дикого типа (или последовательностью полипептида BRAF V600E) в одном или нескольких из этих аминокислотных остатков. В связанных вариантах осуществления мутантные молекулы нуклеиновой кислоты BRAF содержат мутацию по сравнению с последовательностью нуклеиновой кислоты BRAF человека дикого типа (или последовательностью полипептида BRAF V600E) в одном или нескольких нуклеотидах, кодирующих один или несколько из этих аминокислотных остатков. В иллюстративных вариантах осуществления мутантные полипептиды BRAF, описанные в настоящем

документе, содержат одну или несколько из следующих обеспечивающих резистентность мутаций: A29V, H72N, S113I, S124F, P162H, C194*, L227F, P231T, C251F, V291F, Q329K, K483E, L485F, T521K, V528F, D587E, P655T, S657*, S683R, P686Q, P686T, C696*, L697I, P722T, F738L и C748F. В других иллюстративных вариантах осуществления мутантные молекулы нуклеиновой кислоты BRAF, описанные в настоящем документе и кодирующие мутантный полипептид BRAF, содержат одну или несколько следующих обеспечивающих резистентность мутаций: A29V, H72N, S113I, S124F, P162H, C194*, L227F, P231T, C251F, V291F, Q329K, K483E, L485F, T521K, V528F, D587E, P655T, S657*, S683R, P686Q, P686T, C696*, L697I, P722T, F738L и C748F.

Мутантные молекулы нуклеиновой кислоты BRAF и мутантные полипептиды BRAF по изобретению могут содержать другие мутации в дополнение к описанным в настоящем документе. Например, мутантный полипептид BRAF по изобретению может содержать мутации других аминокислотных остатков в дополнение к одной или нескольким мутациям аминокислотных остатков A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, K483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 и C748. Во всех случаях мутантные полипептиды BRAF по изобретению обладают активность BRAF, и мутантные молекулы нуклеиновой кислоты BRAF по изобретению кодируют полипептиды, обладающие активностью BRAF. В иллюстративном варианте осуществления мутантная молекула BRAF по изобретению содержит мутацию аминокислотного остатка V600 в дополнение к одной или нескольким мутациям аминокислотных остатков A29, H72, S113,

S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, K483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 и C748. В одном из вариантов осуществления мутация V600 представляет собой активирующую мутацию, например, мутацию V600E. Показано, что ингибитор RAF RAF-265 эффективно ингибирует активность BRAF, содержащего активирующую мутацию V600E. Эта мутация наблюдается в большом количестве опухолей, включая приблизительно две трети меланом. Мутации BRAF, обеспечивающие резистентность, описываемые в настоящем документе, обеспечивают резистентность к ингибиторам RAF, таким как RAF-265, аллеля BRAF-V600E. Таким образом, пациенты с опухолью, содержащей BRAF-V600E, характеризуются риском рецидива при лечении ингибитором BRAF первого поколения, таким как RAF-265, вследствие наличия второй мутации BRAF в любой из следующих позиций: A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, K483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 и C748.

Как описано в настоящем документе, обнаружение мутаций BRAF, обеспечивающих резистентность к ингибиторам BRAF, позволяет разрабатывать и искать "ингибиторы RAF второго поколения", которые эффективно ингибируют белок BRAF, содержащий одну или несколько обеспечивающих резистентность мутаций. Такие ингибиторы RAF второго поколения используют во многих клинических и терапевтических областях применения, например, при лечении злокачественной опухоли. Обнаружение обеспечивающих резистентность мутаций в полипептиде BRAF также позволяет обследовать пациентов со злокачественной опухолью для определения наличия или отсутствия одной или нескольких обеспечивающих резистентность мутаций BRAF в злокачественной опухоли. Определение наличия или отсутствия одной или нескольких обеспечивающих резистентность мутаций BRAF в злокачественной опухоли позволяет изменять стратегию лечения пациента со злокачественной опухолью. Например, обнаружение одной или нескольких обеспечивающих резистентность мутаций BRAF, описываемых в настоящем документе, в образце, содержащем злокачественную клетку, который берут у пациента со злокачественной опухолью, можно использовать для назначения пациенту лечения ингибитором RAF второго поколения. Таким же образом, обнаружение одной или нескольких обеспечивающих резистентность мутаций BRAF, описываемых в настоящем документе, в образце, содержащем злокачественную клетку, который берут у пациента со злокачественной опухолью, можно использовать для назначения пациенту лечения ингибитором MEK. Обнаружение обеспечивающих резистентность мутаций BRAF также позволяет обследовать и обнаруживать пациентов с высоким риском рецидива или отсутствием ответа на лечение определенными ингибиторами RAF.

III. Способы определения ингибиторов BRAF второго поколения

Определение обеспечивающих резистентность мутаций BRAF позволяет разрабатывать и/или определять "ингибиторы RAF второго поколения". Как применяют в настоящем документе, ингибитор RAF второго поколения представляет собой средство, которое эффективно ингибирует активность полипептида RAF, например, полипептида BRAF, содержащих одну или несколько мутаций, описываемых в настоящем документе. Ингибитор RAF второго поколения необязательно может ингибировать активность полипептида RAF дикого типа в дополнение к мутантному полипептиду RAF. В предпочтительном варианте осуществления ингибитор RAF второго поколения ингибирует активность полипептида BRAF V600E (SEQ ID NO: 4), а также полипептида BRAF V600E, дополнительно содержащего одну или несколько обеспечивающих резистентность мутаций, описываемых в настоящем документе. В иллюстративном варианте осуществления ингибитор RAF второго поколения ингибирует активность полипептида BRAF, содержащего мутации одного или нескольких следующих аминокислотных остатков: A29, H72, S113, S124, P162, C194, L227, P231, C251, V291, Q329, K483, L485, T521, V528, D587, P655, S657, S683, P686, C696, L697, P722, F738 и C748.

Таким образом, настоящее изобретение относится к способам определения тестируемого соединения как ингибитор RAF второго поколения. В одном из вариантов осуществления соединение можно определять как ингибитор RAF второго поколения посредством определения относительной активности RAF мутантного полипептида BRAF в присутствие или отсутствие соединения по сравнению с немутантным полипептидом BRAF (например, полипептидом BRAF дикого типа или полипептидом BRAF V600E). В присутствии соединения, ко