Способ получения l-орнитина с использованием бактерий, сверхэкспрессирующих lyse

Способ получения l-орнитина с использованием бактерий, сверхэкспрессирующих lyse

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Предпосылки создания изобретения

Известно, что L-орнитин оказывает стимулирующее действие на функцию печени, и его часто применяют в качестве компонента в лекарственных средствах и продуктах питания для спортсменов.

В настоящее время L-орнитин получают с помощью различных методов. Одним из методов является получение посредством ферментации с использованием микроорганизмов. Другим методом является щелочной гидролиз аргинина, например, с применением гидроксида бария (CN 1594282 А). Еще одним методом является биотрансформация аргинина с помощью иммобилизованных микроорганизмов, обладающих аргиназной активностью (KR 589121 В1). В патентной литературе описан также метод получения L-орнитина из L-цитруллина (JP 42007767 В4).

В литературе описаны микроорганизмы, отличающиеся тем, что они высвобождают L-орнитин в культуральную среду. Примерами таких микроорганизмов могут служить бактерии p.Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus (JP 43010996 B4, JP 57041912 В), Escherichia (US 3668072 A), Providencia (JP 03195494) или Arthrobacter (US 3574061).

Продуцирующие L-орнитин микроорганизмы часто отличаются тем, что они являются ауксотрофами по аминокислотам L-аргинину или L-цитруллину (что описано для Brevibacterium, Bacillus, Corynebacterium в ЕР 392708 В1 и KR 161147 В1 и для Escherichia в US 366072 А). Кроме того, были описаны микроорганизмы, обладающие устойчивостью к 2-тиазол-аланину, сульфагуанидину или 2-фторпирувату (публикация выложенной заявки на японский патент №61-119194). В ЕР 0393708 В1 описаны продуценты L-орнитина, которые отличаются пониженной устойчивостью к орнитолу и микофеноловой кислоте. Указанные свойства могут присутствовать также в сочетании друг с другом.

Уровень высвобождения основных аминокислот, таких как L-лизин, L-аргинин и L-орнитин, посредством пассивной диффузии из клетки является очень низким (Bellmann и др., Microbiology, 147, 2001, сс.1765-1774). Это было подробно описано на примере лизина. Vrlijc с соавторами (Vrlijc и др., Journal of Bacteriology, 177(14), 1995, сс.4021-4027) изучили целый ряд мутантов Corynebacterium glutamicum, характеризующихся дефицитом экспорта. Для одного из мутантов было установлено, что внутриклеточная концентрация L-лизина составляла 174 мМ, в то время как его концентрация во внеклеточной среде составляла только 0,7 мМ.

В работах, опубликованных Vrlijc с соавторами (Molecular Microbiology, 22(5), 1996, сс.815-826 и Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology, 1, 1999, cc. 327-336), и в ЕР 0868527 B1 представлены результаты идентификации и дано описание нового организма-экспортера, являющегося экспортером L-лизина (LysE). Выявленный нуль-мутант по гену LysE не обладал способностью транспортировать L-лизин из клетки. Полипептид, кодируемый геном lysE, состоит из 233 аминокислот или аминокислотных остатков и имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2. Было установлено, что в результате осуществления сверхэкспрессии гена lysE в продуценте лизина происходило увеличение высвобождения L-лизина.

Bellmann с соавторами (Microbiology, 147, 2001, сс.1765-1774) охарактеризовали более подробно экспортера LysE с точки зрения транспорта различных основных аминокислот в С.glutamicum. Авторы продемонстрировали, что транспортер обладает специфической способностью экспортировать аминокислоты L-лизин и L-аргинин из клетки. Кроме того, авторы изучили вопрос о том, может ли LysE экспортировать также и L-орнитин из клетки. Для этой цели, прежде всего, был создан ауксотрофный по L-аргинину штамм С.glutamicum, обозначенный как ATCC13032::argF.

Штамм культивировали в 50 мл (периодический процесс культивирования) минимальной среды, обозначенной как CGXII, которая содержала глюкозу в концентрации 40 г/л. После инкубации в течение 24 ч измерения показали, что концентрация L-орнитина составляла 60 мМ, что соответствовало 7,9 г/л. Внутриклеточная концентрация L-орнитина в клетках указанного штамма, измеренная после периода инкубации, составлявшего примерно 70 мин, составляла примерно 200 мМ. Для решения вопроса о том, обладает ли LysE способностью транспортировать также L-орнитин из клетки, осуществляли трансформацию штамма 13032::argF с помощью реплицирующейся плазмиды pEC71ysE. Это было сделано для того, чтобы придать штамму повышенную LysE-активность и тем самым придать ему способность с большей скоростью транспортировать L-орнитин в среду. Однако принятые меры не привели к увеличению скорости экспорта L-орнитина. Было установлено, что и контрольный штамм (13032::argF) и трансформант (13032::argF, несущий pEC71ysE) характеризовались одинаковой скоростью экспорта (0,6 нмоля·мин^-1 (мг сухой массы)^-1). На основе полученных результатов авторы сделали вывод о том, что L-орнитин не экспортируется экспортером LysE. Кроме того, они пришли к заключению о том, что в Corynebacterium glutamicum должна существовать другая еще неизвестная обеспечивающая экспорт L-орнитина функция (белок-экспортер) (Bellmann и др., 2001, с.1771, фиг.56 и с.1772, строки 21-28).

Был идентифицирован вариант LysE (см. SEQ ID NO:4) в штамме С.glutamicum R, который обличался от аминокислотной последовательности LysE- экспортера из штамма АТСС 13032, представленной в SEQ ID NO:2, удлиненным на три аминокислотных остатка N-концом. Аминокислотные остатки располагались в следующем порядке: метионин, валин, изолейцин (MVI). Этот LysE-полипептид из штамма R описан в ЕР 1266966 В1 в качестве варианта, который отличался от белка дикого типа с точки зрения формирования области петли, более конкретно, он не мог формировать указанную петлю, и вследствие этого обладал способностью более эффективно осуществлять экспорт L-лизина и L-аргинина.

Другой вариант LysE был описан Gunji и Yasueda (Journal of Biotechnology 127, 2006, cc. 1-13). Авторы изучали вопрос производства L-лизина облигатной метилотрофной бактерией, Methylophilus methylotrophus. Они трансформировали М. methylotrophus плазмидой, обозначенной как pSE, которая содержала ген lysE из штамма С.glutamicum АТСС13869, с целью повышения производства лизина М. methylotrophus. Однако авторы обнаружили, что им удалось стабильно интродуцировать в М. methylotrophus только мутантную форму гена lysE (lysE24). Открытая рамка считывания гена lysE была сдвинута в аллеле lysE24 вследствие инсерции остатка тимидина, это обусловливало то, что открытая рамка считывания заканчивалась после 432 пары оснований. Укороченная рамка считывания кодировала белок LysE, который был короче на 92 ак на С-конце по сравнению с белком LysE, присутствующим в штамме С.glutamicum АТСС 13869 дикого типа. Он состоял из 141 аминокислотного остатка. Кроме того, последние 6 С-концевых аминокислот укороченного белка (остатки 135-141) отличались от аминокислот аминокислотной последовательности LysE дикого типа. Штамм М. methylotrophus, несущий на плазмиде (pSE24) модифицированный аллель LysE, тестировали в отношении производства лизина. Для этой цели штамм анализировали в 0,3 л минимальной среды, обозначенной как SEIIc, в режиме периодического культивирования с подпиткой в течение 50 ч. Авторы установили, что трансформант продуцировал наряду с L-лизином (0,55 мМ) и L-аргинином (0,19 мМ) также в небольших количествах L-орнитин (0,07 мМ, что соответствовало концентрации 11,8 мг/л). Авторы пришли к выводу о том, что возможным объяснением обнаруженного образования L-орнитина может являться либо измененная специфичность мутантного транспортера в отношении субстрата, либо измененный внутриклеточный пул L-аргинина в штамме. В ЕР 1266966 В1 (на имя Gunji и Yasueda) описано положительное воздействие LysE24-TpancnopTepa на экскрецию L-лизина и L-аргинина.

Задача изобретения

В основу настоящего изобретения была положена задача разработать новый способ ферментативного получения L-орнитина.

Описание изобретения

Объектом изобретения является способ получения L-орнитина, отличающийся тем, что осуществляют следующие стадии, на которых:

а) осуществляют ферментацию высвобождающей L-орнитин бактерии, выбранной из группы, включающей бактерии p.p.Corynebacterium, Bacillus, Streptomyces, Arthrobacter и сем. Enterobacteriaceae, которая сверхэкспрессирует в среду полинуклеотид, кодирующий полипептид, который обладает активностью экспортера L-орнитина и имеет аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на (≥) 35%, ≥40%, ≥50%, ≥55%, ≥60%, ≥65%, ≥70%, ≥75%, ≥80%, ≥85%, ≥90%, ≥92%, ≥94%, ≥96%, ≥97%, (98%, ≥99% или 100%, предпочтительно на ≥70%, более предпочтительно на>90%, еще более предпочтительно на ≥96%, и наиболее предпочтительно на 100%, аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:2,

б) накапливают L-орнитин в среде, получая в результате ферментативный бульон,

в) при этом для осуществления сверхэкспрессии не применяют плазмиду pEC71ysE, депонированную в DSM23239,

г) и при этом длина кодируемого полипептида составляет при необходимости от ≥146 до ≤286 аминокислот или аминокислотных остатков.

Предпочтительно диапазон длин выбирают из группы, включающей диапазоны, включающие от ≥171 до ≤286, от ≥196 до ≤261, от ≥203 до ≤258, от ≥218 до ≤243, от ≥228 до ≤236 и от ≥228 до ≤233 аминокислот или аминокислотных остатков.

Особенно предпочтительными диапазонами длин являются диапазоны от ≥203 до ≥258, от ≥218 до ≤243, от ≥228 до ≤236 и от ≥228 до ≤233, и наиболее предпочтительными диапазонами длин являются диапазоны от ≥228 до ≤236 и от ≥228 до ≤233.

Когда ниже в настоящем описании упоминается L-орнитин, то следует иметь в виду, что это понятие включает также его соли, такие, например, как моногидрохлорид L-орнитина или сульфат L-орнитина.

В способе, предлагаемом в изобретении, применяют бактерии, выбранные из группы, включающей бактерии p.p.Corynebacterium, Bacillus, Streptomyces, Arthrobacter и бактерии сем. Enter obacteriaceae.

В роде Corynebacterium, предпочтительными являются штаммы, выведенные из следующих видов:

Corynebacterium efficiens, например, типовой штамм DSM44549,

Corynebacterium glutamicum, например, типовой штамм АТСС13032 или штамм R, и

Corynebacterium ammoniagenes, например, штамм АТСС6871,

при этом наиболее предпочтительными являются штаммы, выведенные из Corynebacterium glutamicum.

Некоторые представители вида Corynebacterium glutamicum известны из существующего уровня техники под другими названиями. К ним относятся, например:

штамм АТСС13870, имеющий название Corynebacterium acetoacidophilum,

штамм DSM20137, имеющий название Corynebacterium lilium,

штамм АТСС 17965, имеющий название Corynebacterium melassecola,

штамм АТСС 14067, имеющий название Brevibacterium flavum,

штамм АТСС 13869, имеющий название Brevibacterium lactofermentum, и

штамм АТСС14020, имеющий название Brevibacterium divaricatum.

Для Corynebacterium glutamicum применяют также название «Micrococcus glutamicus». Некоторые представители вида Corynebacterium efficiens известны из существующего уровня техники также под названием Corynebacterium thermoaminogenes, например, штамм FERM BP-1539.

Среди бактерий p.Bacillus предпочтительными являются бактерии вида Bacillus subtilis.

Среди бактерий p.Arthrobacter предпочтительными являются бактерии вида Arthrobacter citreus.

Среди бактерий семейства Enterobacteriacae предпочтительными являются бактерии родов Escherichia, Erwinia, Providencia, Pantoea и Serratia. Наиболее предпочтительными являются бактерии p.Escherichia и p.Serratia. Наиболее предпочтительными являются: в p.Escherichia вид Escherichia coli, в p.Serratia вид Serratia marcescens, и в p.Providencia вид Providencia rettgeri.

Бактерии или штаммы (исходные штаммы), применяемые в способах обеспечения сверхэкспрессии экспортера L-орнитина, предпочтительно уже должны обладать способностью высвобождать L-орнитин в окружающую их питательную среду и накапливать его в ней. Для обозначения этого ниже в настоящем описании используют также выражение «продуцировать». Более конкретно, применяемые в способах обеспечения сверхэкспрессии штаммы должны обладать способностью концентрировать или накапливать L-орнитин в питательной среде до уровня, составляющего ≥0,1 г/л, ≥0,3 г/л, ≥1 г/л, ≥3 г/л, ≥10 г/л. Исходные штаммы предпочтительно представляют собой штаммы, которые были получены путем мутагенеза и селекции, с помощью технологий рекомбинантной ДНК или с помощью комбинации обоих методов.

Является очевидным и не требует дополнительных объяснений, что бактерию, пригодную для применения в способах (подходах), предлагаемых в изобретении, можно получать также, осуществляя сначала сверхэкспрессию полинуклеотида, кодирующего полипептид, который обладает активностью экспортера L-орнитина и аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на (≥) 35% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:2, где длина кодируемых полипептидов при необходимости находится в указанных выше диапазонах длин, в штамме дикого типа, таком, например, как типовой штамм Corynebacterium glutamicum АТСС13032 или штамм АТСС14067, и затем с помощью дополнительных известных из существующего уровня техники генетических методов обеспечивать способность бактерии продуцировать L-орнитин. Осуществление только лишь трансформации штамма дикого типа, такого, например, как штамм АТСС13032, АТСС14067, АТСС13869 или АТСС17965, с помощью указанного полинуклеотида не представляет собой способ, предлагаемый в изобретении.

Примерами штаммов вида Corynebacterium glutamicum, которые обладают способностью высвобождать или продуцировать L-орнитин, являются:

штамм Brevibacterium lactofermentum FERM-BP 2344 и штамм Corynebacterium glutamicum FERM-BP 2345, описанные в US 5188947.

Примером штамма вида Arthrobacter citreus, который обладает способностью высвобождать или продуцировать L-орнитин, является:

штамм Arthrobacter citreus FERM-BP 2342, описанный в US 5188947.

Примером штамма вида Bacillus subtilis, который обладает способностью высвобождать или продуцировать L-орнитин, является:

штамм Bacillus subtilis BOR-32 (FERM-P 3647), описанный в JP 57041912.

Примером штамма вида Providencia rettgeri, который обладает способностью высвобождать или продуцировать L-орнитин, является:

штамм Providencia rettgeri ARGA6 (FERM P-l 1147), описанный в JP 03195494.

Примером штамма вида-Escherichia coli, который обладает способностью высвобождать или продуцировать L-орнитин, является:

штамм Escherichia coli В-9-19 (АТСС 21104), описанный в US 3668072.

Продуцирующие L-орнитин бактерии, как правило, являются ауксотрофами по таким аминокислотам, как L-цитруллин или L-аргинин. В альтернативном варианте можно рассматривать продуцирующие L-орнитин бактерии, которые являются брадитрофными по L-цитруллину или L-аргинину. Определения понятий «ауксотрофный» и «брадитрофный» даны, например, на с.9 в WO 01/09286. Брадитрофов называют в данной области также «просачивающимися» («протекающими») мутантами (т.е. мутантами с неполным выражением мутационного повреждения). Среди брадитрофных бактерий применяют прежде всего таких, в которых активность продуктов генов ArgF (орнитинкарбамоилтрансфераза), ArgG (аргининсукцинатсинтаза) или ArgH (аргининсукцинатлиаза) больше (>) нуля, но равна или меньше (≤) 10%, предпочтительно>нуля и ≤1% от указанной активности в бактерии дикого типа.

Из существующего уровня техники известны полинуклеотиды, которые обозначают как ген lysE и которые кодируют белки или полипептиды, обладающие активностью экспортера L-лизина. Указанные полипептиды сокращенно обозначают также как LysE.

Экспортер представляет собой белок, который локализован в клеточной мембране клетки и который транспортирует метаболит, например, L-лизин или L-орнитин, из цитоплазмы указанной клетки в окружающую среду. Если необходимая для этого энергия присутствует в форме аденозинтрифосфата (АТФ), то указанный процесс называют первичным активным транспортом или экспортом. Если указанная энергия поступает в форме ионного градиента, например, ионов натрия, то данный процесс называют вторичным активным транспортом или экспортом (Jeremy М. Berg, John L. Tymoczko и L. Stryer; Biochemie, 5-е изд, изд-во Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Germany, 2003, cc. 378-384). Instructions for determining L-ornitin export activity can be found in Bellmann et al. (Microbiology 2001; 147:1765-74).

При создании настоящего изобретения было установлено, что экспортеры лизина, являющиеся представителями p.Corynebacterium, предпочтительно Corynebacterium glutamicum, и p.Micrococcus, предпочтительно Micrococcus luteus, обладают помимо активности в отношении экспорта L-лизина также активностью, присущей экспортеру L-орнитина.

Согласно изобретению применяют гены, кодирующие полипептиды, которые обладают активностью в отношении экспорта L-орнитина и имеют аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на (≥) 35%, ≥40%, ≥50%, ≥55%, ≥60%, ≥65%, ≥70%, ≥75%, ≥80%, ≥85%, ≥90%, ≥92%, ≥94%, ≥96%, ≥97%, ≥98%, ≥99% или на 100%, предпочтительно>70%, более предпочтительно ≥90%, еще более предпочтительно ≥96%, и наиболее предпочтительно ≥100%, аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:2, при этом длина кодируемого полипептида при необходимости находится в указанных выше диапазонах длин.

Примерами пригодных экспортеров L-орнитина являются экспортеры лизина или LysE-полипептиды штаммов Corynebacterium glutamicum АТСС 13032 (SEQ ID NO:2), Corynebacterium glutamicum R (SEQ ID NO:4), Corynebacterium glutamicum ATCC14067 (SEQ ID NO:5), Corynebacterium glutamicum ATCC13869 (SEQ ID NO:7), Corynebacterium efficiens YS-314 (SEQ ID NO:9), Corynebacterium diphteriae NCTC 13129 (SEQ ID NO:10), Corynebacterium striatum ATCC6940 (SEQ ID NO: 11), Corynebacterium aurimucosum ATCC700975 (SEQ ID NO:12), Corynebacterium matruchotii ATCC33806 (SEQ ID NO:13), Corynebacterium pseudogenitalium ATCC33035 (SEQ ID NO: 14), Corynebacterium accolens ATCC49725 (SEQ ID NO:15), Corynebacterium glucuronalyticum ATCC 51867 (SEQ ID NO:16), Micrococcus luteus NCTC2665 (SEQ ID NO:17), Corynebacterium tubuculostearicum SK141 (SEQ ID NO:18) и Corynebacterium matruchotii ATCC14266 (SEQ ID NO:19). Полипептиды, последовательности которых представлены в SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO:19, обозначают в данной области также как ArgO-полипептиды.

При создании настоящего изобретения была определена нуклеотидная последовательность генов lysE штаммов Corynebacterium glutamicum АТСС 14067 и Corynebacterium glutamicum АТСС13869 (SEQ ID NO:6 и SEQ ID NO:8). Аминокислотные последовательности LysE-полипептида штаммов Corynebacterium glutamicum АТСС 14067 и Corynebacterium glutamicum АТСС13869 представлены в SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:7. Они идентичны аминокислотной последовательности LysE штамма С.glutamicum АТСС13032, представленной в SEQ ID NO:2.

В таблице 1 приведены регистрационные номера LysE-полипептидов различных представителей p.Corynebacterium и p.Micrococcus luteus, взятые из баз данных Национального центра биотехнологической информации (NCBI, Бетесда, шт.Мэриленд, США). Кроме того, в таблице 1 даны ссылки на аминокислотные последовательности LysE-полипептида, представленные в перечне последовательностей. И, наконец, в таблице 1 указана длина (количество аминокислот) кодируемого LysE-полипептида.

Таблица 1
Бактерия	SEQ ID NO:	Регистрационный номер	Длина полипептида
С.glutamicum	2	YP 225551.1	233
С.efficiens	9	ZP 05749209.1	228
С.diphteriae	10	NP 939452.1	228
С.striatum	11	ZP 03933958.1	222
С.aurimucosum	12	YP 002834652.1	235
С.matruchotii	13	ZP 03711883.1	244
С.pseudogenitalium	14	ZP 03922319.1	230
С.accolens	15	ZP 03931790.1	241
С.glucuronolyticum	16	ZP 03918361.1	261
М. luteus	17	YP 002958101.1	204
С.tubuculostearicum	18	ZP 05365683.1	230
С.matruchotii	19	ZP 04835056.1	244

На фиг.1 представлено множественное сравнение аминокислотных последовательностей LysE-полипептидов бактерий, перечисленных в таблице 1. Выравнивание аминокислотных последовательностей, представленных на фиг.1, осуществляли с помощью программы Clone Manager 9 Professional Edition (фирма Scientific & Educational Software, 600 Pinner Weald Way, Ste 202, Cary, шт.Северная Каролина, 27513, США). В качестве эталонной молекулы при осуществлении выравнивания использовали LysE-полипептид (LysE) штамма АТСС 13032. В качестве матрицы очков (матрицы баллов) была выбрана матрица «Blosum 62» (см. Jeremy М. Berg, John L. Tymoczko и L. Stryer; Biochemie, 5-e изд., изд-во Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Germany, cc. 194-197, 2003) was chosen.

При необходимости можно использовать также программы, известные из существующего уровня техники, такие, например, как программа ClustalX (Thompson J.D., Gibson T.J., Plewniak F., Jeanmougin F. и Higgins D.G., The ClustalX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research, 25, 1997, cc. 4876-4882).

Аминокислотные остатки 4-236 LysE-полипептида штамма Corynebacterium glutamicum R (см. SEQ ID NO:4) соответствуют аминокислотной последовательности LysE штамма С.glutamicum АТСС 13032, представленной в SEQ ID NO:2. Полипептид штамма С.glutamicum R имеет на N-конце дополнительную последовательность, состоящую из трех аминокислотных остатков (метионин-валин-изолейцин). Указанные дополнительные остатки образуются в том случае, когда вместо стартового кодона гена lysE в штамме С.glutamicum АТСС 13032 (см. SEQ ID NO:1) используют стартовый кодон, расположенный на расстоянии 9 пар оснований против хода транскрипции относительно гена lysE.

Аминокислотная последовательность LysE-полипептида штамма С.efficiens YS-314 идентична на 71%, штамма С.diphteriae NCTC 13129 идентична 44%, штамма Corynebacterium striatum АТСС6940 идентична на 44%, штамма Corynebacterium aurimucosum АТСС700975 идентична на 42%, штамма Corynebacterium matruchotii АТСС33806 идентична на 43%, штамма Corynebacterium pseudogenitalium АТСС33035 идентична на 43%, штамма Corynebacterium accolens АТСС49725 идентична на 43%, штамма Corynebacterium glucuronalyticum АТСС 51867 идентична на 36%, штамма Micrococcus luteus NCTC2665 идентична на 40% аминокислотной последовательности LysE штамма С.glutamicum АТСС 13032, представленной в SEQ ID NO:2. Кроме того, аминокислотная последовательность ArgO-полипептида штамма С.tubuculostearicum SK141 идентична на 43% аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:2. Кроме того, аминокислотная последовательность ArgO-полипептида штамма С.matruchotii АТСС14266 идентична на 44% аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2. Проценты идентичности рассчитывали на основе глобального выравнивания последовательностей с помощью программы Clone Manager 9 с использованием задаваемой матрицы Blosum 62 (см. фиг.2).

Гены lysE, т.е. полинуклеотиды, которые кодируют полипептиды, обладающие активностью экспортера L-орнитина, можно выделять из организмов с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием соответствующих праймеров. Соответствующие инструкции можно найти, в частности, в лабораторном руководстве «PCR» под ред. Newton и Graham, изд-во Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Germany, 1994, и в WO 2006/100211 на cc. 14-17.

Наиболее предпочтительно в способе, предлагаемом в изобретении, применяют гены, кодирующие полипептиды, которые обладают активностью в отношении экспорта L-орнитина и имеют аминокислотную последовательность, отличающуюся одним или несколькими характерными особенностями, выбранными из группы особенностей, которыми обладают следующие последовательности:

а) аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:4,

б) аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID NO:2, которая имеет одну или несколько, вплоть до 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 или 1, делецию(й) аминокислот,

в) аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID NO:2, которая имеет одну или несколько, вплоть до 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 или 1, инсерцию(й) аминокислот, и

г) аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 2, которая имеет одну или несколько, вплоть до 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 или 1, предпочтительно вплоть до 5, 4, 3, 2 или 1, замену/замен (замещение/замещений) аминокислот,

д) аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID NO:2, которая имеет одно или несколько, вплоть до 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 или 1, предпочтительно вплоть до 5, 4, 3, 2 или 1, добавление(й) аминокислот на N-конце и/или на С-конце.

Предпочтительно применяют, если это необходимо, консервативные аминокислотные замены. В случае ароматических аминокислот консервативные замены представляют собой замены фенилаланина, триптофана и тирозина друг на друга. В случае гидрофобных аминокислот консервативные замены представляют собой замены лейцина, изолейцина и валина друг на друга. В случае полярных аминокислот консервативные замены представляют собой замены глутамина и аспарагина друг на друга. В случае основных аминокислот консервативные замены представляют собой замены аргинина, лизина и гистидина друг на друга. В случае кислых аминокислот консервативные замены представляют собой замены аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты друг на друга. В случае аминокислот, содержащих гидроксильные группы, консервативные замены представляют собой замены серина и треонина друг на друга.

Кроме того, можно применять полинуклеотиды, которые гибридизуются в строгих условиях с нуклеотидной последовательностью, комплементарной последовательности, которая представлена в SEQ ID NO: 1, предпочтительно с кодирующей областью последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1, и которые кодируют полипептид, обладающий активностью в отношении экспорта L-орнитина, где аминокислотная последовательность кодируемого белка идентична по меньшей мере на ≥70% аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, и длина кодируемого полипептида при необходимости находится в указанных выше диапазонах длин.

Специалист в данной области может найти инструкции касательно гибридизации нуклеиновых кислот и полинуклеотидов соответственно среди прочего в руководстве «The DIG System Users Guide for Filter Hybridization)) фирмы Boehringer Mannheim GmbH (Маннгейм, Германия, 1993) и у Liebl и др., International Journal of Systematic Bacteriology 41, 1991, cc. 255-260. Если гибридизацию осуществляют в строгих условиях, то это означает, что образуются только такие гибриды, в которых зонд, т.е. полинуклеотид, который содержит нуклеотидную последовательность, комплементарную последовательности, представленной в SEQ ID NO:1, предпочтительно кодирующей области последовательности, представленной в SEQ ID NO:1, и последовательность-мишень, т.е. полинуклеотиды, которые обрабатывают или идентифицируют с помощью рассматриваемого зонда, идентичны по меньшей мере на 70%. Известно, что на строгость гибридизации, включая стадии отмывки, можно оказывать воздействие или задавать ее посредством вариации состава буфера, температуры и концентрации соли. Реакцию гибридизации, как правило, осуществляют в условиях относительно низкой строгости по сравнению со стадиями отмывки (руководство Hybaid Hybridisation Guide, фирма Hybaid Limited, Теддингтон, Великобритания, 1996).

Например, для реакции гибридизации можно применять 5х SSC-буфер при температуре примерно 50-68°C. В этом случае зонды могут гибридизоваться также с полинуклеотидами, идентичными менее чем на 70% нуклеотидной последовательности применяемого зонда. Такие гибриды менее стабильны и их удаляют путем отмывки в строгих условиях. Это можно осуществлять, например, снижая концентрацию соли до 2х SSC или lx SSC и затем, при необходимости, до 0,5х SSC (руководство The DIG System User's Guide for Filter Hybridisation), фирма Boehringer Mannheim, Маннгейм, Германия, 1995), и устанавливая температуру на уровне примерно 50-68°C, примерно 52-68°C, примерно 54-68°C, примерно 56-68°C, примерно 58-68°C, примерно 60-68°C, примерно 62-68°C, примерно 64-68°C, примерно 66-68°C. Предпочтительными диапазонами температур являются примерно 64-68°C или примерно 66-68°C. Необязательно можно снижать концентрацию соли до концентрации, соответствующей 0,2х SSC или 0,1х SSC. SSC-буфер необязательно содержит додецилсульфат натрия (ДСН) в концентрации 0,1%. Путем постепенного ступенчатого (примерно на 1-2°C) повышения температуры гибридизации от 50°C до 68°C, можно выделять полинуклеотидные фрагменты, идентичные по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, при необходимости на 100%, последовательности применяемого зонда или последовательности, комплементарной последовательности применяемого зонда, и которая кодирует полипептид, обладающий активностью в отношении экспорта L-орнитина. Дополнительные инструкции касательно гибридизации содержатся в продуктах, поступающих в продажу в форме «наборов» (например, набор DIG Easy Hyb фирмы Roche Diagnostics GmbH, Маннгейм, Германия, каталожный номер 1603558).

Согласно изобретению осуществляют сверхэкспрессию полинуклеотида, который кодирует белок, обладающий активностью в отношении экспорта L-орнитина, в бактерии или исходном или родительском штамме, продуцирующем L-орнитин, где аминокислотная последовательность кодируемого белка идентична на ≥35% аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, и длина кодируемого полипептида при необходимости находится в указанных выше диапазонах.

В целом, сверхэкспрессия означает повышение внутриклеточной концентрации или активности рибонуклеиновой кислоты, белка (полипептида) или фермента по сравнению с исходным штаммом (родительским штаммом) или штаммом дикого типа, если последний применяют в качестве исходного штамма. Исходный штамм (родительский штамм) представляет собой штамм, который подвергали манипуляции, приводящей к сверхэкспрессии.

Понятия «белок» и «полипептид» рассматриваются как взаимозаменяемые.

Для обеспечения сверхэкспрессии предпочтительно применяют методы рекомбинантной сверхэкспрессии. Они включают любые методы, в которых микроорганизм создают с использованием ДНК-молекулы, полученной in vitro. Примерами таких ДНК-молекул являются промоторы, кассеты экспрессии, гены, аллели, кодирующие области и т.д. Их можно переносить в требуемый микроорганизм с помощью методов трансформации, конъюгации, трансдукции или других подобных методов.

Манипуляции, осуществляемые для обеспечения сверхэкспрессии, повышают активность или концентрацию соответствующего полипептида, как правило, по меньшей мере на 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% или 500%, предпочтительно вплоть до 1000%, 2000%, 4000%, 10000% или 20000%, по отношению к уровню активности или концентрации рассматриваемого полипептида в штамме до осуществления манипуляции, приводящей к сверхэкспрессии.

Когда применяют штаммы вида Corynebacterium glutamicum, то при необходимости в качестве пригодного эталона (референс-точки) при оценке сверхэкспрессии используют активность в отношении экспорта L-орнитина в штамме АТСС13032 или АТСС14067, или АТСС13869, или АТСС17965. Когда применяют штаммы на основе штамма АТСС13032 или выведенные из него штаммы, то пригодным эталоном является указанный штамм АТСС 13032. Соответствующим примером является штамм, полученный при создании настоящего изобретения, а именно, ATCC13032_Delta_argFRGH/pVWExl_lysE, созданный на основе штамма АТСС 13032. Когда применяют штаммы на основе штамма АТСС 14067 или выведенные из него штаммы, то пригодным эталоном является указанный штамм АТСС 14067. Когда применяют штаммы на основе штамма АТСС 13869 или выведенные из него штаммы, то пригодным эталоном является указанный штамм АТСС13869. Соответствующим образом выбирают другие пригодные эталоны.

Когда применяют штаммы вида Escherichia coli, предпочтительно штамм Escherichia coli К12, то при необходимости в качестве пригодного эталона при оценке сверхэкспрессии используют активность в отношении экспорта L-орнитина в штамме MG1655.

Для достижения сверхэкспрессии применяют многочисленные методы, известные из существующего уровня техники.

Они включают увеличение количества копий и модификацию нуклеотидных последовательностей, регулирующих или контролирующих экспрессию гена. Транскрипцию гена контролируют среди прочего с помощью промотора и необязательно с помощью белков, которые подавляют (белки-репрессоры) или стимулируют (белки-активаторы) транскрипцию. Трансляцию образовавшейся РНК контролируют среди прочего с помощью сайта связывания рибосом и стартового кодона. Полинуклеотиды или ДНК-молекулы, которые включают промотор и сайт связывания рибосом, и необязательно стартовый кодон, называют также кассетой экспрессии.

Указанные методы включают также применение вариантов полипептидов или ферментов, обладающих повышенной каталитической активностью.

Количество копий можно увеличивать с использованием плазмид, которые реплицируются в цитоплазме бактерии. Для этой цели можно применять целый ряд плазмид, известных из существующего уровня техники, которые пригодны для отличающихся большим разнообразием групп микроорганизмов, указанные плазмиды можно использовать для достижения требуемого увеличения количества копий гена. Плазмиды, которые можно применять для бактерий р. Escherichia, описаны, например, в руководстве по молекулярной биологии Labfax (под ред. Т.А. Brown, изд-во Bios Scientific, Oxford, UK, 1991). Плазмиды, которые можно применять для бактерий p.Corynebacterium, описаны, например, у Tauch и др., Journal of Biotechnology, 104 (1-3), 2003, сс.27-40 или у Stansen и др., Applied and Environmental Microbiology 71, 2005, сс.5920-5928.

Подход, основанный на применении плазмиды pEC71ysE, депонированной под регистрационным номером DSM 23239, с целью увеличения количества копий в штаммах Corynebacterium glutamicum исключено из числа подходов, предназначенных для осуществления настоящего изобретения. Нуклеотидная последовательность плазмиды pEC7lysE была определена и она представлена в SEQ ID NO:29.

Количество копий можно дополнительно увеличивать по меньшей мере на одну (1) копию путем интродукции дополнительных копий в хромосому бактерии. Соответствующие методы, которые можно применять для бактерий р. Corynebacterium, предпочтительно Corynebacterium glutamicum, описаны, например, в международных заявках на патент WO 03/014330, WO 03/040373 и WO 04/069996. В WO 03/014330 описаны методы тандемного удвоения генов в нативном локусе генов. В WO 03/040373 описаны методы встраивания второй или третьей копии гена в другие локусы генов, при этом конкретный локус генов не является существенным для роста или производства конкретной аминокислоты, которой в случае настоящего изобретения является L-орнитин. Примерами локусов генов, пригодных для включения второй или следующей копии гена lysE согласно способу, предлагаемому в изобретении, являются гены odh, sucA, dapA, dapB, ddh, lysA, argR, argF, argG и argH. В WO 04/069996 (см. таблицы 12 и 13) описаны межгенные области и гены С.glutamicum, кодирующие фаги и компоненты фагов, которые пригодны для встраивания дополнительных копий гена lysE.

Примерами методов, которые можно применять для бактерий р. Escherichia, являются встраивание копии гена в сайт att фага (Yu и Court, Gene 223, 1988, сс.77-81), амплификация хромосомального гена с помощью фага Mu, описанная в ЕР 0332448, или методы замены гена с помощью условно реплицирующейся плазмиды, описанные у Hamilton и др., Journal of Bacteriology 174, 1989, сс.4617-4622 или у Link и др., Journal of Bacteriology 179, 1997, сс.6228-6237).

Экспрессию гена можно дополнительно повышать путем применения сильного промотора, функционально связанного с предназначенным для экспрессии геном. Предпочтительно следует применять промотор, более сильный, чем встречающийся в естественных условиях промотор, т.е. промотор, присутствующий в штамме дикого типа или в родительском штамме. Для этой цели можно применять целый ряд методов, известных из существующего уровня техники.

Промоторы и системы экспрессии, которые можно применять для представителей p.Corynebacterium, описаны среди прочего в следующих патентах и заявках на патент: ЕР 0629699 А2, US 2007/0259408 А1 (промотор gap), WO 2006/069711, ЕР 1881076 Al, WO 2008/088158, WO 2009/025470 (промотор butA, промотор рук), US 6861246 (варианты МС20 и МА16 промотора dap А) и ЕР 1918378 А1 (промотор sod), а также обзорах, таких как «Handbook of Corynebacterium glutamicum» (под ред. Lothar Eggeling и Michael Bott, изд-во CRC Press, Boca Raton, US, 2005), или в книге «Corynebacteria, Genomics and Molecular Biology» (под ред. Andreas Burkovski, изд-во Caister Academic Press, Norfolk, UK, 2008). Примеры промоторов, которые обеспечивают контролируемую, т.е. индуцибельную или подавляемую, экспрессию, описаны, например, у Tsuchiya и Morinaga, Bio/Technology 6, 1988, сс.428-430.

Промоторы, которые можно применять для представителей p.Escherichia, известны уже в течение длительного периода времени. К ним относятся, среди прочего, классические промоторы, такие как промотор lac, промотор trp, гибридные промоторы tac и trc, промоторы PL и PR фага λ. Можно применять также промоторы фага Т7, промоторы gear-box, промотор nar или промоторы генов rrsG, rnpB, csrA, csrB, ompA, fusA, pepQ, rplX или rpsG. Контролируемую экспрессию можно обеспечивать, например, с помощью системы cI857-PR или CI857-PL фага λ (Gotting и др., BioTechniques 24, 1988, сс.362-366). Соответствующие обзоры приведены у Makrides, Microbiological Reviews 60(3), 1996, сс.512-538 или в руководстве «Escherichia coli and Salmonella, Cellular and Molecular Biology» (главный редактор F.C.Neidhardt, изд-во ASM Press, Washington, US, 1996).

Такие промоторы или кассеты экспрессии, как правило, помещают на расстоянии от 1 до 1000, предпочтительно от 1 до 500, нуклеотидов против хода транскрипции от первого нуклеотида стартового кодона кодирующей области гена. Расстояние, равное 1, означает, что промотор или кассета экспрессии расположен/расположена непосредственно перед первым основанием стартового кодона кодирующей области.

Для повышения экспрессии гена lysE в С.glutamicum пригодные промоторы, такие, например, как промотор sod С.glutamicum (см. SEQ ID NO:1, представленную в ЕР 1918378 А1) или промотор gap С.glutamicum (см. SEQ ID NO: 3, представленную в US 2007/0259408), предпочтительно встраивают между положениями 930 и 990 SEQ ID NO:1.

Когда применяют кассеты экспрессии, содержащие промотор и сайт связывания рибосом (RBS), такие, например, как экспрессионная конструкция гена sod С.glutamicum (см. SEQ ID NO:2, представленную в ЕР 1918378 А1) или экспрессионная конструкция гена gap С.glutamicum, описанный в US 2007/0259408 и представленный в SEQ ID NO:28 (обозначен в указанном документе как PgapRBS), их встраивают, например, в случае С.glutamicum предпочтительно между положениями 930 и 1001, наиболее предпочтительно между положениями 1000 и 1001 SEQ ID NO:1. Примером пригодного сайта связывания рибосом в такой кассете экспрессии является нуклеотидная последовательность 5'-agaaaggagg-3', охарактеризованная Amador (Microbiology 145, 1999, сс.915-924).

Можно также поме