Получение терминальных алкенов с помощью ферментативного декарбоксилирования 3-гидроксиалканоевых кислот

Получение терминальных алкенов с помощью ферментативного декарбоксилирования 3-гидроксиалканоевых кислот

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Введение

Настоящее изобретение относится к способу получения алкенов с помощью биологического процесса. В частности, изобретение относится к способу получения терминальных алкенов (в частности, пропилена, этилена, 1-бутилена, изобутилена или изоамилена) из молекул типа 3-гидроксиалканоата.

Предпосылки создания изобретения

Большое количество химических соединений в настоящее время получают из нефтехимических продуктов. Алкены (такие, как, например, этилен, пропилен, различные бутены, а также пентены) используются в промышленности по производству пластмасс, например, для получения полипропилена или полиэтилена, а также в других областях химической промышленности и в производстве горючего и топлива.

Этилен, самый простой алкен, лежит в основе промышленной органической химии: он представляет собой органическое соединение, которое наиболее широко производится в мире. Он используется, в частности, для получения полиэтилена, основного пластика. Этилен может также превращаться во множество других промышленно полезных продуктов путем химической реакции (окисления, галогенирования).

Пропилен играет подобную роль: его полимеризация приводит к получению пластического материала, полипропилена. Технические свойства этого продукта в отношении устойчивости, прочности, плотности, твердости, способности к деформации и прозрачности не имеют себе равных. Мировой рынок для полипропилена постоянно растет с момента его открытия в 1954.

Бутилен существует в четырех формах, одна из которых изобутилен, входит в состав с метил-трет-бутилового этера (МТВЕ), противодетонационной присадки для автомобильного топлива. Изобутилен может также использоваться для получения изооктена, который, в свою очередь, может восстанавливаться до изооктана (2,2,4-триметилпентан); при этом очень высокое соотношение возгорания/воспламенения делает его наилучшим топливом для так называемых "газолиновых" моторов.

Амилен, гексен и гептен существуют во множестве форм в соответствии с положением и конфигурацией двойной связи. Эти продукты имеют реальное промышленное применение, но являются менее важными, чем этилен, пропилен или бутены.

Все эти алкены в настоящее время получают путем каталитического крекинга нефтепродуктов (или с помощью модификации процесса Фишера-Тропша в случае гексена из угля или газолина). Его цена, таким образом, естественно индексируется по отношению к цене нефти. Кроме того, каталитический крекинг иногда ассоциируется со значительными техническими сложностями, которые увеличивают сложность процесса и затраты на производство.

Вне зависимости от приведенных выше соображений биопродукция пластмасс ("биопластмассы") представляет собой процветающую отрасль. Такой подъем стимулируется экономическими целями, связанными с ценой на нефтепродукты, и из соображений охраны окружающей среды, обе эти предпосылки являются глобальными (продукты с нейтральным показателем высвобождения углерода) и локальными (контроль и утилизация отходов).

Основное семейство биопластмасс представляет собой таковое на основе полигидроксиалканоатов (РНА). Они представляют собой полимеры, полученные путем конденсации молекул, включающих как кислотную группу, так и спиртовую группу. Конденсация осуществляется путем эстерификации кислоты на спирте следующего мономера. Эфирная связь не является настолько стабильной, как непосредственная связь углерод-углерод, которая присутствует в полимерах традиционным пластмасс, что объясняет тот факт, почему РНА имеют способность к биоразложению в течение от нескольких недель до нескольких месяцев.

Семейство РНА включает, в частности, поли-3-гидроксибутират (РНВ), полимер 3-гидроксибутират, и полигидроксибутират-валерат (PHBV), альтернативный полимер 3-гидроксибутирата и 3-гидроксивалерата.

РНВ обычно получают при использовании некоторых штаммов бактерий, таких, как Alcaligenes eutrophus и Bacillus megaterium. В общем случае были созданы лабораторные бактерии, подобные E.coli, обладающие интегрированными синтетическими путями превращения, приводящими к получению РНВ или РНА. Соединение или его полимер могут при некоторых лабораторных условиях насчитывать вплоть до 80% массы бактерий (Wong MS и др., Biotech. Bioeng., 2008). Попытки получения РНВ в промышленных масштабах были предприняты в 1980-ые годы, однако затраты на получения соединения путем ферментации считались достаточно высокими на то время. Проекты, вовлекающие непосредственное получение этих соединений в генетически модифицированных растениях (которые содержат интегрированные ключевые ферменты синтетического пути РНВ, присутствующие в бактерии-продуценте), сейчас находятся на стадии развития и могут повлечь за собой снижение затрат на производство.

Получение алканов или других биологических молекул, которые могут использоваться в качестве топлива или в качестве предшественников синтетических смол, с помощью биологического предусматривается в контексте сбалансированной промышленной эксплуатации в соответствии с геохимическими циклами. Первое поколение биотоплива заключалось в ферментативном получении этанола, в виде процессов ферментации и дистилляции, которые уже существовали в пищевой промышленности. Получение второго поколения биотоплива находится на фазе испытания и охватывает, в частности, получение длинноцепочечных спиртов (бутанола и пентанола), терпенов, линейных алканов и жирных кислот. Два новых обзора обеспечивают общее рассмотрение исследований в этой области: Ladygina N и др., Process Biochemistry, 2006, 41: 1001; и Wackett LP, Current Opinions in Chemical Biology, 2008, 21: 187.

В химическом семействе алкена изопрен (2-метил-1,3-бутадиен) представляет собой фрагмент терпена, который при полимеризации приводит к получению резины. Также могут разрабатываться другие терпены, с помощью химического, биологического или смешанного пути, в качестве используемых продуктов, таких, как биотопливо, или для производства пластмасс. Современная литература демонстрирует, что мевалонатный путь (ключевое промежуточное соединение в биосинтезе стероидов во многих организмах) может использоваться для того, чтобы эффективно получать продукты из семейства терпена с промышленным выходом (Withers ST и др., Appl. Environ. Microbiol., 2007, 73: 6277).

Получение терминальных алкенов [этилен моно- или ди-замещенный в положении 2: H₂C=C(R¹)(R²)] очевидным образом является менее исследованным. Было обнаружено получение изобутилена из изовалерата с помощью дрожжей Rhodotorula minuta (Fujii Т. и др., Appl. Environ. Microbiol., 1988, 54: 583), однако эффективность такого превращения, составляющего менее 1 миллионную часть в минуту или приблизительно 1 для 1000 в день, является далеким от того, чтобы позволить осуществлять промышленное использование. Механизм реакции был изучен Fukuda H. и др. (BBRC, 1994, 201(2): 516), он вовлекает фермент цитохром Р450, который декарбоксилирует изовалерат путем восстановления группы оксоферрила Fe^V=O. Ни на каком этапе реакция не предполагает гидроксилирования изовалерата. Изовалерат также представляет собой промежуточное соединение в катаболизме лейцина. Биосинтез изобутилена в промышленных масштабах с помощью этого пути представляется в значительной степени нецелесообразным, поскольку он будет требовать синтеза и разложения одной молекулы лейцина с образованием одной молекулы изобутилена. Кроме того, фермент, который катализирует реакцию, использует гем в качестве кофактора, который является слабо пригодным как таковой для рекомибинантной экспрессии в бактериях и для улучшения параметров фермента. По всем этим причинам представляется крайне маловероятным, чтобы этот путь, известный из уровня техники, мог служить в качестве основы для промышленной эксплуатации. Были также описаны другие микроорганизмы, как такие, которые являются более или менее способными к природному получению изобутилена из изовалерата; полученные выходы являются даже более низкими, чем те, которые получены при использовании Rhodotorula minuta (Fukuda Н. и др., Agric. Biol. Chem., 1984, 48: 1679).

Эти исследования также описывают природное получение пропилена: многие микроорганизмы являются способными к продукции пропилена, но опять-таки с чрезвычайно малым выходом.

Продукция этилена является известной давно (Meigh и др., 1960, Nature, 186: 902). В соответствии с выясненным путем метаболизма метионин представляет собой предшественник этилена (Adams и Yang, PNAS, 1979, 76: 170). Превращение 2-оксоглутарата также было описано (Ladygina N. и др., Process Biochemistry 2006, 41: 1001). Поскольку единственная молекула этилена требует предварительного получения четырех или пятиуглеродной цепи, потребности в оборудовании и энергии всех этих путей превращения являются неблагоприятными и не предвещают ничего хорошего для биопродукции алкена.

Перед характеристикой ферментативных этапов, которые в растениях превращают в этилен его истинный метаболический предшественник S-аденозилметионин (SAM) путем образования 1-аминоциклопропан-1-карбоксилата (АСС) (Adams и Yang, PNAS, 1979, 76: 170), было предложено несколько других гипотез в научной литературе для объяснения получения этилена, среди которых было декарбоксилирование акрилата (H₂C=CH-CO₂H), получаемого в результате дегидратации 3-гидроксипропионата. В некоторых статьях, в частности, предполагается возможность метаболического пути, который будет превращать 3-гидроксипропионат в этилен через акрилат, для того, чтобы интерпретировать радиоизотопные исследования продукции этилена, где меченные ¹⁴С субстраты добавляются к препаратам растений: бета-аланин-2-¹⁴С вносят к экстрактам семядолей бобов (Stinson и Spencer, Plant Physiol., 1969, 44: 1217; Thompson и Spencer, Nature, 1966, 210: 5036), a пропионат-2-¹⁴С к гомогенатам мякоти бананов (Shimokawa и Kasai, Agr. Biol. Chem., 1970, 34(11): 1640). Все эти гипотезы вовлечения 3-гидроксипропионата и акрилата в метаболическую продукцию этилена, что не приводило к характеристике ферментативной активности, исчезли из научной литературы, как только была открыта роль метионина, SAM и АСС (Hanson и Kende, Plant Physiology, 1976, 57: 528; Adams и Yang, PNAS, 1979, 76: 170).

Таким образом, по нашему мнению, в настоящее время не существует никакого эффективного способа для получения терминальных, алкенов, таких, как этилен, пропилен, 1-бутилен, изобутилен, 1-амилен или изоамилен, путем микробиологического синтеза. Такой способ позволит устранить применение нефтепродуктов и снизить затраты на получение пластиков и топлива. В завершение, это может потенциально обладать значительным глобальным воздействием на окружающую среду путем создания возможности для углерода накапливаться в твердой форме.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение описывает способ осуществления синтеза соединений алкена с помощью биологического процесса.

Изобретение основывается на модели нового пути синтеза соединений терминального алкена на основе превращения 3-гидроксиалканоатов. Изобретение также основывается на демонстрации того, что указанное превращение может быть осуществлено биологически, при использовании фермента типа декарбоксилазы или его вариантов. Изобретение может использоваться in vitro, в бесклеточных системах, или путем использования микроорганизмов. Изобретение также относится к получению алкенов из источника углерода и, в частности, из углеводов (в частности, глюкозы), полиола (в частности, глицерина), биоразлагаемого полимера (в частности, крахмала, целлюлозы, поли-3-гидроксиалканоата); при этом источник углерода превращается с помощью микроорганизма до метаболического промежуточного соединения, которое принадлежит к семейству 3-гидроксиалканоата, которое потом превращается в терминальный алкен.

В частности, объект настоящего изобретения обеспечивает способ получения терминального алкена, характеризующийся тем, что он включает этап превращения 3-гидроксиалканоата в присутствии фермента, обладающего декарбоксилазной активностью.

Другой объект в соответствии с изобретением основывается на применении соединений 3-гидроксиалканоата в качестве предшественника или субстрата для получения соединений терминального алкена.

В частности, воплощения изобретения:

- 3-гидроксипропионат подвергается превращению до этилена; или

- 3-гидроксибутират подвергается превращению до пропилена; или

- 3-гидроксивалерат подвергается превращению до 1-бутилена; или

- 3-гидрокси-3-метилбутират (или 3-гидроксиизовалерат) подвергается превращению до изобутилена; или

- 3-гидрокси-3-метилвалерат подвергается превращению до изоамилена.

Изобретение дополнительно относится к применению фермента декарбоксилазы, или микроорганизма, продуцирующего декарбоксилазу, для получения соединений терминального алкена из 3-гидроксиалканоатов.

Изобретение также относится к композиции, включающей микроорганизм, продуцирующий декарбоксилазу, приемлемой культуральной среде и соединению 3-гидроксиалканоата, или источнику углерода, который может подвергаться превращению с помощью микроорганизма с образованием соединения 3-гидроксиалканоата.

Другой объект изобретения относится к биокатализатору, включающему фермент декарбоксилазу или микроорганизм, продуцирующий декарбоксилазу, который декарбоксилирует соединение 3-гидроксиалканоата до терминального алкена.

Другой объект изобретения относится к соединению терминального алкена, полученному с помощью способа, такого, как тот, что описан в данном изобретении.

Дополнительный объект изобретения представляет собой изолированный или очищенный фермент, обладающий декарбоксилазной активностью и включающий всю или часть последовательности SEQ ID NO: 6, или фермент, обладающий с ним, по крайней мере, 15% гомологией последовательности.

Другой объект изобретения относится к применению фермента, обладающего декарбоксилазной активностью и включающего всю или часть последовательности SEQ ID NO: 6, или фермента, обладающего с ним, по крайней мере, 15% гомологией последовательности, для получения терминального алкена.

Другой объект изобретения относится к способу получения фермента, обладающего декарбоксилазной активностью и включающего всю или часть последовательности SEQ ID NO: 6, или фермента, обладающего с ним, по крайней мере, 15% гомологией последовательности, при этом способ включает культивирование микроорганизма, включающего рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую указанную последовательность в условиях, позволяющих осуществлять экспрессию указанной последовательности.

Другой объект изобретения относится к микроорганизму, включающему рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую фермент, обладающий декарбоксилазной активностью и включающий всю или часть последовательности SEQ ID NO: 6, или фермент, обладающий с ним, по крайней мере, 15% гомологией последовательности.

Определения

"3-гидроксиалканоат", как используется в данной заявке, означает любую молекулу, включающую 3-гидроксипропионат в качестве общего элемента (Фигура 1), и необязательно одно или два замещения алкила на углероде в положении 3. Указанные алкильные остатки или группы могут быть линейными или разветвленными. Как используется в данной заявке, термины "алкоил" и "алкил" имеют одинаковые значения и являются взаимозаменяемыми. Кроме того, термины "остаток" и "группа" имеют одинаковые значения и являются взаимозаменяемыми. Группы метила, этила, пропила, изопропила, бутила, изобутила представляют собой примеры указанных алкильных групп. Углерод 3 становится хиральным центром, если два алкильных замещения являются различными. Настоящее определение охватывает две хиральные формы, даже если одна из двух форм, например, R форма, представляет собой основную форму, которую получают в природе. Примеры 3-гидроксиалканоатов являются представленными на Фигуре 3. Необязательно, алкильные заместители могут прибавляться на углероде в положении 2, который потом также может становиться хиральным (если два заместителя являются различными). В равной степени конфигурации субстратов 3-гидроксиалканоата в настоящем изобретении охватывают все стереоизомеры. Предпочтительным образом, 3-гидроксиалканоаты соответствуют либо 3-гидроксипропионату, либо вариантам или производным 3-гидроксипропионата, в которых один из двух или два атома водорода, находящиеся на углероде в положении 3, являются замещенными элементом, который состоит только из атомов углерода и водорода, при этом количество атомов углерода указанных заместителей колеблется от 1 до 5, предпочтительно от 1 до 3, заместители могут представлять собой метил, этил, пропил, изопропил, бутил или изобутил. Суффикс "оат", как используется в данной заявке, может попеременно означать либо ион карбоксилата (СОО-), либо карбоновую кислоту (СООН). Он не используется дл обозначения эстера. В частном воплощении 3-гидроксиалканоаты являются представленными следующими формулами: НО-CO-CH₂-C(R¹)(R²)-OH или O^--CO-CH₂-C(R¹)(R²)-OH.

Термин "терминальные алкены" в соответствии с настоящим изобретением означает молекулы, которые состоят только из углерода и водорода (ненасыщенные углеводороды, имеющие формулу C_nH_2n), включающие этилен и органические молекулы, которые получены из этилена путем моно- или дизамещения двух атомов водорода, связанных с углеродами в положении 2, с помощью неразветвленных или разветвленных алкильных групп. Терминальные алкены являются представленными формулами Н₂С=C(R¹)(R²), где R¹ и R² независимо являются выбранными из группы, состоящей из атома водорода и линейной или разветвленной алкильной группы, предпочтительно содержащей от 1 до 4 атомов углерода, более предпочтительно от 1 до 3 атомов углерода. Предпочтительно, по крайней мере, один из двух заместителей на углероде в положении 2 алкена представляет собой линейную или разветвленную алкильную группу. Терминальные алкены включают разветвленные соединения изоалкена, такие, как, например, изобутилен. Предпочтительные примеры соединений терминального алкена в соответствии с изобретением представляют собой, в частности, этилен, пропилен, изобутилен и изоамилен (Фигура 4), или также 1-бутилен и 1-амилен.

"Источник углерода", как используется в данной заявке, означает любое углеродное соединение, которое моет использоваться в качестве субстрата для организмов в соответствии с изобретением. Указанный термин включает глюкозу или любую другую гексозу, ксилозу или любую другую пентозу, полиолы, такие как глицерин, сорбит или маннит, или также полимеры, такие как крахмал, целлюлоза или гемицеллюлоза, или также поли-3-гидроксиалканоаты, подобные поли-3-гидроксибутирату. Такой источник может представлять собой любой субстрат, который позволяет выращивать микроорганизмы, такой как, например, формиат. Он может также представлять собой CO₂ в случае, когда организмы являются способными осуществлять фотосинтез.

"Рекомбинант", как используется в данной заявке, означает искусственную генетическую модификацию организма, которая осуществляется либо путем прибавления, либо удаления, либо модификации хромосомного или экстрахромосомного гена или регуляторного элемента, такого, как промотор, или путем слияния организмов, или путем прибавления вектора любого типа, например, плазмидного. Термин "рекомбинантная экспрессия" означает продукцию белка, вовлекающую генетическую модификацию, предпочтительно для того, чтобы получить белок экзогенного или гетерологичного происхождения в отношении его хозяина, то есть, такой, который не существует в природе в хозяине, осуществляющем продукцию, или для того, чтобы получить модифицированный или мутированный эндогенный белок.

"Сверхэкспрессия" или "сверхэкспрессирующий", как используется в данной заявке, означает рекомбинантную экспрессию белка, который предпочтительно происходит от организма, отличного от того, в котором он подвергается экспрессии, повышенной на, по крайней мере, 10% и предпочтительно на 20%, 50%, 100%, 500% и, возможно, более по сравнению с природной экспрессией указанного белка. Это определение также охватывает случай, когда не происходит природной экспрессии указанного белка.

"Косубстрат" представляет собой продукт, который прибавляется к ферментативной реакционной среде для того, чтобы улучшить определенные ее параметры, и прежде всего ее активность, при этом указанный продукт и принципиальный субстрат потребляются в равных количествах. Таким образом, косубстрат должен прибавляться к реакционной среде при концентрации, сравнимой с таковой принципиального субстрата. В зависимости от фермента присутствие косубстрата может требоваться для осуществления ферментативной реакции.

"Кофактор" представляет собой продукт, который прибавляется к ферментативной реакции, для того, чтобы улучшить определенные ее параметры, и прежде всего, ее активность, при этом указанный продукт не потребляется в процессе реакции и таким образом требует прибавления только при низкой концентрации, пропорциональной количеству фермента, при этом указанная концентрация, таким образом, называется "каталитической".

Термин "часть" аминокислотной последовательности означает фрагмент, включающий, по крайней мере 10, предпочтительно, по крайней мере 10 20, 30, 40 или 50 последовательных аминокислотных остатков указанной последовательности.

"Гомология" означает существование подобности между двумя последовательностями, как измеряется в процентах идентичности между двумя указанными последовательностями.

Химические соединения часто являются известными под несколькими наименованиями, официальным и традиционным. В данной заявке традиционные наименования молекул являются предпочтительными. Таким образом:

- "этилен" используется для обозначения этена

- "пропилен" используется для обозначения пропена

- "бутилен" используется для обозначения бутена

- "изобутилен" используется для обозначения 2-метилпропена или изобутена

- "амилен" используется для обозначения пентена

- "изоамилен" используется для обозначения 2-метил-бут-1-ена или изопентена

- "пропионат" используется для обозначения пропионовой кислоты или пропаноатного иона

- "бутират" используется для обозначения бутановой кислоты или бутаноатного иона

- "валерат" используется для обозначения пентановой кислоты или пентаноатного иона.

Подробное описание изобретения

В частности, изобретение обеспечивает способ получения терминальных алкенов, включающий этап ферментативного декарбоксилирования соединений 3-гидроксиалканоата. Изобретение также относится к применению декарбоксилаз для катализа этой реакции и, в частности, ферментов типа мевалонатдифосфат декарбоксилазы, и субстратов, таких, как 3-гидроксибутират, 3-гидроксивалерат, 3-гидрокси-3-метилбутират (или 3-гидроксиизовалерат) и 3-гидроксипропионат. Изобретение описывает применение кофакторов, включающих этил дифосфат, пропилдифосфат, метилдифосфат, аналогов указанных молекул, и пирофосфата. Изобретение дополнительно описывает применение косубстратов, таких, как АТФ или других соединений, содержащих фосфоангидридную связь.

Изобретение также относится к применению источников углерода, таких, как глюкоза, для непосредственного получения терминальных алкенов из цельных клеток, синтетического пути, осуществляемого с помощью 3-гидроксиалканоатов.

Изобретение дополнительно относится к природным или модифицированным организмам, которые эндогенно продуцируют 3-гидроксиалканоат, и также экспрессирующим декарбоксилазу, превращающую указанные 3-гидроксиалканоаты в терминальные алкены.

Продуцируемые соединения алкена, в частности, пропилен, этилен и изобутилен, представляют собой ключевые молекулы в промышленности по производству пластмасс и топлива, и их промышленное получение при использовании биологического пути, из возобновляемых источников, представляет собой основную инновацию.

Таким образом, изобретение вытекает из модели нового синтетического пути для соединений типа терминального алкена, основы превращения соединений типа 3-гидроксиалканоата. Изобретение демонстрирует, что указанное превращение может осуществляться биологически, при использовании фермента типа декарбоксилазы, что позволяет осуществлять превращение 3-гидроксиалканоата в терминальный алкен. Как проиллюстрировано на Фигуре 2, указанное превращение осуществляется посредством реакции промежуточного соединения, которое обладает структурой 3-фосфогидроксиалканоата.

Этап превращения в соответствии с изобретением может осуществляться in vitro, в присутствии изолированного фермента (или ферментной системы, которая дополнительно включает один или более кофакторов), или в культуре, в присутствии микроорганизма, продуцирующего фермент.

Как описано в данной заявке в Примере 5, при некоторых условиях можно наблюдать соотношение сигнал-шум (измеренное при отсутствии фермента), составляющее приблизительно 100-кратное значение для выхода реакции превращения. Аффинность для 3-гидроксиизовалерата (HIV), как было измерено, составляла приблизительно 40 мМ. Не является очевидным, что может быть получена такая весьма существенная ферментативная активность: несомненно, биохимику, знакомому с теорией и практикой энзимологии, хорошо известно, что фермент активирует сайты, содержащие структурные элементы, которые позволяют осуществлять узнавание, связывание и химическое превращение определенных специфических субстратов. Научная литература изобилует экспериментальными данными, указывающими на то, что изменение размеров или электрического заряда, даже незначительное, может приводить к исключению субстратов. В частности, никакое научное предсказание не позволяет предположить, что MDP декарбоксилаза может в общем случае использовать в качестве субстрата молекулы типа 3-гидроксиалканоата, и, в частности, 3-гидроксиизовалерат, последний отличается от мевалонатдифосфата не только своим размером (MW 118 против 308 для мевалонатдифосфата), но также электрическими зарядами группы дифосфата, которая является присутствующей на природном субстрате, мевалонатдифосфате.

В особом воплощении кофактор прибавляют к реакционной смеси для того, чтобы обеспечить стерическую или электронную комплементацию в каталитическом желобке. Кофактор предпочтительно выбирают из группы, которая состоит из иона пирофосфата, метилдифосфата, этилдифосфата или пропилдифосфата. В общем случае, кофактор представляет собой соединение, которое содержит элемент фосфоангидрида, имеющего общую формулу R-O-PO₂H-O-РО₃Н₂, в которой R представляет собой, в частности, атом водорода, линейную, разветвленную или циклическую группу алкила, предпочтительно содержащую от 1 до 10 или от 1 до 5 атомов углерода, или любую другую моновалентную органическую группу. Аналогичные элементы, соответствующие моноэстерам метилен дифосфоната, представленные общей формулой R-O-PO₂H-СН₂-РО₃Н₂, в которой фосфоангидрид является замещенным метиленовым мостиком, имеют преимущество, которое заключается в том, что они не подвергаются гидролизу, что также представляет собой часть изобретения.

В предпочтительном воплощении превращение осуществляется в присутствии косубстрата, при этом указанный косубстрат предпочтительно представляет собой соединение, содержащее фосфоангидрид, и предпочтительно представляющий собой АТФ, рНТФ, дНТФ или смесь из нескольких таких молекул, полифосфат или пирофосфат. Косубстрат обычно присутствует в хозяине. Однако в другом частном воплощении косубстрат, который может прибавляться к реакционной смеси, предпочтительно является выбранным из группы, состоящей из АТФ, рНТФ, дНТФ, смеси нескольких рНТФ или дНТФ, полифосфата, и предпочтительно пирофосфата, или соединения, содержащего фосфоангидрид (которое является представленным общей формулой Х-РО₃Н₂ на Фигуре 2).

В особом воплощении изобретения используется микроорганизм, который продуцирует декарбоксилазу. В предпочтительном воплощении микроорганизм является рекомбинантным в отношении того, что он продуцирует гетерологичную по отношению к организму хозяина-продуцента декарбоксилазу. Способ может, таким образом, осуществляться непосредственно в культуральной среде без необходимости отделения или очистки ферментной системы. В особенно предпочтительном воплощении используется микроорганизм, обладающий природным или синтетическим свойством эндогенной продукции одного или более 3-гидроксиалканоатов, а также экспрессии или сверхэкспрессии декарбоксилазы, природной или модифицированной, так, что является возможным получение терминальных алкенов непосредственно из источника углерода, присутствующего в растворе.

Используемый в изобретении микроорганизм может быть прокариотическим или эукариотическим и, в частности, представляет собой бактерии, грибы, клетки растений, грибов и плесени, животные клетки. В особом воплощении эти микроорганизмы представляют собой бактерии, в частности, штамм Alcaligenes eutrophus или Bacillus megaterium.

В другом частном воплощении эти микроорганизмы представляют собой рекомбинантные бактерии штамма Escherichia coli, который является модифицированным так, чтобы эндогенно продуцировать один или более 3-гидроксиалканоатов, и превращать их в терминальные алкены.

В другом частном воплощении эти микроорганизмы представляют собой рекомбинантные дрожжи, продуцирующие 3-гидроксиалканоаты, и превращающие их в терминальные алкены.

В другом частном воплощении используют микроорганизм, который продуцирует один или более 3-гидроксиалканоатов, с одной стороны, и декарбоксилазу, необязательно экспрессируемую другим микроорганизмом, с другой стороны. Необязательно, можно культивировать и одновременно использовать два организма в способе в соответствии с изобретением.

В другом частном воплощении цельные растения или животных, необязательно модифицированные с помощью трансгенеза, используются для получения терминальных алкенов из 3-гидроксиалканоатов, при этом таковые обеспечиваются эндогенно или экзогенно.

В другом частном воплощении используют фотосинтетический микроорганизм, обладающий природным или искусственно созданным свойством эндогенно продуцировать один или более 3-гидроксиалканоатов, а также сверхэкспрессировать декарбоксилазу, природную или модифицированную, так, чтобы непосредственно получить терминальные алкены из CO₂, присутствующего в растворе. Предпочтительно, микроорганизм представляет собой фотосинтетическую бактерию или микроскопические водоросли.

Настоящее изобретение дополнительно относится к организмам, описанным в данной заявке выше, и их применению для получения соединений терминального алкена.

Как описывается ниже, способ в соответствии с изобретением может осуществляться в микроаэрофильных условиях.

Кроме того, в предпочтительном воплощении способ осуществляют в присутствии системы для сбора газа терминальных алкенов, которые удаляются из реакционной смеси.

Декарбоксилаза, как используется в данной заявке, означает любой фермент, способный превращать 3-гидроксиалканоат с n атомами углерода до соединения терминального алкена с n-1 атомами углерода. Как иллюстрируется на Фигуре 2, способ в соответствии с изобретением предпочтительно осуществляется через промежуточную реакцию 3-фосфогидроксиалканоата, и используемый фермент предпочтительно обладает активностью декарбоксилазы и активностью фосфорилазы.

В особом воплощении декарбоксилаза представляет собой члена филогенетического надсемейства мевалонатдифосфат (MDP) декарбоксилазы (номенклатура фермента ЕС 4.1.1.33), то есть, природный или синтетический фермент, который кодируется природным или синтетическим геном, и необязательно являющийся способным катализировать реакцию, проиллюстрированную на Фигуре 2.

MDP декарбоксилаза представляет собой фермент, вовлеченный в биосинтез холестерина. Указанный фермент был изолирован из разнообразных организмов, включая животных, грибы, дрожжи и некоторые бактерии. Он может также экспрессироваться некоторыми растениями (Lalitha и др., 1985). Многие гены, кодирующие этот фермент, были клонированы и секвенированы. Эти ферменты в общем случае состоят из 300-400 аминокислот и используют АТФ в качестве косубстрата, который превращается в процессе реакции в АДФ и неорганический фосфат. Группа фосфата переносится с молекулы АТФ на третичный спирт мевалонатдифосфата, что приводит к высвобождению АДФ. Фосфорилированное по группе 3-гидроксила промежуточное соединение, полученное в результате реакции, потом подвергается удалению фосфатной группы при высвобождении в физиологическом отношении изопентилпирофосфата (Фигура 2).

Трехмерные структуры некоторых ферментов из этого семейства были разрешены. На сегодняшний момент было осуществлено относительно немного исследований на ферментах из этого семейства, и эти ферменты исследовались только в контексте только описания пути биосинтеза холестерина. С другой стороны, насколько нам известно, еще не было проведено никаких исследований для того, чтобы отклонить этот фермент от его природной функции и превратить его в промышленный катализатор.

Некоторые примеры MDP декарбоксилазы из различных организмов являются приведенными в последовательностях SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 16.

Таким образом, в предпочтительном воплощении используемый фермент представляет собой декарбоксилазу, предпочтительно включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16, или последовательности, обладающие, по крайней мере, 15% гомологией последовательности с одной из указанных последовательностей и сохраняющие активность декарбоксилазы. Предпочтительные ферменты преимущественно обладают, по крайней мере, 50% гомологией последовательности, предпочтительно, по крайней мере, 80%, более предпочтительно, по крайней мере, 85%, даже более предпочтительно, по крайней мере, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% гомологией с одной из первичных последовательностей SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 и 16. Процент гомологии последовательности может быть определен с помощью различных способов и при использовании компьютерных программ, известных специалисту в данной области техники, таких, как, например способ CLUSTAL или BLAST и производных от них программ, или при использовании алгоритма сравнения последовательностей, такого, как описано Needleman и Wunsch (J. Mol. Biol., 1970, 48: 443) или Smith и Waterman (J. Mol. Biol., 1981, 147: 195).

Предпочтительная декарбоксилаза в соответствии с изобретением является представленной ферментом, обладающим последовательностью SEQ ID NO: 6, а также любым ферментом, обладающим значительной гомологией последовательности. Предпочтительные ферменты преимущественно обладают, по крайней мере, 50% гомологией последовательности, предпочтительно, по крайней мере 80%, более предпочтительно, по крайней мере, 85%, даже более предпочтительно, по крайней мере, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% гомологией последовательности с первичной последовательностью SEQ ID NO: 6. Указанный фермент был клонирован из Picrophilus torridus и получен с помощью рекомбинантных способов в соответствии с данным изобретением. Как иллюстрируется в примерах, этот фермент является особенно эффективным при получении соединений терминального алкена в соответствии с настоящим изобретением. Этот фермент также представляет собой объект настоящего изобретения, как и его получение и применение в качестве катализатора. В частности, объект настоящего изобретения представляет собой применении фермента декарбоксилазы, включающего всю или часть последовательности SEQ ID NO: 6, или фермента, обладающего значительной гомологией последовательности, и предпочтительно, по крайней мере, 15% гомологией с последовательностью SEQ ID NO: 6, для получения соединений терминального алкена. Значительная гомология последовательности означает гомологию последовательности, которая может определяться при использовании упомянутых выше алгоритмов, и предпочтительно гомологию последовательности, большую, чем 15%. Организмы, имеющие близкое филогенетическое родство с Picrophilus torridus, такие, как Ferroplasma acidarmanus, Thermoplasma acidophilum, Thermoplasma volcanium и Picrophilus oshimae, являются способными продуцировать MDP декарбоксилазы,