Применение hsp70 в качестве регулятора ферментативной активности

Применение hsp70 в качестве регулятора ферментативной активности

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Данная заявка является непредварительной заявкой патентной заявки DK РА 200800885, поданной 26 июня 2008 года, которая включена в настоящее описание в полном объеме в качестве ссылки. Все патентные и непатентные ссылки, указанные в предварительной заявке или в настоящей заявке, также включены в настоящее описание в полном объеме в качестве ссылки.

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к области модуляции ферментативной активности посредством использования взаимодействия между молекулярным шапероном Hsp70 и лизосомальным фосфолипидом бис(моноацилглицеро)фосфатом (BMP, также известным под названием LBPA). Взаимодействие Hsp70-BMP модулирует активность ферментов лизосомального компартмента, взаимодействующих с BMP, и, таким образом, настоящее изобретение предоставляет средства реверсирования патологии лизосомных болезней накопления.

Уровень техники

Молекулярные шапероны обнаруживаются во всех компартментах клетки, где имеют место конформационные перегруппировки белков, хотя синтез белков является главным источником несвернутых пептидов в клетке, проблема клетки, которая возникает из-за высокой температуры или других стимулов, которые могут делать белки структурно лабильными и, таким образом, подверженными несвертыванию и агрегации, сталкивается со специфическим клеточным ответом, вовлекающим продукцию защитных белков. Данный ответ представляет собой явление, которое наблюдают во всех типах клеток от прокариот до эукариот и обозначают как ответ на тепловой шок или стресс. Индуцируемые данным ответом белки известны как белки теплового шока (HSP), среди которых существует несколько семейств.

Основным примером семейства шаперонов являются белки Hsp70. Недавно данное семейство связали с другими аспектами клеточного гомеостаза, помимо функционирования в качестве шаперона, наиболее заметно по причине своих антиапоптотических свойств, своих функций в иммунитете и явной зависимости злокачественных клеток от стимуляции Hsp70. Кроме того, Hsp70 может играть роль в сохранении целостности лизосом. Однако молекулярные механизмы остаются неясными.

Лизосомные болезни накопления являются редкой группой заболеваний, характеризуемой накоплением веществ в лизосомальном компартменте и приводящей к его дестабилизации, что оказывает разрушительное действие на пораженных индивидуумов. Вещества накапливаются в лизосомальном компартменте по причине дефицита ферментов, вовлеченных в их катаболизм.

К настоящему времени не существует доступного лечения большинства лизосомных болезней накопления. Основной причиной данной группы заболеваний является неспособность специфических лизосомальных ферментов эффективно катаболизировать специфические лизосомальные вещества, такие как липиды. Таким образом, для подгруппы данных заболеваний, включающей болезнь Гоше и болезнь Фабри, применяют заместительную терапию ферментами (ERT) посредством предоставления пациенту рекомбинантного фермента. Однако ERT является дорогим видом терапии, что может ограничивать ее применение в некоторых регионах, и эффективным только против специфического типа заболевания, для которого получен рекомбинантный фермент. Целью настоящего изобретения является предоставление новых средств для лечения лизосомных болезней накопления.

Сущность изобретения

В настоящем изобретении молекулярную основу участия Hsp70 в стабильности лизосомальной мембраны описывают посредством объяснения молекулярной основы ассоциации между Hsp70 и клеточными мембранами, в частности, цитоплазматической и лизосомальной мембранами.

Из литературы известно, что Hsp70 может играть роль в сохранении целостности лизосом. Однако молекулярный механизм остается неясным. Кроме того, вопрос, является ли данное свойство специфическим для большинства индуцируемых стрессом Hsp70 (HspA1A/A1B обозначены как Hsp70 на всем протяжении данного исследования) или обладают ли другие члены семейства Hsp70 теми же характеристиками, также не рассматривался.

Данные оставшиеся без ответа вопросы подсказали одну из главных целей данного изобретения, представляющую собой исследование молекулярной основы лизосомально-протективного действия Hsp70. В связи с этим разрабатывали способ получения рекомбинантного Hsp70 и его мутантов, как и способ субклеточного фракционирования, основанного на ультрацентрифугировании в градиенте йодиксанола. Анализ для прямой оценки целостности лизосомальной мембраны основывается на индуцированной фотоокислением проницаемости лизосом, что делает возможным микроскопический подход к оценке действия Hsp70 и других компонентов в реальном времени в отношении их способности делать чувствительными или защищать лизосомальные мембраны. В различных системах in vitro исследовали взаимодействие рекомбинантного Hsp70 и мутантов с различными липидами, включая измерение рассеяния света липосомами под углом 90°, сдвига флуоресценции триптофана и поверхностного плазменного резонанса (BIAcore). Моделирование электростатической поверхности Hsp70 in silico помогло в создании концептуальной модели взаимодействия Hsp70-BMP. Для проверки in vivo соответствия наблюдаемого в системах in vitro взаимодействия липидов взаимодействие BMP-Hsp70 метили в отношении обоих компонентов. Для дальнейшей демонстрации возможности применения данного механизма описывали способ гибели клеток, индуцируемой введением цисплатина, и в этой системе гибели клеток метили лизосомальный Hsp70 в линиях опухолевых и нетрансформированных клеток.

Для рассмотрения молекулярной основы вклада Hsp70 в стабильность лизосомальной мембраны авторы стремились установить систему, которая устраняла бы влияние цитозольного Hsp70, т.е. нацеливания Hsp70 непосредственно на лизосомы. На фотографиях электронной микроскопии Nylandsted et al. показано, что Hsp70 может присутствовать внутри лизосом, и таким образом, решали разрабатывать способ получения рекомбинантного Hsp70 человека (rHsp70) в надежде применять механизм эндоцитоза в качестве способа доставки rHsp70 напрямую в лизосомы. Авторы настоящего изобретения преодолевали, таким образом, необходимость добавления лизосомальных сортировочных сигналов Hsp70, потенциально нарушая функции и избегая осложнений, которые могут появляться вследствие сверхэкспрессии. Кроме того, эндоцитозный подход делает возможным титрование количеств rHsp70 и в длительной перспективе открывает возможности изучения механизма поглощения внеклеточного Hsp70.

Обладая разработанным способом получения Hsp70, для оценки эндоцитоза его метили флуорофором Alexa Fluor 488 (Hsp70-AF488). С применением конфокальной визуализации показывали, что rHsp70 в действительности, таким образом, нацелен на лизосомы. Затем для оценки влияния на стабильность лизосомальной мембраны авторы разрабатывали способ количественного определения проницаемости лизосомальной мембраны на уровне единичных лизосом и применение данного способа для оценки действия подвергшегося эндоцитозу rHsp70. Данные способы формируют основу для примеров 1 и 2, в которых авторы показывают, что Hsp70 усиливает выживание клетки посредством стабилизации лизосом посредством рН-зависимого высокоаффинного связывания с эндолизосомальным анионным фосфолипидом бис(моноацилглицеро)фосфатом (BMP). Положительно заряженный АТФазный домен Hsp70 отвечает за связывание, но субстрат-связывающий домен также необходим для эффективной стабилизации лизосом. Любопытно, что данное взаимодействие и протективное действие, которое оно оказывает, зависят от триптофана 90, локализованного в положительно заряженном клине АТФазного домена. Важно, что можно достичь цитопротективного действия доставкой rHsp70 посредством эндоцитоза и специфически отменить его посредством внеклеточного введения антител BMP или ингибиторов Hsp70.

В дополнение к этому, авторы также стремились соединить механизм защиты лизосомальных мембран Hsp70 с явлениями образования опухоли и программируемой гибели клеток. Таким образом, авторы характеризовали программу гибели клеток, инициируемую введением общепринятого химиотерапевтического средства цисплатина, и обнаруживали, что она не зависит от каспазы, но для нее характерно лизосомальное высвобождение протеаз. Трансгенный, также как и подвергшийся эндоцитозу, Hsp70 способен усиливать выживание клеток в условиях воздействия цисплатина посредством стабилизации лизосомальных мембран. Любопытно, что авторы показали, что меченый лизосомальный Hsp70 сам по себе или его лизосомальный партнер по взаимодействию бис(моноацилглицеро)фосфат (BMP) делают трансформированные, но не нетрансформированные, линии клеток предстательной железы чувствительными к цисплатину, что служит экспериментальным подтверждением применения взаимодействия BMP-Hsp70 в качестве фармакологической мишени для терапии злокачественных опухолей.

Любопытно, что, несмотря на то, что Hsp70-2 обладает 86% гомологией по последовательности аминокислот с Hsp70, он не способен защищать лизосомальные мембраны напрямую. Однако истощение Hsp70-2 также сказывается на проницаемости лизосомальной мембраны и последующей программируемой гибели клеток. Данное действие не зависит от прямого взаимодействия Hsp70-2 и лизосомального компартмента, а скорее контролируется через подавление фактора роста эпителия хрусталика (LEDGF) в ответ на истощение Hsp70-2.

Способы и результаты данного исследования более подробно рассматриваются в разделе Примеры.

Объясняя в настоящем документе молекулярную основу цитопротективного действия Hsp70 посредством взаимодействия с лизосомальным BMP, способствующего лизосомальной стабилизации, полученные данные предоставляют основу для терапевтического воздействия на лизосомные болезни накопления.

К настоящему моменту продемонстрировано, что, неожиданно, введение рекомбинантного Hsp70 в клетки эффективно реверсирует патологию лизосомных болезней накопления, как показано в настоящем документе для болезни Ниманна-Пика и болезни Фарбера. Кроме того, введение в клетки индуктора Hsp70, бензилового спирта, эффективно реверсирует патологию лизосомных болезней накопления, как показано в настоящем документе для болезни Ниманна-Пика.

Таким образом, настоящее изобретение относится к способу лечения лизосомных болезней накопления посредством увеличения прямо или косвенно внутриклеточной концентрации и/или активности Hsp70 у нуждающихся в этом индивидуумов посредством введения Hsp70, его функционального фрагмента или варианта или посредством введения индуктора или коиндуктора Hsp70.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к биоактивному средству, способному увеличивать внутриклеточную концентрацию и/или активность Hsp70 для применения в качестве лекарственного средства или для применения в лечении лизосомных болезней накопления.

В одном из вариантов осуществления указанное биоактивное средство представляет собой Hsp70 или его функциональный фрагмент или вариант.

В другом варианте осуществления указанное биоактивное средство является индуктором или коиндуктором Hsp70.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способу лечения лизосомных болезней накопления, включающему введение биоактивного средства по настоящему изобретению нуждающемуся в этом индивидууму.

В одном из вариантов осуществления указанное лечение является профилактическим, излечивающим или смягчающим.

В одном из вариантов осуществления указанная лизосомная болезнь накопления выбрана из группы, состоящей из болезни Ниманна-Пика, болезни Фарбера, болезни Краббе, болезни Фабри, болезни Гоше, сиалидоза, метахроматической лейкодистрофии и дефицита сапозинов.

В другом варианте осуществления указанную лизосомную болезнь накопления характеризуют как имеющую остаточную ферментативную активность дефектного фермента, вовлеченного в патологию.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения лизосомной болезни накопления, включающему введение биоактивного средства по настоящему изобретению в сочетании с, по меньшей мере, одним другим способом лечения.

Дополнительный аспект настоящего изобретения относится к способу модуляции ферментативной активности фермента, где указанный фермент взаимодействует с BMP (бис(моноацилглицеро)фосфатом), включающему этапы

i) введения биоактивного средства по настоящему изобретению,

ii) допущения взаимодействия между BMP и Hsp70, и

iii) модуляции ферментативной активности фермента, взаимодействующего с BMP.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к Hsp70 или его функциональному фрагменту или варианту для применения в качестве лекарственного средства.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу модуляции ферментативной активности фермента, где указанный фермент взаимодействует с BMP, включающему этап введения Hsp70 или его функционального фрагмента или варианта в форме, допускающей взаимодействие между BMP и Hsp70 или указанным его функциональным фрагментом или вариантом, и, таким образом, модуляции ферментативной активности фермента, взаимодействующего с BMP.

Предпочтительно Hsp70 или указанный его функциональный фрагмент или вариант образует ковалентный или нековалентный комплекс с BMP.

Предпочтительно BMP взаимодействует с сапозином.

Предпочтительно указанный сапозин выбран из группы, состоящей из сапозина А, сапозина В, сапозина С и сапозина D.

Предпочтительно указанный фермент выбран из группы, состоящей из сфингомиелиназы, кислой сфингомиелиназы, сиалидазы, альфа-галактозидазы, бета-галактозидазы, бета-галактозилцерамидазы, глюкозилцерамидазы и кислой церамидазы.

Предпочтительно указанная модуляция ферментативной активности является стимуляцией ферментативной активности указанного фермента.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к Hsp70 или его функциональному фрагменту или варианту для применения в качестве лекарственного средства. Предпочтительно указанный Hsp70 или его функциональный фрагмент или вариант можно использовать в лечении, облегчении или профилактике лизосомных болезней накопления, таких как болезнь Ниманна-Пика, болезнь Гоше, болезнь Фарбера, болезнь Краббе, болезнь Фабри и сиалидоз.

В другом аспекте изобретение относится к способу увеличения захвата соединения, включающему этап введения указанного соединения вместе с Hsp70 или его функциональным фрагментом или вариантом. В одном из вариантов осуществления указанный Hsp70 или его функциональный фрагмент или вариант ковалентно связан с указанным соединением. В другом варианте осуществления указанный Hsp70 или его функциональный фрагмент или вариант нековалентно связан с указанным соединением.

Вариант осуществления изобретения относится к способу стимуляции ферментативной активности фермента, ассоциированного с лизосомной болезнью накопления, такой как болезнь Ниманна-Пика, болезнь Гоше, болезнь Фарбера, болезнь Краббе, болезнь Фабри и сиалидоз. Предпочтительно указанная лизосомная болезнь накопления является болезнью Ниманна-Пика.

Поскольку лизосомные болезни накопления возникают по причине недостаточной ферментативной активности, целью изобретения является увеличение ферментативной активности для смягчения или лечения нарушения.

Показано, что Hsp70 взаимодействует с BMP. Поскольку BMP действует как кофактор для различных других белков, взаимодействие между Hsp70 и BMP может модулировать функцию этих различных других белков. Например, BMP действует как кофактор для аSМазы. Таким образом, взаимодействие Hsp70 и BMP может увеличивать активность аSМазы. Поскольку болезнь Ниманна-Пика ассоциирована со снижением активности аSМазы, Hsp70 может смягчать или излечивать болезнь Ниманна-Пика посредством увеличения активности аSМазы. Аналогично, BMP действует как кофактор для сапозина А, сапозина В, сапозина С и сапозина D. Данные белки сапозины вовлечены в другие лизосомные болезни накопления, и, таким образом, Hsp70 может смягчать или излечивать другие лизосомные болезни накопления посредством усиления активности сапозина или фермента, ассоциированного с указанным сапозином.

В варианте осуществления изобретения Hsp70 применяют вместе с заместительной терапией ферментом при лечении лизосомной болезни накопления. Таким образом, необходимое количество фермента можно значительно снизить благодаря фермент-активирующему действию Hsp70.

В другом варианте осуществления Hsp70 применяют для облегчения захвата ферментов при заместительной терапии ферментом, таким образом, увеличивая количество фермента, захваченного соответствующими клетками.

Определения и сокращения

аSМаза/ASM: кислая сфингомиелиназа

ADD70: ловушка Hsp70, являющаяся производным AIF

AIF: Апоптоз-индуцирующий фактор

АО: Акридиновый оранжевый

Apaf-1: Апоптотический протеаза-активирующий фактор 1

Bag-1: Bcl-2-ассоциированный атаноген-1

Bcl-2: В-клеточная лимфома/лейкоз 2

Bid: BH3-взаимодействующий агонист домена смерти

BMP: бис(моноацилглицеро)фосфат

CARD: Домен активации каспазы

Каспаза: Цистеинаспартатспецифические протеазы

CHIP: С-конец Hsp70-связывающегося белка

CytC: Цитохром С

DD: Домен смерти

DED: Домен эффектора смерти

дцРНК: Двухцепочечная РНК

eHsp70: Внеклеточный Hsp70

ER: Эндоплазматическая сеть

ERT: Заместительная терапия ферментом

FADD: Fas-ассоциированный белок, содержащий домен смерти

HIP: Нзр70-взаимодействующий белок

HRP: Пероксидаза хрена

HS: Тепловой шок/стресс

HSE: Элемент теплового шока

HSF: Фактор теплового шока

Hsp: Белок теплового шока

HspBP1: Белок 1, связывающий белки теплового шока

IAP: Белок-ингибитор апоптоза

iMEF: Иммортализованные эмбриональные фибробласты мыши

JNK: c-jun NH₂-концевая киназа

LAMP-1/-2: Лизосомальный мембранный белок-1/-2

LBPA: Лизобисфосфатидная кислота

LEDGF: Фактор роста эпителия хрусталика

LMP: Проницаемость лизосомальной мембраны

MIC-1: Макрофагальный ингибиторный цитокин 1

МОМР: Проницаемость внешней митохондриальной мембраны

MPR: Рецептор манноза-6-фосфата

МТТ: 3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолия бромид

NPD: Болезнь Ниманна-Пика

NPDA: Болезнь Ниманна-Пика, тип А

NPDB: Болезнь Ниманна-Пика, тип В

NPDC: Болезнь Ниманна-Пика, тип С

NPDD: Болезнь Ниманна-Пика, тип D

PCD:: Программируемая гибель клеток

РКС: Протеинкиназа С

РОРС: Пальмитоилолеоилфосфатидилхолин

POPS: Пальмитоилолеоилфосфатидилсерин

RNAi: РНК-интерференция

ROS: Активные формы кислорода

SD: Стандартное отклонение

миРНК: Малые интерферирующие РНК

Smac/Diablo: Второй митохондриальный активатор каспазы

tBid: Усеченный Bid

TNF: Фактор некроза опухоли

TNFR: рецептор TNF

TRADD: TNFR-ассоциированный белок, содержащий домен смерти

TRAF: TNFR-ассоциированный фактор

Лизосомные болезни накопления (LSD): термины "лизосомное нарушение накопления" и "лизосомная болезнь накопления" используют в качестве синонимов.

Функциональный фрагмент Hsp70: термин "функциональный фрагмент Hsp70" истолковывают в значении любого фрагмента Hsp70, обладающего желаемой функцией. В отношении модуляции ферментативной активности функциональный фрагмент является фрагментом, способным модулировать ферментативную активность. В отношении увеличения захвата вещества функциональный фрагмент Hsp70 является фрагментом, способным увеличивать захват указанного вещества. Следует понимать, что точный количественный эффект функционального фрагмента может отличаться от действия полноразмерной молекулы. В некоторых случаях функциональный фрагмент в действительности может являться более эффективным, чем полноразмерная молекула. Кроме того, применение фрагментов вместо полноразмерных молекул может быть выгодным с точки зрения меньшего размера фрагментов.

Функциональный вариант Hsp70: термин "функциональный вариант Hsp70" истолковывают в значении любого варианта Hsp70, обладающего желаемой функцией. В отношении модуляции ферментативной активности функциональный вариант является вариантом, способным модулировать ферментативную активность. В отношении увеличения захвата вещества функциональный вариант Hsp70 является фрагментом, способным увеличивать захват указанного вещества. Понятно, что точный количественный эффект функционального варианта может отличаться от действия полноразмерной молекулы. В некоторых случаях функциональный вариант, в действительности, может являться более эффективным, чем полноразмерная молекула.

"Биоактивное средство" (т.е. биологически активное вещество/средство) является любым средством, лекарственным средством, соединением, композицией материалов или смесью, которая обеспечивает некоторое фармакологическое, зачастую полезное, действие, которое можно демонстрировать in vivo или in vitro. В настоящем документе данный термин, кроме того, включает любое физиологически или фармакологически активное вещество, которое оказывает местное или системное действие на индивидуума. Дополнительные примеры биоактивных средств включают в качестве неограничивающих примеров средства, включающие или состоящие из олигосахарида, средства, содержащие или состоящие из полисахарида, средства, необязательно содержащие или состоящие из гликозилированного пептида, средства, необязательно содержащие или состоящие из гликозилированного полипептида, средства, содержащие или состоящие из нуклеиновой кислоты, средства, содержащие или состоящие из олигонуклеотида, средства, содержащие или состоящие из полинуклеотида, средства, содержащие или состоящие из липида, средства, содержащие или состоящие из жирной кислоты, средства, содержащие или состоящие из сложного эфира жирной кислоты, и средства, содержащие или состоящие из вторичного метаболита. Его можно использовать профилактически, терапевтически в связи с лечением индивидуума, такого как человек или любое другое животное. В настоящем документе биоактивное средство является веществом, способным увеличивать внутриклеточную концентрацию и/или активность Hsp70.

Термины "лекарственное средство" или "лекарственный препарат" в настоящем документе включают биологически, физиологически или фармакологически активные вещества, способные местно или системно действовать на тело человека или животного.

Термины "лечение" и "терапия" в настоящем документе равноценно применяют для лечебной терапии, профилактической или превентивной терапии и смягчающей или паллиативной терапии. Термин включает подход получения полезных или желаемых физиологических результатов, которые можно установить клинически. Для целей данного изобретения полезный или желаемый клинический результат включает в качестве неограничивающих примеров снижение симптомов, снижение степени заболевания, стабилизированное (т.е. не ухудшающееся) состояние, остановку или замедление прогресса или ухудшения состояния/симптомов, смягчение или облегчение состояния или симптомов и ремиссию (частичную или полную), обнаруживаемую или не обнаруживаемую. В настоящем документе термин "облегчение" и его варианты означают, что степень и/или нежелательные проявления физиологического состояния или симптома уменьшаются и/или ход прогресса замедлен или растянут во времени по сравнению с не принимавшими композиции по настоящему изобретению.

"Эффект лечения" или "терапевтический эффект" проявляется если появляется изменение в состоянии, подвергшемся лечению, что оценивают по критерию, составляющему определение термина "лечение". Это "изменение" состояния, подвергшегося лечению, существует, если существует, по меньшей мере, 5% улучшение, предпочтительно 10% улучшение, более предпочтительно - по меньшей мере, 25%, даже более предпочтительно - по меньшей мере, 50%, такое как, по меньшей мере, 75%, и наиболее предпочтительно - по меньшей мере, 100% улучшение. Изменение может основываться на улучшениях тяжести подвергшегося лечению состояния индивидуума, или на разнице частоты улучшающихся состояний в популяции индивидуумов с лечением и без лечения биоактивным средством, или с биоактивным средством в сочетании с фармацевтической композицией по настоящему изобретению.

"Фармакологически эффективное количество", "фармацевтически эффективное количество" или "физиологически эффективное количество "биоактивного средства" является таким количеством биоактивного средства, присутствующего в фармацевтической композиции, как описано в настоящем документе, которое необходимо для обеспечения желаемого уровня активного средства в кровотоке или в месте действия у индивидуума (например, в легких, желудочной системе, колоректальной системе, предстательной железе и т.д.) для лечения с целью получения ожидаемого физиологического ответа при введении такой композиции. Точное количество зависит от многих факторов, например, активного средства, активности композиции, применяемого средства доставки, физических характеристик композиции, предполагаемого применения пациентом (т.е. количество доз, вводимых в сутки), соблюдения пациентом режима лечения и т.п., и его легко может определить специалист в данной области в зависимости от информации, предоставляемой в настоящем документе. "Эффективное количество" биоактивного средства можно вводить в одно введение или посредством многократного введения количества, составляющего в общей сложности эффективное количество, предпочтительно в течение 24-часового периода. Его можно определить посредством стандартных клинических способов определения подходящих количеств и выбора времени введения. Следует понимать, что "эффективное количество" может являться результатом эмпирического и/или индивидуализированного (для каждого отдельного случая) определения со стороны лечащего медицинского работника и/или индивидуума.

Термины "увеличение" и "улучшение" положительного эффекта и их варианты в настоящем документе относятся к терапевтическому эффекту биоактивного средства по сравнению с плацебо или увеличению терапевтического эффекта медицинского лечения по современному уровню техники сверх достигаемого обычно, когда фармацевтическую композицию вводят без биоактивного средства по данному изобретению. "Увеличение терапевтических эффектов" проявляется, когда имеет место ускорение и/или увеличение интенсивности и/или продолжительности терапевтических эффектов, достигаемых в результате введения биоактивного средства (средств). Это также может включать увеличение продолжительности терапевтических эффектов. Это также может проявляться, когда для достижения таких же эффектов, как при совместном введении с биоактивным средством (средствами), предоставляемым по настоящему изобретению, по сравнению с введением большего количества фармацевтической композиции без биоактивного средства требуется введение меньшего количества фармацевтической композиции. Усиление эффекта предпочтительно, но необязательно, приводит к лечению острых симптомов, для которых фармацевтическая композиция отдельно неэффективна или менее терапевтически эффективна. Усиления достигают, когда имеет место, по меньшей мере, 5% усиление терапевтических эффектов, такое как, по меньшей мере, 10% усиление терапевтических эффектов, когда биоактивное средство по настоящему изобретению вводят совместно с фармацевтической композицией по сравнению с введением фармацевтической композиции отдельно. Предпочтительно увеличение на, по меньшей мере, 25%, более предпочтительно - по меньшей мере, 50%, даже более предпочтительно - по меньшей мере, 75%, наиболее предпочтительно - по меньшей мере, 100%.

"Совместное введение" биоактивного средства (средств), или биоактивных средств и лекарственных средств по современному уровню техники в настоящем документе относится к введению одного или нескольких биоактивных средств по настоящему изобретению, или введению одного или нескольких биоактивных средств по настоящему изобретению и фармацевтической композиции по современному уровню техники в некоторый период времени. Предпочтительным является период времени менее чем 72 часа, такой как 48 часов, например, менее чем 24 часа, такой как менее чем 12 часов, например, менее чем 6 часов, такой как менее чем 3 часа. Однако данные термины также означают, что биоактивное средство и терапевтическую композицию можно вводить совместно.

Термин "индивидуум" относится к позвоночным, в частности к представителям видов класса млекопитающих, предпочтительно приматам, включая людей. В предпочтительном варианте осуществления индивидуум в настоящем документе является человеком, мужчиной или женщиной любого возраста.

"Нуждающийся в этом индивидуум" относится к индивидууму, который может получать пользу от настоящего изобретения. В одном из вариантов осуществления указанный нуждающийся в этом индивидуум является больным индивидуумом, где указанное заболевание является лизосомной болезнью накопления.

Термин "природный нуклеотид" или "нуклеотид" относится к любому из четырех дезоксирибонуклеотидов, dA, dG, dT и dC (элементы ДНК) и четырех рибонуклеотидов, A, G, U и С (элементы РНК), как они существуют в природе. Каждый природный нуклеотид содержит или по существу состоит из остатка сахара (рибозы или дезоксирибозы), остатка фосфата и остатка природного/стандартного основания. Природные нуклеотиды связываются с комплементарными нуклеотидами по широко известным правилам спаривания оснований (Watson и Crick), где аденин (А) спаривается с тимином (Т) или урацилом (U); и где гуанин (G) спаривается с цитозином (С), где соответствующие пары нуклеотидов являются частью комплементарных антипараллельных цепей нуклеотидов. Спаривание оснований приводит к специфической гибридизации между заранее определенными и комплементарными нуклеотидами. Спаривание оснований является основой, в соответствии с которой ферменты способны катализировать синтез олигонуклеотида, комплементарного матричному олигонуклеотиду. В этом синтезе строительные блоки (как правило, трифосфаты рибо- или дезоксирибо-производных А, Т, U, С или G) направляются матричным олигонуклеотидом для образования комплементарного олигонуклеотида с правильной комплементарной последовательностью. Распознавание последовательности олигонуклеотидов по ее комплементарной последовательности опосредуется соответствующими и взаимодействующими основаниями, которые образуют пары оснований. В природе специфические взаимодействия, приводящие к спариванию оснований, регулируются размером оснований и структурой доноров и акцепторов водородной связи в основаниях. Большое пуриновое основание (А или G) спаривается с небольшим пиримидиновьм основанием (Т, U или С). Дополнительно распознавание пары оснований между парами находится под влиянием водородных связей, формирующихся между основаниями. В геометрии пары оснований Уотсона-Крика, шестичленное кольцо (пиримидин в природных олигонуклеотидах) сопоставляется с кольцевой системой, состоящей из слитого шестичленного кольца и пятичленного кольца (пурин в природных олигонуклеотидах) с водородной связью в середине, связывающей два атома кольца, и водородными связями на любой стороне кольца, соединяющими функциональные группы, присоединенные к каждому кольцу, с донорными группами, спаренными с акцепторными группами.

В настоящем документе "нуклеиновая кислота" или "молекула нуклеиновой кислоты" относится к полинуклеотидам, таким как дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) или рибонуклеиновая кислота (РНК), олигонуклеотидам, фрагментам, полученным посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР), и фрагментам, полученным посредством лигирования, расщепления, действия эндонуклеазы или действия экзонуклеазы. Молекулы нуклеиновой кислоты можно составлять из мономеров, которые являются природными нуклеотидами (такими как ДНК и РНК) или аналогами природных нуклеотидов (например, альфа-энантиомерные формы природных нуклеотидов) или их комбинацией. Модифицированные нуклеотиды могут иметь отличия в остатках сахара и/или в остатках пиримидиновых или пуриновых оснований. Модификации сахара, включающие, например, замену одной или нескольких гидроксильных групп галогенами, алкильными группами, аминами и азидными группами, или сахара можно функционализировать как простые эфиры или сложные эфиры. Кроме того, целый остаток можно заменить стерически и электронно-схожими структурами, такими как азасахара и карбоциклические аналоги сахара. Примеры модификации остатков оснований включают алкилированные пурины и пиримидины, ацилированные пурины или пиримидины или другие широко известные гетероциклические заменители. Мономеры нуклеиновой кислоты можно связывать фосфодиэфирными связями или аналогами таких связей. Аналоги фосфодиэфирных связей включают фосфотиоат, фосфодитиоат, фосфоселеноат, фосфодиселеноат, фосфоанилотиоат, фосфоанилидат, фосфоамидат и т.п. Термин "молекула нуклеиновой кислоты" также включает, например, так называемые "пептидные нуклеиновые кислоты", которые содержат природные или модифицированные основания нуклеиновых кислот, прикрепленные к полиамидному остову. Можно применять одноцепочечные или двухцепочечные нуклеиновые кислоты.

Термин "комплементарная молекула нуклеиновой кислоты" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, обладающей комплементарной последовательностью нуклеотидов и обратной ориентацией, по сравнению с исходной последовательностью нуклеотидов. Например, последовательность 5′ ATGCACGGG 3′ комплементарна 5′ CCCGTGCAT 3′.

"Выделенная молекула нуклеиновой кислоты" является молекулой нуклеиновой кислоты, которая не встроена в геномную ДНК организма. Например, молекула ДНК, которая кодирует фактор роста и которую отделяли от геномной ДНК клетки, является выделенной молекулой ДНК. Другим примером выделенной молекулы ДНК является химически синтезированная молекула нуклеиновой кислоты, которая не интегрирована в геном организма. Молекула нуклеиновой кислоты, которую выделяли из отдельных видов, меньше, чем полная молекула ДНК хромосомы этого вида.

"Конструкция молекулы нуклеиновой кислоты" является молекулой нуклеиновой кислоты, одно- или двухцепочечной молекулой нуклеиновой кислоты, модифицированной вмешательством человека таким образом, чтобы содержать сегменты нуклеиновой кислоты, комбинированные и сопоставленные в несуществующем в природе порядке.

"Линейная ДНК" означает некольцевую молекулу ДНК, имеющую свободные 5′- и 3′-концы. Линейную ДНК можно получать из закрытых кольцевых молекул ДНК, таких как плазмиды, посредством ферментативного расщепления или физического разрушения.

"Комплементарная ДНК (кДНК)" является одноцепочечной молекулой ДНК, полученной из матричной мРНК с помощью фермента обратная транскриптаза. Как правило, для инициации обратной транскрипции применяют праймер, комплементарный частям мРНК. Специалисты в данной области также применяют термин "кДНК" для обозначения двухцепочечной молекулы ДНК, состоящей из одноцепочечной молекулы ДНК и комплементарной ей цепи ДНК. Термин "кДНК" также относится к клону молекулы кДНК, синтезированной по матрице РНК.

"Гетерологичная ДНК" относится к молекуле ДНК или совокупности молекул ДНК, которые не существуют в природе в определенной клетке-хозяине. Гетерологичные для отдельной клетки-хозяина молекулы ДНК могут содержать ДНК из вида клетки-хозяина (т.е. эндогенная ДНК) при условии, что ДНК хозяина комбинирована с ДНК нехозяина (т.е. экзогенной ДНК). Например, молекулу ДНК, содержащую сегмент ДНК нехозяина, кодирующий полипептид, функционально связанный с сегментом ДНК хозяина, содержащим транскрипционный промотор, рассматривают как гетерологичную молекулу ДНК. Наоборот, гетерологичная молекула ДНК может содержать эндогенный ген, функционально связанный с экзогенным промотором. В качестве другой иллюстрации, молекулу ДНК, содержащую ген из клетки дикого типа, рассматривают как гетерологичную ДНК, если данная молекула ДНК встроена в мутантную клетку с недостатком гена дикого типа.

"Полипептид" является полимером аминокислотных остатков, предпочтительно соединенных исключительно пептидными связями, полученных природным или синтетическим путем. Полипептид, полученный посредством экспрессии молекулы ДНК не-хозяина, является "гетерологичным" пептидом или полипеп