Способ получения экстракта аллергена

Способ получения экстракта аллергена

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к способу получения очищенного экстракта аллергена и фармацевтических композиций и вакцин для применения в диагностике и лечении аллергии.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Аллергия является приобретенным расстройством гиперчувствительности иммунной системы и запускается от воздействия безвредных веществ окружающей среды, известных как аллергены. Реакция гиперчувствительности типа I является характеристикой аллергических реакций и приводит к производству чрезмерных количеств антител IgE, которые в свою очередь активируют базофилы и тучные клетки, вызывая воспалительную реакцию. Эффекты могут быть системными, такими как вазодилатация, секреция слизи, стимуляция нервов и сокращение гладких мышц, вызывая реакцию анафилаксии, или ограниченными определенной областью тела, например, дыхательной системой.

Пищевая аллергия является развивающейся крупной проблемой здравоохранения, которая затрагивает около 6% школьников и приблизительно 4% взрослых и может иметь серьезные последствия, включая фатальные анафилактические реакции⁽¹⁾. Аллергия, следовательно, может иметь значительное влияние на психосоциальные аспекты качества жизни, выходя за рамки непосредственных клинических эффектов аллергического состояния пациента и форм повседневной деятельности семей ⁽²⁾. В настоящее время стандарт медицинского наблюдения этого типа аллергии включает строгое избежание специфических аллергенов и лечение эпинефрином.

Аллергия на арахис является иммунным ответом по типу гиперчувствительности типа I (опосредованной IgE) на пищевые вещества из арахиса, вызывая чрезмерную реакцию иммунной системы. Американский фонд астмы и аллергии (The Asthma and Allergy Foundation of America) считает, что аллергия на арахис является наиболее частой причиной смерти, связанной с пищевыми продуктами в США и подсчитал, что она затрагивает 0,4-0,6% населения. Древесные орехи, такие как пекан, фисташки, кедровые орехи и грецкий орех, также являются распространенными ореховыми аллергенами.

К настоящему времени одиннадцать аллергенов (от Ara h 1 до Ara h 11) из арахиса были идентифицированы (Arachis hypogea) и многие из них секвенированы и клонированы. На основании номенклатуры Международного союза иммунологических обществ (МСИО) (International Union of Immunological Societies, IUIS), эти аллергены включают: Ara h 1, купин (вициллин-тип, 7S глобулин) массой 64 кДа; Ara h 2, конглютин (2S альбумин) массой 17 кДа; Ara h 3, купин (легумин-тип, 11S глобулин, глицинии) массой 60 кДа; Ara h 4, купин (легумин-тип, 11S, глицинии) массой 37 кДа; Ara h 5, профилин массой 15 кДа; Ara h 6, конглютин (2S альбумин) массой 15 кДа; Ara h 7, конглютин (2S альбумин) массой 15 кДа; Ara h 8, связанный с патогенезом белок, PR-10 массой 17 кДа; Ara h 9, неспецифический липид-переносящий белок 1 массой 9,8 кДа; Ara h 10, 16 кДа олеозин, и Ara h 11, 14 кДа олеозин.

Аллергия на кошек является чрезвычайно распространенной, встречаясь у до 25% индивидуумов с аллергиями. Аллергия на кошек является более распространенной, чем аллергия на перхоть собак, что может быть связано с активностью кошачьей шерсти и перхоти как аллергена, а так же с фактом, что кошек обычно не купают. Кошачий аллерген производится в больших количествах, в частности некастрированными котами мужского пола, поскольку аллерген частично находится под гормональным контролем. Перхоть является постоянно переносимой по воздуху, липкой и находится в общественных местах, даже там, где нет кошек. Это связано с тем, что перхоть переносится на одежде людей, у которых есть кошки, затем сбрасывается в общественных местах. Следовательно, кошачий аллерген является компонентом домашней пыли, даже в домах, где никогда не жила кошка. Размер частиц кошачьей перхоти крайне мал и вдыхается глубоко в легкие. Кошачья перхоть, следовательно, является распространенной причиной аллергической астмы, и владельцы кошек, которые имеют аллергию на кошек, являются более склонными к развитию симптомов астмы ^{(8, 9)}.

Основные кошачьи и собачьи аллергены могут находиться в экстрактах шерсти/перхоти и слюне и поэтому рассматриваются как эпителиальные аллергены. Восемь различных аллергенов были идентифицированы у кошки, и многие из них секвенированы и клонированы. На основании веб-сайта МСИО (IUIS) эти алергены включают: Fel d 1 утероглобин массой 14 и 4 кДа; Fel d 2 альбумин массой 69 кДа; Fel d 3 цистатин массой 11 кДа; Fel d 4, липокалин массой 22 кДа; Fel d 5, иммуноглобулин А массой 400 кДа; Fel d 6, иммуноглобулин М массой 800-1000 кДа; Fel d 7, белок железы фон Эбнера массой 17,5 кДа; Fel d 8 лазерин-подобный белок массой 24 кДа. Основной кошачий аллерген, Fel d 1, был подробно охарактеризован с использованием белковых и иммунохимических техник и недавно был экспрессирован как рекомбинантный аллерген. Fel d 1 представляет димер массой приблизительно 36 кДа, который состоит из двух 17 кд субъединиц⁽¹⁰⁾.

Аллергия на травы является одним из наиболее распространенных и преобладающих форм аллергии, которая влияет на людей со своими историями в течение определенного сезона. Это присутствует в воздухе поздней весной и ранними летними месяцами, что может вызвать аллергические риниты, аллергические конъюнктивиты и астму. Прямой контакт кожи с травой, от сидения на травах или движения по газону, может вызвать зуд кожи, крапивницу, атопические дерматиты. Одним из самых представительных видов является вид тимофеевка луговая Phleum pratense, выбранный в качестве лидера группы трав. Девять различных аллергенов были идентифицированы из вида Phleum pratense. На основании вебсайта Allergen¹ эти аллергены включают: Phl р 1, бета-экспанзин массой 27 кДа; Phl p 2, группу трав II/III массой 10-12 кДа; Phl p 4, белок массой 55 кДа, Phl p 5 массой 32 кДа, Phl p 6 массой 11 кДа, Phl p 7, кальций-связывающий белок массой 6 кДа, Phl p 11, Ole е 1-связанный белок массой 20 кДа, Phl p 12 профилин массой 14 кДа и Phl p 13, полигалактуроназа массой 55 кДа.

Тростник (Phragmites) является родом, принадлежащим к группе трав. Было описано несколько видов, включая P. australis, или P. communis. Как сообщается, пыльца Phragmites communis является аллергенной в разных местностях. Опыление происходит между летом и осенью, в зависимости от широты и высоты над уровнем моря.

Пять различных белков со способностью связывания IgE были идентифицированы в роде Phragmites. На основании веб-сайта Allergome эти аллергены включают: экспанзин массой 30 кДа; белок, принадлежащий к группе 4 трав массой 60 кДа; рибонуклеазу массой 35 кДа, профилин массой 14 кДа и, наконец, полигалактуроназу.

Виды рода Амброзия (Ambrosia) являются сорными травами, которые растут главным образом в Центральной Европе. Растение живет только сезон, но одно растение производит до тысячи пыльцевых зерен. Тепло, влажность и ветер после восхода солнца помогают высвободить пыльцевые зерна. До сих пор три различных вида были связаны с симптомами аллергии {Amborsia artemisiifolia (амброзия полыннолистная), A. psilostachya (амброзия голометельчатая), and A. trifida (амброзия трехраздельная)). Десять различных аллергенов были идентифицированы в амброзии полыннолистной и многие из них были секвенированы и клонированы. В случае Amborsia artemisiifolia, таковые называют от Amb а 1 до Amb а 10 согласно международной номенклатуре для аллергенов. На основании веб-сайта IUIS эти аллергены включают: Amb а 1 а пектатлиазу массой 38 кДа; Amb а 2 пектатлиазу массой 38 кДа; Amb а 3 а пластоцианин массой 11 кДа; Amb а 4, дефензин-подобный белок массой 30 кДа; Amb а 5, массой 5 кДа; Amb а 6, липид-переносящий белок массой 10 кДа; Amb а 7 пластоцианин массой 12 кДа; Amb а 8 профилин массой 14 кДа; Amb а 9 полканцин массой 10 кДа и Amb а 10 полканцин-подобный белок массой 18 кДа. Для A. psilostachya был описан только аллерген Amb р 5 с неизвестной биологической функцией. Только один аллерген массой 5 кДа был также описан в A. trifida.

Сорные травы могут быть разделены на гомологичные группы в соответствии с их классифицированными аллергенными экстрактами. Амброзия была выбрана в качестве одного из лидеров этой группы растений. По этой причине, результаты, полученные с этим экстрактом пыльцы, можно экстраполировать на другие сорные травы¹.

Аллергию можно лечить рядом известных способов, включая иммунотерапию аллергенами, специфическую иммунотерапию (SIT) или специфическую аллерговакцинацию (SAV), которая является одной из форм иммунотерапии аллергических расстройств, при которой пациента вакцинируют все большими дозами экстракта аллергена с целью индуцирования иммунологической толерантности. Иммунотерапия аллергенами модулирует иммунный ответ на аллерген, а не улучшение симптомов, вызванных аллергической реакцией, и может либо уменьшить потребность в лечении, уменьшить тяжесть симптомов или устранить гиперчувствительность в целом.

Хотя имеется достаточное доказательство того, что иммунотерапия аллергенами является единственным средством, за исключением избежания аллергена, для причинного лечения IgE-опосредованных аллергических расстройств, вызванных ингаляционными аллергенами и жалящими насекомыми из группы Hymenoptera, иммунотерапия экстрактами аллергенов обычно не применяется для лечения пищевой аллергии. Только два недавних исследования показали умеренную клиническую эффективность применения сублингвальной иммунотерапии у индивидуумов, сенсибилизированных на грецкий орех и персик соответственно^{(3, 4)}.

В предыдущих исследованиях предпринимались попытки индуцировать толерантность низкой дозы, путем кормления детей незначительными следами арахиса, которые постепенно становятся все больше и больше с целью построить иммунную систему ^{(4, 6)}. Хотя данные ранних клинических испытаний показывают, что аллергия на арахис может быть смягчена применением иммунотерапии ⁽⁷⁾, в настоящее время отсутствует подтвержденное лечение для предотвращения или излечения аллергических реакций на арахис, с единственным эффективным вариантом для атопических индивидуумов в том, чтобы избегать пищевых продуктов, которые содержат или загрязнены целыми орехами арахиса, частицами арахиса и арахисовыми маслами и обеспечение оперативного доступа к самостоятельно вводимому эпинефрину.

Одним из рисков иммунотерапии является тот, что введение аллергена сенсибилизированному пациенту может вызвать тяжелую аллергическую реакцию или анафилактический шок. Со времени ее первого применения в начале 20-го века, много усилий было предпринято для дальнейшего улучшения безопасности и эффективности иммунотерапии аллергенами. Одним из подходов является использование аллерговакцин с уменьшенной аллергенностью, но с поддержанием иммуногенности.

Патенты США 5770698 и EP 0662080 раскрывают способ удаления веществ и других материалов низкомолекулярного веса с целью очистки экстракта аллергена и увеличения окончательного содержания аллерген/белок. Способ включает разрыв электростатических, гидрофобных или других физических сил в таких условиях, чтобы отделить не вызывающие аллергию вещества от аллергически активных белков. Способ может включать мягкую кислотную обработку путем снижения pH ниже pI соответствующих белков аллергенов.

Один из разнообразных способов уменьшения аллергенности включает химическое модифицирование нативных экстрактов аллергенов с альдегидом, главным образом, формальдегидом и глутаральдегидом, для производства аллергоидов. Эта обработка альдегидом приводит к продуктам реакции (главным образом полимерам), которые потеряли часть своей аллергенности (т.е. проявляют уменьшение IgE-реактивных В-клеточных эпитопов), уменьшая аллергические побочные эффекты. В то же время, нативная иммуногенность аллергена сохраняется благодаря неизмененным Т-клеточным эпитопам. Этот путь модификации аллергена был выбран некоторыми производителями аллерговакцин для разработки коммерчески доступных продуктов, основанных на этом принципе. В целом, существует тенденция к дальнейшей очистке экстрактов аллергенов, тщательной селекции наиболее важных и клинически значимых аллергенов.

Патенты EP 1834649 и EP 1834648 раскрывают способы получения экстрактов аллергенов, однако такие способы не достаточно удаляют загрязняющие белки низкомолекулярного веса.

Существует необходимость дальнейшего улучшения безопасности и эффективности лекарственных средств для применения в иммунотерапии аллергических расстройств путем оптимизации способа очистки аллергенов, чтобы гарантировать, что загрязняющие белки низкомолекулярного веса, раздражающие вещества и токсичные компоненты устранены.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы изобретения разработали промежуточный этап, предшествующий полимеризации для дальнейшего улучшения способа полимеризации и уменьшения аллергенности некоторых экстрактов, таких как клещи, пыльцевые зерна, в том числе трав, сорных трав и деревьев, эпителиальные аллергены и пищевые аллергены, предшествующий обработке глутаральдегидом.

Целью настоящего изобретения является обеспечение способа получения экстрактов, содержащих аллергены и фармацевтических композиций и вакцин для лечения аллергии. Дальнейшей целью является обеспечить оптимально эффективный экстракт аллергена со сниженной IgE - связывающей способностью, но который сохраняет свою иммуногенную способность.

В соответствии с первым аспектом настоящего изобретения, обеспечивается способ производства экстракта аллергена, включающий:

a) исходный материал, содержащий аллерген, контактирует с жидким экстракционным агентом для получения смеси, содержащей липиды растворенные в жидкой фазе и твердой фазы, содержащей остаток исходного материала, включающего аллергены и белки.

b) смесь подвергают первому этапу разделения для выделения остатка исходного материала,

c) остаток исходного материала контактирует со средством экстракции аллергенов с получением смеси аллергенов, растворенной в жидкой фазе, и твердой фазы, содержащей неаллергенный остаток.

d) смесь подвергают второму этапу разделения для выделения аллергенов, растворенных в жидкой фазе, для получения сырого экстракта аллергена,

e) сырой экстракт аллергена подвергают этапу удаления низкомолекулярной фракции для удаления молекул с молекулярным размером менее 3,5 кДа и

f) проводят этап е), пока экстракт аллергена не будет иметь проводимость ниже 1000 мкСм/см при 3-5°C для получения очищенного нативного экстракта аллергена.

Следующий этап обработки может включать

g) подкисление нативного экстракта аллергена, удаление молекул с молекулярным размером менее 3,5 кДа и нейтрализация pH для получения депигментированного экстракта аллергена.

Способ может в дальнейшем включать этап полимеризации, включающий:

h) контакт нативного экстракта аллергена или депигментированного экстракта аллергена с альдегидом и

i) удаление молекул с молекулярным размером менее 100 кДа.

Согласно второму аспекту настоящего изобретения, обеспечивается экстракт аллергена, доступный в соответствии со способом первого аспекта настоящего изобретения.

Согласно третьему аспекту настоящего изобретения, обеспечивается очищенный экстракт аллергена для применения в качестве активного терапевтического вещества для лечения аллергии.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

"Аллерген" может быть определен как молекула, способная индуцировать IgE-ответ и/или аллергическую реакцию I типа.

Термин "депигментированный", относящийся к данному документу, может быть определен как полуочищенный экстракт аллергена, полученный из нативного экстракта путем удаления посторонних веществ, включая адсорбированные пигменты, которые он может содержать.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Аллергенные экстракты настоящего изобретения могут быть произведены из любого исходного материала, содержащего природные аллергены, как известно, вызывающие IgE-опосредованную иммунную реакцию у человека. Такие аллергены могут включать пищевые аллергены (например, арахис), переносимые по воздуху аллергены (например, пыльца трав, дерева, злака и сорных трав, пылевые клещи, грибы и плесени), аллергены насекомых (например, таракана, блох, пчелиный и осиный яд) и эпителиальные аллергены (шерсть животных, перхоть животных, например перхоть кошек и собак).

Пыльцевые аллергены из деревьев, трав и сорных трав происходят из таксономической группы порядков Fagales (например, Alnus и Betula), Lamiales (например, Olea и Plantago), Poales (например, Phleum pratense), Asterales (например, Ambrosia и Artemisia), Cayophyllales (например, Chenopodium и Salsola), Rosales (например, Parietaria), Proteales (например, Platanus), и т.д. Пылевые клещи относятся к группе отрядов Astigmata (например, Dermatophagoides и Euroglyphus). Переносимые по воздуху аллергены, произведенные от плесеней и грибов, относятся к отряду Pleosporales (например, Alternarid), Capnodiales (например, Cladosporium) и т.д.

Исходный материал согласно настоящему изобретению может быть любым аллергеном, включая пищевые аллергены, арахис, все виды земляных орехов, переносимые по воздуху аллергены (например, пыльца (древесная пыльца, пыльца сорных трав, пыльца трав, пыльца зерновых), пылевые клещи, грибы, плесени)), аллергены клещей, трав, деревьев и сорных трав, эпителиальные аллергены (шерсть животных, перхоть животных, например, кошачья шерсть и перхоть и собачья шерсть и перхоть) и аллергены насекомых (например, тараканов, блох, пчелиный и осиный яд).

Предпочтительно пищевым аллергеном является арахис.Более предпочтительно, арахисовым аллергеном является Arachis hypogeal.

Аллергены, переносимые по воздуху, могут выбирать/могут выбирать из групп: Древесная пыльца (Alnus glutinosa, Betula alba, Corylus avellana, Cupressus arizonica,, Olea europea, Platanus sp), пыльца трав (Cynodon dactylon, Dactylis glomerata, Festuca elatior, Holcus lanatus, Lolium perenne, Phleum pratense, Phragmites communis, Poa pratensis), пыльца сорных трав (Ambrosia elatior, Artemisia vulgaris, Chenopodium album, Parietaria judaica, Plantago lanceolata, Salsola kali) и пыльца зерновых (Avena sativa, Hordeum vulgare, Secale cereal, Triticum aestivum, Zea mays), пылевые клещи (Acarus siro, Blomia tropicalis, Dermatophagoides farinae, Dermatophagoides microceras, Dermatophagoidespteronyssinus, Euroglyphus maynei, lepidoglyphus destructor, Tyrophagus putrescentiae), грибы и плесени (Alternaria alternate, Cladosporium herbarum, Aspergillusfumigatus)

Эпителиальные Аллергены можно выбирать из любого животного, включая кошачью шерсть и перхоть, собачью шерсть и перхоть, лошадиную шерсть и перхоть, человеческие волосы и перхоть, кроличью шерсть и перхоть и перья.

Аллергены насекомых можно выбирать из муравья, блохи, клещей (Acarus siro, Blomia tropicalis, Dermatophagoides farinae, Dermatophagoides microceras,

Dermatophagoidespteronyssinus, Euroglyphus maynei, lepidoglyphus destructor, Tyrophagus putrescentiae), таракана, осиного яда и пчелиного яда.

Предпочтительно, исходный материал выбирают из пищевых аллергенов (Arachis hypogeal), пыльцы (Alnus glutinosa, Betula alba, Corylus avellana, Cupressus arizonica,, Olea europea, Platanus sp, Cynodon dactylon, Dactylis glomerata, Festuca elatior, Holcus lanatus, Lolium perenne, Phleum pratense, Phragmites communis, Poa pratensis, Ambrosia elatior, Artemisia vulgaris, Chenopodium album, Parietaria judaica, Plantago lanceolata, Salsola kali, Avena sativa, Hordeum vulgare, Secale cereal, Triticum aestivum, Zea mays), пылевых клещей (Acarus siro, Blomia tropicalis, Dermatophagoides farinae, Dermatophagoides microceras, Dermatophagoidespteronyssinus, Euroglyphus maynei, lepidoglyphus destructor, Tyrophagus putrescentiae), грибов и плесеней (Alternaria alternate, Cladosporium herbarum, Aspergillusfumigatus), эпителиальных аллергенов (кошачья шерсть и перхоть, собачья шерсть и перхоть, лошадиная шерсть и перхоть, человеческие волосы и перхоть, кроличья шерсть и перхоть и перья), аллергенов насекомых (муравья, блох, клещей таракана, осиного и пчелиного яда).

Более предпочтительно исходный материал выбирают из арахиса (Arachis hypogea), пыльцы (Olea europaea, Parietaria judaica, Phragmites communis и Phleum pratense), клещей (Dermatophagoides pteronyssinus) и эпителиального (кошачья перхоть).

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения исходный материал выбирают из Arachis hypogeal, Olea europaea, Parietaria judaica, Phleum pratense, Dermatophagoides pteronyssinus, Phragmites communis, Parietaria judaica и кошачьей перхоти.

В еще более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения исходный материал выбирают из Arachis hypogea, Phleum pratense, Phragmites communis, Parietaria judaica и кошачьей перхоти.

В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения аллергеном является Arachis hypogeal.

Когда исходным материалом является арахис, предпочтительно шкурки удаляют, или материал может быть давленным или молотым. Арахис может быть жареным, обжаренным, запеченным или сырым.

Исходный материал могут обрабатывать для создания максимальной площади поверхности для контакта с жидким экстракционным средством. Исходный материал можно гомогенизировать, перемешивать, давить или молоть для получения гомогенной суспензии для жидкостной экстракции. Этап жидкостной экстракции является этапом "обезжиривания" для удаления липофильных соединений, таких как липиды и жирные кислоты, из исходного материала.

Жидкий экстракционный агент может быть ацетоном, который может быть холодным. Этап жидкостной экстракции могут осуществлять в соотношении 1:1 (вес исходного материала/вес жидкого экстракционного средства), или любом отношении, где вес жидкого экстракционного средства превышает вес исходного материала, например, 1:2, 1:3, 1:5, 1:10. Этап жидкостной экстракции предпочтительно осуществляют в соотношении 1 кг исходного материала к 2 л жидкого экстракционного средства. Этап жидкостной экстракции предпочтительно осуществляют в течение достаточного времени для того, чтобы липиды в исходном материале растворились в жидком экстракционном средстве, что может быть более 1 минуты, предпочтительно в течение 5 мин, более предпочтительно в течение 30 минут и наиболее предпочтительно в течение 1 часа или больше. Этап жидкостной экстракции можно осуществлять при температуре от 20 до 25°C, но предпочтительно осуществляют холодным при температуре от 2 до 6°C, а наиболее предпочтительно от 3 до 5°C. В течение этапа жидкостной экстракции, исходный материал предпочтительно размешивают и взбалтывают с жидким экстракционным средством.

Первым этапом разделения может быть фильтрация.

После первого этапа разделения, остаток исходного материала можно промывать с жидким экстракционным средством. Факультативно, остаток исходного материала можно в дальнейшем экстрагировать жидким экстракционным средством, затем разделять. Предпочтительно, осуществляются один, два или более дополнительных этапов жидкостной экстракции. Жидкостная экстракция остатка исходного материала предпочтительно продолжается до тех пор, пока жидкое экстракционное средство не будет оставаться прозрачным после контакта с остатком исходного материала.

После жидкостной экстракции, остаток исходного материала можно высушивать. Остаток исходного материала можно высушивать при температуре от 2 до 25°C, и предпочтительно сушат при комнатной температуре. Этап сушки предпочтительно продолжают в течение достаточного времени для удаления жидкого экстракционного средства из остатка исходного материала, которое может составлять от 1 до 24 часов, от 6 до 18 часов, от 10 до 14 часов, предпочтительно около 12 часов.

Аллергены можно получать из "обезжиренного" остатка исходного материала путем экстракции со средством экстракции аллергена для получения сырого экстракта аллергена, содержащего аллергены, растворенные в жидкой фазе и твердой фазы, включающей "нежелательный", неаллергенный остаток. Средство экстракции аллергена может быть водным раствором и предпочтительно включать буферное средство. Средство экстракции аллергена может включать PBS и/или NaCl, например, раствор 0,01 М PBS/0,15 М NaCl. Остаток исходного материала могут экстрагировать в средстве экстракции аллергена в любом соотношении, где вес средства экстракции аллергена превышает вес остатка исходного материала, например, 1:2, 1:3, 1:5, 1:10, 1:20, 1:50. Предпочтительно, остаток исходного материал экстрагируют в средстве экстракции аллергена в соотношении 1:10 остаток исходного материала: средство экстракции аллергена (вес/вес). Соотношение остатка исходного материала к средству экстракции аллергена на этапе экстракции может варьировать, но должно быть таким, чтобы аллергены в остатке исходного материала могли растворяться в средстве экстракции аллергена. Экстракцию остатка исходного материала со средством экстракции аллергена предпочтительно осуществляют в течение достаточного времени для того, чтобы аллергены в остатке исходного материала растворились в средстве экстракции аллергена, которое может быть от 30 минут до 12 часов, предпочтительно от 1 до 6 часов, более предпочтительно от 2 до 5 часов и наиболее предпочтительно около 4 часов. Этап экстракции аллергена могут осуществлять при температуре от 20 до 25°C, но предпочтительно осуществляют холодным при температуре от 2 до 6°C, а наиболее предпочтительно от 3 до 5°C. На этапе экстракции аллергена, остаток исходного материала предпочтительно перемешивают или взбалтывают со средством экстракции аллергена. После этапа экстракции аллергена, аллергены, растворенные в жидкой фазе, можно отделять от неаллергенного остатка, для получения сырого экстракта аллергена. Этап разделения представляет собой предпочтительно центрифугирование, хотя многие техники для отделения твердого вещества от жидкости применимы, что хорошо известны специалистам в данной области. Предпочтительно, аллергены, растворенные в жидкой фазе, центрифугируют при температуре от 2 до 6°C, предпочтительно от 3 до 5°C, в течение достаточного времени, чтобы осадить неаллергенный остаток в виде гранул, например, от 1 минуты до 1 часа или более 1 часа. Сырой экстракт аллергена (например, супернатант, содержащий растворенные аллергены), можно хранить при температуре при температуре от 2 до 6°C. Гранулу неаллергенного остатка можно дополнительно экстрагировать со средством экстракции аллергена, применяя те же условия, что на первом этапе экстракции аллергена, и желательно на более длительный период экстракции, такой как 4-8 часов, 8-12 часов или более 12 часов. После второго этапа экстракции аллергена, аллергены, растворенные в жидкой фазе, можно отделять от неаллергенного остатка для получения сырого экстракта аллергена. Сырые экстракты аллергена из первого и второго этапов экстракции аллергена предпочтительно объединяют для дальнейшей обработки. Сырой экстракт аллергена могут фильтровать, например, с использованием 0,45 мкм размер пор. Сырой экстракт аллергена могут подвергать этапу удаления низкомолекулярной фракции для удаления молекул, имеющих низкий молекулярный размер, такие как соли и другие неаллергенные соединения. Заявителем экспериментально установлено, что композиция белков и аллергенов экстрактов арахиса является от 8 до 150 кДа, и эти аллергены должны быть сохранены на этапе удаления молекулярной фракции. Например, белок, переносящий липиды (LTP) арахиса - важный аллерген - 8кДа и который необходимо сохранить на протяжении этапа удаления низкомолекулярной фракции. На этапе е) молекулы, имеющие молекулярный размер менее 8 кДа, или 7 кДа, или 6 кДа, или 5 кДа, 4 кДа или 3,5 кДа можно удалять. Этап удаления низкомолекулярной фракции предпочтительно продолжают до тех пор, пока проводимость экстракта аллергена при 3-5°C не будет менее 900 мкСм/см, или менее 800 мкСм/см, или менее 700 мкСм/см, или менее 600 мкСм/см или более предпочтительно менее 500 мкСм/см. Этап удаления низкомолекулярной фракции предпочтительно продолжают до тех пор, пока проводимость экстракта аллергена при 3-5°C не будет от 200 до 1000 мкСм/см, или от 300 до 900 мкСм/см и наиболее предпочтительно от 400 до 800 мкСм/см.

Полученный в результате очищенный нативный экстракт аллергена можно фильтровать, например, с применением 0,45 и/или 0,22 мкм размеров пор.

Нативный экстракт аллергена можно применять в получении фармацевтической композиции или вакцины для целей стандартизации, диагностики, синтеза и вакцинации.

Способ может в дальнейшем включать дальнейший этап обработки, где неаллергенные соединения, адгезирующие к белку аллергена, удаляют с применением средств, которые разрушают электростатические, гидрофобные или других физические силы, которые ответственны за адгезию неаллергенных соединений к белкам. Средства для разрушения электростатических, гидрофобных или других физических сил можно выбирать из группы химических средств, включающей кислотные и щелочные материалы, в том числе анионо- и катионообменные материалы, соли и электрического тока. Кислотные и щелочные химические средства можно применять в количестве, вызывающем превышение изоэлектрической точки белков. Экстракт аллергена, полученный в результате дальнейшего этапа обработки далее по тексту именуется депигментированным экстрактом аллергена.

Дальнейший этап обработки может включать

g) подкисление нативного экстракта аллергена, удаление молекул с молекулярным размером менее 3,5 кДа и нейтрализацию pH для получения депигментированного экстракта аллергена.

Дальнейший этап обработки предпочтительно включает мягкую кислотную обработку. При мягкой кислотной обработке pH аллергенных белков может быть понижен до менее чем pH 3, например, значение pH от 2,0 до 2,5. РН аллергенных белков может быть от 2,0 до 6,0. Заявителем экспериментально установлено, что оптимум pH для отсоединения неаллергенных соединений, адгезирующих к аллергенным белкам, является pH от 2,0 до 2,1. Значение pH ниже 2,0 приводит к неполноте белкового профиля депигментированного экстракта аллергена, а недостаточно низкий pH, например, выше 3,0, приводит к неполному удалению неаллергенных соединений в полученном в результате депигментированном экстракте аллергена.

РН нативного экстракта аллергена можно снижать с применением подходящей кислоты, например HCl. Подкисленный экстракт можно хранить при низких pH 1-60 минут, предпочтительно 5-30 минут, более предпочтительно 10-20 минут и наиболее предпочтительно около 15 минут. Молекулы, имеющие молекулярный размер менее 3,5 кДа можно удалять на этапах удаления низкомолекулярной фракции.

После дальнейшего этапа обработки, полученный в результате депигментированный экстракт можно собирать и pH экстракта аллергена можно нейтрализовать с применением подходящих щелочей, например NaOH. РН могут доводить до значения, где избегается осаждение белков, например, выше pH 7,0, предпочтительно pH от 7,0 до 8,0, более предпочтительно pH от 7,0 до 7,5 и наиболее предпочтительно pH от 7,3 до 7,4. Дальнейший этап обработки может включать:

g) подкисление нативного экстракта аллергена до pH 2-2,1 и сохранение подкисленного экстракта в течение 5-30 минут, затем подвержение экстракта этапу удаления низкомолекулярной фракции для удаления молекул с молекулярным размером менее 3,5 кДа и доведение pH до 7,3-7,4 для получения депигментированного экстракта аллергена.

Дальнейший этап обработки может включать подкисление нативного экстракта аллергена до pH от 2,0 до 4,0.

Средства для разрушения электростатических сил могут включать электрический ток в форме электрофореза. Неаллергенные соединения могут иметь молекулярную массу менее 8000 Да, 5000 Да и предпочтительно менее чем 3500 и могут включать флавоноиды и/или их гликозиды.

Этап удаления низкомолекулярной фракции может быть этапом диализа, где экстракт диализируют против диализата, такого как очищенная вода или буфер. Этап удаления низкомолекулярной фракции можно осуществлять при температуре от 20 до 25°C, но предпочтительно проводят холодным от 2 до 6°C, а наиболее предпочтительно от 3 до 5°C. Этап удаления низкомолекулярной фракции можно осуществлять в течение 12-24 часов, где растворитель, или в случае диализа, диализат, регулярно меняют для поддержания реакции.

Полученный в результате депигментированный экстракт аллергена можно фильтровать, например, с применением 0,45 мкм и/или 0,22 мкм размера пор, и могут замораживать или лиофилизировать для хранения.

Каждый экстракт, полученный с применением способа настоящего изобретения можно в дальнейшем обрабатывать. Способ может дополнительно включать этап полимеризации, включающий:

h) контакт нативного экстракта аллергена или депигментированного экстракта аллергена с альдегидом и

i) удаление молекул с молекулярным размером менее 100 кДа.

Альдегидом может быть любой подходящий альдегид, к примеру, глутаральдегид или формальдегид.

Этап полимеризации может включать:

h) контакт нативного экстракта аллергена или депигментированного экстракта аллергена с глутаральдегидом или формальдегидом,

i) подвержение экстракта этапу удаления молекулярной фракции для удаления молекул с молекулярным размером менее 100 кДа и

j) проведение этапа i) до тех пор, пока экстракт аллергена не будет иметь проводимость ниже 210 мкСм/см при 3-5°C и/или будет отсутствовать глутаральдегид для получения полимеризованного экстракта аллергена или депигментированного полимеризованного экстракта аллергена.

Если экстракт полимеризации лиофилизируют, его могут восстанавливать в буфере, например, 0,01М PBS/0,15M NaCl, до конечной концентрации 0,1-500 мг/мл, предпочтительно 1-100 мг/мл и наиболее предпочтительно 10-50 мг/мл.

Реакцию полимеризации предпочтительно осуществляют до завершения, так что полосы белка <100 кДа (например, 14-25 кДа) не обнаруживаются невосстанавливающим SDS-PAGE в полимеризованном экстракте. Заявителем экспериментально определено (см. таблицу 2), что два параметра влияют на оптимальные условия для полимеризации.

Во-первых, важна конечная концентрация глутаральдегида, при которой возрастающие концентрации глутаральдегида снижают выход полимера и увеличивают выход остатка, полученного путем центрифугирования перед диализом. В отличие от ранее известных условий полимеризации, применение концентрации глутаральдегида около 5 мг/мл (т.е., 0,009 мл глутаральдегида на мл экстракта аллергена), оптимальная концентрация глутаральдегида, как было экспериментально установлено, является примерно вдвое большей, чем известные количества, т.е. 10 мг/мл (0,02 мл глутаральдегида на мл экстракта аллергена). Альдегид могут добавлять в диапазоне 1-20 мг/мл. Несмотря на то, что использование ранее известных количеств конечной концентрации глутаральдегида может привести к некоторой полимеризации аллергенов, предпочтительно, когда альдегид добавляют до конечной концентрации 10 мг/мл или в соотношении 0,02 мл глутаральдегида на мл экстракта для достижения оптимальной полимеризации.

Во-вторых, заявителем установлено, что снижение скорости добавки глутаральдегида уменьшает выход полимера и увеличивает выход остатка. Альдегид можно добавлять к экстракту с постоянной скоростью, например, от 0,001 до 0,5 мл в минуту (1-500 мкл/мин, 60-3000 мкл/час).

Реакцию полимеризации можно поддерживать на срок от 1-12 ч, предпочтительно 7 часов при комнатной температуре. Реакцию полимеризации можно останавливать с использованием глицина в количестве 40 мг на мл полимеризованного раствора экстракта. Остановленную реакцию можно поддерживать в течение ночи при 3-5°C, предпочтительно при перемешивании. Полимеризованные аллергены в жидкой фазе можно отделять от нерастворимого остатка для получения полимеризованного экстракта аллергена или депигментированного полимеризованного экстракта аллергена. Этапом разделения является предпочтительно центрифугирование, хотя применимы многие способы разделения, при этом таковые хорошо известны специалистам в этой области. Предпочтительно, экстракт центрифугируют при температуре от 2 до 6°C, предпочтительно от 3 до 5°C, в течение достаточного времени для того, чтобы осадить нерастворимый остаток, в виде гранулы, например, от 1 минуты до 1 часа или в течение 1 часа. Супернатант (содержащий растворимые аллергены) можно собирать и подвергать этапу удаления молекулярной фракции (i).

На этапе i) молекулы, имеющие молекулярный размер менее 150 кДа, можно удалять. Молекулы с молекулярным весом более 3 мДа, как обнаружено, осаждаются, и также могут быть удалены во время этапа полимеризации.

Предпочтительно, этапом удаления молекулярной фракции является этап диализа, на котором экстракт диализируют против диализата, такого, как очищенная вода или буфер, при 3-5°C. Этап удаления молекулярной фракции можно продолжать до тех пор, пока проводимость, измеренная при 3-5°C не будет менее 200 мкСм/см, более предпочтительно менее 175 мкСм/см, более предпочтительно менее 150 мкСм/см, более предпочтительно менее 125 мкСм/см, более предпочтительно менее 100 мкСм/см, более предпочтительно от 50 до 200 мкСм/см и наиболее предпочтительно от 100 до 150 мкСм/см.

Полученный в результате экстракт аллергена можно фильтровать, например, с применением 0,45 мкм и/или 0,22 мкм размера пор, и могут замораживать или лиофилизировать