Способ повышения фармакологической активности действующего вещества лекарственного средства и фармацевтическая композиция

Способ повышения фармакологической активности действующего вещества лекарственного средства и фармацевтическая композиция

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для повышения фармакологической активности и терапевтической эффективности лекарственных средств на основе сверхразбавленных антител.

Известен способ усиления действия - потенцирования специфических эффектов лекарственного средства или вещества путем введения потенцирующего компонента в виде активированной - потенцированной формы того же лекарственного средства или вещества в сверхмалой дозе, приготовленного по гомеопатической технологии (RU 2253477 C1, А61К 45/00, 2005). Однако сложность определения лекарственных средств или действующих веществ, для которых данное решение может быть эффективно, ограничивают функциональные возможности данного способа.

Известна также фармацевтическая композиция для профилактики и лечения диабета, содержащая в качестве компонентов лекарственное средство с действующим веществом и усиливающим агентом (RU 2286148 С2, А61К 31/33, 2006), которая не применима для лечения других заболеваний.

Изобретение направлено на повышение фармакологической активности и терапевтической эффективности лекарственных средств, преимущественно на основе сверхразбавленных антител.

Решение поставленной задачи обеспечивается тем, что в способе повышения фармакологической активности действующего вещества лекарственного средства на основе активированной - потенцированной формы сверхразбавленных антител к антигену, участвующему в патогенезе заболевания, для которого применяют указанное лекарственное средство, путем введения - совмещения с усиливающим агентом, согласно изобретению усиливающим агентом является активированная - потенцированная форма сверхразбавленных антител к эндотелиальной NO-синтазе.

При этом лекарственное средство с действующим веществом и усиливающий агент на основе активированной - потенцированной формы сверхразбавленных антител к эндотелиальной NO-синтазе вводят одновременно и сочетанно в виде единого препарата - одной лекарственной формы, или совместно в виде различных препаратов.

Решение поставленной задачи обеспечивается также тем, что в фармацевтической композиции, содержащей в качестве компонентов лекарственное средство с действующим веществом и усиливающий агент, согласно изобретению усиливающим агентом является активированная - потенцированная форма сверхразбавленных антител к эндотелиальной NO-синтазе.

При этом действующее вещество представляет собой активированную - потенцированную форму сверхразбавленных антител к антигену, участвующему в патогенезе заболевания.

Причем активированную - потенцированную форму сверхразбавленных антител, используют в виде активированного - потенцированного водного или водно-спиртового раствора, полученного соответственно в процессе последовательного многократного разведения в водном или водно-спиртовом растворителе и промежуточного вертикального встряхивания матричного раствора антител к антигену, участвующему в патогенезе заболевания, для которого применяют указанное лекарственное средство, и к эндотелиальной NO-синтазе.

Кроме того, фармацевтическая композиция может быть выполнена в твердой лекарственной форме и содержать эффективное количество гранул нейтрального носителя, насыщенного смесью активированной - потенцированной формой антител к антигену, участвующему в патогенезе заболевания, для которого применяют указанное лекарственное средство, и активированную - потенцированную форму антител к эндотелиальной NO-синтазе, и фармацевтически приемлемые добавки, которые могут включать лактозу, целлюлозу микрокристаллическую и магния стеарат.

В соответствии с изобретением для лечения заболеваний предстательной железы в качестве действующего вещества используют активированную - потенцированную форму сверхразбавленных антител к простатоспецифическому антигену.

В соответствии с изобретением для лечения острых и хронических нарушений мозгового кровообращения, или синдрома дефицита внимания, или болезни Альцгеймера в качестве действующего вещества используют активированную - потенцированную форму сверхразбавленных антител к мозгоспецифическому белку S-100.

В соответствии с изобретением для лечения резистентности к инсулину в качестве действующего вещества используют активированную - потенцированную форму сверхразбавленных антител к C-концевом фрагменту β-субъединицы рецептора инсулина.

В соответствии с изобретением для лечения хронической сердечной недостаточности, или артериальной гипертензии I-II степени, или вегетососудистой дистонии в качестве действующего вещества используют активированную - потенцированную форму сверхразбавленных антител к C-концевому фрагменту AT₁-рецептора ангиотензина II.

Возможно сочетанное и одновременное введение в организм активированной - потенцированной формой антител к антигену, участвующему в патогенезе заболевания, для которого применяют указанное лекарственное средство, и активированную - потенцированную форму антител к эндотелиальной NO-синтазе, приготовленных по отдельности.

Технический результат заявленного решения с использованием активированной - потенцированной формы сверхразбавленных антител к эндотелиальной NO-синтазе в качестве усиливающего агента достигается предположительно за счет активации NO-синтазы, увеличения выработки оксида азота и может сопровождаться усилением внутриклеточной трансдукции сигнала от действующего вещества.

Кроме того, заявленное техническое решение расширяет арсенал препаратов, предназначенных для лечения заболеваний различной этиологии.

Для приготовления гомеопатически активированной потенцированной формы компонентов заявленной композиции используют моноклональные или преимущественно поликлональные антитела, которые могут быть получены по известным технологиям - методикам, описанным, например, в книге Иммунологические методы, под ред. Г. Фримеля, М.: Медицина, 1987, с.9-33; или, например, в статье Laffly E., Sodoyer R. Hum. Antibodies. Monoclonal and recombinant antibodies, 30 years after. - 2005 - Vol.14. - N 1-2. P.33-55.

Моноклональные антитела получают, например, с помощью гибридомной технологии. Причем начальная стадия процесса включает иммунизацию, основанную на принципах, уже разработанных при приготовлении поликлональных антисывороток. Дальнейшие этапы работы предусматривают получение гибридных клеток, продуцирующих клоны одинаковых по специфичности антител. Их выделение в индивидуальном виде проводится теми же методами, что и в случае поликлональных антисывороток.

Поликлональные антитела могут быть получены активной иммунизацией животных. Для этого по специально разработанной схеме животным делают серию инъекций требуемыми в соответствии с изобретением антигенами: антигеном, участвующем в патогенезе заболевания, для которого применяют указанное лекарственное средство, и эндотелиальной NO-синтазой. В результате проведения такой процедуры получают моноспецифические антисыворотки с высоким содержанием антител, которые используют для получения активированных - потенцированных форм. При необходимости проводят очистку антител, присутствующих в антисыворотке, например, методом аффинной хроматографии путем применения фракционирования солевым осаждением или ионообменной хроматографии.

Предпочтительным для приготовления заявленной фармацевтической композиции является использование поликлональных антител к антигену, участвующему в патогенезе заболевания, для которого применяют указанное лекарственное средство, и к эндотелиальной NO-синтазе, которые в качестве матричного (первичного) раствора с концентрацией 0,5÷5,0 мг/мл, используют для последующего приготовления активированной - потенцированной формы компонентов.

Предпочтительной для приготовления каждого компонента является использование смеси трех водно-спиртовых разведений первичного матричного раствора антител, разведенных соответственно в 100¹², 100³⁰, и 100²⁰⁰ раз, что соответствует сотенным гомеопатическим разведениям С12, С30 и С200.

Предпочтительным для приготовления заявленного лекарственного препарата является использование поликлональных антител к эндотелиальной NO-синтазе, которые могут быть получены иммунизацией кроликов следующим образом.

Пример 1.

Для лечения заболеваний предстательной железы используют фармацевтическую композицию, содержащую активированную - потенцированную форму сверхразбавленных антител к простатоспецифическому антигену и активированную - потенцированную форму сверхразбавленных антител к эндотелиальной NO-синтазе.

Для приготовления активированной - потенцированной формы антител были использованы антитела, приготовленные по заказу специализированной фармацевтической фирмой.

Поликлональные антитела к эндотелиальной NO-синтазе получают аналогичным вышеуказанным способом, используя в качестве иммуногена (антигена) для иммунизации кроликов адъювант и цельную молекулу эндотелиальной NO-синтазы следующей последовательности:

Возможно для получения поликлональных антител к эндотелиальной NO-синтазе использование в качестве иммуногена (антигена) цельной молекулы эндотелиальной NO-синтазы следующей последовательности:

Возможно для получения поликлональных антител к эндотелиальной NO-синтазе использование в качестве иммуногена (антигена) синтетического пептида эндотелиальной NO-синтазы, выбранного, например, из следующих аминокислотных последовательностей:

Перед отбором крови за 7-9 дней проводят 1-3 внутривенных инъекций для повышения уровня антител. В процессе иммунизации у кроликов отбирают небольшие пробы крови для оценки количества антител. Максимальный уровень иммунного ответа на введение большинства растворимых антигенов достигается через 40-60 дней после первой инъекции. После окончания первого цикла иммунизации кроликов в течение 30 дней дают восстановить здоровье и проводят реиммунизацию, включающую 1-3 внутривенные инъекции. Для получения антисыворотки из иммунизированных кроликов собирают кровь в центрифужную пробирку объемом 50 мл. С помощью деревянного шпателя удаляют со стенок пробирки образовавшиеся сгустки и помещают палочку в сгусток, образовавшийся в центре пробирки. Кровь помещают в холодильник (температура 4°C) на ночь. На следующий день удаляют сгусток, прикрепившийся к шпателю, и центрифугируют оставшуюся жидкость при 13000g в течение 10 мин. Супернатант (надосадочная жидкость) является антисывороткой. Полученная антисыворотка должна быть желтого цвета. Добавляют к антисыворотке 20% (весовая концентрация) NaN₃ до конечной концентрации 0,02% и хранят до использования в замороженном состоянии при температуре -20°C. Для выделения из антисыворотки антител к эндотелиальной NO-синтазе производят абсорбцию на твердой фазе в следующей последовательности:

1. 10 мл антисыворотки кролика разбавляют в 2 раза 0,15 М NaCl добавляют 6,26 г Na₂SO₄, перемешивают и инкубируют 12-16 ч при 4°C;

2. выпавший осадок удаляют центрифугированием, растворяют в 10 мл фосфатного буфера и затем диализуют против того же буфера в течение ночи при комнатной температуре;

3. после удаления осадка центрифугированием раствор наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенную фосфатным буфером;

4. фракцию антител определяют измеряя оптическую плотность элюата при 280 нм.

Затем производят очистку антител методом аффинной хроматографии путем прикрепления полученных антител к эндотелиальной NO-синтазе, который находится на нерастворимом матриксе с последующим элюированием концентрированными растворами соли.

Полученный таким образом буферный раствор поликлональных кроличьих антител к эндотелиальной NO-синтазе, очищенных на антигене, с концентрацией 0,5÷5,0 мг/мл, предпочтительно 2,5÷3,0 мг/мл, используют в качестве матричного (первичного) раствора для последующего приготовления активированной - потенцированной формы.

Поликлональные антитела к простатоспецифическому антигену получают по аналогичной вышеуказанной методике, используя в качестве иммуногена (антигена) для иммунизации кроликов адъювант и, например, простатоспецифический антиген с аминокислотной последовательностью (25-261):

Возможно для приготовления поликлональных антител к простатоспецифическому антигену использование в качестве иммуногена (антигена) для иммунизации кроликов адъювант и, например, один полипептидный фрагмент простатоспецифического антигена из следующих последовательностей:

Активированную - потенцированную форму каждого компонента готовят путем равномерного уменьшения концентрации в результате последовательного разведения 1 части упомянутого матричного раствора в 9 частях (для десятичного разведения), или в 99 частях (для сотенного разведения), или в 999 частях (для тысячного разведения) нейтрального растворителя с многократным вертикальным встряхиванием (″динамизацией″) каждого полученного разведения и использованием отдельных емкостей для каждого последующего разведения до получения требуемой потенции - кратности разведения по гомеопатическому методу (см., например, В. Швабе. ″Гомеопатические лекарственные средства. М., 1967 г., с.14-29).

Внешнюю обработку в процессе уменьшения концентрации также можно осуществлять ультразвуком, электромагнитным или иным физическим воздействием.

Например, для приготовления 12-го сотенного разведения С12 одну часть упомянутого матричного раствора антител к простатоспецифическому антигену (ПСА) (или к NO-синтазе) с концентрацией 3,0 мг/мл разводят в 99 частях нейтрального водного или водно-спиртового растворителя (преимущественно 70% этилового спирта) и многократно (10 и более раз) вертикально встряхивают - потенцируют полученное 1-е сотенное С1 разведение. Данную операцию повторяют 11 раз, получая 12-е сотенное разведение С12. Таким образом, 12-е сотенное разведение С12 представляет собой раствор, полученный разбавлением последовательно в разных емкостях 12 раз 1-ой части исходного матричного раствора антител к простатоспецифическому антигену (ПСА) с концентрацией 3,0 мг/мл в 99-и частях нейтрального растворителя, т.е. раствор, полученный сверхразведением матричного раствора в 100¹² раз. Аналогичные операции с соответствующей кратностью разведения проводят для получения разведений С30 и С200.

При использовании в качестве биологически активного жидкого компонента смеси различных гомеопатических, преимущественно сотенных, разведений, действующего вещества каждый компонент состава (например, С12, С30, С200) приготовляют раздельно по описанной выше технологии до их предпоследнего разведения (соответственно до получения С11, С29, С199) и затем вносят в соответствии с составом смеси в одну емкость по одной части каждого компонента и смешивают с требуемым количеством растворителя (соответственно с 97 частями для сотенного разведения). При этом получают активированную - потенцированную форму антител к простатоспецифическому антигену (ПСА) в сверхмалой дозе каждого компонента, приготовленной из матричного раствора, разведенного в 100¹², в 100³⁰, в 100²⁰⁰, что эквивалентно смеси сотенных гомеопатических разведений С12, С30, С200.

Возможно использование действующего вещества в виде смеси других различных гомеопатических разведений, например десятичных и/или сотенных (D20, С30, С100 или С12, С30, С50 и т.д.), эффективность которых определяют экспериментально.

При потенцировании вместо встряхивания в процессе уменьшения концентрации также можно осуществлять внешнее воздействие ультразвуком, электромагнитным или иным физическим воздействием.

Для получения заявленной фармацевтической композиции водные или водно-спиртовые растворы действующих компонентов смешивают преимущественно в соотношении 1:1 и используют в жидкой лекарственной форме.

Заявленная фармацевтическая композиция может быть использована и в твердой лекарственной форме, которая содержит эффективное количество гранул нейтрального носителя - лактозы, насыщенного путем пропитывания до насыщения смесью водных или водно-спиртовых растворов активированной - потенцированной формой антител к простатоспецифическому антигену (ПСА) и активированную - потенцированную форму антител к эндотелиальной NO-синтазе, и фармацевтически приемлемые добавки, включающие преимущественно лактозу, целлюлозу микрокристаллическую и магния стеарат.

Для получения твердой оральной формы заявленного лекарственного средства производят в установке кипящего слоя (например, типа «Hüttlin Pilotlab» производства компании Hüttlin GmbH) орошение до насыщения вводимых в псевдоожиженный - кипящий слой гранул нейтрального вещества - лактозы (молочного сахара) с размером частиц 150÷300 мкм, предварительно полученным водным или водно-спиртовым раствором, содержащим смесь гомеопатически активированных - потенцированных форм антител к антигену, участвующему в патогенезе конкретного заболевания, для которого применяют указанное лекарственное средство, и к эндотелиальной NO-синтазе преимущественно в соотношении 1 кг раствора антител на 5 или 10 кг лактозы (1:5 - 1:10) с одновременной сушкой в потоке подаваемого под решетку нагретого воздуха при температуре не выше 40°C. Расчетное количество 0,17÷0,45 от массы твердой оральной формы) высушенных гранул, насыщенных активированной - потенцированной формой антител, загружают в смеситель и смешивают с микрокристаллической целлюлозой, вводимой в количестве 2÷5 масс. частей от общей массы загрузки - от массы твердой оральной формы. Затем в эту смесь добавляют 10÷45 масс. частей от общей массы загрузки «ненасыщенной» чистой лактозы (для снижения стоимости и некоторого упрощения и ускорения технологического процесса без снижения эффективности лечебного воздействия), стеарат магния в количестве 0,1÷0,3 масс. частей от общей массы загрузки и микрокристаллическую целлюлозу в количестве 2÷5 масс. частей от общей массы загрузки. Полученную таблеточную массу равномерно перемешивают и таблетируют прямым сухим прессованием (например, в таблет-прессе Korsch - XL 400) с формированием круглых таблеток массой 150÷500 мг. Масса таблетки может составлять 150÷500 мг. Предпочтительно использовать таблетки массой 250÷300 мг, которые включают 3,0÷6,0 мг/табл. активированной - потенцированной формы водно-спиртовых разведений субстанции - действующего вещества поликлональных кроличьих антител к эндотелиальной NO-синтазе и к простатоспецифическому антигену, очищенных на антигене в сверхмалой дозе каждого компонента, приготовленной из матричного раствора, разведенного в 100¹², в 100³⁰, в 100²⁰⁰, что эквивалентно смеси сотенных гомеопатических разведений С12, С30, С200.

Предпочтительно заявленную фармацевтическую композицию рекомендуется принимать по 1-2 таблетке 2-4 раза в день.

Пример 1.

Исследование влияния комплексного препарата, в состав которого входят активированные - потенцированные формы поликлональных аффинно очищенных кроличьих антител к мозгоспецифическому белку S-100 (анти-S100) и к эндотелиальной NO-синтазе (анти-eNOS) в сверхмалых дозах (СМД), полученных сверхразведением исходного матричного раствора (концентрацией 2,5 мг/мл) в 100¹², 100³⁰, 100²⁰⁰ раз, эквивалентных смеси сотенных гомеопатических разведений С12, С30, С200, в соотношении 1:1 (СМД анти-S100+анти-eNOS), а также компонентов, входящих в его состав - активированной - потенцированной формы поликлональных кроличьих антител к мозгоспецифическому белку S-100, очищенных на антигене, в сверхмалой дозе (СМД анти-S100), полученной сверхразведением исходного матричного раствора в 100¹²,100³⁰, 100²⁰⁰ раз, эквивалентной смеси сотенных гомеопатических разведений С12, С30, С200 и активированной - потенцированной формы поликлональных кроличьих антител к эндотелиальной NO-синтазе, очищенных на антигене, в сверхмалой дозе (СМД анти-eNOS), полученной сверхразведением исходного матричного раствора в 100¹², 100³⁰, 100²⁰⁰ раз, эквивалентной смеси сотенных гомеопатических разведений С12, С30, С200, проводили in vitro на связывание стандартного лиганда [³H]пентазоцина с рекомбинантным сигма 1 рецептором человека оценивали радиолигандным методом.

Сигма-1 рецептор - внутриклеточный рецептор, локализованный в клетках центральной нервной системы, клетках большинства периферических тканей и иммунокомпетентных клетках. Рецепторы демонстрируют уникальную способность транслоцироваться, которая вызывается множеством психотропных препаратов. Динамика сигма-1 рецепторов непосредственно связана с различными влияниями, осуществляемыми препаратами при действии на сигма-1 рецепторы. Эти влияния включают регуляцию каналов активности, экоцитоз, передачу сигналов, ремоделирование плазменной мембраны (формирование рафтов) и транспортировку липидов/метаболизм. Все это может способствовать развитию пластичности нейронов в мозге. Имеются доказательные данные, что сигма-1 рецепторы оказывают модулирующее влияние на все основные нейромедиаторные системы: норадренергическую, серотонинергическую, дофаминергическую, холинергическую системы и NMDA-регулируемые глутаматные эффекты. Сигма-1 рецептор играет важную роль в патофизиологии нейроденегенративных заболеваний, в том числе Альцгеймера, участвует в процессах обучения и памяти. В связи с этим способность лекарственных средств оказывать влияние на эффективность взаимодействия лигандов с сигма-1 рецептором указывает на наличие нейропротекторного, противоишемического, анксиолитического, антидепрессивного, антиастенического компонентов в спектре их фармакологической активности, что позволяет рассматривать данные препараты в качестве эффективных лекарственных средств, в том числе для лечения цереброваскулярных заболеваний.

В качестве контроля тестируемых препаратов была протестирована потенцированная дистиллированная вода (смесь гомеопатических разведений С12+С30+С200).

В опыте (для измерения общего связывания) в инкубационную среду вносили 20 мкл комплексного препарата СМД анти-S100+анти-eNOS или по 10 мкл СМД анти-S100 или 10 мкл СМД анти-eNOS. Таким образом, количество СМД анти-S100+анти-еNOS, вносимых в экспериментальную лунку при тестировании комплексного препарата, было идентично количеству СМД анти-S100 и СМД анти-eNOS тестируемых в качестве монопрепаратов, что позволяет провести сравнение эффективности комплексного препарата с его отдельными компонентами, входящими в его состав. Потенцированную дистиллированную воду вносили в инкубационную среду в объеме 20 мкл и 10 мкл.

Затем вносили 160 мкл (~200 мкг белка) гомогената мембран клеток линии Jurkat (линия лейкемических Т-лимфоцитов человека), и в последнюю очередь 20 мкл радиолиганда, меченного тритием [³H]пентазоцин (15 нМ).

Для измерения неспецифического связывания вместо препаратов или потенцированной воды в инкубационную среду вносили 20 мкл немеченого лиганда - галоперидола (10 мкМ).

Радиоактивность измеряли на сцинтилляционном счетчике (Topcount, Packard) с использованием сцинтилляционной смеси (Microscint 0, Packard) после инкубации в течение 120 минут при температуре 22°C в 50 мМ Tris-HCl буфере (pH=7,4) и фильтрации на стекловолоконных фильтрах (GF/B, Packard). Специфическое связывание (в опыте или контроле) рассчитывали как разницу между общим (в опыте или контроле) и неспецифическим связыванием.

Результаты представлены в виде процента ингибирования специфического связывания в контроле (в качестве контроля использовали дистиллированную воду) (Таблица 1).

Результаты, отражающие ингибирование выше 50%, представляют собой значительные эффекты исследуемых соединений; ингибирование от 25% до 50% - свидетельствуют об эффектах от слабого до умеренного; ингибирование менее 25% - считаются незначительными эффектами исследуемого соединения и находятся в пределах уровня фона.

Таким образом, в условиях данной экспериментальной модели показано, что: комплексный препарат СМД анти-S100+анти-eNOS более эффективно, чем отдельные его компоненты (СМД анти-S100 и СМД анти-eNOS) ингибирует связывание стандартного радиолиганда [³H]пентазоцина с рекомбинантным сигма 1 рецептором человека; СМД анти-S100, внесенные в экспериментальную лунку в объеме 10 мкл, ингибируют связывание стандартного радиолиганда [³H]пентазоцина с рекомбинантным сигма 1 рецептором человека, но выраженность эффекта уступает выраженности эффекта комплексного препарата СМД анти-S100+анти-eNOS; СМД анти-eNOS, внесенные в экспериментальную лунку в объеме 10 мкл, не оказывали влияния на связывание стандартного радиолиганда [³H]пентазоцина с рекомбинантным сигма 1 рецептором человека; потенцированная вода, внесенная в экспериментальную лунку в объеме 10 мкл или 20 мкл, не оказывала влияния на связывание стандартного радиолиганда [³H]пентазоцина с рекомбинантным сигма 1 рецептором человека.

Пример 2.

Эффективность препаратов при скополаминовой амнезии у крыс (модель болезни Альцгеймера).

Болезнь Альцгеймера (БА) является нейродегенеративным заболеванием и характеризуется снижением когнитивных функций, ухудшением памяти, спутанностью сознания, изменениями эмоционального фона. Хотя основной причиной развития данной патологии в настоящее время считается накопление бета-амилоида, приводящее к образованию бета-амилоидных бляшек и нейрофибриллярных клубков в тканях мозга, БА также сопровождается дефицитом холинэргической системы. На этом основан один из наиболее распространенных способов моделирования БА у животных с помощью антагониста холинергической системы скополамина. Введение скополамина экспериментальным животным (обычно крысам или мышам) нарушает способность к обучению и приводит к ухудшению памяти.

Для оценки когнитивных функций крыс и мышей используют различные методы, в частности водный лабиринт Морриса. Суть этого теста состоит в том, что в сосуде с непрозрачной водой животные, выпускаемые в воду с разных точек, вынуждены искать скрытую неподвижную платформу. Преимуществом этого метода является то, что он позволяет как наблюдать за процессом обучения животного (формирование у него представления о пространственном расположении платформы независимо от того, в каком месте его опустили в воду), так и оценивать прочность запоминания (для этого проводят тест-пробу, когда платформу вынимают).

В Примере 2 изучали эффективность при скополаминовой амнезии у крыс заявленного лекарственного средства в виде композиции, содержащей активированные - потенцированные формы поликлональных аффинно очищенных на антигене кроличьих антител к мозгоспецифическому белку S-100 (анти-S100) и к эндотелиальной NO-синтазе (анти-eNOS) в сверхмалых дозах (СМД), полученных сверхразведением исходного матричного раствора (с концентрацией 2,5 мг/мл) в 100¹², 100³⁰, 100²⁰⁰ раз, эквивалентных смеси сотенных гомеопатических разведений С12, С30, С200 (СМД анти-S100+анти-eNOS).

В исследовании эффективности препарат СМД анти-S100+анти-eNOS при скополаминовой амнезии у крыс (модель болезни Альцгеймера) было использовано 48 крыс-самцов линии Rj: Wistar (Нап) (масса 180-280 г). В течение 4 дней крысам подкожно вводили физиологический раствор (n=12, интактные) или скополамин в дозе 0,5 мг/кг (n=36) (скополамин-индуцированная амнезия). Крыс со скополамин-индуцированной амнезией разделили на 3 группы и вводили им соответственно дистиллированную воду (7,5 мл/кг, n=12, контроль, группа №1), СМД анти-S100 (7,5 мл/кг, n=12, группа №2) и СМД анти-S100+анти-eNOS (7,5 мл/кг, n=12, группа №3) внутрижелудочно в течение 9 дней (4 дня до начала инъекций скополамина, 4 дня на фоне введения скополамина и 1 день после окончания введения скополамина).

В течение 4 дней введения скополамина через 60 минут после введения тестируемых препаратов и 30 минут после введения скополамина проводили обучающую сессию в лабиринте Морриса (4 последовательных теста с интервалом 60 сек). Лабиринт Морриса представляет собой круглый сосуд (диаметром 150 см, высотой 45 см), на 30 см заполненную водой (26-28°C). В 18 см от края сосуда находится скрытая платформа (диаметром 15 см), утопленная на 1,5 см ниже уровня воды. Воду делают мутной, добавляя в нее нетоксичный краситель (например, молочный порошок), что делает платформу невидимой. Для каждого теста животное помещали в лабиринт в одной из начальных точек, находящихся на одинаковом расстоянии от скрытой платформы, и давали им возможность найти ее. Если животное не могло найти платформу за 120 секунд, его ставили на платформу на 60 секунд и затем начинали новый тест. В ходе 4 испытаний в случайном порядке животные начинали прохождение по лабиринту дважды с каждой исходной точки. Испытания записывали на видеопленку, а затем анализировали расстояние, преодоленное в поисках платформы в каждом испытании, и латентный период поиска платформы.

На 5 день проводили пробу: платформу убирали из лабиринта и крысе давали свободно плавать на протяжении 60 секунд. Регистрировали время, проведенное в том месте, где раньше находилась платформа.

Введение скополамина значительно ухудшало способность животных к обучению: в контрольной группе №1 время, затраченное животными на поиск платформы и расстояние, которое животные проплыли в поисках платформы, значительно увеличивались (Таблицы 2, 3). Проба показала, что и память животных контрольной группы №1 значительно ухудшилась: в месте, где раньше находилась платформа, они находились меньше времени, чем интактные крысы (Таблица 4). Введение СМД анти-S100 в группе №2 не приводило к улучшению исследованных параметров (Таблицы 2, 3, 4). Введение СМД анти-S100+анти-eNOS в группе №3 приводило к некоторому улучшению обучения, которое выражалось в укорочении латентного времени поиска платформы (Таблица 2) и преодоленного расстояния (Таблица 3) в течение 4 дней обучения, и улучшению памяти, что выражалось в увеличении времени, проведенного в месте, где была платформа (Таблица 4).

Таким образом, в использованной модели болезни Альцгеймера применение комплекса СМД анти-S100+анти-eNOS было более эффективным по сравнению с изолированным введением СМД анти-S100.

Пример 3.

В нижеприведенном исследовании изучали эффективность активированных - потенцированных форм поликлональных аффинно очищенных на антигене кроличьих антител к мозгоспецифическому белку S-100 (анти-S100) и к эндотелиальной NO-синтазе (анти-eNOS) в сверхмалых дозах (СМД), полученных сверхразведением исходного матричного раствора (с концентрацией 2,5 мг/мл) в 100¹²,100³⁰, 100²⁰⁰ раз, эквивалентных смеси сотенных гомеопатических разведений С12, С30, С200 (СМД анти-S100+анти-eNOS) при лечении ишемического инсульта у крыс, вызванного фототромбозом префронтальной коры головного мозга.

Острое нарушение мозгового кровообращения (инсульт) занимает третье место среди причин смертности в развитых странах и является одной из ведущих причин развития нетрудоспособности (Гусев Е.И., 2003; Janardhan V., Qureshi A.I., 2004).

Модель фотоиндуцированного тромбоза отвечает практически всем требованиям, предъявляемым к экспериментальным моделям фокальной ишемии головного мозга. Методика, разработанная Ватсоном (Watson В. et al., 1985), основана на том, что при действии света с длиной волны 560 нм на введенный в кровоток фотосенсибилизированный краситель бенгальский розовый (Bengal rose) образуются активные формы кислорода, под действием которых увеличивается адгезивность клеток эндотелия и тромбоцитов и формируются тромбы, закрывающие просвет сосудов. Методика воспроизведения ишемической патологии при помощи фотоиндуцированного тромбоза технически проста и максимально приближена к клиническим формам ишемического инфаркта головного мозга. Большим преимуществом этой модели перед другими является то, что она является неинвазивной, т.е. не требует трепанации черепа и, таким образом, более точно воспроизводит клиническую патологию, возникающую при тромбозе сосудов головного мозга.

В исследовании эффективности препарата СМД анти-S100+анти-eNOS у крыс с ишемическим инсультом, вызванным фототромбозом префронтальной коры головного мозга, было использовано 37 крыс-самцов линии Вистар (вес 150-180 г; 2-3 мес). Двустороннее фокальное ишемическое повреждение в префронтальной коре головного мозга крыс вызывали методом фотохимического тромбоза по Watson (Watson В.D. et al., 1985) в модификации И.В. Викторова (Романова Г.А. и соавт., 1998). Крысам (n=37) под наркозом (хлоралгидрат 300 мг/кг, внутрибрюшинно) в яремную вену вводили 3% раствор красителя (бенгальский розовый 40 мг/кг). С помощью оптоволоконного световода диаметром 3 см луч света от галогеновой лампы (24 В, 250 Вт) подводили к поверхности черепа над областью лобной коры левого и правого полушария головного мозга, индуцируя фототромбоз. Ложнооперированным крысам (n=6) в тех же условиях проводили все вышеописанные манипуляции за исключением введения красителя и облучения светом галогеновой лампы. Интактная группа включала 6 крыс.

Крысам с фототромбозом в течение 5 дней до индукции инсульта и 9 дней после внутрижелудочно вводили дистиллированную воду (контроль-фототромбоз, n=12), СМД анти-S100 (n=7) или СМД анти-S100+анти-eNOS (n=6) в дозе 5 мл/кг. На 8 день после операции (или ложной операции) для оценки способности к обучению и памяти у всех крыс проводили тест условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ). Крыс помещали в установку, которая состоит из освещенной площадки и соединенной с ней затемненной камеры, на пол которой подается электроболевое раздражение силой 0,45 мА, в результате чего предпочитаемая в норме затемненная камера становилась опасной. На следующие сутки проводили тестирование выработки условного рефлекса пассивного избегания. Для этого крыс помещали на освещенную площадку и регистрировали латентный период первого захода в темную камеру. Если крыса долго не заходила в темную камеру, делали вывод о том, что она помнит об опасности (электроболевом раздражении). Чем дольше латентный период захода в камеру, тем лучше сохранность памяти, которая нарушается после инсульта, вызванного фототромбозом.

На 9 день после операции у части крыс экспериментальных групп оценивали объем зоны инсульта в морфометрическом исследовании.

У крыс контрольной группы фототромбоз приводил к образованию обширной зоны инсульта и, как следствие, ухудшению памяти - ухудшению воспроизведения УРПИ на 9,6% по сравнению с интактными крысами и на 22,9% по сравнению с ложнооперированными (Таблица 5). Введение СМД анти-S100 сокращало площадь очага инсульта на 42,2% и улучшало память на 14,0% по сравнению с контролем-фототромбозом. Введение СМД анти-S100+анти-eNOS было более эффективным: в этой группе очаг инсульта был меньше на 44,0%, а воспроизведение условного рефлекса - на 33,4% лучше, чем в группе контроль-фототромбоз.

Таким образом, применение комплексного препарата СМД анти-S100+анти-eNOS было более эффективным, чем введение монопрепарата СМД анти-S100.

Пример 4.

В нижеприведенном исследовании изучали эффективность активированных - потенцированных форм поликлональных аффинно очищенных на антигене кроличьих антител к мозгоспецифическому белку S-100 (анти-S100) и к эндотелиальной NO-синтазе (анти-eNOS) в сверхмалых дозах (СМД), полученных сверхразведением исходного матричного раствора (с концентрацией 2,5 мг/мл) в 100¹², 100³⁰, 100²⁰⁰ раз, эквивалентных смеси сотенных гомеопатических разведений С12, С30, С200 (СМД анти-S100+анти-eNOS) при лечении ишемического инсульта у крыс, вызванного фототромбозом префронтальной коры головного мозга.

Острое нарушение мозгового кровообращения (и