Способ криоконсервации клеток, искусственные клеточные конструкции или трехмерные сложные комплексы тканей

Способ криоконсервации клеток, искусственные клеточные конструкции или трехмерные сложные комплексы тканей

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области криоконсервации клеток и культур тканей, более конкретно оно относится к способу криоконсервации и длительного хранения клеток, клеточных конструкций или трехмерных сложных комплексов тканей. Способ основан на применении коллагенового клеточного носителя, имеющего специфический состав, а также определенную толщину и соответствующие механические свойства, которые сохраняются после размораживания. Применение такого коллагенового клеточного носителя (CCC) создает подходящую основу для криоконсервации, что проявляется в очень высокой выживаемости после процесса размораживания и позволяет получать клетки и комплексы тканей, которые уже прикреплены к механически прочному и биологически совместимому каркасу.

Изобретение также относится к замороженным комплексам клеток-коллагенового носителя и к замороженным искусственным клеточным конструкциям или трехмерным сложным комплексам тканей, которые могут быть получены в соответствии со способом изобретения, а также к их применению после размораживания.

Уровень техники

Криоконсервация

Криоконсервация играет важную роль в кратковременном и долговременном сохранении клеток и, таким образом, имеет центральное значение в хранении клеток и тканей. Замороженные клетки, такие как человеческие гематопоэтические стволовые клетки, успешно пересаживали в стандартной клинической терапии лейкоза в течение нескольких десятилетий. Все чаще основанные на клетках способы лечения, в которых используются замороженные ткани, применяются также и в других областях регенеративной медицины. Большой потенциал подобных методов растет, поскольку новые открытия приводят к созданию новых продуктов для клинического применения.

При помощи криотехнологии суспензии клеток адгерентные клетки и даже искусственно создаваемые ткани могут быть сделаны доступными «точно в срок» благодаря банкам клеток. Впрочем, выполнение подобных проектов требует доступности соответствующих тканей, регенерированных из клеток, а также систем криоконсервации, с помощью которых адгерентные клетки или сложные комплексы тканей могут быть получены и сохранены в их естественной трехмерной форме, в точно контролируемых, воспроизводимых и рентабельных условиях.

Для защиты клеток в процессах замораживания и размораживания в среду для замораживания добавляют специальные соединения, такие как диметилсульфоксид (ДМСО), трегалозу, глицерин или гидроксиэтилкрахмал (ГЭК).

Указанные так называемые криопротекторы предохраняют клетки и их органеллы от повреждения мембран кристаллами льда и от внутриклеточной дегидратации во время перехода воды из жидкой в кристаллическую фазу. Известно, что замораживание и размораживание связаны с потерей жизнеспособности и функций в клетках, причем степень потери зависит от типа замораживаемой клетки. В стандартных методиках диметилсульфоксид используют при концентрациях до 10% (об/об), отдельно или в комбинации с гидроксиэтилкрахмалом. ДМСО работает, прежде всего, во внутриклеточном компартменте, снижая температуру замерзания, что уменьшает формирование кристаллов льда и, таким образом, минимизирует клеточную дегидратацию во время замораживания. Напротив, такие макромолекулы, как гидроксиэтилкрахмал, действуют внеклеточно, формируя на клетках защитное покрытие и предотвращая потерю жидкости из клеток в процессе замораживания.

Клеточные носители

В дополнение к криопротекторам в процессе криоконсервации основное значение также имеет правильный тип клеточного носителя. В идеальном случае его толщина должна быть приблизительно равна толщине клеток, колонизирующих его, то есть менее 150 мкм. Из-за своей более высокой теплоемкости клеточные носители с большей толщиной могут действовать как буфер, в особенности в процессе замораживания и размораживания, создавая температурный градиент, который отрицательно воздействует на стандартизированные скорости замораживания или размораживания. Воспроизводимость и стандартизация становятся еще более важными, когда требуется законсервировать чувствительные и дорогостоящие клетки, сложные клеточные комплексы или регенерированные из клеток ткани. Скорость замораживания или размораживания и окружающее давление помогают определить степень, в которой происходит кристаллизация при достижении температуры замерзания. Кроме того, нужно учитывать, что кристаллизация также может происходить в материале клеточных носителей с определенной способностью абсорбировать жидкости. Более тонкие клеточные носители обладают дополнительным преимуществом, поскольку криопротекторы быстро проникают внутрь. Ряд материалов использовали в качестве клеточного носителя для культивирования и/или криоконсервации клеток или ткани. Гиалуроновая кислота, альгинат, агароза, фибрин, хитин/хитозан, полилактид (PLA), полигликолид (PGA) или поли-L-молочная кислота (PPLA) являются некоторыми из материалов, которые известны в уровне техники в качестве матрицы или носителя для культивирования и/или криоконсервации клеток.

Коллагенсодержащие носители широко применялись в качестве матрицы для культивирования клеток, а также для их криоконсервации. Коллаген является одним из основных компонентов в структуре соединительных тканей, например кожи, кровеносных сосудов, связок, сухожилий и хрящей, а также в структурах костей и зубов. На настоящий момент идентифицировано более 28 различных типов коллагена, проявляющих лишь незначительные различия между отдельными видами. Данный факт, наряду с тем фактом, что разложение коллагена не приводит к образованию токсичных продуктов разложения, делает коллаген биологически совместимым и крайне ценным в медицине.

Впрочем, коллагеновые клеточные носители, применяемые на данный момент для криоконсервации адгерентных клеток, обычно находятся в форме гидрогелей, то есть гелеобразного материала с высокой вязкостью и чрезвычайно высоким содержанием воды. Указанные гидрогели на основе коллагена обычно применялись для криоконсервации в различных конформациях. Наиболее распространенная и самая простая конформация представляет собой монослой, то есть клетки или ткань непосредственно посеяны в культуральные планшеты, покрытые монослоем простого коллагенового геля. Другой широко используемой конформацией для криоконсервации клеток или тканей в гидрогелях на основе коллагена является сэндвич-конформация, то есть клетки криоконсервируют между двумя слоями коллагенового геля.

Тем не менее указанные гидрогели на основе коллагена имеют недостаток, связанный с тем, что обычно их толщина превышает 150 мкм, что отрицательно влияет на жизнеспособность клеток после размораживания по указанным выше причинам. Кроме того, чистые коллагеновые гидрогели не обладают достаточной механической прочностью, позволяющей выполнять контролируемый перенос конструкции в организм после размораживания.

Таким образом, существует потребность в разработке способов криоконсервации клеток, клеточных конструкций или сложных комплексов тканей, поддерживаемых клеточными носителями, обладающими достаточной механической прочностью после размораживания. Это могло бы позволить, в случае регенеративной медицины, проводить прямую пересадку и иммобилизацию конструкции клеток-носителя в поврежденном организме, но с сохранением в то же время положительного эффекта в части биосовместимости и способности к разложению, уже известных для коллагеновых носителей.

Все механически прочные матрицы-носители, доступные на данный момент для криоконсервации адгерентных клеток, основаны на синтетических или комплексных материалах или имеют толщину более 150 мкм. Включение клеток в синтетические клеточные носители не происходит или возможно только до ограниченной степени.

Способы криоконсервации клеток, клеточных конструкций и комплексов тканей, предложенные в настоящей заявке, основаны на характеристиках недавно разработанной, простой и стандартизированной коллагеновой мембраны (CCC), которая обладает комбинацией высокой механической прочности и исключительной тонкости. CCC представляет собой биоразлагаемый клеточный носитель для криоконсервации, который позволяет проводить недеструктивное замораживание адгерентных клеток, а также легкий перенос клеточной конструкции после размораживания. Получение CCC, применяемого в способе, описанном в настоящей заявке, раскрыто в заявке PCT/EP/2008/006660.

Краткое описание фигур

Фиг.1: изображение поверхности CCC под микроскопом. A: электронно-микроскопическое изображение поверхности. Масштабная метка: 500 мкм. B: поперечный срез мембраны. Масштабная метка: 10 мкм.

Фиг.2: A: сила при растяжении CCC. Сплошная линия: сухой CCC, пунктирная линия: влажный CCC. B: показана установка для испытания на растяжение. C: геометрические параметры тестируемого образца.

Фиг.3: A: криовставка для культивирования адгерентных клеток (лежит на боку) и пробирки для криоконсервации, в которые устанавливается вставка. B: криовставка с мембраной-носителем на основе коллагена.

Фиг.4: A/B: окрашивание DAPI ядер мезенхимальных стволовых клеток (MSC) на верхней стороне мембраны (A) и клеток Caco-2 на нижней (B). Изображение получено с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа. Масштабные метки: 100 мкм. C: комбинированное иммуноцитохимическое окрашивание MSC (виментин, красный) и клеток Caco-2 (цитокератин, зеленый). Трехмерная реконструкция с помощью флуоресцентного лазерного растрового микроскопа. Масштабная метка: 50 мкм.

Фиг.5: A: культура эмбриональных мышиных кардиомиоцитов на CCC. Иммуноцитохимия альфа-актинина через 7 дней культивирования. B: иммуноцитохимия альфа-актинина криоконсервированных кардиомиоцитов. Эмбриональные мышиные кардиомиоциты культивировали на коллагеновом клеточном носителе и хранили в течение 3 недель в жидком азоте. Масштабная метка: 20 мкм.

Фиг.6: иммуноцитохимия виментина и BrdU криоконсервированных клеток SAOS-2. Клетки культивировали на коллагеновом клеточном носителе и хранили в течение 230 дней в жидком азоте. После размораживания клетки культивировали с BrdU и подвергали иммуноцитохимическому анализу. Стрелки указывают BrdU-положительные клетки. Масштабная метка: 40 мкм.

Описание изобретения

Первый объект настоящего изобретения относится к способу криоконсервации и длительного хранения одного или нескольких типов клеток, клеточных конструкций или трехмерных сложных комплексов тканей, включающему:

a) посев одного или нескольких типов клеток или различных типов клеток, соответствующих клеточным конструкциям или трехмерным комплексам тканей, на стабильный коллагеновый клеточный носитель (CCC), имеющий толщину менее 150 мкм, массу на единицу площади 10-170 г/м² и следующий состав:

i) коллаген [% по весу]: от 30 до 80,

ii) амидный азот [% по весу]: от 0,06 до 0,7,

iii) полиол [% по весу]: от 0 до 50,

iv) липиды [% по весу]: от 0 до 20,

v) вода [% по весу]: от 5 до 40,

b) культивирование клеток до их адгезии к CCC,

c) удаление неадгерентных клеток с помощью промывки,

d) замораживание коллагенового клеточного носителя с адгерентными клетками в среде для замораживания.

Способ криоконсервации настоящего изобретения представляет особый интерес, поскольку он позволяет замораживать адгерентные клетки, или клеточные конструкции, или трехмерные комплексы тканей, которые после размораживания остаются прикрепленными к CCC. Комплекс CCC-клетки, или клеточная конструкция, или трехмерная тканевая конструкция, присоединенная к механически прочной подложке из коллагеновой пленки, могут быть разморожены при необходимости и предоставлены непосредственно в момент их применения или использования.

В способах предшествующего уровня техники перед замораживанием адгерентные клетки обычно отделяли от поверхности клеточной культуры при использовании протеаз, таких как трипсин, промывали в нескольких стадиях центрифугирования, а затем замораживали после добавления среды для криоконсервации. При необходимости клетки размораживали и сеяли на чашки. В других способах предшествующего уровня техники клетки замораживали в носителе или прикрепляли к нему, а после размораживания отделяли от поверхности носителя и выделяли с помощью аналогичных процессов. Тем не менее и обработка протеазами с сопутствующей деструкцией межклеточного контакта и контакта клетка-субстрат, и механический стресс при центрифугировании и пипетировании приводят к пониженным уровням выживаемости или повреждению клеток.

Криоконсервация адгерентных клеток, растущих на биологически совместимой мембране-носителе, как в способе настоящего изобретения, обладает большим преимуществом по сравнению со способами выделения клеток, поскольку больше не требуется отделять клетки от поверхности, на которой их выращивали. Это увеличивает и выживаемость, и жизнеспособность клеток после размораживания. В особенности это относится к криоконсервации чувствительных клеток, таких как первичные кардиомиоциты или клетки печени. Высокая выживаемость согласно способу настоящего изобретения также обеспечивает преимущество, которое заключается в том, что небольшие количества клеток могут быть подвергнуты глубокой заморозке. Это, опять же, является отличием от способов выделения клеток, в которых минимальное количество клеток составляет 100000, и оно необходимо для получения видимого осадка клеток после центрифугирования, который можно перенести в свежую питательную среду, а затем посеять.

Конкретный вариант или вариант осуществления способа изобретения включают посев и культивирование одного или нескольких типов клеток на каждой стороне коллагенового клеточного носителя с целью получения их определенной пространственной конформации на обеих сторонах коллагеновой пленки. Данный вариант способа может применяться при создании конформаций сложных тканей. Промежуточный слой коллагена обеспечивает временную подложку для многослойной клеточной системы, состоящей из различных клеток. Контролируемое послойное расположение клеток с индивидуальными характеристиками и получаемой в результате функциональностью создает основу для создания сложных in vivo-подобных клеточных систем. На фиг.4 представлен пример данного варианта осуществления, в котором каждый из двух различных типов клеток (мезенхимальных стволовых клеток и клеток Caco-2) выращен на одной из сторон CCC.

Как изложено выше, преимущества настоящего способа криоконсервации в значительной степени вытекают из отдельных характеристик применяемого CCC. CCC с вышеуказанными характеристиками обеспечивает особые химические и физические свойства, которые делают его подходящим не только для культивирования клеток, но и для их криоконсервации. Наблюдалось, что CCC, описанный в настоящей заявке, не только не проявляет какой-либо значительной потери биосовместимости, но и не теряет механическую прочность в процессах замораживания и размораживания, даже после длительной криоконсервации.

Особые механические характеристики CCC достигаются посредством сушки коллагеновой композиции воздухом в ходе производства соответствующей коллагеновой пленки. Указанный необратимый процесс делает ее высокопрочной и стойкой. Коллагеновую композицию предпочтительно превращают в высушенную воздухом, прочную и тонкую плоскую пленку, которая достигает пределов прочности при растяжении от приблизительно 20 до приблизительно 100 Н/мм². На фиг.2 показаны механические характеристики CCC в диаграмме деформации-силы при использовании устройства для испытания на растяжение UTS Software 209.00 V 4.06.04 (испытание согласно промышленному стандарту Германии DIN 53 455). Установка для испытания, используемая для выполнения испытания, также показана на фиг.2.

В конкретных вариантах осуществления, когда необходимо получить более высокие показатели прочности при растяжении, коллагеновая композиция может быть получена путем сшивания химическими сшивающими агентами, такими как бифункциональные альдегиды, например глутаровый альдегид, изоцианаты, например гексаметилендиизоцианат (HMDI), карбодиимиды, например 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимид (EDC), или любые другие химические сшивающие агенты, известные в уровне техники и не вводящие нежелательных уровней токсичности в получаемый продукт. Сшивание также может быть выполнено физическими методами, такими как дегидротермическое сшивание или облучение (УФ или ионизирующее излучение), или при помощи ферментативных реакций, например, с использованием трансглутаминазы.

Для осуществления способа изобретения коллагеновая пленка может быть представлена на любом типе подложки для культивирования клеток, таком как планшеты для культур клеток, чашки или матрасы, микрогранулы. Также она может быть представлена в виде вставки для лунок планшета для культур клеток или конструкции любого другого типа (см. фиг.3). Последняя форма позволяет применять вариант осуществления изобретения, в котором различные типы клеток культивируют одновременно на каждой из сторон CCC.

В дополнение к конформации в виде тонкой плоской пленки, коллагеновая композиция также может быть сформирована в виде рукавной пленки для применения в качестве емкости для клеток. Коллагеновые трубки можно криоконсервировать после наполнения жидкими суспензиями клеток. После размораживания они могут использоваться для переноса стимулирующих регенерацию суспензий клеток в участок поврежденной ткани в теле.

Толщина сухой коллагеновой пленки, применяемой в способе изобретения, во всех случаях не превышает 150 мкм для того, чтобы исключить отрицательное влияние на процесс замораживания. В предпочтительном варианте осуществления изобретения толщина сухого CCC не превышает 80 мкм, и в еще более предпочтительном варианте осуществления толщина меньше или равна 40 мкм. Малая толщина стенки обеспечивает быстрое проникновение криопротекторов, а также позволяет провести быструю промывку после размораживания.

Любой тип фибриллярного коллагена из любого животного источника может использоваться при получении CCC, применяемом в способе изобретения. Несмотря на это, предпочтительный вариант осуществления изобретения включает применение бычьего коллагена I, полученного из бычьих шкур или кожи. Другие конкретные варианты осуществления включают смесь коллагена I и коллагена III или смесь коллагена I и/или III с эластином.

Важным компонентом коллагеновой композиции, применяемой в способе изобретения, является полиол. Он действует в качестве увлажнителя, который предотвращает нежелательное высыхание CCC. Хотя пленку подвергают сушке воздухом во время изготовления, предпочтительно, чтобы она сохраняла некоторое количество влаги для того, чтобы не стать хрупкой. В рамках настоящего изобретения могут применяться многие различные полиолы, такие как глицерин, этиленгликоль, бутелендиолы, пропилендиолы, сорбит или другие гекситолы, ксилит или другие пентитолы, а также их смеси. Предпочтительный вариант осуществления включает применение глицерина, или сорбита, или их смесей.

Другим компонентом CCC может быть жир. Предпочтительно, применяемый жир по существу имеет растительное происхождение. Применение растительных масел повышает упругость коллагеновой пленки.

Конкретный и предпочтительный вариант осуществления изобретения представлен CCC, имеющим, в сухом состоянии, толщину 20 мкм, массу на единицу площади от 25 до 35 г/м² и следующий состав:

коллаген [% по весу]: от 50 до 70,

амидный азот [% по весу]: от 0,14 до 0,4,

глицерин [% по весу]: от 12 до 35,

жир [% по весу]: от 1 до 5,

сорбит [% по весу] от 0 до 20,

вода [% по весу]: от 5 до 40.

Хотя это не является существенным признаком для осуществления способа изобретения, CCC необязательно может быть модифицирован молекулами различного типа на его поверхности. Например, CCC может быть покрыт структурными белками внеклеточного матрикса, такими как ламинин, фибронектин, эластин или гиалуроновая кислота, а также апатитом или функциональными молекулами, такими как факторы роста, цитокины, направляющие молекулы или антитела. Указанные факторы могут влиять на жизнеспособность клеток, адгезию клеток, ориентацию клеток, пролиферацию клеток и дифференцировку клеток.

Определенные условия культивирования клеток до адгезии могут изменяться в зависимости от типа клеток. Это существенно для всех клеток, поскольку их выращивают в условиях погружения в питательную среду или в питательный туман, что гарантирует предотвращение высыхания клеток. Специфичная для клеток атмосфера и биологически совместимая поверхность, такая как одна из поверхностей CCC, применяемого в настоящей заявке, к которой могут прикрепляться клетки, также необходимы. Как правило, необходима питательная среда, атмосфера, специфичная для прокариотических и эукариотических клеток, и определенная температура. Питательные среды для культур клеток и условия культивирования на CCC для каждой клетки являются такими же, как описано в стандартных методах культивирования клеток.

Перед замораживанием неадгерентные клетки удаляют с помощью промывки в одной или нескольких стадиях промывки в буферном растворе.

Замораживание комплекса клетка-CCC или клеточной конструкции, или трехмерных комплексов тканей в CCC проводят в присутствии среды для криоконсервации. Она обычно включает питательную среду с добавкой криопротекторов, таких как диметилсульфоксид (ДМСО), трегалоза, глицерин или гидроксиэтилкрахмал (ГЭК). Предпочтительный вариант осуществления изобретения включает применение ДМСО в способе криоконсервации. Замораживание обычно выполняется под жидким азотом, хотя может использоваться другой известный способ и/или методики замораживания.

Было показано, что способ настоящего изобретения позволяет успешно проводить криоконсервацию целого ряда эукариотических или прокариотических клеток, генетически модифицированных или нет.

Из эукариотических клеток несколько клеток животных, растений или грибов успешно культивировали и подвергали глубокой заморозке. Из прокариотических клеток несколько видов бактерий, как было также показано, сохраняли жизнеспособность после размораживания.

Способ криоконсервации изобретения более всего подходит для клеток млекопитающих, либо для первичных клеток, либо для иммортализованных клеточных линий.

Ниже приведен перечень типов клеток, которые могут быть подвергнуты способу криоконсервации изобретения:

a) Стволовые клетки (эмбриональные, фетальные, неонатальные, зрелые) и их клетки-предшественники

- линии эмбриональных стволовых клеток,

- индуцированные плюрипотентные стволовые клетки,

- сперматогональные стволовые клетки,

- зародышевые стволовые клетки,

- мезенхимальные стволовые клетки,

- эндотелиальная стволовая клетка,

- гематопоэтические стволовые клетки,

- нервные стволовые клетки,

- стволовые клетки нервного гребня,

- желудочно-кишечные стволовые клетки,

b) Соматические клетки

- эндотелиальные клетки,

- эпителиоциты из желудка и кишечника,

- эпителиоциты молочной железы,

- меланоциты,

- эпителиоциты легкого,

- почечные эпителиоциты,

- кератиноциты,

- уротелиальные клетки,

- гепатоциты,

- клетки роговицы,

- клетки хрусталика,

- остеобласты,

- остеоциты,

- одонтобласты,

- хондроциты,

- клетки связок,

- клетки сухожилий,

- клетки желез (клетки гипофиза, клетки слюнной железы, надпочечников, экзокринные и эндокринные панкреатические клетки, клетки Лейдига),

- липоциты,

- фибробласты,

- клетки сетчатки,

- нейроны (допаминергические, ГАМКенергические, глутаминергические, холинергические, адренергические нейроны),

- глиальные клетки (астроциты, олигодендроциты, шванновские клетки),

- гладкомышечные клетки,

- клетки скелетных мышц,

- кардиомиоциты,

- иммуноциты (B-лимфоциты, T-лимфоциты, макрофаги, нейтрофилы, дендритные клетки, тучные клетки, эозинофилы, базофилы, NK-клетки, М-клетки, микроглия),

c) Генетически модифицированные клетки,

d) Линии раковых клеток

- HeLa, аденокарцинома шейки матки человека,

- CCF-STTG1, астроцитома мозга человека,

- Hep G2, карцинома, гепатоцеллюлярная, печени человека,

- SK-MEL-5, меланома, злокачественная, кожи человека,

- Saos-2, остеосаркома кости человека,

- WERI-Rb-1, ретинобластома глаза, сетчатки человека,

e) Иммортализованные клеточные линии

- NuLi, человеческий бронхиальный эпителий,

- CuFi, человеческий бронхиальный эпителий,

- CHON-001, человеческий фибробласт хряща кости,

- BJ-5ta, человеческий фибробласт крайней плоти,

- hTERT-HME1 (ME16C), человеческий эпителий молочной железы,

- hTERT-HPNE, человеческие эпителиоподобные клетки протоков поджелудочной железы,

- hTERT RPE-1, человеческий пигментный эпителий сетчатки,

- NeHepLxHT, человеческие эпителиоподобные клетки печени,

- T HESCs, человеческие эндометриальные фибробластоподобные гибридомные клеточные линии,

f) Клетки растений

- Brownanthus corallinus,

- Carpanthea pomeridiana,

- Conophytum meyerae,

- Delosperma ecklonis,

- Sesuvium portulacastrum,

- Sphalmanthus trichomotus,

- Amaranthus retroflexus,

- Pleuropetalum darwinii,

- Amaryllidaceae,

- Crinum x powellii hort.,

- Catharanthus longifolius,

- Dictyophleba leonensis,

- Ervatamia coronaria,

g) Клетки грибов

нитчатые грибы

- Dacrymyces deliquescens,

- Fennellomyces linderi,

- Cunninghamella blakesleeana,

- Tolypocladium inflatum,

- Radiomyces spectabilis,

- Wallemia sebi,

- Lophodermium seditiosum,

дрожжи

- Saccharomyces cerevisiae,

- Candida albicans,

- Debaromyces japonicus,

- Fellomyces polyborus,

- Brettanomyces abstinens,

- Hyphopichia burtonii,

- Kloeckera brevis,

h) Бактерии

- Acidobacterium capsulatum,

- Escherichia coli,

- Saccharococcus thermophilus,

- Lactobacillus acidophilus,

- Bacillus thuringiensis,

- Pseudomonas aeruginosa,

- Enterococcus faecalis.

Другим объектом изобретения является замороженный комплекс CCC-клетка, или замороженная искусственная клеточная конструкция, или замороженные трехмерные сложные комплексы тканей, получаемые с помощью способа изобретения. Они представляют собой потенциальный и фактически постоянный источник клеток, клеточных конструкций или комплексов тканей, которые могут длительно храниться и предоставляться "точно в срок" при необходимости. Указанный композиционный материал сохраняет свою трехмерную конфигурацию после размораживания и гарантирует фиксацию клеток в том положении, в котором они необходимы.

Наконец, объектом изобретения также является применение после размораживания замороженного комплекса клеток-CCC, или замороженной искусственной клеточной конструкции, или замороженных трехмерных сложных комплексов тканей, получаемых с помощью способа изобретения.

Первое назначение включает применение комплекса коллагенового носителя-клеток, искусственной клеточной конструкции или трехмерного сложного комплекса тканей после размораживания в регенеративной медицине, т.е. для in vivo имплантации клеток или поврежденных тканей. Исследования имплантации in vivo показали, что CCC биологически совместим и не вызывает иммунную реакцию у реципиента. Это, наряду с механической прочностью и уменьшенной толщиной, делает указанные размороженные продукты особо интересными в качестве колонизируемого клетками импланта для разнообразных клинических применений у животных и людей. Криоконсервация позволяет получать импланты заранее и размораживать их "точно в срок" для трансплантации.

Высокая механическая прочность CCC (даже после размораживания) также обеспечивает защиту и стабилизацию в начальной фазе в случае трансплантаций, пока он не будет поглощен окружающей тканью.

Предпочтительно, чтобы замороженные/размороженные импланты содержали аутологичные, а не гетерологичные клетки, чтобы избежать или снизить любую возможную иммунную реакцию на имплант у реципиента.

Второе назначение включает применение комплекса коллагенового носителя-клеток, искусственной клеточной конструкции или трехмерного сложного комплекса тканей после размораживания для in vitro тест-систем. Они могут применяться в области фундаментальных исследований или в качестве тест-систем для фармакологических веществ, химических соединений или косметических средств и позволяют анализировать цитоактивные вещества без использования тестов на животных. Одной общепризнанной, широко известной системой для тестирования фармакологических веществ или косметических средств является модель кожи. Данная модель, конечно, может быть воспроизведена и заморожена согласно способу изобретения.

Возможность замораживания/размораживания сложных клеточных комплексов вместе с их матрицами-носителями, при сохранении их трехмерной структуры, как в настоящем изобретении, открывает новые возможности для их применений в фармацевтической или биотехнологической промышленности. Криоконсервированные тест-системы, полученные согласно изобретению, могут быть доставлены без какой-либо опасности загрязнения или снижения жизнеспособности клеток, вызванных колебаниями условий, в которых находятся культуры во время транспортировки.

Следующие примеры предназначены для иллюстрации изобретения и не должны при этом рассматриваться как ограничение объема изобретения.

Пример 1: Получение коллагенового клеточного носителя

1.1. Получение в виде плоской пленки согласно изобретению

50,0 кг нарезанных бычьих шкур подвергали предварительному механическому измельчению и три раза промывали водой (3 раза по 50 кг). Затем сырье подвергали обработке щелочью в суспензии 0,29 кг гидроксида кальция в 50 кг воды при значении рН 11,8 в течение 150 часов. Обработку щелочью останавливали добавлением соляной кислоты (10% раствор в воде), пока pH массы не достигал значения 0,6. Затем реакционную смесь снова промывали водой, пока pH массы не достигал значения 2,8. Полученные в результате "коллагеновые чешуйки" затем подвергали механической переработке при регулируемой температуре (<24°C) в гелеобразную вязкоэластичную массу посредством их грубого измельчения и продавливания измельченного материала через ряд перфорированных дисков с последовательно уменьшающимися диаметрами соответствующих отверстий. Выход составил 78,1 кг "концентрированной" коллагеновой массы.

60,0 кг полученной "концентрированной" массы переносили в емкость, оборудованную мешалкой и охлаждающей рубашкой. Воду (376,4 кг) и глицерин (2,15 кг) добавляли при перемешивании. Одновременно значение рН доводили соляной кислотой до 2,9. Затем смесь пропускали через гомогенизатор, удаляли воздух и экструдировали через щелевую насадку на конвейерную ленту, на которой формируемый тонкий слой геля проходил через туннельную сушилку. Перед входом в сушилку гель подвергали нейтрализации с использованием газообразного аммиака, повышая, таким образом, значение рН геля. В конце сушилки высушенная пленка проходила через зону регидратации перед ее сматыванием.

1.2. Получение в виде рукавной пленки согласно изобретению

"Концентрированную" массу производили аналогично 1.1, но продолжительность щелочной обработки сокращали до 48 ч. 60,0 кг полученной "концентрированной" коллагеновой массы переносили в смеситель и разводили при перемешивании, постепенно добавляя воду (36,0 кг) при строгом регулировании температуры (<24°C). Параллельно значение рН коллагеновой массы доводили до 2,8. Полученную пасту пропускали через гомогенизатор, а затем оставляли на ночь при 20°C для размягчения. На следующий день коллагеновую массу, полученную таким образом, экструдировали через кольцевую насадку, получив в результате бесконечную рукавную пленку. Для предотвращения схлопывания рукава и для нейтрализации коллагена смесь воздуха и газообразного аммиака пропускали в рукав около экструзионной головки. Затем наполненную газом рукавную пленку перемещали через ряд промывных опрыскивателей (вода) и, в последней оросительной ванне, ее опрыскивали 4% раствором глицерина в воде. Наконец, рукавную пленку пропускали через туннельную сушилку, на выходе из которой ее прокатывали между валиками и наматывали на катушки. Методику, описанную в 1.2, выполняли дважды, используя различные экструзионные головки, с получением одной рукавной пленки с диаметром 60 мм и другой с диаметром 115 мм.

Часть полученных рукавных пленок разрезали вдоль с получением плоской пленки.

1.3. Регулирование значения рН

Значение рН плоских или рукавных пленок, полученных согласно 1.1 или 1.2, доводили вне экструзионных линий в лаборатории при использовании кальций- и магнийсодержащего фосфатного буфера (фосфатно-солевого буфера (PBS), содержащего Ca⁺⁺ и Mg⁺⁺ (PAA H15-001)), с достижением физиологического диапазона pH 7,2-7,5. Для этого соответствующую коллагеновую пленку промывали системой буферов при перемешивании в течение 5 дней. Два раза в день буфер меняли.

В альтернативной методике коллагеновые мембраны, полученные согласно 1.1 или 1.2, погружали на час в фосфатный буфер, содержащий глицерин, при значении рН 7,3 (фосфатный буфер: 15,6 г KH₂PO₄, 71,3 г Na₂HPO₄×2H₂O и 492,9 г глицерина растворяли в 7722 г дистиллированной воды). Затем обработанную пленку оставляли для стекания жидкости и помещали в растягивающую рамку, где ее оставляли для просушки при комнатной температуре.

1.4. Дополнительная необязательная обработка

После короткого уравновешивания в дистиллированной воде коллагеновую мембрану обрабатывали 100% ацетоном с целью осаждения водорастворимых белковых фракций. После удаления ацетона высушенную мембрану промывали 3 раза по часу с использованием кальций- и магнийсодержащего фосфатного буфера (в г/л: KCl 0,2; KH₂PO₄ 0,2; NaCl 8,0; Na₂HPO₄ безводный 1,15; CaCl₂-2H₂O в H15-001 0,132; MgCl₂-2H₂O в H15-001 0,1). Для удаления буферной соли полученную пленку снова 3 раза по часу промывали в дистиллированной воде.

1.5. Формовка и стерилизация

Высушенные коллагеновые плоские или рукавные пленки, полученные согласно любой из вышеуказанных методик (1.1-1.4), нарезали произвольным способом или штамповали в листы любой формы или размера, совместимые с габаритами пленки. Затем полученные листы стерилизовали обработкой бета- или гамма-излучением мощностью 25 кГр или 50 кГр. Сухие рукавные пленки также нарезали на части и облучали таким же способом.

В следующих таблицах приведены параметры некоторых типовых пленок, полученных согласно примерам 1.1 и 1.2:

Образец	1	2	3
Изготовлен согласно	1.1	1.2	1.2
Тип пленки	плоская	рукав ø60 мм	рукав ø115 мм
Коллаген (вес.%)	67	76	77
Амидный азот (% от веса сухого коллагена)	0,42	0,57	0,57
Вода (вес.%)	15	12	12
Глицерин (вес.%)	15	10	6
Жир (вес.%)	2	1	1
Зольный остаток (вес.%)	1	1	2
Значение pH	5,1	4,2	3,8
Толщина сухой пленки (мкм)	20	75	115
Вес на единицу площади (г/м2)	30	115	160
Предел прочности при продольном растяжении (Н/мм2)	44	--*	--*
Предел прочности при поперечном растяжении (Н/мм2)	41	--*	--*
*-- Не определяли

Применяли следующие аналитические методы.

Количественный анализ коллагена производили при помощи определения аналога гидроксипролина/амидного азота EP1676595 (Geistlich Söhne AG)/глицерина с помощью ВЭЖХ/жира с помощью экстракции по Сокслету/сорбита с помощью ВЭЖХ/гравиметрического анализа зольного остатка после сжигания в муфельной печи в течение 5 часов при 600°C/гравиметрического анализа содержания воды после сушки в сушильном шкафу при 150°C/значения рН при нарезании пленки на небольшие части, погружении кусочков в 5% раствор NaCl и измерении с использованием стеклянного электрода через 10 минут/массы на единицу площади путем взвешивания образ