Пептид, полученный из человеческого лактоферрина, для применения в качестве агента, маскирующего антиген

Пептид, полученный из человеческого лактоферрина, для применения в качестве агента, маскирующего антиген

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Уровень техники

Общие сведения об иммуноглобулине G: иммуноглобулин G (IgG) представляет собой молекулы антител. IgG наиболее распространенный иммуноглобулин и приблизительно в равной степени распространен в крови и в жидкостях тканей, составляя основную часть сывороточных иммуноглобулинов у млекопитающих и человека. Молекулы IgG синтезируются и секретируются клетками плазмы B.

IgG антитела преимущественно участвуют во вторичном иммунном ответе. Присутствие специфического IgG в общем соответствует готовности гуморального иммунного ответа. IgG представляет собой единственный изотип антитела, который может проходить через человеческую плаценту, таким образом, обеспечивая защиту плода в матке. Наряду с IgA, секретированным в грудном молоке, остаточный IgG, абсорбированный через плаценту, обеспечивает новорожденному гуморальный иммунитет до развития его собственной иммунной системы.

IgG может связываться с множеством видов патогенов, например с вирусами, бактериями и грибами, и защищает организм от них путем агглютинации и иммобилизации, активации комплемента (классический путь), опсонизации для фагоцитоза и/или нейтрализации их токсинов. Он также играет важную роль в антитело-зависимой клетка-опосредованной цитотоксичности (ADCC).

IgG млекопитающих, генерирующие иммунные ответы, сильно связаны с другими и каскадами иммунных ответов и сигнальными путями. Так что гаптен или иммуноген мотивы или рецепторы и семейства рецепторов коррелируют и регулируют во многих известных и неизвестных путях у отдельных млекопитающих индивидуальным образом.

Вот почему любой биологически активный агент, введенный в качестве терапевтического средства, может вводить иммунный ответ, желательный и нежелательный, даже после многих отдельных доз.

В WO 2007/048599 описываются системы доставки лекарственного средства в виде твердых частиц на основе полимерного носителя, отличающиеся тем, что по меньшей мере одно сигнальное вещество для транспорта через биологический барьер и по меньшей мере один активный ингредиент включены с носителем, причем сигнальное вещество и активный ингредиент не показывают ковалентное связывание друг с другом. Сигнальное вещество представляет собой лактоферрин или пептид, полученный из лактоферрина.

В особенно предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения сигнальный пептид выбирается из группы пептидов, имеющих аминокислотную последовательность

KCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKR	(SEQ ID No. 3 в WO 2007/048599),
CFQWQRNMRKVRGPPVSC	(SEQ ID No. 4 в WO 2007/048599),
FQWQRNMRKVRGPPVS	(SEQ ID No. 5 в WO 2007/048599),
FQWQRNMRKVR	(SEQ ID No. 6 в WO 2007/048599),
KCRRWQWRMKKLGAPSITCVRR	(SEQ ID No. 29 в WO 2007/048599) и
CRRWQWRMKKLGAPSITC	(SEQ ID No. 30 в WO 2007/048599)

или их производной.

В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения проникающие в клетку пептиды согласно WO 2007/048599 содержат аминокислотную последовательность, как показано в WO 2007/048599, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 29 или SEQ ID No. 30, или соответствующую последовательность с идентичностью по меньшей мере 40%, предпочтительно по меньшей мере 50%, особенно предпочтительно с идентичностью более 75% или лучше более 90%.

В WO 2007/076904 A1 описывается пептид, имеющий аминокислотную последовательность, содержащую по меньшей мере 8 последовательных аминокислот белка человеческого лактоферрина или белка бычьего лактоферрина, причем пептид подходит для действия в качестве проникающего в клетку пептида. Многие пептиды, упомянутые в WO 2007/076904 A1 и в WO 2007/048599, идентичны.

Наиболее эффективный проникающий в клетку пептид согласно WO 2007/076904 A1 с наилучшими эффектами, показанными в примерах, представляет собой KCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKR (SEQ ID No. 3 в WO 2007/076904 A1, SEQ ID No. 1 в настоящей заявке).

Полученные из лактоферрина, проникающие в клетку пептиды, как подразумевается, обеспечивают транспорт транспортных молекул, которые представляют собой активные фармацевтические ингредиенты, такие как ДНК, РНК, пептиды или антигены для вакцинации, которые могут приниматься перорально, через биологические мембраны, и, таким образом, обеспечивают эффективное внедрение этих молекул в организм человека или животного.

Проблема и решение

Когда биологически активное вещество, которое доставляется в организм млекопитающего для излечения заболевания, индуцирует нежелательный иммунный ответ, это может стать серьезной проблемой, когда такое же биологически активное вещество должно доставляться в этот же определенный организм позже еще раз.

Задача настоящего изобретения состояла в обнаружении агента, маскирующего антиген, который может применяться в качестве вспомогательного средства или в качестве эксципиента при получении фармацевтической композиции для доставки биологически активного вещества в организм млекопитающего, где биологически активное вещество способно индуцировать нежелательный иммунный ответ в организме млекопитающего, с тем эффектом, что после доставки фармацевтической композиции в организм млекопитающего в нем не происходит или происходит только пониженная индукция нежелательного иммунного ответа против биологически активного вещества.

Проблема решается с помощью пептида, полученного из человеческого лактоферрина, для применения в качестве агента, маскирующего антиген, при получении фармацевтической композиции для доставки биологически активного вещества в организм млекопитающего, где биологически активное вещество способно индуцировать нежелательный иммунный ответ в организме млекопитающего, где фармацевтическая композиция содержит надмолекулярный агрегат биологически активного вещества и пептида, полученного из лактоферрина, с тем эффектом, что после доставки фармацевтической композиции в организм млекопитающего в нем не происходит или происходит только пониженная индукция нежелательного иммунного ответа против биологически активного вещества.

Подробное описание настоящего изобретения

Настоящее изобретение относится к пептиду, полученному из человеческого лактоферрина, для применения в качестве агента, маскирующего антиген, при получении фармацевтической композиции для доставки биологически активного вещества в организм млекопитающего, где биологически активное вещество способно индуцировать нежелательный иммунный ответ в организме млекопитающего, где фармацевтическая композиция содержит конъюгат биологически активного вещества и пептида, полученного из человеческого лактоферрина, с тем эффектом, что после доставки фармацевтической композиции в организм млекопитающего в нем не происходит или происходит только пониженная индукция нежелательного иммунного ответа против биологически активного вещества.

Так как пептид, полученный из человеческого лактоферрина, получают из человеческого лактоферрина, он является неиммунногенным в отношении иммунной системы человека.

Неожиданно было получено, что пептид, полученный из человеческого лактоферрина, является неиммунногенным или иммунногенным только в низкой степени относительно иммунной системы млекопитающих, предпочтительно продуктивных животных или домашних животных, как, например, свиньи, овцы, коровы или собаки, применяемые в качестве модельных образцов при разработке лекарственных средств, хотя последовательности являются генетически неконсервативными. Таким образом, преимущества настоящего изобретения не ограничиваются до применения человеком, но настоящее изобретение может также применяться в ветеринарных применениях и для разработки терапевтических средств для человека, с применением животных моделей.

Пептид, полученный из человеческого лактоферрина

Пептид, полученный из человеческого лактоферрина, может иметь длину от 19 до 30 аминокислот.

Пептид, полученный из человеческого лактоферрина, может иметь длину от 19 до 30 аминокислот и может включать аминокислотную последовательность согласно SEQ. ID. No. 1 KCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKR или последовательность, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98% гомологична этой последовательности SEQ. ID. No. 1.

Пептид, полученный из человеческого лактоферрина, предпочтительно представляет собой пептид с аминокислотной последовательностью согласно SEQ. ID. No. 1 KCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKR или последовательность, которая по меньшей мере на 90, 95 или 98% гомологична этой последовательности.

Наиболее предпочтительно пептид, полученный из человеческого лактоферрина, по меньшей мере на 90, 95 или 98% гомологичен последовательности SEQ: ID1, и в нем присутствуют цистеиновые остатки в положениях 2 и 19. Предпочтительно цистеиновые остатки присутствуют в окисленной форме, формируя внутренний Cys-Cys-мостик.

Может быть включена любая дополнительная стандартная химическая модификация, применяемая в пептидном GMP-синтезе, как, например N-ацетилирование, ацилирование, метилирование, бензилирование, C-амидирование, эстерификация, C-терминальная-эстерификация в массе, изостерические аминокислотные модификации, и неприродные аминокислоты, такие как тиофенил-аланин или циклопролин-аланин, или любое другое аминокислотное замещение амид-, сложный эфир- или простой эфир-основная цепь.

Однако предпочтительно, чтобы за исключением образования Cys-Cys-мостика, пептид, полученный из человеческого лактоферрина, не показывал дополнительных химических модификаций.

Биологически активное вещество, которое способно вызывать нежелательный иммунный ответ в организме млекопитающего

Биологически активное вещество, которое способно индуцировать нежелательный иммунный ответ в организме млекопитающего, как правило, содержится или присутствует в фармацевтической форме или фармацевтическом препарате.

Биологически активные вещества, которые, как предполагается, применяются для индицирования желательного иммунного ответа в организме млекопитающего, например большинство вакцин, не попадают под определение "нежелательный иммунный ответ".

Биологически активное вещество, которое способно индуцировать нежелательный иммунный ответ в организме млекопитающего, может предпочтительно выбираться из группы биологически активных белков или биологически активных пептидов, антисыворотки, поликлональных или моноклональных антител. Также необходимо упомянуть рекомбинантные белки, обеспечивающие другие "растворимые рецепторы", или "связующие растворимых рецепторов", или модифицированные рекомбинантные белки, такие как полиэтиленгликол(PEG)ированные вещества, а также терапевтические средства с риском иммуногенности в качестве нежелательного побочного эффекта, включая маленькие молекулы, где такой риск известен, или потенциально релевантные, как антибиотики, пептидные лекарственные средства и пептидомиметики.

Биологически активное вещество, которое способно индуцировать нежелательный IgG иммунный ответ, может содержаться в образце крови, которая переливается в организм млекопитающего.

Биологически активное вещество, которое способно индуцировать нежелательный IgG иммунный ответ, содержится в или на поверхности органа, который трансплантируется в организм млекопитающего.

Нежелательный иммунный ответ

Нежелательный иммунный ответ организма млекопитающего представляет собой ответ иммунной системы посредством производства антител против биологически активного вещества, которое доставляется в организм млекопитающего для того, чтобы вызвать благоприятный терапевтический эффект, который отличается от иммунного ответа, или когда иммунный ответ представляет собой нежелательный побочный эффект.

Нежелательный иммунный ответ может представлять собой (предпочтительно) IgG иммунный ответ.

Нежелательный иммунный ответ может представлять собой (предпочтительно) IgE иммунный ответ.

Даже когда нежелательный иммунный ответ может не вызывать нежелательные побочные эффекты при первой доставке этой фармацевтической формы или в фармацевтическом препарате, содержащем или включающем биологически активное вещество, которое способно индуцировать нежелательный иммунный ответ, нежелательный иммунный ответ может вызывать нежелательные побочные эффекты, когда фармацевтический препарат содержит или включает биологически активное вещество, которое способно индуцировать нежелательный (IgG или IgE) иммунный ответ, доставляется или должно быть доставлено во второй раз, или другой раз, или несколько раз, или через период времени. В этом случае, например, существующие уровни IgG в плазме могут частично или полностью инактивировать биологически активное вещество и уменьшать желательный терапевтический эффект. В некоторых случаях частичная или полная инактивация биологически активного вещества может также идти рука об руку с раздражением, жаром или другими нежелательными побочными эффектами. Эти побочные эффекты могут неспецифически вызываться присутствием агрегатов или преципитатов IgG-антитела с биологически активным веществом.

Типичным примером биологически активного вещества, которое способно вызывать нежелательный IgG иммунный ответ организма млекопитающих, является, например, противоядие на основе антисыворотки против яда ядовитых животных. Например, змей, насекомых, пауков или определенных видов медуз, где антисыворотка производится животными, как правило, лошадьми, где антисыворотка, как подразумевается, вылечивает человека, имевшего контакт с этим ядом. После первой доставки этой антисыворотки у отдельного человека, как правило, развивается нежелательный преобладающий IgG иммунный ответ против лошадиных белков, главным образом IgG-антител, содержащихся в антисыворотке.

Хорошо известен случай противоядия против яда змей на основе антисыворотки, производимой лошадьми, которая доставляется в организм человека, который был укушен определенными видами змей, для излечения некоторых эффектов змеиного яда. После первой доставки антисыворотки против яда змей отдельный человек может быть излечен посредством инактивации яда, но может развиться нежелательный IgG иммунный ответ против лошадиных белков, главным образом лошадиных IgG-антител, содержащихся в сыворотке. Если этот же человек позже будет укушен этой же или другой змеей, обработка его лошадиной антисывороткой против змеиного яда еще раз может быть опасна из-за имеющегося уровня IgG антител, возникших против лошадиных сывороточных белков.

Также известны иммуномодуляторные лекарственные средства миелодиспластических синдромов низкой степени риска у человека, где применяются антилимфоцит/антитимо-лимфоцит глобулины. В этих терапевтических средствах глобулины с антителами, направленными против человеческих иммуногенных клеток, которые продуцируются в кроликах или лошадях, доставляются в организм пациента-человека через определенный период времени. Также в этом случае имеется опасность нежелательного IgG иммунного ответа против белков кролика или лошади, главным образом лошадиных IgG антител, содержащихся в фракциях глобулина. Этот нежелательный IgG иммунный ответ может отрицательно влиять на имеющуюся или повторную терапию.

Известно другое применение фармацевтических препаратов, содержащих или включающих моноклональные антитела, возникшие против эпитопов на раковых клетках.

Другие случаи, когда подавление нежелательного IgG иммунного ответа согласно настоящему изобретению может быть предпочтительно, могут относиться к области переливания крови, когда может иметь место несовместимость между переливаемой кровью и иммунной системой пациента в контексте нежелательного IgG иммунного ответа.

Другие случаи, когда подавление нежелательного IgG иммунного ответа согласно настоящему изобретению может быть предпочтительно, могут относиться к области трансплантации органов, когда может иметь место несовместимость между трансплантируемым органом, которым может быть почка, печень, легкое или сердце, среди прочих примеров, и иммунной системой пациента в контексте нежелательного IgG иммунного ответа, и, таким образом, могут иметь место по меньшей мере частичные реакции отталкивания или отторжения.

Биологически активное вещество, которое способно вызывать нежелательный IgG иммунный ответ организма млекопитающего, таким образом, может содержать фармакологически или биологически активные белки или пептиды, особенно белки или пептиды, которые являются не нативными относительно организма млекопитающего, в который они доставляются.

«Не нативный» может означать, что биологически активные белки или пептиды происходят либо из других видов, предпочтительно из других видов млекопитающих, по сравнению с видами, в которые они доставляются, или из тех же видов, либо имеют полусинтетическое происхождение.

«Не нативный» может означать, что биологически активные белки или пептиды модифицированы таким образом, что это делает их обнаруживаемыми IgG иммунным ответом организма млекопитающего, в который они, как предназначается, доставляются.

Предпочтительный млекопитающий организм, в который биологически активное вещество, которое способно вызывать нежелательный IgG иммунный ответ, может быть доставлено, представляет собой Homo sapiens (человек разумный).

Например, белок, который происходит из определенного организма млекопитающего может стать обнаруживаемым IgG-иммунным ответом этого организма млекопитающего, когда он будет продуцирован рекомбинантным микробиологическим организмом.

Например, гликозилированный белок, происходящий их эукариотического организма-источника, но который был получен в рекомбинантном прокариотическом организме, как правило, не будет показывать гликозилирование. Таким образом, рекомбинантный белок может стать обнаруживаемым IgG-ответом этого исходного млекопитающего организма-источника, когда он доставляется назад в этот организм в форме фармацевтического препарата.

Побочные эффекты в связи с нежелательным IgE иммунным ответом хорошо известны, как, например, аллергия, анафилаксия или даже анафилактический шок.

Биологически активное вещество, которое способно вызывать нежелательный IgG или IgE иммунный ответ организма млекопитающего, может содержать препараты, которые содержат или включают антисыворотку, или поликлональные или моноклональные антитела, или рекомбинантные белки, обеспечивающие другие "растворимые рецепторы" или "связующие растворимых рецепторов", или модифицированные рекомбинантные белки, такие как полиэтиленгликоль, полиэтиленгликол(PEG)ированные, усеченные или генетически модифицированные вещества, а также терапевтические средства с риском иммуногенности в качестве нежелательных, или критических, или летальных побочных эффектов, как, например анафилаксия и анафилактический шок, включая маленькие молекулы, такие как антибиотики, обезболивающие, где такой риск известен, а также любое биологически активное соединение, где иммуногенность потенциально релевантна, включая пептидные лекарственные средства и пептидомиметики, факторы роста или некроза, или смеси, такие как фракции жидкостей тела, как, например, факторы крови из крови человека или клеточные культуры.

Кроме того, иммуномодуляторный эффект фрагмента человеческого лактоферрина мог бы применяться для маскирования антигена, чтобы управлять потенциальным иммунным ответом, включая средства в области аллергии. Например, ассоциация фрагмента человеческого лактоферрина с пыльцой, травяной пыльцой, молочными белками, меллитином, яичными белками и т.д. могла бы регулировать аллергическую реакцию человеческого организма против этих эпитопов и антигенов.

Фармацевтическая композиция

Пептид, полученный из лактоферрина человека, может применяться в качестве агента, маскирующего антиген, при получении фармацевтической композиции для доставки биологически активного вещества в организм млекопитающего.

Фармацевтическая композиция может представлять собой фармацевтическую форму или предпочтительно многочастичную фармацевтическую форму, предпочтительно выбранную из пеллет, гранул, мини-таблеток, таблеток или капсул или других фармацевтических форм. Фармацевтическая композиция может также включать ветеринарные фармацевтические композиции.

Фармацевтическая композиция, содержащая пептид, полученный из лактоферрина человека, и биологически активное вещество, может содержать другие эксципиенты, которые, как известно специалистам в данной области техники, полезны при формировании фармацевтических форм. Типичными эксципиентами являются антиоксиданты, блескообразователи, связывающие агенты, разбавители, наполнители, придающие вкус вещества, вещества, способствующие текучести, ароматизирующие вещества, глиданты, способствующие проникновению агенты, пигменты, пластификаторы, полимеры, формирующие поры агенты, растворители или стабилизаторы.

Фармацевтическая композиция может содержать, может содержать по существу или может содержать до 80, до 50, до 25, до 10 мас.% любых фармацевтических эксципиентов, например других эксципиентов, которые, как известно специалистам в данной области техники, полезны для получения фармацевтических форм.

Надмолекулярный агрегат

Наиболее предпочтительно, пептид, полученный из человеческого лактоферрина, и биологически активное вещество образуют надмолекулярный агрегат, который также может быть назван комплексом или конъюгатом, где пептид, полученный из человеческого лактоферрина, и биологически активное вещество ковалентно не связаны друг с другом. В этом случае надмолекулярный агрегат удерживается, например, с помощью ионных сил или Ван-дер-ваальсовых сил.

Эти надмолекулярные агрегаты очень предпочтительно могут быть получены путем добавления биологически активного соединения в водный раствор или раствор среды процесса или суспензию пептида, полученного из человеческого лактоферрина. Этот раствор должен мягко перемешиваться в течение коротко периода времени, предпочтительно в течение до 2 минут, или инкубироваться в течение до 1 часа, до 2 часов или больше.

Помимо пептида, полученного из человеческого лактоферрина, и биологически активного вещества, надмолекулярный агрегат может дополнительно содержать или включать носитель, например полимерный носитель, такой как дендрический полимер.

Также возможно, но менее предпочтительно, пептид, полученный из человеческого лактоферрина, и биологически активное вещество образуют надмолекулярный агрегат, в котором пептид, полученный из человеческого лактоферрина, и биологически активное вещество ковалентно связаны друг с другом. В этом случае надмолекулярный агрегат может образовываться посредством химической реакции реакционно-способных групп в пептиде, полученном из человеческого лактоферрина, с реакционно-способными группами в биологически активном веществе. Альтернативно дополнительные химически реакционно-способные линкерные молекулы могут применяться для связи молекул.

Предпочтительно надмолекулярные агрегаты могут содержать, могут по существу содержать или могут содержать по меньшей мере 20%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или 100 мас.% пептида, полученного из человеческого лактоферрина, и биологически активного вещества. Надмолекулярный агрегат может быть частью фармацевтической композиции, которая может содержать другие эксципиенты.

Предпочтительно фармацевтическая композиция может содержать, может по существу содержать или может содержать по меньшей мере 20, по меньшей мере 50, по меньшей мере 75, по меньшей мере 90% или 100 мас.% надмолекулярного агрегата.

Способ получения фармацевтической композиции

Настоящее изобретение также относится к способу получения фармацевтической композиции, как определено в настоящей заявке, путем смешивания пептида, полученного из человеческого лактоферрина, и биологически активного агента в природных условиях, инкубации смеси с обеспечением (ковалентного или нековалентного) формирования надмолекулярного агрегата и добавления смеси в фармацевтическую композицию.

В самом простом варианте выполнения настоящего изобретения фармацевтическая композиция может быть идентична указанной смеси, что означает, что готовая фармацевтическая композиция содержит по существу только пептид, полученный из человеческого лактоферрина, и биологически активный агент. Однако во многих случаях может быть предпочтительно или надлежаще добавить другие фармацевтические эксципиенты с формированием (готовой) фармацевтической композиции.

Природные условия должны означать условия, при которых поддерживается биологическая активность пептида, полученного из человеческого лактоферрина, и биологическая активность агента. Природным условием может быть, например, смешивание пептида, полученного из человеческого лактоферрина, и биологически активного агента в водном буферном растворе, например фосфатно буферизованном соляном растворе, pH 7.4, или в физиологическом натрий хлоридном растворе.

Инкубация смеси с обеспечением образования надмолекулярных агрегатов должна продолжаться достаточное время для обеспечения агрегации пептида, полученного из человеческого лактоферрина, и биологически активного агента. Как правило, может быть достаточно смешивание и инкубация в течение до 2 минут при комнатной температуре. Однако инкубация в течение до 1 часа, до 2 часов или больше также может быть подходящей. Подходящие температуры для формирования надмолекулярных агрегатов могут лежать в интервале от 0 до 37°C, предпочтительно от 4 до 30°C, комнатная температура от 18 до 28°C может быть подходящей.

Примеры

Пример 1: нековалентное связывание фрагмента человеческого лактоферрина (hLf) с бактериальным лизатом

Материал:

Бактериальный лизат из Escherichia coli, фрагмент человеческого лактоферрина, SEQ. ID. No. 1 KCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKR, фосфатно буферизированный соляной раствор, pH 7.4 (Европейская фармакопея): 5.97 г дигидрата гидрофосфата динатрия (соответствует 4.76 г гидрофосфата динатрия), 0.38 г дигидрофосфата калия и 16 г хлорида натрия растворили в 1.8 л дистиллированной воды. Затем полученный чистый раствор помещают в колбу, объемом 2 л, заполняют до калибровочной метки дистиллированной водой и затем гомогенизируют. Затем доводят pH до 7.43 при 23.2°C, применяя 3 мл 2H HCl перед помещением конечного раствора в PE бутылки.

Устройство:

Malvern Zetasizer Nano ZS90; Параметры размера:

Материал: белок RI: 1.45 поглощение: 0.00, диспергирующее вещество: вода 25°C: 0.8872 сП RI: 1.330; 37°C: 0.6864 сП RI: 1.330, Клетка: DTS 1060C: чистый разовый дзета-потенциал клетки

Измерения: 3 автоматических цикла, способ представления: поиск оптимального положения, автоматический выбор внимания, анализ модели: общая цель

Дзета-параметры: диэлектрическая проницаемость: 78.5 при 25°C и 74.4 при 37°C

Модель: Smoluchowski F(KA)value: 1.5, измерения: 3 автоматических цикла

Автоматический выбор внимания

Получение образца

Окисление пептида: пептид растворили при концентрации ниже 1 мМ (2.75 мг/мл) в фосфатно буферизированном соляном растворе (PBS), pH 7.4. (Европейская фармакопея), например, 5 мг в 10 мл (=0.5 мг/мл). Раствор продували чистым кислородом в течение 5 минут при 37°C. Инкубировали в течение 2 часов при 37°C.

Для разбавления бактериального лизата 1 мл бактериального клеточного лизата разбавили до 10 мл с помощью PBS pH 7.4. (Европейская фармакопея).

Присоединение к частицам лизата достигалось путем добавления 1 мл бактериального лизата (=1.2 мг Е. coli) с 0.097714286 мг hLF.

20 мкл 0.5 мг/мл раствора пептида добавили к 1 мл ранее разведенной вакцины (0.12 мг/мл) и инкубировали 2 часа при медленном перемешивании, 100-150 оборотов в минуту, при 4°C, предотвращая любое пенообразование.

Таблица 1
Проанализированные образцы и их состав
ОБРАЗЕЦ	РАЗРУШЕНИЕ	СУСПЕНЗИЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО ЛИЗАТА	РАСТВОР ОКИСЛЕННОГО ФРАГМЕНТА HLF
Бактериальный лизат 1:10	нет	5 мл 0.12 мг/мл	-
Бактериальный лизат 4:10	1 мин, ультразвуковой зонд	5 мл 0.12 мг/мл	-
Бактериальный лизат 1:10+1 мин ультразвуковой зонд	нет	5 мл 0.48 мг/мл	-
Бактериальный лизат 4:10+1 мин ультразвуковой зонд	1 мин, ультразвуковой зонд	5 мл 0.48 мг/мл	-
hLF	нет	-	1.5 мл 0.5 мг/мл
hLF+2 мин ультразвуковая ванна	2 мин, ультразвуковая ванна	-	1.5 мл 0.5 мг/мл
Бактериальный	Предварительное	5 мл 0.12 мг/мл	200 мкл 0.5 мг/мл
лизат 1:10+hLF	разрушение ультразвуком, как показано выше
Бактериальный лизат 1:10+hLF 2 мин ультразвуковая ванна	Предварительное разрушение ультразвуком, как показано выше, +2 мин ультразвуковая ванна после hLF присоединения	5 мл 0.12 мг/мл	200 мкл 0.5 мг/мл
Бактериальный лизат 4:10+hLF	Предварительное разрушение ультразвуком, как показано выше	5 мл 0.48 мг/мл	200 мкл 0.5 мг/мл
Бактериальный лизат 4:10+hLF 2 мин ультразвуковая ванна	Предварительное разрушение ультразвуком, как показано выше, +2 мин ультразвуковая ванна после hLF присоединения	5 мл 0.48 мг/мл	200 мкл 0.5 мг/мл

Заключения

Дзета-потенциал (Фиг.1)

Было показано, что лизат Е. coli представляет собой суспензию, содержащую отрицательно заряженные поверхностные частицы. hLF пептидный фрагмент, даже если наблюдается образование агрегатов, показывает общий положительный заряд, и добавление второго к первому приводит к изменению поверхностных свойств лизата.

Размер частиц (Фиг.2)

На чертежах "размер частиц" показывает средние значения

Заключения относительно данных по размеру частиц:

- Склонность к агрегации возникает во всех случаях: вакцина сама по себе, hLF фрагмент сам по себе и их комбинация.

- Эти явления агрегации приводят к большим размерам частиц

- Агрегация и осаждение могут происходить обратимые посредством разрушения ультразвуком и/или подходящего перемешивания.

Пример 2: Иммуномодуляция иммунной системы крысы путем обработки антигеном, фрагментом человеческого лактоферрина и комбинацией антигена и фрагмента человеческого лактоферрина

Материал

Бактериальный лизат: Klebsiella pneumoniae CECT 141; 12.000 миллионов бактерий/мл (десятикратная конечная концентрация), стандартная не обработанная глицерином композиция, без фенола

hLF фрагмент, SEQ. ID. No. 1 KCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKR

окисленная форма, в виде продукта лиофилизата; дозирована в пробирках по 50 мг каждая, в 25 мл пробирках, подлежит восстановлению. Сразу после восстановления хранится охлажденной (4°C).

Фосфатно буферизированный соляной раствор (PBS) стерилизуется любой подходящей методикой и хранится в подходящем контейнере, если не применяется сразу после получения. Хранится при 4°C в течение всего периода времени.

Методики

Восстановление hLF стокового раствора осуществляли путем восстановления 50 мг фрагмента hLF в пробирке путем добавления 20 мл PBS. Это обеспечивало полное надлежащее восстановление до гомогенного свободного от частиц раствора. Пробирку мягко перемешивали посредством повторяемых поворотов закрытой пробирки. В результате получили hLF-стоковый раствор для исследования: номинальная концентрация 2.5 мг/мл.

hLF разбавления для испытания на животных осуществляли ежедневно. Для этого 1 мл восстановленного hLF стокового раствора переносили в новую 25 мл пробирку, с последующим добавлением 21.5 мл PBS и аккуратно перемешивали посредством повторяемых поворотов закрытой пробирки, чтобы избежать пенообразования. Результатом было ежедневное разбавление стока, номинальная концентрация 0,1 мг/мл.

"A+B" композиция

4.5 мл ежедневного hLf разбавления перенесли в подходящую пробирку (емкостью 5 мл или больше), с последующим добавлением 0.5 мл 12,000 миллионов бактерий/мл бактериального лизата, и аккуратно перемешивали посредством повторяемых поворотов закрытой пробирки, чтобы избежать пенообразования, Результатом было 5 мл A+B вакцины, 1200 миллионов бактерий/мл, 0.1 мг hLf фрагмента/мл, при соотношении 12:1.

"B" композиция

4.5 мл ежедневного hLf разбавления перенесли в подходящую пробирку PBS и аккуратно перемешивали посредством повторяемых поворотов закрытой пробирки, чтобы избежать пенообразования. Результатом было 5 мл 0.1 мг/мл раствора фрагмента hLf.

"A" композиция

0.5 мл бактериального лизата (12,000 миллионов бактерий/мл) перенесли в подходящую пробирку (емкостью 5 мл или больше), с последующим добавлением 4.5 мл PBS, и аккуратно перемешивали посредством повторяемых поворотов закрытой пробирки, чтобы избежать пенообразования. Результатом было 5 мл бактериального лизата, 1200 миллионов бактерий/мл ("A" бактериальный лизат).

Дозы и режимы введения:

"A+B" введение

Введение 0.5 мл "A+B" каждой из трех крыс из группы A+B (интраперитонеально).

Введение 0.5 мл "A+B" каждой из трех крыс из группы α+β (внутрижелудочно).

"B" введение

Введение 0.5 мл B крысам из группы B (интраперитонеально).

Введение 0.5 мл B трем крысам из группы β (внутрижелудочно).

"A" введение

Введение 0.5 мл вакцины A трем крысам из группы A

Введение 0.5 мл вакцины A трем крысам из группы α

Обработка животных

Пероральные лизаты Klebsiella pneumoniae CECT 141 применялись в качестве модели для инокулята, который индуцирует IgG иммунный ответ у крыс в качестве моделей организмов при внутрижелудочном или интраперитонеальном введении. Пептид, полученный из человеческого лактоферрина с аминокислотной последовательностью SEQ. ID. No. 1 KCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKR, применялся для получения конъюгатов с лизатами Klebsiella pneumoniae CECT 141 следующим образом.

Исследовались 6 групп по три крысы:

a. Группа A: интраперитонеально вводили бактериальный лизат (композиция "A")

b. Группа B: интраперитонеально вводили фрагмент hLf (композиция "B")

c. Группа C: интраперитонеально вводили конъюгат (композиция "A+B")

d. Группа α: внутрижелудочно вводили композицию "A"

е. Группа β: внутрижелудочно вводили композицию "B"

f. Группа δ: внутрижелудочно вводили композицию "A+B"

Продолжительность испытания: 4 недели (28 дней)

Модель применения продукта

Таблица 2
Обработка групп крыс и количество
День	A	B	A+B	Контроль
0	0.5 мл	0.5 мл	0.5 мл	нет дозы
7	0.5 мл	0.5 мл	0.5 мл	нет дозы
14	0.5 мл	0.5 мл	0.5 мл	нет дозы
21	0.5 мл	0.5 мл	0.5 мл	нет дозы

Параметр и график отбора проб

Измеряемые параметры показывают общий IgG. Способ осуществили посредством ELISA. График отбора проб для всех групп был следующим (Таблица 3):

Таблица 3
Образцы крови берутся по следующей схеме
День	Замечание
0	Перед введением дозы
6
13
20
27	умерщвление

Заключения

Изменение уровней IgG со временем

Контрольная группа (Фиг.3)

У животных контрольной группы уровни IgG оставались постоянными с течением времени без статистически значимых различий, наблюдающихся между различными моментами исследования.

Группа с человеческим лактоферрином (hLf, „B”-композиция) (Фиг.4):

Обработка человеческим лактоферрином, как оказалось, не оказывает какой-либо эффект на уровни IgG со временем, без статистически значимых различий, наблюдающихся между уровнями IgG крыс, подвергающихся обработке hLf в любые моменты исследования, независимо от способа введения.

Группа, обрабатываемая бактериальным экстрактом („A”-композиция) (Фиг.5):

У животных, подвергающихся интраперитонеальной обработке бактериальным экстрактом, наблюдалось, что уровни IgG имеют тенденцию к значительному повышению со временем. Дополнительно, необходимо отметить, что уровни IgG повышаются с числом доз бактериального экстракта, что означает, что эффект этого лечения является кумулятивным, объясняя повышение уровней IgG со временем. Такое же поведение наблюдалось у животных, обрабатываемых внутрижелудочно бактериальным экстрактом. Эти результаты очень важны, так как они показывают, что действие бактериального экстракта на уровни IgG не зависит от способа введения.

Группа, обрабатываемая бактериальным экстрактом + hLf (Фиг.6)

Для животных, подвергающихся обработке бактериальным экстрактом + hLf, необходимо отм