Биспецифические антитела

Биспецифические антитела

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Данное изобретение относится к биспецифическим антителам, способам их получения, фармацевтическим композициям, содержащим указанные антитела, и к их применению.

Уровень техники

В последнее время был разработан широкий спектр форматов полиспецифических рекомбинантных антител, например, четырехвалентных биспецифических антител, например, путем слияния антитела формата IgG и одноцепочечных доменов (см., например, Coloma, M.J., et al., Nature Biotech 15 (1997) 159-163; WO 2001/077342; и Morrison, S.L., Nature Biotech. 25 (2007) 1233-1234).

Кроме того, было разработано несколько других новых форматов, в которых больше не сохраняется центральная структура антитела (IgA, IgD, IgE, IgG или IgM), например димерные, тримерные или тетрамерные антитела, миниантитела, несколько одноцепочечных форматов (scFv, Bis-scFv), которые способны связывать два или более двух антигенов (Holliger, P., et al., Nature Biotech 23 (2005) 1126-1136; Fischer, N., Leger O., Pathobiology 74 (2007) 3-14; Shen, J., et at., Journal of Immunological Methods 318 (2007) 65-74; Wu, С., et al., Nature Biotech. 25 (2007) 1290-1297).

Все эти форматы используют линкеры либо для слияния центральной структуры антитела (IgA, IgD, IgE, IgG или IgM) с другим связывающим белком (например, scFv), либо для слияния, например, двух Fab-фрагментов или scFv (Fischer N., Leger О., Pathobiology 74 (2007) 3-14). Следует иметь в виду, что можно сохранить эффекторные функции, такие как, например, комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC) или антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC), которые опосредованы Fc-рецепторным связыванием, сохраняя высокую степень сходства с природными антителами.

В WO 2007/024715 сообщается об иммуноглобулинах с двойственным вариабельным доменом, полученных путем генной инженерии в виде поливалентных и полиспецифичных связывающих белков. Процесс получения биологически активных димеров антител представлен в патенте США 6897044. Многовалентные Fv-конструкции антител, имеющие по меньшей мере четыре вариабельных домена, которые связаны друг с другом через пептидные линкеры, представлены в патенте США 7129330. Димерные и мультимерные структуры, связывающие антиген, представлены в патенте США 2005/0079170. В патенте США 6511663 представлен трех- или четырехвалентный моноспецифический антигенсвязывающий белок, содержащий три или четыре Fab-фрагмента, связанных друг с другом ковалентно с помощью связывающей структуры, при этом белок не является природным иммуноглобулином. В патенте WO 2006/020258 представлены четырехвалентные биспецифические антитела, которые могут эффективно экспрессироваться в прокариотических и эукариотических клетках, и могут быть использованы в терапевтических и диагностических способах. В патенте США 2005/0163782 представлен способ разделения или преимущественно синтеза димеров, которые связаны по меньшей мере одной межцепочечной дисульфидной связью, из димеров, которые не связаны по меньшей мере одной межцепочечной дисульфидной связью, из смеси, содержащей два типа полипептидных димеров. В патенте США 5959083 представлены биспецифические четырехвалентные рецепторы. В патенте WO 2001/077342 представлены созданные путем генной инженерии антитела с тремя или более чем тремя функциональными сайтами связывания антигена.

В патенте WO 1997/001580 представлены полиспецифические и поливалентные антигенсвязывающие полипептиды. В патенте WO 1992/004053 представлены гомоконъюгаты, как правило, полученные из моноклональных антител класса IgG, ковалентно связанных путем синтетического сшивания, которые связываются с одной и той же антигенной детерминантой. В патенте WO 1991/06305 представлены олигомерные моноклональные антитела с высокой авидностью к антигену, как правило, класса IgG, которые секретируются в виде двух или более чем двух иммуноглобулиновых мономеров, связанных вместе для формирования четырехвалентных или шестивалентных молекул IgG. В патенте США 6350860 представлены антитела, полученные от овец, и конструкции антител, полученные путем генной инженерии, которые могут быть использованы для лечения заболеваний, при которых активность гамма-интерферона является патогенной. В патенте США 2005/0100543 представлены целевые конструкции, которые являются поливалентными носителями биспецифических антител, т.е. каждая молекула целевой конструкции может служить носителем двух или более чем двух биспецифических антител.

В патенте WO 1995/009917 представлены генно-инженерные биспецифические четырехвалентные антитела. В патенте WO 2007/109254 представлены стабилизированные связывающие молекулы, состоящие из или содержащие стабилизированные scFv.

О биспецифических антителах против EGFR и IGF-1R известно из Lu, D., et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 318 (2004) 507-513; Lu, D., et al., J. Biol. Chem., 279 (2004) 2856-2865; и Lu, D., et al., J. Biol Chem. 280 (2005) 19665-72.

Патент США 2007/0274985 относится к синтетическим молекулам антител, содержащим одноцепочечные белки Fab (scFab), которые также могут быть связаны сдимерами, включая гетеромерные антитела, в которых по меньшей мере две одноцепочечные молекулы антител ассоциированы друг с другом.

Патент WO 2009/080253 относится к биспецифическим двухвалентным антителам.

Тем не менее, в силу различных проблем и аспектов мультиспецифических антител (таких как, например, фармакокинетические и биологические свойства, стабильность, агрегация, выход экспрессии, побочные продукты), существует необходимость других альтернативных форматов полиспецифических антител.

Сущность изобретения

В одном аспекте изобретение относится к биспецифическому антителу, содержащему

а) тяжелую цепь и легкую цепь первого антитела полной длины, которое специфически связывается с первым антигеном;

б) тяжелую цепь и легкую цепь второго антитела полной длины, которое специфически связывается со вторым антигеном, где М-конец тяжелой цепи связан с С-концом легкой цепи через пептидный линкер.

В другом аспекте изобретения биспецифическое антитело в соответствии с изобретением также характеризуется тем, что

СН3-домен тяжелой цепи антитела полной длины а) и СН3-домен тяжелой цепи антитела полной длины б) встречаются на контактной поверхности, которая включает изменение в исходной контактной поверхности между СН3-доменами антитела;

где i) в СН3-домене одной тяжелой цепи

аминокислотный остаток заменен аминокислотным остатком с боковой цепью большего объема и создает тем самым выступ в контактной поверхности СН3-домена одной тяжелой цепи, которая размещается в полости на контактной поверхности СН3-домена другой тяжелой цепи,

и где

ii) в СН3-домене другой тяжелой цепи

аминокислотный остаток заменен аминокислотным остатком с боковой цепью меньшего объема и создает тем самым полость в контактной поверхности второго СН3-домена, в которой размещается выступ на контактной поверхности первого СН3-домена.

В другом аспекте биспецифическое антитело в соответствии с изобретением характеризуется тем, что

оба СН3-домена далее изменены путем введения цистеина (С) в качестве аминокислоты в соответствующих позициях каждого СН3-домена таким образом, чтобы между двумя СН3-доменами мог быть сформирован дисульфидный мостик.

В другом аспекте изобретения биспецифическое антитело в соответствии с изобретением характеризуется тем, что

вариабельный домен тяжелой цепи антитела (VH) и вариабельный домен легкой цепи антитела (VL) тяжелой и легкой цепей второго антитела полной длины б) являются дисульфид-стабилизированными за счет введения дисульфидных связей между следующими позициями:

i) позицией 44 вариабельного домена тяжелой цепи и позицией 100 вариабельного домена легкой цепи,

ii) позицией 105 вариабельного домена тяжелой цепи и позицией 43 вариабельного домена легкой цепи, или

iii) позицией 101 вариабельного домена тяжелой цепи и позицией 100 вариабельного домена легкой цепи.

В другом аспекте изобретения биспецифическое антитело в соответствии с изобретением характеризуется тем, что

а) первое антитело полной длины специфически связывается с IGF-1R и включает тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID №1 и легкую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID №2, и

б) второе антитело полной длины специфически связывается с EGFR и включает тяжелую цепь, связанную с легкой цепью через пептидный линкер, где указанные тяжелая и легкая цепи, связанные пептидом, имеют аминокислотную последовательность SEQ ID №3.

В другом аспекте изобретения биспецифическое антитело в соответствии с изобретением характеризуется тем, что

а) первое антитело полной длины специфически связывается с IGF-1R и включает тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID №1 и легкую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID №2 и

б) второе антитело полной длиной специфически связывается с EGFR и включает тяжелую цепь, связанную с легкой цепью через пептидный линкер, где указанные тяжелая и легкая цепи, связанные пептидом, имеют аминокислотную последовательность SEQ ID №4.

В другом аспекте изобретения биспецифическое антитело в соответствии с изобретением характеризуется тем, что

а) первое антитело полной длины специфически связывается с EGFR и включает тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID №5 и легкую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID №6,

б) второе антитело полной длиной специфически связывается с IGF-1R и включает тяжелую цепь, связанную с легкой цепью через пептидный линкер, где указанные тяжелая и легкая цепи, связанные пептидом, имеют аминокислотную последовательность SEQ ID №7.

В другом аспекте изобретения биспецифическое антитело в соответствии с изобретением характеризуется тем, что

а) первое антитело полной длины специфически связывается с EGFR и включает тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID №5 и легкую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID №6,

б) второе антитело полной длиной специфически связывается с IGF-1R и включает тяжелую цепь, связанную с легкой цепью через пептидный линкер, где указанные тяжелая и легкая цепи, связанные пептидом, имеют аминокислотную последовательность SEQ ID №8.

В другом аспекте изобретения биспецифическое антитело в соответствии с изобретением характеризуется тем, что антитело содержит константную область IgG1.

В другом аспекте изобретения биспецифическое антитело в соответствии с изобретением характеризуется тем, что антитело гликозилировано сахарной цепью на Asn297, где количество фукозы в сахарной цепи составляет 65% или ниже.

Кроме того, другими аспектами изобретения являются фармацевтическая композиция, содержащая указанное биспецифическое антитело, указанная композиция для лечения рака, применение указанного биспецифического антитела для изготовления лекарственного средства для лечения рака, способ лечения пациентов, страдающих от рака, путем введения указанного биспецифического антитела пациенту, нуждающемуся в таком лечении.

Еще один аспект изобретения представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую цепь биспецифического антитела в соответствии с изобретением.

Кроме того, изобретение предусматривает экспрессионные векторы, содержащие указанную нуклеиновую кислоту в соответствии с изобретением, способные экспрессировать указанную нуклеиновую кислоту в прокариотической или эукариотической клетке-хозяине, и клетки-хозяева, содержащие такие векторы, для рекомбинантной продукции биспецифического антитела в соответствии с изобретением.

Кроме того, изобретение включает прокариотическую или эукариотическую клетку-хозяина, содержащую вектор в соответствии с изобретением.

Кроме того, изобретение включает способ получения биспецифического антитела в соответствии с изобретением, который характеризуется экспрессией нуклеиновой кислоты в соответствии с изобретением в прокариотической или эукариотической клетке-хозяине и извлечением указанного биспецифического антитела из указанной клетки или из супернатанта клеточной культуры. Кроме того, изобретение включает антитело, полученное таким способом, для производства биспецифического антитела.

Другим аспектом изобретения является способ получения биспецифического антитела в соответствии с изобретением, включающий этапы

а) трансформации клетки-хозяина векторами, содержащими нуклеиновокислотные молекулы, кодирующие

аа) тяжелую цепь и легкую цепь первого антитела полной длины, которое специфически связывается с первым антигеном; и

аб) тяжелую цепь и легкую цепь второго антитела полной длины, которое специфически связывается со вторым антигеном, где N-конец тяжелой цепи связан с С-концом легкой цепи через пептидный линкер;

б) культивирования клетки-хозяина в условиях, обеспечивающих синтез указанной молекулы антитела; и

в) извлечения указанной молекулы антитела из указанной культуры.

Было обнаружено, что биспецифические антитела в соответствии с изобретением обладают ценными характеристиками, такими как хороший выход экспрессии в клетках млекопитающих (например, HEK293- и СНО-клетках), стабильность, биологическая или фармакологическая активность, фармакокинетические свойства. Они могут быть использованы, например, для лечения таких заболеваний как рак. Эти биспецифические антитела в соответствии с изобретением, содержащие три полипептидные цепи, имеют профиль ценного побочного продукта при экспрессии в клетках млекопитающих.

Описание графических материалов

Фиг.1. Схематическая структура антитела полной длины без домена СН4, которое специфически связывается с первым антигеном 1 с двумя парами тяжелых и легких цепей, которые содержат вариабельные и константные домены в типичном порядке.

Фиг.2. Схематическая структура биспецифического антитела в соответствии с изобретением.

Фиг.3а и 3b. Схематическая структура биспецифического антитела в соответствии с изобретением, включающего изменение СН3-доменов типа «ключ-замок».

Фиг.4а и 4b. Схематическая структура биспецифического антитела в соответствии с изобретением, включающего изменение СН3-доменов типа «ключ-замок» и дисульфидную стабилизацию VH- и VL-домена тяжелой и легкой цепи второго антитела.

Фиг.5. Ингибирование пролиферации HUVEC биспецифическим антителом в соответствии с изобретением Ang2-VEGF-OA-Ava-N-scFabLC06.

Фиг.6. Ингибирование фосфорилирования Tie2 биспецифическим антителом в соответствии с изобретением Ang2-VEGF-OA-Ava-N-scFabLC06.

Фиг.7. Вестерн-блот (восст.) OA-Ak18-scFab-GA201 (фиг.7а) и OA-GA201-scFab-Ak18 (фиг.7b).

Фиг.8. Подавление роста раковых клеток Н322М биспецифическим <EGFR-IGF1R> антителом OA-GA201-scFab-Ak18_WT (дозозависимое) по сравнению с родительскими моноспецифическими антителами <IGF-1R> HUMAB клон 18 или<EGFR>ICR62.

Фиг.9. Biacore (поверхностный плазменный резонанс)-сенсограмма: Биспецифическое антитело OA-GA201-scFab-Ak18_WT показало одновременное связывание аминосвязанного человеческого EGFR и человеческого IGF1R (ось абсцисс: ответ, ось ординат: время).

Фиг.10. Подавление роста опухоли на модели с ксенотрансплантатом ВхРС3 антителом OA-GA201-scFab-Ak18_WT по сравнению с комбинацией родительских моноспецифических антител <IGF-1R> HUMAB клон 18 и <EGFR> ICR62.

Подробное описание изобретения

В одном аспекте изобретение относится к биспецифическому антителу, содержащему

а) тяжелую цепь и легкую цепь первого антитела полной длины, которое специфически связывается с первым антигеном;

б) тяжелую цепь и легкую цепь второго антитела полной длины, которое специфически связывается со вторым антигеном, где N-конец тяжелой цепи связан с С-концом легкой цепи через пептидный линкер.

Термин «антитело полной длины» означает антитело, состоящее из двух «тяжелых цепей антитела полной длины» и двух «легких цепей антитела полной длины» (см. фиг.1). «Тяжелая цепь антитела полной длины» представляет собой полипептид, содержащий от N-конца по направлению к С-концу вариабельный домен тяжелой цепи антитела (VH), константный домен 1 тяжелой цепи антитела (СН1), шарнирную область антитела (HR), константный домен 2 тяжелой цепи антитела (СН2) и константный домен 3 тяжелой цепи антитела (СН3), сокращенно VH-CH1-HR-CH2-CH3, и, возможно, константный домен 4 тяжелой цепи антитела (СН4) в случае антитела подкласса IgE. Предпочтительно «тяжелая цепь антитела полной длины» представляет собой полипептид, содержащий от N-конца по направлению к С-концу VH, СН1, HR, СН2 и СН3. «Легкая цепь антитела полной длины» представляет собой полипептид, содержащий от N-конца по направлению к С-концу вариабельный домен легкой цепи антитела (VL) и константный домен легкой цепи антитела (CL), сокращенно VL-CL. Константный домен легкой цепи антитела (CL) может быть к (каппа) или Л (лямбда). Две цепи антитела полной длины связаны друг с другом посредством межполипептидных дисульфидных связей между доменом CL и доменом СН1 и между шарнирными областями тяжелых цепей антитела полной длины. Примерами типичных антител полной длины являются природные антитела, такие как IgG (например, IgG1 и IgG2), IgM, IgA, IgD и IgE. Антитела полной длины в соответствии с изобретением могут быть от одного вида, например, человека, либо они могут быть химерными или гуманизированными антителами. Антитела полной длины в соответствии с изобретением состоят из двух антигенсвязывающих сайтов, каждый из которых образован парой VH и VL, которые специфически связываются с одним и тем же антигеном. С-конец тяжелой или легкой цепи указанного антитела полной длины обозначает последнюю аминокислоту на С-конце указанной тяжелой или легкой цепи. N-конец тяжелой или легкой цепи указанного антитела полной длины обозначает последнюю аминокислоту на N-конце указанной тяжелой или легкой цепи.

Термин «пептидный линкер», используемый в изобретении, обозначает пептид с аминокислотной последовательностью, которая предпочтительно имеет синтетическое происхождение. Эти пептиды в соответствии с изобретением используются для соединения С-конца легкой цепи с N-концом тяжелой цепи второго антитела полной длины (которое специфически связывается со вторым антигеном) через пептидный линкер. Пептидный линкер в рамках тяжелой и легкой цепей второго антитела полной длины представляет собой пептид с аминокислотной последовательностью длиной не менее 30 аминокислот, предпочтительно с длиной от 32 до 50 аминокислот. В одном воплощении пептидный линкер представляет собой пептид с аминокислотной последовательностью длиной от 32 до 40 аминокислот. В одном воплощении указанный линкер представляет собой (GxS)n, где G = глицин, S = серин, (х=3, n=8, 9 или 10 и m=0, 1, 2 или 3) или (х=4 и n=6, 7 или 8, m=0, 1, 2 или 3), предпочтительно х=4, n=6 или 7 и m=0, 1, 2 или 3, более предпочтительно х=4, n=7 и m=2. В одном воплощении указанный линкер представляет собой (G₄S)₆G₂. Предпочтительно СН3-домены биспецифического антитела в соответствии с изобретением могут быть изменены по технологии «ключ-замок», которая подробно описана в нескольких примерах, например, в WO 96/027011, Ridgway J.B., et al., Protein Eng 9 (1996) 617-621; и Merchant, A.M., et al., Nat Biotechnol 16 (1998) 677-681. В этом способе поверхности взаимодействия двух СН3-доменов изменены таким образом, чтобы увеличилась гетеродимеризация обеих тяжелых цепей, содержащих эти два СН3-домена. Каждый из двух СН3-доменов (двух тяжелых цепей) может быть «замком», а другой «ключом». Введение дисульфидного мостика стабилизирует гетеродимеры (Merchant, A.M, et al., Nature Biotech 16 (1998) 677-681; Atwell, S., et al. J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35) и увеличивает выход.

В одном аспекте изобретения биспецифическое антитело в соответствии с изобретением дополнительно характеризуется тем, что

СН3-домен одной тяжелой цепи и СН3-домен другой тяжелой цепи встречаются на контактной поверхности, которая включает исходную контактную поверхность между СН3-доменами антитела;

где указанная контактная поверхность изменена таким образом, чтобы способствовать формированию биспецифического антитела, причем изменение характеризуется тем, что:

а) СН3-домен одной тяжелой цепи изменен таким образом,

что в исходной контактной поверхности СН3-домена одной тяжелой цепи, которая встречается с исходной контактной поверхностью СН3-домена другой тяжелой цепи в биспецифическом антителе,

аминокислотный остаток заменен аминокислотным остатком с боковой цепью большего объема и создает тем самым выступ в контактной поверхности СН3-домена одной тяжелой цепи, которая размещается в полости на контактной поверхности СН3-домена другой тяжелой цепи,

и

б) СН3-домен другой тяжелой цепи изменен таким образом,

что в исходной контактной поверхности второго СН3-домена, который встречается с исходной контактной поверхностью первого СН3-домена в биспецифическом антителе,

аминокислотный остаток заменен аминокислотным остатком с боковой цепью меньшего объема и создает тем самым полость в контактной поверхности второго СН3-домена, в которой размещается выступ на контактной поверхности первого СН3-домена.

Таким образом, антитело в соответствии с изобретением предпочтительно характеризуется тем, что

СН3-домен тяжелой цепи антитела полной длины а) и СН3-домен тяжелой цепи антитела полной длины б) встречаются на контактной поверхности, которая включает изменения в исходной контактной поверхности СН3-доменов антитела;

где i) в СН3-домене одной тяжелой цепи

аминокислотный остаток заменен аминокислотным остатком с боковой цепью большего объема и создает тем самым выступ в контактной поверхности СН3-домена одной тяжелой цепи, которая размещается в полости на контактной поверхности СН3-домена другой тяжелой цепи,

и где

ii) в СН3-домене другой тяжелой цепи

аминокислотный остаток заменен аминокислотным остатком с боковой цепью меньшего объема и создает тем самым полость в контактной поверхности второго СН3-домена, в которой размещается выступ на контактной поверхности первого СН3-домена.

Предпочтительно указанный аминокислотный остаток, имеющий боковую цепь большего объема, выбран из группы, состоящей из аргинина (R), фенилаланина (F), тирозина (Y), триптофана (W).

Предпочтительно указанный аминокислотный остаток, имеющий боковую цепь меньшего объема, выбран из группы, состоящей из аланина (А), серина (S), треонина (Т), валина (V).

В одном аспекте изобретения оба СН3-домена также изменены путем введения цистеина (С) в качестве аминокислоты в соответствующих позициях каждого СН3-домена, так что может быть сформирован дисульфидный мостик между двумя СН3-доменами.

В одном воплощении биспецифическое антитело содержит мутацию T366W в СН3-домене «цепи-ключа» и мутации T366S, L368A, Y407V в СН3-домене «цепи-замка». Также может быть использован дополнительный межцепочечный дисульфидный мостик между СН3-доменами (Merchant, A.M, et al., Nature Biotech 16 (1998) 677-681), например, путем введения мутации Y349C в СН3-домен «цепи-ключа» и мутации Е356С или мутации S354C в СН3-домен «цепи-замка».

В другом воплощении биспецифическое антитело в соответствии с изобретением содержит мутации Y349C, T366W в одном из двух СН3-доменов и мутации Е356С, T366S, L368A, Y407V в другом из двух СН3-доменов. В другом предпочтительном воплощении биспецифическое антитело содержит мутации Y349C, T366W в одном из двух СН3-доменов и мутации S354C, T366S, L368A, Y407V в другом из двух СН3-доменов (дополнительная мутация Y349C в одном СН3-домене и дополнительная мутация Е356С или S354C в другом СН3-домене для формирования межцепочечного дисульфидного мостика) (нумерация всегда в соответствии с ЕС индексом Кабата). Альтернативно или дополнительно также могут быть использованы и другие технологии типа «ключ-замок», описанные в ЕР 1870459А1. Таким образом, другим примером биспецифического антитела являются мутации R409D; K370E в СН3-домене области «цепи-ключа» и мутации D399K; E357K в СН3-домене области «цепи-замка» (нумерация всегда в соответствии с ЕС индексом Кабата).

В другом воплощении биспецифическое антитело содержит мутацию T366W в СН3-домене «цепи-ключа» и мутации T366S, L368A, Y407V в СН3-домене «цепи-замка», и дополнительно мутации R409D; K370E в СН3-домене «цепи-ключа» и мутации D399K; E357K в СН3-домене «цепи-замка».

В другом воплощении биспецифическое антитело содержит мутации Y349C, T366W в одном из двух СН3-доменов и мутации S354C, T366S, L368A, Y407V в другом из двух СН3-доменов, или указанное трехвалентное биспецифические антитело содержит мутации Y349C, T366W в одном из двух СН3-доменов и мутации S354C, T366S, L368A, Y407V в другом из двух СН3-доменов, и дополнительно мутации R409D; K370E в СН3-домене «цепи-ключа» и мутации D399K; E357K в СН3-домене «цепи-замка».

В одном воплощении вариабельный домен тяжелой цепи антитела (VH) и вариабельный домен легкой цепи антитела (VL) тяжелой и легкой цепей второго антитела полной длины (которое специфически связывается со вторым антигеном) являются дисульфид-стабилизированными за счет введения дисульфидной связи между следующими позициями:

i) позицией 44 вариабельного домена тяжелой цепи и позицией 100 вариабельного домена легкой цепи,

ii) позицией 105 вариабельного домена тяжелой цепи и позицией 43 вариабельного домена легкой цепи, или

iii) позицией 101 вариабельного домена тяжелой цепи и позицией 100 вариабельного домена легкой цепи (нумерация всегда в соответствии с ЕС индексом Кабата).

В одном воплощении вариабельный домен тяжелой цепи антитела (VH) и вариабельный домен легкой цепи антитела (VL) тяжелой и легкой цепей второго антитела полной длины (которое специфически связывается со вторым антигеном) являются дисульфид-стабилизированными за счет введения дисульфидной связи между следующими позициями: позицией 44 вариабельного домена тяжелой цепи и позицией 100 вариабельного домена легкой цепи.

Такая дальнейшая дисульфидная стабилизация достигается за счет введения дисульфидной связи между вариабельными доменами VH и VL тяжелой и легкой цепей второго антитела полной длины. Методики введения неприродных дисульфидных мостиков для стабилизации одноцепочечного Fv описаны, например, в WO 94/029350, Rajagopal, V., et al, Prot. Engin. 10 (1997) 1453-59; Kobayashi, H., et al., Nuclear Medicine & Biology, Vol.25, (1998) 387-393; или Schmidt, М., et al., Oncogene (1999) 18, 1711-1721. В одном воплощении возможная дисульфидная связь между вариабельными доменами тяжелой и легкой цепей второго антитела полной длины находится между позицией 44 вариабельного домена тяжелой цепи и позицией 100 вариабельного домена легкой цепи. В одном воплощении возможная дисульфидная связь между вариабельными доменами находится между позицией 105 вариабельного домена тяжелой цепи и позицией 43 вариабельного домена легкой цепей (нумерация всегда в соответствии с ЕС индексом Кабата).

В одном воплощении предпочтительным является биспецифическое антитело в соответствии с изобретением с указанной дополнительной дисульфидной стабилизацией между вариабельными доменами VH и VL тяжелой и легкой цепей второго антитела полной длины.

В одном воплощении предпочтительным является биспецифическое антитело в соответствии с изобретением без указанной дополнительной дисульфидной стабилизации между вариабельными доменами VH и VL тяжелой и легкой цепей второго антитела полной длины.

Обе части биспецифического антитела в соответствии с изобретением содержат антигенсвязывающие сайты (тяжелая и легкая цепи первого антитела полной длины содержат один антигенсвязывающий сайт, и тяжелая и легкая цепи второго антитела полной длины содержат один антигенсвязывающий сайт). Термины «сайт связывания» или «антигенсвязывающий сайт», используемые в данном документе, обозначают область(и) указанного биспецифического антитела в соответствии с изобретением, с которой обычно связывается соответствующий антиген. Каждый из антигенсвязывающих сайтов тяжелой и легкой цепей первого антитела полной длины и тяжелой и легкой цепей второго антитела полной длины сформированы парой, состоящей из вариабельного домена легкой цепи антитела (VL) и вариабельного домена тяжелой цепи антитела (VH).

Антигенсвязывающие сайты, которые связываются с нужным антигеном (например, EGFR) могут быть получены а) из известных антител к антигену (например, анти-EGFR-антител) или б) из новых антител или фрагментов антител, полученных с помощью способов иммунизации de novo с использованием, помимо прочего, антигенного белка или нуклеиновой кислоты или их фрагментов или с помощью фагового дисплея.

Антигенсвязывающий сайт антитела в соответствии с изобретением содержит шесть определяющих комплементарность областей (CDR), которые в разной степени способствуют аффинности сайта связывания и антигена. Существует три CDR вариабельного домена тяжелой цепи (CDRH1, CDRH2 и CDRH3) и три CDR вариабельного домена легкой цепи (CDRL1, CDRL2 и CDRL3). Протяженность CDR и каркасных областей (FR) определяют путем сравнения с базой данных аминокислотных последовательностей, в которых эти области были определены в соответствии с вариабельностью среди последовательностей.

Специфичность антитела относится к селективному распознаванию антителом определенного эпитопа антигена. Природные антитела, например, являются моноспецифическими. Термин «биспецифическое» антитело используемый в данном документе, означает антитело, которое имеет два или более двух антигенсвязывающих сайтов и связывается с двумя различными антигенами или двумя различными эпитопами одного и того же антигена. «Биспецифические антитела» в соответствии с изобретением являются антителами, которые имеют две различных антигенсвязывающих специфичности. В одном воплощении антитела данного изобретения являются биспецифическими для двух различных антигенов, т.е. VEGF в качестве первого антигена и Ang-2 в качестве второго антигена или, например, EGFR в качестве первого антигена и IGF-1R в качестве второго антигена, или наоборот.

Термин «моноспецифическое» антитело, используемый в данном документе, означает антитело, которое имеет один или более чем один сайт связывания, каждый из которых связывается с одним и тем же эпитопом одного и того же антигена.

Термин «валентность», используемый в данной заявке, означает наличие определенного количества сайтов связывания в молекуле антитела. Таким образом, термины «трехвалентный», «четырехвалентный», «пятивалентный» и «шестивалентный» обозначают наличие в молекуле антитела трех сайтов связывания, четырех сайтов связывания, пяти сайтов связывания и шести сайтов связывания, соответственно. Природное антитело, например, или биспецифическое антитело в соответствии с изобретением обладает двумя сайтами связывания и является двухвалентным.

Термин «EGFR», используемый в данном документе, относится к рецептору человеческого эпидермального фактора роста (также известному как HER-1 или Erb-B1, SEQ ID №13), 170 кДа трансмембранному рецептору, кодируемому протоонкогеном с-erbB и демонстрирующему внутреннюю тирозинкиназную активность (Modjtahedi, H., et al., Br. J. Cancer 73 (1996) 228-235; Herbst, R.S., и Shin, DM, Cancer 94 (2002) 1593-1611). Запись в базе данных SwissProt P00533 предусматривает последовательность EGFR. Есть также изоформы и варианты EGFR (например, альтернативные РНК-транскрипты, усеченные версии, полиморфизмы и т.д.), включая те, которые определены записями в базе данных Swissprot №№ Р00533-1, Р00533-2, Р00533-3 и Р00533-4, но не ограничиваясь ими. EGFR, как известно, связывает лиганды, в том числе эпидермальный фактор роста (EGF), трансформирующий фактор роста-α (TGF-амфирегулин, гепарин-связывающий EGF (hb-EGF), бетацеллюлин и эпирегулин (Herbst, R.S., and Shin, D.M., Cancer 94 (2002) 1593-1611; Mendelsohn, J., и Baselga, J., Oncogene 19 (2000) 6550-6565). EGFR регулирует многочисленные клеточные процессы через опосредованные тирозинкиназой пути передачи сигнала, в том числе, но не ограничиваясь этим, активацию путей передачи сигнала, которые контролируют клеточную пролиферацию, дифференцировку, выживание клеток, апоптоз, ангиогенез, митогенез и метастазирование (Atalay, G., et al., Ann. Oncology 14 (2003) 1346-1363; Tsao, A.S., и Herbst, R.S, Signal 4 (2003) 4-9; Herbst, R.S., и Shin, DM, Cancer 94 (2002) 1593-1611; Modjtahedi, H., et al., Br. J. Cancer 73 (1996) 228-235).

Термин «IGF-1R», используемый в данном документе, относится к рецептору человеческого инсулин-подобного фактора роста I (IGF-IR, антиген CD 221; SEQ ID №14), который принадлежит к семейству трансмембранных белков тирозинкиназ (LeRoith, D., et al., Endocrin. Rev. 16 (1995) 143-163; и Adams, Т.Е., et al., Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000) 1050-1063). Запись в базе данных SwissProt P08069 предусматривает последовательность IGF-1R. IGF-IR связывает IGF-I с высокой аффинностью и инициирует физиологическую реакцию на этот лиганд in vivo. IGF-IR также связывается с IGF-II, однако с несколько более низкой аффинностью. Сверхэкспрессия IGF-IR способствует опухолевой трансформации клеток, и существует доказательство того, что IGF-IR участвует в злокачественной трансформации клеток и, следовательно, является полезной мишенью для разработки терапевтических агентов для лечения рака (Adams, Т.Е., et al., Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000) 1050-1063).

В предпочтительном аспекте изобретения биспецифическое антитело в соответствии с изобретением специфически связывается с человеческим IGF-1R, а также с человеческим EGFR (т.е. биспецифическое антитело в соответствии с изобретением является биспецифическим анти-IGF-1R/анти-EGFR-антителом). Биспецифическое антитело основано на антигенсвязывающих сайтах человека <IGF-1R> HUMAB клон 18 (DSM АСС 2587; WO 2005/005635, сокращенно <IGF-1R> клон 18 или <IGF-1R> AK18) и гуманизированного <EGFR> ICR62 (WO 2006/082515, сокращенно <EGFR> ICR62). Соответствующие аминокислотные последовательности легкой и тяжелой цепей этих биспецифических двухвалентных антител приведены в SEQ ID №1, SEQ ID №2, SEQ ID №3 (для OA-Ak18-scFab-GA201), в SEQ ID №5, SEQ ID №6, SEQ ID №7 (для OA-GA201-scFab-Ak18), в SEQ ID №1, SEQ ID №2, SEQ ID №4 (для OA-Ak18-scFab -GA201_WT), а в SEQ ID №5, SEQ ID №6, SEQ ID №8 (для OA-GA201-scFab-Ak18_WT).

Биспецифические антитела <EGFR-IGF-1R> в соответствии с изобретением демонстрируют преимущества для пациентов, людей, нуждающихся в EGFR- и IGF-IR-нацеленной терапии. Антитела в соответствии с изобретением имеют весьма ценные свойства, дающие пользу пациентам, страдающим от таких заболеваний, особенно страдающих от рака. Биспецифические антитела <EGFR-IGF-1R> в соответствии с изобретением демонстрируют, например, снижение интернализации рецепторов IGF-1R по сравнению с моноспецифическим родительским антителом <IGF-1R>. Кроме того, они демонстрируют хорошее нацеливание на опухолевые клетки, экспрессирующие оба антигена EGFR и IGF-1R, что является выгодным в плане соотношения эффективности/токсичности для пациентов, страдающих от рака, экспрессирующего оба антигена, EGFR и IGF-1R.

Таким образом, в одном аспекте изобретения биспецифическое антитело в соответствии с изобретением характеризуется тем, что

а) первое антитело полной длины специфически связывается с IGF-1R и включает тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID №1 и легкую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID №2, и

б) второе антитело полной длины специфически связывается с EGFR и включает тяжелую цепь, связанную с легкой цепью через пептидный линкер, где указанные связанные тяжелая и легкая цепи имеют аминокислотную последовательность SEQ ID №3.

В другом аспекте изобретения биспецифическое антитело в соответствии с изобретением характеризуется тем, что

а) первое антитело полной длины специфически связывается с IGF-1R и включает тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID №1 и легкую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID №2, и

б) второе антитело полной длины специфически связывается с EGFR и включает тяжелую цепь, связанную с легкой цепью через пептидный линкер, где указанные связанные тяжелая и легкая цепи имеют аминокислотную последовательность SEQ ID №4.

В другом аспекте изобретения биспецифическое антитело в соответствии с изобретением характеризуется тем, что

а) первое антитело полной длины специфически связывается с EGFR и включает тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID №5 и легкую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID №6, и

б) второе антитело полной длины специфически связывается с IGF-1R и включает тяжелую цепь, связанную с легкой цепью через пептидный линкер, где указанные связанные тяжелая и легкая цепи имеют аминокислотную последовательность SEQ ID №7.

В другом аспекте изобретения биспецифическое антитело в соответствии с изобретением характеризуется тем, что

а) первое антитело полной длины специфически связывается с EGFR и включает тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID №5 и легкую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID №6, и

б) второе антитело полной длины специфически связывается с IGF-1R и включает тяжелую цепь, связанную с легкой цепью через пептидный линкер, где указанные связанные тяжелая и легкая цепи имеют аминокислотную последовательность SEQ ID №8.

Таким образом, в одном воплощении изобретения биспецифическое антитело представляет собой анти-IGF-1R/анти-EGFR-антитело и характеризуется тем, что содержит