Антитела против cxcr4 для лечения инфекции вич

Антитела против cxcr4 для лечения инфекции вич

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к новым антителам, в частности мышиным моноклональным антителам, химерным и гуманизированным, способным специфически связываться с хемокиновыми рецепторами (CXCR), а также амино- и нуклеиновокислотным последовательностям, кодирующим такие антитела. Согласно одному из аспектов изобретение относится к новым антителам, функциональным фрагментам или производным, способным специфически связываться с CXCR4 и обладающим высокой активностью против инфекции вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ). Изобретение также включает применение таких антител, функциональных фрагментов или производных в качестве лекарственного средства для превентивного и/или терапевтического лечения ВИЧ-инфекции.

Хемокины представляют собой небольшие секретируемые пептиды, которые регулируют миграцию лейкоцитов по направлению химического градиента (концентрации) лиганда, известного как хемокиновый градиент, в особенности при иммунных реакциях (ZIotnick А. и соавт., 2000). Они подразделяются на два основных подсемейства, СС и СХС, в зависимости от расположения их NH₂-концевых цистеиновых остатков, и связываются с G-белок-связанными рецепторами, два основных подсемейства которых обозначаются как CCR и CXCR. К настоящему времени описано более 50 человеческих хемокинов и 18 хемокиновых рецепторов.

Некоторые члены семейства хемокиновых рецепторов функционируют в качестве корецепторов вместе с важнейшим рецептором CD4, облегчая проникновение различных штаммов ВИЧ 1 типа в клетки, при этом основными корецепторами являются CCR5 и CXCR4. Обладающие тропностью к Т-клеткам Х4-ВИЧ-1 для проникновения в клетки используют CD4 и CXCR4, тогда как макрофагтройные R5 ВИЧ-1 используют CD4 и CCR5. Штаммы с двойной тропностью в качестве корецепторов могут использовать как CXCR4, так и CCR5. CCR3, CCR2, CCR8, CXCR6, CXCR7, CX3CR1, среди других хемокиновых рецепторов, могут функционировать в качестве корецепторов для более ограниченной подгруппы штаммов ВИЧ.

SDF-1, природный лиганд CXCR4, а также лиганды CCL3, CCL4, CCL4-L1 и CCL5 для CCR5 способны ингибировать слияние клеток и инфекцию различными штаммами ВИЧ-1. Эти данные способствовали разработке терапевтических средств против ВИЧ, направленных на хемокиновые рецепторы, приведшей к получению разрешения на проведение испытаний маравирока (CELSENTRI®), низкомолекулярного антагониста CCR5, в комбинации с другими агентами против ВИЧ-1 на пациентах, инфицированных CCR5-тропным ВИЧ-1. Однако, маравирок не применяется ни на пациентах, инфицированных ВИЧ-1 с двойной тропностью, ни на пациентах, инфицированных CXCR4-тропным ВИЧ-1 (справочник ВИДАЛЬ, 2009). Таким образом, существует очевидная потребность медицины в распространении этого типа терапии на пациентов, инфицированных как Х4-тропным ВИЧ, так и ВИЧ с двойной тропностью, терапии, основанной на идентификации антагонистов CXCR4, способных ингибировать репликацию Х4-тропного ВИЧ.

Хемокиновый рецептор 4 (также известный как фусин, CD184, LESTR или HUMSTR) существует в виде двух изоформ, содержащих 352 или 360 аминокислот. Остаток Asn11 гликозилирован, остаток Tyr21 модифицирован путем присоединения сульфатной группы, a Cys109 и 186 связаны с помощью дисульфидного мостика на внеклеточной части рецептора (Juarez J. и соавт., 2004).

Этот рецептор экспрессируется разными видами нормальных тканей, наивными Т-клетками, не являющимися клетками памяти, регуляторными Т-клетками, В-клетками, нейтрофилами, эндотелиальными клетками, первичными моноцитами, дендритными клетками, природными клетками-киллерами, CD34+гематопоэтическими стволовыми клетками и на низком уровне в сердце, толстом кишечнике, печени, почках и головном мозге. CXCR4 играет ключевую роль в миграции лейкоцитов, В-клеточном лимфопоэзе и миелопоэзе.

Уникальным лигандом рецептора CXCR4, описанным к настоящему времени, является фактор-1 стромальных клеток (SDF-1) или CXCL12. SDF-1 секретируется в большом количестве в лимфоузле, костном мозге, печени, легком и в меньшей степени секретируется почками, головным мозгом и кожей. CXCR4 также распознается антагонистическим хемокином, вирусным макрофагальным воспалительным белком II (vMIP-II), кодируемым вирусом человеческого герпеса III типа.

Как упомянуто ранее, рецептор CXCR4 является важнейшим корецептором для обладающих тропностью к Т-клеткам изолятов ВИЧ-1 (Х4-тропных вирусов). Оказание противодействия этому рецептору должно ингибировать репликацию Х4-тропных вирусов очень эффективным образом.

Один из аспектов настоящего изобретения заключается в создании мышиных моноклональных антител (Mab), ингибирующих репликацию ВИЧ. Изобретение охватывает CXCR4-Mab 515H7 (или его фрагменты), способное связываться с гомодимерами CXCR4 и обладающее высокими активностями против ВИЧ-инфекции. Изобретение также охватывает CXCR4-Mab 301аЕ5 (или его фрагменты), способное связываться с гомодимерами CXCR4 и обладающее высокими активностями против ВИЧ-инфекции.

Неожиданно акторам изобретения удалось создать моноклональные антитела, способные связываться с CXCR4, а также способные индуцировать конформационные изменения гомодимеров CXCR4 и способные ингибировать репликацию первичного изолята Х4-ВИЧ-1 в РВМС. Более конкретно, антитела по изобретению также могут быть способны ингибировать репликацию первичного изолята Х4/Р5-ВИЧ-1 в РВМС.

Предпочтительно, соединение CXCR4 представляет собой одну из двух изоформ CXCR4 человека, выбранную из группы, состоящей из:

- изоформы b хемокинового (мотив С-Х-С) рецептора 4 (Homo sapiens), имеющей последовательность, которая представлена в SEQ ID No.27 под номером доступа в Genbank NP_003458:

MEGISIYTSDNYTEEMGSGDYDSMKEPCFREENANFNKIFLPTIYSIIFLTGIVGNGLVILVMGYQKKLRSMTDKYRLHLSVADLLFVITLPFWAVDAVANWYFGNFLCKAVHVIYTVNLYSSVLILAFISLDRYLAIVHATNSQRPRKLLAEKWYVGVWIPALLLTIPDFIFANVSEADDRYICDRFYPNDLWWVFQFQHIMVGLILPGIVILSCYCIIISKLSHSKGHQKRKALKTTVILILAFFACWLPYYIGISIDSFILLEIIKQGCEFENTVHKWISITEALAFFHCCLNPILYAFLGAKFKTSAQHALTSVSRGSSLKILSKGKRGGHSSVSTESESSSFHSS;

- изоформы а хемокинового (мотив С-Х-С) рецептора 4 (Homo sapiens), имеющей последовательность, которая представлена в SEQ ID No.28 под номером доступа в Genbank NP_001008540:

MSIPLPLLQIYTSDNYTEEMGSGDYDSMKEPCFREENANFNKIFLPTIYSIIFLTGIVGNGLVILVMGYQKKLRSMTDKYRLHLSVADLLFVITLPFWAVDAVANWYFGNFLCKAVHVIYTVNLYSSVLILAFISLDRYLAIVHATNSQRPRKLLAEKWYVGVWIPALLLTIPDFIFANVSEADDRYICDRFYPNDLWWVFQFQHIMVGLILPGIVILSCYCIIISKLSHSKGHQKRKALKTTVILILAFFACWLPYYIGISIDSFILLEIIKQGCEFENTVHKWISITEALAFFHCCLNPILYAFLGAKFKTSAQHALTSVSRGSSLKILSKGKRGGHSSVSTESESSSFHSS;

- их альтернативного варианта транскрипции и сплайсинга или природного варианта, имеющего по меньшей мере 95% идентичности с одной из этих изоформ b или а, имеющей SEQ ID No.27 или 28; и

- их фрагмента, способного быть специфически распознанным их природным лигандом - фактором-1 стромальных клеток (SDF-1) - и содержащего предпочтительно по меньшей мере 100, 150 и 200 аминокислот.

CXCR2 выбран из группы, состоящей из:

- бета-рецептора интерлейкина 8 (Homo sapiens), имеющего последовательность, которая представлена под номером доступа в Genbank NP_001548SEQIDNo.29:

MEDFNMESDSFEDFWKGEDLSNYSYSSTLPPFLLDAAPCEPESLEINKYFWIIYALVFLLSLLGNSLVMLVILYSRVGRSVTDVYLLNLALADLLFALTLPIWAASKVNGWIFGTFLCKWSLLKEVNFYSGILLLACISVDRYLAIVHATRTLTQKRYLVKFICLSIWGLSLLLALPVLLFRRTVYSSNVSPACYEDMGNNTANWRMLLRILPQSFGFIVPLLIMLFCYGFTLRTLFKAHMGQKHRAMRVIFAWLIFLLCWLPYNLVLLADTLMRTQVIQETCERRNHIDRALDATEILGILHSCLNPLIYAFIGQKFRHGLLKILAIHGLISKDSLPKDSRPSFVGSSSGHTSTTL;

- его альтернативного варианта транскрипции и сплайсинга или природного варианта, имеющего по меньшей мере 95% идентичности с бета-рецептором интерлейкина 8, имеющим SEQ ID No.29; и

- его фрагмента, способного быть специфически распознанным IL-8 и содержащего предпочтительно по меньшей мере 100, 150 и 200 аминокислот.

Изобретение также включает способ отбора соединения, обладающего активностью против ВИЧ, или которое может быть использовано для изготовления композиции для лечения ВИЧ-инфекции, где указанный способ включает стадию:

В первом аспекте объектом настоящего изобретения является способ создания и отбора антител по изобретению.

Более конкретно, изобретение относится к способу отбора антитела против CXCR4 или одного из его функциональных фрагментов или производных, способных ингибировать репликацию ВИЧ, включающему следующие стадии:

1) скрининг созданных антител и отбор антител, способных специфически связываться с CXCR4;

2) тестирование отобранных на стадии (1) антител и отбор антител, способных связываться с мононуклеарными клетками периферической крови (РВМС),

3) тестирование отобранных на стадии (2) антител и отбор антител, способных связываться с гомодимером CXCR4, и затем

4) тестирование отобранных на стадии (3) антител и отбор антител, способных ингибировать репликацию первичных изолятов Х4-тропного ВИЧ-1 в РВМС.

В другом воплощении изобретение относится к способу отбора антитела против CXCR4 или одного из его функциональных фрагментов или производных, способных ингибировать репликацию ВИЧ, включающему следующие стадии:

1) скрининг созданных антител и отбор антител, способных специфически связываться с CXCR4;

2) тестирование отобранных на стадии (1) антител и отбор антител, способных связываться с мононуклеарными клетками периферической крови (РВМС),

3) тестирование отобранных на стадии (2) антител и отбор антител, способных связываться с гомодимером CXCR4, и затем

4) тестирование отобранных на стадии (3) антител и отбор антител, способных ингибировать репликацию первичных изолятов Х4-тропного ВИЧ-1 в РВМС и/или способных ингибировать репликацию первичных изолятов X4/R5-тропного ВИЧ-1 в РВМС.

Получение антител может быть реализовано любым способом, известным специалисту в данной области, таким как, например, слияние миеломной клетки с клетками селезенки из иммунизированных мышей или других видов, совместимых с отобранными миеломными клетками (Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256: 495-497). Иммунизированные животные могут включать трансгенных мышей с локусами иммуноглобулинов человека, которые затем при этом непосредственно продуцируют человеческие антитела. Другое возможное воплощение может состоять в использовании методов фагового дисплея для скрининга библиотек.

Стадии (1) и (2) скрининга могут быть реализованы любым способом или способом, известным специалисту в данной области. В качестве неограничивающих примеров можно упомянуть ELISA, BIAcore, иммуногистохимию, анализ вестерн-блоттинг с использованием CXCR4-экспрессирующих экстрактов клеточных мембран или очищенного CXCR4, анализ с применением FACS и функциональный скрининг. Предпочтительный способ заключается в скрининге посредством FACS-анализа на CXCR4-трансфектантах (стадия 1) и по меньшей мере на РВМС (стадия 2), чтобы иметь уверенность в том, что продуцируемые антитела будут также способны распознавать нативную конформацию рецептора CXCR4 на поверхности клетки-мишени. Этот способ будет описан более подробно в следующих далее примерах.

Стадия (3) скрининга может быть реализована любым способом или способом, известным специалисту в данной области. В качестве неограничивающего, но предпочтительного примера, можно упомянуть методы вестерн-блоттинга и/или иммунопреципитации с использованием представляющих интерес антител на экстракте мембран из CXCR4-трансфицированных клеток или РВМС.

Стадия (4) скрининга может быть реализована любым способом или способом, известным специалисту в данной области. В качестве неограничивающего, но предпочтительного примера, можно упомянуть способ, заключающийся в скрининге антител по их способности ингибировать репликацию первичных изолятов Х4-ВИЧ-1 и/или первичных изолятов Х4/Р5-ВИЧ-1 в РВМС с использованием протокола, описанного Holl и соавт. (J. Immunol. 2004, 173, 6274-83).

В предпочтительном воплощении стадии (3) отбора способа по изобретению указанная стадия (3) заключается в оценке антител с использованием BRET-анализа на клетках, экспрессирующих CXCR4-RLuc/CXCR4-YFP, и отборе антител, способных ингибировать по меньшей мере 40%, предпочтительно 45%, 50%, 55% и наиболее предпочтительно 60% сигнала BRET.

Известно, что технология BRET представляет собой репрезентативную технологию димеризации белков (Angers et al., PNAS, 2000, 97: 3684-89).

Технология BRET, используемая на стадии (3) способа, хорошо известна специалисту в данной области и будет подробно рассмотрена в следующих далее примерах. Более конкретно, BRET (резонансный перенос энергии биолюминесценции) представляет собой безизлучательный перенос энергии между донором биолюминесценции (люциферазой Renilla (Rluc)) и акцептором флуоресценции, мутантом GFP (зеленого флуоресцентного белка) или YFP (желтого флуоресцентного белка). В настоящем случае использовали EYFP (усиленный желтый флуоресцентный белок). Эффективность переноса зависит от ориентации донора и акцептора и расстояния между ними. Так, перенос энергии может происходить, только если эти две молекулы находятся в непосредственной близости (1-10 нм). Это свойство используют для разработки анализов белок-белковых взаимодействий. Действительно, чтобы изучить взаимодействие между двумя партнерами, осуществляют слияние на генетическом уровне первого из них с люциферазой Renilla, а второго - с желтым мутантом GFP. Слитые белки, как правило, но не обязательно, экспрессируют в клетках млекопитающих. В присутствии своего субстрата (коэлентеразина), для которого мембрана является проницаемой, Rluc испускает голубой свет.Если мутант GFP располагается относительно Rluc на расстоянии меньше 10 нм, может произойти перенос энергии, и можно зарегистрировать дополнительный желтый сигнал. Сигнал BRET измеряют как соотношение интенсивности света, испущенного акцептором, и интенсивности света, испущенного донором. Таким образом, сигнал BRET будет возрастать по мере того, как эти два слитых белка будут сближаться друг с другом, или если конформационное изменение сблизит Rluc и мутант GFP.

Если BRET-анализ применяется в предпочтительном воплощении, то для измерения конформационных изменений димеров CXCR4 может быть использован любой другой метод, известный специалисту в данной области. Можно упомянуть, без ограничения, следующие технологии: FRET (резонансный перенос энергии флуоресценции), HTRF (гомогенную флуоресценцию с разрешением по времени), FLIM (визуализирующую микроскопию времени жизни флуоресценции) или SW-FCCS (одноволновую флуоресцентную кросс-корреляционную спектроскопию).

Также можно было использовать другие классические технологии, такие как ко-иммунопреципитация, технология AlphaScreen, химическое перекрестное сшивание, двухгибридная система, аффинная хроматография, ELISA или дальний вестерн-блоттинг.

В конкретном аспекте способа по изобретению стадия (3) заключается в оценке антител с использованием BRET-анализа на клетках, экспрессирующих одновременно обе конструкции CXCR4-RLuc/CXCR4-YFP, и отборе антител, способных ингибировать по меньшей мере 40% сигнала BRET.

Во втором аспекте объектом изобретения являются выделенные антитела или один из их функциональных фрагментов либо одно из их производных, причем полученные указанным способом. Указанные антитела или один из их функциональных фрагментов либо одно из их производных способны специфически связываться с человеческим CXCR4, причем указанные антитела также способны индуцировать конформационные изменения гомодимеров CXCR4.

Из литературы известно, что CXCR4-Mab типа, например, клона А120, способны ингибировать проникновение лабораторного штамма ВИЧ-1 (X4HIV-1_NL4-3) в РВМС (Tanaka R. et al., J. Virol., 2001, 75, 11534-11543). Кроме того, также известно, что CXCR4-Mab способны ингибировать первичные изоляты Х4-ВИЧ-1 в клеточных линиях, экспрессирующих CXCR4. С другой стороны, никогда не описывалось антитело, способное ингибировать такой вирус в его природном окружении, то есть не только лабораторные вирусы или клеточные линии. Как бы то ни было, новый и неочевидный аспект изобретения заключается в том, что CXCR4-Mab способны ингибировать первичные изоляты Х4-ВИЧ-1 в РВМС.

Выражение "функциональные фрагменты и производные" будет определено подробно в описании настоящего изобретения позже.

Здесь должно быть понятно, что изобретение не относится к антителам в природной форме, другими словами, что они не находятся в их природном окружении, но что они могут быть выделены или получены очисткой из природных источников, или еще получены с использованием генетической рекомбинации, или посредством химического синтеза, и что они могут, кроме того, содержать неприродные аминокислоты, как будет описано далее.

Более конкретно, согласно другому аспекту изобретения заявлены выделенные антитела или один из их функциональных фрагментов либо одно из их производных, причем указанные антитела содержат по меньшей мере один определяющий комплементарность участок CDR, выбранный из CDR, содержащих аминокислотную последовательность SEQ ID No.1-6 и 30-33, как определено по системе нумерации IMGT (база данных по иммуногенетике (от англ. ImMunoGeneTics database)).

Согласно первому аспекту изобретение относится к выделенному антителу или его функциональному фрагменту либо производному, содержащему по меньшей мере один CDR, выбранный из CDR с последовательностями SEQ ID No.1-6, как определено по системе нумерации IMGT, или по меньшей мере один CDR, последовательность которого идентична по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98%, после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID No.1-6.

Согласно второму аспекту изобретение относится к выделенному антителу или его функциональному фрагменту либо производному, содержащему по меньшей мере один CDR, выбранный из CDR с последовательностями SEQ ID No.1, 2 и 30-33, как определено по системе нумерации IMGT, или по меньшей мере один CDR, последовательность которого идентична по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98%, после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID No.1, 2 и 30-33.

"Функциональный фрагмент" антитела означает, в частности, такой фрагмент антитела, как фрагменты Fv, scFv (sc=одноцепочечный), Fab, F(ab')₂, Fab', scFv-Fc или диатела, или любой фрагмент, период полувыведения которого увеличен. Такие функциональные фрагменты будут изложены подробно в описании настоящего изобретения позже.

"Дериватизированное соединение" или "производное" антитела означает, в частности, связывающий белок, состоящий из пептидного каркаса и по меньшей мере одного из CDR исходного антитела для сохранения его способности распознавать CXCR4. Такие дериватизированные соединения, хорошо известные специалисту в данной области, будут изложены более подробно в описании настоящего изобретения позже.

Более предпочтительно, изобретение включает антитела, их дериватизированные соединения или их функциональные фрагменты по настоящему изобретению, в особенности химерные или гуманизированные, полученные с использованием генетической рекомбинации или химического синтеза.

В соответствии с предпочтительным воплощением антитело по изобретению или его дериватизированные соединения либо функциональные фрагменты характеризуются тем, что состоят из моноклонального антитела.

Под термином "моноклональное антитело" понимается антитело, происходящее из почти гомогенной популяции антител. Более конкретно, индивидуальные антитела популяции являются идентичными за исключением немногочисленных возможных природных мутаций, которые могут быть обнаружены с минимальным относительным содержанием. Другими словами, моноклональное антитело представляет собой гомогенное антитело, являющееся результатом роста одного клеточного клона (например, гибридомы, эукариотической клетки хозяина, трансфицированной молекулой ДНК, кодирующей гомогенное антитело, прокариотической клетки хозяина, трансфицированной молекулой ДНК, кодирующей гомогенное антитело, и т.д.), и, как правило, характеризуется наличием тяжелых цепей одного и только одного класса и подкласса и легких цепей только одного типа. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными и направлены против индивидуального антигена. К тому же, в противоположность препаратам поликлональных антител, которые обычно включают различные антитела, направленные против различных детерминант или эпитопов, каждое моноклональное антитело направлено против единственного эпитопа данного антигена.

Более конкретно, в соответствии с первым предпочтительным воплощением изобретения антитело или его дериватизированные соединения либо функциональные фрагменты характеризуются тем, что содержат легкую цепь, содержащую по меньшей мере один CDR, выбранный из CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, где:

- CDR-L1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID No.1,

- CDR-L2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID No.2,

- CDR-L3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID No.3.

В соответствии с другим воплощением антитела по изобретению или одно из их дериватизированных соединений либо один из их функциональных фрагментов, характеризуются тем, что они содержат легкую цепь, содержащую по меньшей мере один из трех CDR с последовательностями SEQ ID No.1, 2 или 3, или по меньшей мере одну последовательность, идентичную по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98%, после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID No.1, 2 или 3.

Антитело по изобретению или один из его функциональных фрагментов либо одно из его производных также характеризуется тем, что содержит легкую цепь, содержащую CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, где CDR-L1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID No.1, CDR-L2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID No.2 и CDR-L3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID No.3.

В другом воплощении антитело по изобретению или один из его функциональных фрагментов либо одно из его производных характеризуется тем, что содержит легкую цепь с последовательностью, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID No.7, или по меньшей мере одну последовательность, идентичную по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98%, после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID No.7.

В соответствии со вторым предпочтительным воплощением изобретения антитело или его дериватизированные соединения или функциональные фрагменты характеризуются тем, что содержат легкую цепь, содержащую по меньшей мере один CDR, выбранный из CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, где:

- CDR-L1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID No.1,

- CDR-L2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID No.2,

- CDR-L3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID No.30.

В соответствии с другим воплощением антитела по изобретению или одно из их дериватизированных соединений либо один из их функциональных фрагментов характеризуются тем, что они содержат легкую цепь, содержащую по меньшей мере один из трех CDR с последовательностями SEQ ID No.1, 2 или 30, или по меньшей мере одну последовательность, идентичную по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98%, после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID No.1, 2 или 30.

Антитело по изобретению или один из его функциональных фрагментов либо одно из его производных также характеризуется тем, что содержит легкую цепь, содержащую CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, где CDR-L1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID No.1, CDR-L2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID No.2 и CDR-L3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID No.30.

В другом воплощении антитело по изобретению или один из его функциональных фрагментов либо одно из его производных характеризуется тем, что содержит легкую цепь с последовательностью, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID No.34, или по меньшей мере одну последовательность, идентичную по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98%, после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID No.34.

Более конкретно, антитела по изобретению или одно из их дериватизированных соединений либо один из их функциональных фрагментов характеризуются тем, что они содержат тяжелую цепь, содержащую по меньшей мере один CDR, выбранный из CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, где:

- CDR-H1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID No.4,

- CDR-H2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID No.5,

- CDR-H3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID No.6.

В соответствии с другим воплощением антитела по изобретению или одно из их дериватизированных соединений либо один из их функциональных фрагментов характеризуются тем, что они содержат тяжелую цепь, содержащую по меньшей мере один из трех CDR с последовательностями SEQ ID No.4, 5 или 6, или по меньшей мере одну последовательность, идентичную по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98%, после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID No.4, 5 или 6.

В соответствии с другим конкретным воплощением антитела или одно из их дериватизированных соединений либо один из их функциональных фрагментов характеризуются тем, что они содержат тяжелую цепь, содержащую CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, где CDR-H1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID No.4, CDR-H2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID No.5 и CDR-H3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID No.6.

В другом воплощении антитело по изобретению или один из его функциональных фрагментов либо одно из его производных характеризуется тем, что содержит тяжелую цепь с последовательностью, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID No.8, или по меньшей мере одну последовательность, идентичную по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98%, после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID No.8.

Более конкретно, антитела по изобретению или одно из их дериватизированных соединений либо один из их функциональных фрагментов характеризуются тем, что они содержат тяжелую цепь, содержащую по меньшей мере один CDR, выбранный из CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, где:

- CDR-H1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID No.31,

- CDR-H2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID No.32,

- CDR-H3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID No.33.

В соответствии с другим воплощением антитела по изобретению или одно из их дериватизированных соединений либо один из их функциональных фрагментов характеризуются тем, что они содержат тяжелую цепь, содержащую по меньшей мере один из трех CDR с последовательностями SEQ ID No.31, 32 или 33, или по меньшей мере одну последовательность, идентичную по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98%, после оптимального выравнивания с последовательностями SEQ ID No.31, 32 или 33.

В соответствии с другим конкретным воплощением антитела или одно из их дериватизированных соединений либо один из их функциональных фрагментов характеризуются тем, что они содержат тяжелую цепь, содержащую CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, где CDR-H1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID No.31, CDR-H2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID No.32 и CDR-H3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID No.33.

В другом воплощении антитело по изобретению или один из его функциональных фрагментов либо одно из его производных характеризуется тем, что содержит тяжелую цепь с последовательностью, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID No.35, или по меньшей мере одну последовательность, идентичную по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98%, после оптимального выравнивания с последовательностью SEQ ID No.35.

Антитело по изобретению или один из его функциональных фрагментов либо одно из его производных характеризуется тем, что содержит легкую цепь, содержащую CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, содержащие соответственно аминокислотную последовательность SEQ ID No.1, 2 и 3; и тяжелую цепь, содержащую CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, содержащие соответственно аминокислотную последовательность SEQ ID No.4, 5 и 6.

И наконец, антитело по изобретению или один из его функциональных фрагментов либо одно из его производных также может характеризоваться тем, что содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID No.7, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID No.8.

Антитело по изобретению или один из его функциональных фрагментов либо одно из его производных характеризуется тем, что содержит легкую цепь, содержащую CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, содержащие соответственно аминокислотную последовательность SEQ ID No.1, 2 и 30; и тяжелую цепь, содержащую CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, содержащие соответственно аминокислотную последовательность SEQ ID No.31, 32 и 33.

И наконец, антитело по изобретению или один из его функциональных фрагментов либо одно из его производных также может характеризоваться тем, что содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID No.34, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID No.35.

В настоящем описании термины "полипептиды", "полипептидные последовательности", "пептиды" и "белки, присоединенные к являющимся антителами соединениям или к их последовательностям" являются взаимозаменяемыми.

Здесь должно быть понятно, что изобретение не относится к антителам в природной форме, то есть их не берут в своем природном окружении, а выделяют или получают очисткой из природных источников или получают методом генетической рекомбинации или химический синтезом, и поэтому они могут нести неприродные аминокислоты, которые будут описаны ниже.

В первом воплощении определяющий комплементарность участок или CDR означает гипервариабельные участки тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов согласно определению по Kabat, как определено Kabat и соавт. (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5^th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991 и более поздние издания). Существуют три CDR тяжелой цепи и три CDR легкой цепи. Здесь термин "CDR" в единственном и множественном используются для указания, в зависимости от случая, одного или более либо даже всех участков, содержащих большинство аминокислотных остатков, ответственных за аффинность связывания антитела с антигеном или эпитопом, который он распознает.

Во втором воплощении под CDR-участками или просто CDR подразумевается указание на гипервариабельные участки тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов, которые определены по IMGT.

Уникальная система нумерации по IMGT была установлена для сравнения вариабельных доменов любых антигенных рецепторов, типов цепей или разновидностей (Lefranc M.-P., Immunology Today, 18, 509 (1997)/Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999)/Lefranc, M.-P., Pommie, С., Ruiz, M., Giudicelli, V, Foulquier, E., Truong, L, Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Сотр. Immunol., 27, 55-77 (2003)). Согласно уникальной системе нумерации по IMGT консервативные аминокислоты всегда имеют одно и то же положение, например, цистеин 23 (1-й CYS), триптофан 41 (КОНСЕРВАТИВНЫЙ TRP), гидрофобная аминокислота 89, цистеин 104 (2-й CYS), фенилаланин или триптофан 118 (J-PHE или J-TRP). Уникальная система нумерации по IMGT обеспечивает стандартизированное определение границ каркасных областей (FR) (FR1-IMGT: положения 1-26, FR2-IMGT:39-55, FR3-IMGT:66-104 и FR4-IMGT: 118-128) и определяющих комплементарность участков: CDR1-IMGT:27-38, CDR2-IMGT:56-65 и CDR3-IMGT:105-117. Поскольку разрывы представляют собой незанятые положения, протяженности CDR-IMGT (показаны в скобках и разделены точками, например [8.8.13]) становятся важной информацией. Уникальная система нумерации по IMGT используется для двумерных (2D) графических представлений, называемых IMGT Colliers de Perles (жемчужное ожерелье) (Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002)/Kaas, Q. and Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)), и для трехмерных (3D) структур в базе данных IMGT/3Dstructure-DB (Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids Res., 32, D208-D210 (2004)).

Существуют три CDR в тяжелой цепи и 3 CDR в легкой цепи. Термин CDR или CDR во множественном числе используется здесь для того, чтобы указать, согласно данному случаю, один из этих участков или несколько либо даже все эти участки, которые содержат большинство аминокислотных остатков, ответственных за аффинное связывание антитела с антигеном или эпитопом, который он распознает.

Для большей ясности необходимо понимать, что в следующем далее описании, и более конкретно в Таблицах 2 и 3 CDR будут определены согласно системе нумерации по IMGT и согласно системе нумерации по Kabat.

Система нумерации по IMGT определяет CDR в соответствии с системой IMGT, которая определена выше, в то же время система нумерации по Kabat определяет CDR в соответствии с системой по Kabat, которая определена выше.

Более конкретно, относительно антитела, обозначенного как 515Н7, CDR-L1 состоит из SEQ ID No.1 согласно системе нумерации по IMGT и из SEQ ID No.9 согласно системе нумерации по Kabat. Что касается CDR-L2, то он состоит из SEQ ID No.2 согласно системе нумерации по IMGT и из SEQ ID No.10 согласно системе нумерации по Kabat. CDR-L3 состоит из SEQ ID No.3 согласно каждой из двух этих систем нумерации. Что касается тяжелой цепи, то CDR-H1 состоит из SEQ ID No.4 согласно системе нумерации по IMGT и из SEQ ID No.11 согласно системе нумерации по Kabat. CDR-H2 состоит из SEQ ID No.5 согласно системе нумерации по IMGT и из SEQ ID No.12 согласно системе нумерации по Kabat. И наконец, CDR-Н3 состоит из SEQ ID No.6 согласно системе нумерации по IMGT, тогда как согласно системе нумерации по Kabat он состоит из SEQ ID No.13.

Далее, что касается антитела, обозначенного как 301аЕ5, то CDR-L1 состоит из SEQ ID No.1 согласно системе нумерации по IMGT и из SEQ ID No.9 согласно системе нумерации по Kabat. Что касается CDR-L2, то он состоит из SEQ ID No.2 согласно системе нумерации по IMGT и из SEQ ID No.36 согласно системе нумерации по Kabat. CDR-L3 состоит из SEQ ID No.30 согласно системе нумерации по IMGT и из SEQ ID No.37 согласно системе нумерации по Kabat. Что касается тяжелой цепи, то CDR-H1 состоит из SEQ ID No.31 согласно системе нумерации по IMGT и из SEQ ID No.38 согласно системе нумерации по Kabat. CDR-H2 состоит из SEQ ID No.32 согласно системе нумерации по IMGT и из SEQ ID No.39 согласно системе нумерации по Kabat. И наконец, CDR-H3 состоит из SEQ ID No.33 согласно системе нумерации по IMGT, тогда как согласно системе нумерации по Kabat он состоит из SEQ ID No.40.

"Процент идентичности" между двумя последовательностями нуклеиновых кислот или аминокислот в контексте настоящего изобретения означает процент идентичных нуклеотидов или аминокислотных остатков между двумя этими сравниваемыми последовательностями, полученный после оптимального выравнивания, причем этот процент является чисто статистическим, и различия между двумя этими последовательностями распределены случайным образом по всей их длине. Сравнение двух нуклеиновокислотных или аминокислотных последовательностей традиционно проводят, сравнивая эти последовательности после выравнивания их оптимальным образом, причем указанное сравнение может быть проведено по сегментам или с использованием "окна сравнения". Оптимальное выравнивание последовательностей для их сравнения может быть осуществлено, в дополнение к сравнению вручную, с применением алгоритма локальной гомологии Smith и Waterman (1981) (Ad. App. Math. 2: 482), с применением алгоритма локальной гомологии Neddleman и Wunsch (1970) (J. Mol. Biol., 48: 443), с применением метода поиска сходства Pearson и Lipman (1988) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444) или с применением компьютерного программного обеспечения, использующего эти алгоритмы (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в пакете программ Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, или даже с применением для такого сравнения программного обеспечения BLAST N или BLAST Р).

Процент идентичности между двумя нуклеиновокислотными или аминокислотными последовательностями определяют путем сравнения этих двух последовательностей, выравненных оптимальным способом, при этом сравниваемая нуклеиновокислотная или аминокислотная последовательность может иметь вставки или делеции по сравнению с последовательностью сравнения, для осуществления оптимального выравнивания между двумя этими последовательностями. Процент идентичности рассчитывают, определяя число идентичных положений, в которых нуклеотидный или аминокислотный остаток будет одинаковым в двух этих последовательностях, предпочтительно в двух полных последовательностях, производя деление этого числа идентичных положений на общее число положений в окне выравнивания и производя умножение полученного результата на 100 для получения процента идентичности между двумя этими последовательностями.

Например, можно использовать программу BLAST "BLAST 2 sequences" (Tatusova et al., "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol. 1999, Lett. 174: 247-250), доступную на сайте http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bI2.html, с параметрами по умолчанию (в частности, что касается параметров "штраф за создание разрыва" ("gap open penalty"): 5, и "штраф за длину разрыва" ("extension gap penalty": 2; при этом выбранной матрицей является, например матрица "BLOSUM 62", предложенная этой программой); процент идентичности между обеими сравниваемыми последовательностями вычисляется непосредственно этой программой.

Что касается аминокислотной последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%, предпочтительно 85%, 90%, 95% и 98% идентичности с аминокислотной последовательностью сравнения, предпочтительные примеры включают последовательности, содержащие последовательность сравнения, некоторые модификации, а именно, делецию, вставку или замену по меньшей мере одной аминокислоты, укорочение или удлинение. В случае замены одной или более чем одной следующих одна за другой или не следующих одна за другой аминокислот предпочтительны замены, в которых заменяемые аминокислоты за