Способ получения растворимого рекомбинантного белка интерферона без денатурирования

Способ получения растворимого рекомбинантного белка интерферона без денатурирования

Иллюстрации

Показать все

Реферат

В соответствии с 35 U.S.C. § 119(e) настоящая заявка испрашивает приоритет по заявке на патент США серийный номер 61/310,671, поданной 4 марта 2010 года. Содержание заявки США серийный номер 61/310,671 включено сюда посредством отсылки в полном объеме.

Настоящая заявка содержит перечень последовательностей, который был представлен в формате ASCII с помощью EFS-Web и включен сюда посредством отсылки в полном объеме. Упомянутая копия ASCII-файла, созданная 11 февраля 2011 года, называется 38194601 (2).txt и имеет размер 9237 байт.

Уровень техники

Многие гетерологичные рекомбинантные белки продуцируются при экспрессии в бактериальных системах в неправильно свернутой нерастворимой форме в виде телец включения. Как правило, для растворения рекомбинантного белка в тельцах включения должны применяться денатурирующие реагенты. Белок затем должен быть ренатурирован в условиях, оптимизированных для правильной укладки белка. Усилия, затраченные на оптимизацию, а также медленный процесс рефолдинга и сниженные выходы продукции увеличивают стоимость и время производства рекомбинантных белков. Интерфероны проявляют противовирусную, антипролиферативную,

иммуномодулирующую и другие активности. Различают несколько типов интерферонов человека, в том числе, α, β и γ, на основе, например, их противовирусной и анти-пролиферативной активности. Секреция интерферона индуцируется сигналами, в том числе, вирусами, двухцепочечными РНК, другими полинуклеотидами, антигенами и митогенами. Интерферон-β представляет собой пример белка, который экспрессируется в рекомбинантной форме в бактериях, где он накапливается в тельцах включения. Человеческий интерферон-β 1b представляет собой регуляторный полипептид с молекулярной массой, составляющей около 22 кДа, и состоящий из 165 аминокислотных остатков. Он может продуцироваться многими клетками в организме, в частности, фибробластами, в ответ на вирусную инфекцию или воздействие других биопрепаратов. Он связывается с мультимерным рецептором клеточной поверхности. Продуктивное связывание с рецептором вызывает каскад внутриклеточных событий, ведущих к экспрессии генов, индуцируемых интерфероном-β, и запуску противовирусной, антипролиферативной и иммуномодулирующей активности. Интерферон-β 1b, а именно, Betaseron (h-IFN-β 1b C17S), был использован для лечения заболеваний, включая рассеянный склероз (MS), инфекционые гепатиты В и С, глиому и меланому. Было продемонстрировано, что интерферон-β уменьшает количество приступов, переносимых пациентами с рецидивирующим и ремиттирующим MS. Значительные количества интерферона β-1b требуются для терапевтического применения. Рекомбинантный интерферон-β 1b был получен с низкими выходами в клетках млекопитающих, в том числе, в человеческих фибробластах и клетках СНО. Как правило, экспрессии в животной клетке мешают технические трудности, в том числе, продолжительное время процесса, легкая загрязняемость культур, необходимость поддерживать жесткие условия культивирования и высокая стоимость среды культивирования. Когда было обнаружено, что гликопротеиновый компонент в целом не является необходимым для активности интерферона β, исследователи обратились к экспрессии рекомбинантного белка в бактериальной системе экспрессии Е. coli. Как уже отмечалось, тельца включения, образующиеся в E.coli, должны растворяться денатурацией, и интерферон-β должен подвергаться рефолдингу. Рефолдинг, который проходит медленно, увеличивает время процесса, повышает стоимость и снижает выход. На сегодняшний день ни для клеток-хозяев млекопитающих, ни для бактериальных клеток-хозяев не был описан способ быстрого и экономичного получения растворимого рекомбинантного интерферона-β с высокими выходами, без необходимости осуществления стадий денатурации и рефолдинга.

Раскрытие изобретения Настоящее изобретение относится к экспрессии интерферона в P. fluorescens и разработке нового способа экстракции активных белков из продукта ферментации с использованием мягких детергентов и без необходимости процесса рефолдинга.

В частности, настоящее изобретение относится к способу получения рекомбинантного белка интерферона I типа, причем упомянутый способ включает экспрессию рекомбинантного белка интерферона культивированием клетки-хозяина Pseudomonas или E.coli, содержащей экспрессионную конструкцию, содержащую кодирующую последовательность, которая была оптимизирована для экспрессии в клетке-хозяине, лизис клетки-хозяина, получение нерастворимой фракции и растворимой фракции на стадии лизиса, экстракцию нерастворимой фракции в неденатурирующих условиях экстракции и получение осадка экстракта и супернатанта экстракта из нерастворимой фракции, причем рекомбинантный белок в экстракте супернатанта присутствует в растворимой форме, активной форме или их комбинации без необходимости осуществления дополнительной стадии его ренатурации или рефолдинга. В вариантах выполнения изобретения неденатурирующие условия экстракции содержат наличие мягкого детергента. В некоторых вариантах выполнения изобретения мягкий детергент представляет собой цвиттерионный детергент.В определенных вариантах выполнения изобретения цвиттерионный детергент представляет собой Zwittergent 3-08, Zwittergent 3-10, Zwittergent 3-12 или Zwittergent 3-14. В вариантах выполнения изобретения неденатурирующие условия экстракции содержат от около 0,5% до около 2% Zwittergent 3-14. В некоторых вариантах выполнения изобретения мягким детергентом не является N-лауроил-саркозин (NLS).

В вариантах выполнения изобретения неденатурирующие условия экстракции содержат наличие мягкого детергента и дополнительно содержат хаотропный агент и космотропную соль. В некоторых вариантах выполнения изобретения хаотропный агент представляет собой мочевину или гуанидин гидрохлорид и космотропная соль представляет собой NaCl, KCl или (NH₄)₂SO₄. В определенных вариантах выполнения изобретения неденатурирующие условия экстракции содержат от около 0,5 до около 2% Zwittergent 3-14; от около 0 до около 2 М мочевины; от около 0 до около 2 М NaCl; и рН составляет от около 6,5 до около 8,5. В вариантах выполнения изобретения неденатурирующие условия экстракции содержат: 1% Zwittergent 3-14, 2 М мочевины, 2 М NaCl и рН равен около 8,2. В других вариантах выполнения изобретения неденатурирующие условия экстракции дополнительно содержат от около 1% до около 40% масс/об. твердых веществ. В некоторых вариантах выполнения изобретения неденатурирующие условия экстракции дополнительно содержат около 5% масс/об. твердых веществ.

В вариантах выполнения изобретения рекомбинантный белок интерферон I типа представляет собой интерферон-β, интерферон-α, интерферон-κ, интерферон-τ или интерферон-ω. В определенных вариантах выполнения изобретения рекомбинантный белок интерферон I типа представляет собой интерферон-β или интерферон-α. В вариантах выполнения изобретения рекомбинантный белок интерферон I типа представляет собой интерферон-β, и упомянутый интерферон-β выбирают из группы, состоящей из: человеческого интерферона-β 1b и человеческого интерферона-β 1b C17S. В вариантах выполнения изобретения, в которых рекомбинантный белок интерферон I типа представляет собой интерферон-α, интерферон-α выбирают из группы, состоящей из: человеческого интерферона-α 2а и человеческого интерферона-α 2b. В других вариантах выполнения изобретения заявленный способ дополнительно содержит измерение количества рекомбинантного белка интерферона I типа в нерастворимой фракции и фракции супернатанта экстракта, причем количество рекомбинантного белка интерферона, определяемое во фракции супернатанта экстракта, составляет от около 10% до около 95% количества рекомбинантного белка интерферона, определяемого в нерастворимой фракции. В других вариантах выполнения изобретения способ дополнительно содержит измерение активности рекомбинантного белка, причем определено, что от около 40% до около 100% рекомбинантного белка, присутствующего в супернатанте экстракта, является активным. В соответствующих вариантах выполнения изобретения рекомбинантный белок представляет собой интерферон-β, и количество активного рекомбинантного белка определяют аффинной хроматографией на колонке с Blue Sepharose, анализом связывания с рецептором, анализом противовирусной активности или анализом цитопатического эффекта. В других вариантах выполнения изобретения рекомбинантный белок представляет собой интерферон-α, интерферон-β или интерферон-ω, и количество активного рекомбинантного белка определяют аффинной хроматографией на колонке с Blue Sepharose, анализом связывания с рецептором, анализом противовирусной активности или анализом цитопатического эффекта. Настоящее изобретение также относится к способам получения рекомбинантного белка интерферона I типа, причем упомянутый способ содержит экспрессию рекомбинантного белка интерферона культивированием клетки-хозяина Pseudomonas или E.coli, содержащей экспрессионную конструкцию, содержащую кодирующую последовательность, которая была оптимизирована для экспрессии в клетке-хозяине, лизис клетки-хозяина, получение нерастворимой фракции и растворимой фракции на стадии лизиса, экстракцию нерастворимой фракции в неденатурирующих условиях экстракции и получение осадка экстракта и супернатанта экстракта из нерастворимой фракции, причем рекомбинантный белок присутствует в экстракте супернатанта в растворимой форме, активной форме или их комбинации без необходимости осуществления дополнительной стадии его ренатурации или рефолдинга, причем рекомбинантный белок представляет собой интерферон-β, и причем дополнительно неденатурирующие условия экстракции оптимизированы с помощью информации, приведенной на фигуре 4В.

В вариантах выполнения изобретения рекомбинантный белок присутствует в супернатанте экстракта в концентрации, равной от около 0,3 грамма на литр до около 10 граммов на литр. В других вариантах выполнения изобретения клетку-хозяина культивируют в объеме, составляющем от около 1 до около 20 или более литров. В определенных вариантах выполнения изобретения клетку-хозяин культивируют в объеме, составляющем около 1 литра, около 2 литров, около 3 литров, около 4 литров, около 5 литров, около 10 литров, около 15 литров или около 20 литров.

В вариантах выполнения изобретения экспрессионная конструкция содержит индуцируемый промотор. В определенных вариантах выполнения изобретения экспрессионная конструкция содержит производное lac промотора и экспрессия интерферона индуцируется IPTG.

В вариантах выполнения изобретения клетку-хозяина выращивают при температуре, равной от около 25°C до 33°C, при значениях рН, составляющих от около 5,7 до около 6,5, и IPTG добавляют до конечной концентрации, составляющей от около 0,08 мМ до 0,4 мМ, причем OD₅₇₅ достигает от около 80 до около 160. В определенных вариантах выполнения изобретения клетку-хозяина выращивают при температуре, равной около 32°C, при значениях рН, составляющих от около 5,7 до 6,25, и IPTG добавляют до конечной концентрации, составляющей около 0,2 мМ, причем OD₅₇₅ достигает от около 120 до около 160.

В вариантах выполнения изобретения экспрессионная конструкция содержит высокоактивный сайт связывания рибосомы. В некоторых вариантах выполнения изобретения клетка-хозяин представляет собой штамм с делецией Lon протеазы и протеазы hslUV. В других вариантах выполнения изобретения интерферон I типа экспрессируется в цитоплазме клетки-хозяина. В соответствующих вариантах изобретения интерферон I типа представляет собой человеческий интерферон-β 1b или человеческий интерферон-β 1b C17S и экспрессируется в цитоплазме клетки-хозяина. Настоящее изобретение также относится к способам экстракции рекомбинантного белка интерферон I типа, причем рекомбинантный белок интерферон присутствует в нерастворимой фракции, упомянутая нерастворимая фракция получена после лизиса клетки-хозяина Pseudomonas или E.coli, экспрессирующей рекомбинантный белок интерферон, причем упомянутый способ содержит подвергание нерастворимой фракции воздействию неденатурирующих условий экстракции и получение осадка экстракта из нерастворимой фракции, причем упомянутый осадок экстракта содержит рекомбинантный белок интерферон, причем рекомбинантный белок интерферон находится в экстракте супернатанта в растворимой форме, активной форме или их комбинации без необходимости осуществления дополнительной стадии его ренатурации или рефолдинга.

В вариантах выполнения изобретения экстрагируемый рекомбинантный белок интерферон I типа представляет собой интерферон-β, интерферон-α, интерферон-κ, интерферон-τ или интерферон-ω. В некоторых вариантах выполнения изобретения рекомбинантный белок интерферон I типа представляет собой интерферон-β или интерферон-α. В вариантах выполнения изобретения рекомбинантный белок интерферон I типа представляет собой интерферон-β, и упомянутый интерферон-β выбирают из группы, состоящей из: человеческого интерферона-β 1b и человеческого интерферона-β 1b C17S. В других вариантах выполнения изобретения интерферон-α выбирают из группы, состоящей из: человеческого интерферона-α 2а и человеческого интерферона-α 2b. Изобретение дополнительно относится к способу получения нерастворимой фракции, содержащей рекомбинантный белок интерферон I типа, причем рекомбинантный белок интерферон экспрессируется в клетке-хозяине Pseudomonas или E.coli из нуклеиново-кислотной конструкции, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, которая является функционально связанной с производным lac промотора, причем упомянутый способ содержит выращивание клетки-хозяина при температуре от около 25°C до 33°C и при значениях рН, составляющих от около 5,7 до около 6,5, до OD₆₀₀ (значениях оптической плотности при 600 нм), составляющих от около 80 до около 160, и индукцию клетки-хозяина IPTG в концентрации, составляющей от около 0,08 мМ до около 0,4 мМ, лизис клетки-хозяина и центрифугирование ее для получения фракции осадка, причем растворимый, активный или растворимый и активный рекомбинантный белок интерферон может быть получен экстрагированием фракции осадка в неденатурирующих условиях без необходимости осуществления дополнительной стадии его ренатурации или рефолдинга. В вариантах выполнения изобретения рекомбинантный белок интерферон I типа, содержащийся в нерастворимой фракции, представляет собой интерферон-β, интерферон-α, интерферон-κ или интерферон-ω. В определенных вариантах выполнения изобретения рекомбинантный белок интерферон I типа представляет собой интерферон-β или интерферон-α. В вариантах выполнения изобретения, в которых рекомбинантный белок интерферон I типа представляет собой интерферон-β, интерферон-β выбирают из группы, состоящей из: человеческого интерферона-β 1b и человеческого интерферона-β 1b C17S. В вариантах выполнения изобретения, в которых рекомбинантный белок интерферон I типа представляет собой интерферон-α, интерферон-α выбирают из группы, состоящей из: человеческого интерферона-α 2а и человеческого интерферона-α 2b. В вариантах выполнения изобретения в способе получения нерастворимой фракции, содержащей рекомбинантный белок интерферон I типа, температура, при которой выращивают клетку-хозяина, составляет около 32°C и концентрация IPTG составляет около 0,2 мМ.

Включение посредством отсылки

Все публикации, патенты и патентные заявки, упомянутые в данном описании, включены сюда посредством отсылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация, патент или патентная заявка была бы специально и отдельно указывалась включенной посредством отсылки.

Краткое описание чертежей

Новые признаки изобретения изложены с подробностями в прилагаемой формуле изобретения. Лучшее понимание признаков и преимуществ настоящего изобретения может быть достигнуто обращением к последующему подробному описанию, в котором изложены иллюстративные варианты выполнения изобретения, использующие принципы изобретения, и в прилагаемых чертежах.

Фигура 1. Первоначальная оценка с помощью CGE белка IFN-β, восстановленного из штамма P. fluorescens PS530-001. А. Белок, анализ которого проводился в восстановительных условиях. В. Белок, анализ которого проводился в невосстанавливающих условиях.

Для обоих А и В:

Дорожка 1. Маркеры молекулярных масс с указанием их величин.

Дорожка 2. Осадок из первоначального центрифугирования после лизиса клеток (нерастворимая фракция).

Дорожки 3-5. Супернатант из первоначального центрифугирования после лизиса клеток (растворимая фракция).

Дорожки 6-9. Супернатант из центрифугирования после стадии экстракции. Дорожки 6 и 7 представляют собой результаты экстракции буфером PBS без 1% Zwittergent 3-14 и с 1% Zwittergent 3-14, соответственно, и дорожки 8 и 9 представляют собой результаты экстракции ацетатным буфером без 1% Zwittergent 3-14 и с 1% Zwittergent 3-14, соответственно.

Дорожки 10-13. Осадок после центрифугирования, проведенного после стадии экстракции. Дорожки 10 и 11 представляют собой результаты экстракции буфером PBS без 1% Zwittergent 3-14 и с 1% Zwittergent 3-14, соответственно, и дорожки 8 и 9 представляют собой результаты экстракции ацетатным буфером без 1% Zwittergent 3-14 и с 1% Zwittergent 3-14, соответственно.

Фигура 2. Блок-схема исследования, проведенного для оценки степени экстракции интерферона-β с использованием различных детергентов.

Фигура 3. Блок-схема предназначенного для статистического анализа исследования, проведенного для оценки степени экстракции интерферона-β с использованием различных условий экстракции, в том числе, ZWittergent 3-14.

Фигура 4. Результаты исследования, проведенного для оценки степени экстракции интерферона-β с использованием различных условий экстракции, в том числе, Zwittergent 3-14. А. Статистическая сводка. В. Диапазоны приемлемых условий экстракции.

Фигура 5. Зависимость продукции нерастворимого IFN-β от времени после индукции для повторенных ферментации.

Были нанесены результаты трех различных повторов.

Фигура 6. Зависимость продукции нерастворимого IFN-β от времени после индукции для варьирующих значений рН и оптической плотности (OD).

Были нанесены результаты трех различных повторов.

Фигура 7. Последовательность IFN-β 1b А. Аминокислотная последовательность IFN-β 1b C17S. (SEQ ID NO: 1) Последовательность показывает N-концевой метионин, который отсутствует в очищенном белке. В. Последовательность ДНК IFN-β с кодонами, оптимизированными для P. fluorescens. Данная последовательность кодирует аминокислотную последовательность, показанную на фигуре 7A. (SEQ ID NO: 2) С. Аминокислотная последовательность IFN-β 1b C17S без N-концевого метионина. (SEQ ID NO: 3)

Фигура 8. Последовательность IFN-α 2а. А. Аминокислотная последовательность IFN-α 2а. (SEQ ID NO: 4) В. Последовательность ДНК IFN-α 2а с кодонами, оптимизированными для P. fluorescens. (SEQ ID NO: 5)

Фигура 9. Последовательность IFN-α 2b. А. Аминокислотная последовательность IFN-α 2b. (SEQ ID NO: 6) В. Последовательность ДНК IFN-α 2b с кодонами, оптимизированными для P. fluorescens. (SEQ ID NO: 7)

Осуществление изобретения

Настоящее изобретение относится к способу получения больших количеств растворимого рекомбинантного белка интерферона в системе экспрессии Pseudomonas. В частности, данный способ устраняет необходимость в, как правило, требуемых денатурирующей стадии с последующей стадией ренатурации/рефолдинга.

Продукция рекомбинантного интерферона-β в бактериальных системах экспрессии было затруднена секвестрацией белка в нерастворимых тельцах включения. Для солюбилизации телец включения требуется денатурация, которая, в свою очередь, требует осуществления стадии рефолдинга, которая является дорогостоящей, отнимающей много времени, и уменьшает выход белка. Настоящее изобретение обходит необходимость стадии рефолдинга, относясь к способам получения и солюбилизации интерферона без обращения к денатурации.

Настоящее изобретение относится к способам получения рекомбинантного белка интерферона, который является растворимым, активным или как растворимым, так и активным, в бактериальной системе экспрессии, не подвергая белок стадии денатурации. В частности, описан неденатурирующий способ экстракции, позволяющий получать растворимый белок интерферон. Интерфероны, экспрессированные в бактериальных системах экспрессии, как правило, локализованы в нерастворимой фракции. В процессе экстракции по настоящему изобретению данную нерастворимую фракцию подвергают воздейстию экстракционных условий, которые включают в себя неденатурирующие концентрации мягких детергентов и продуцируют растворимый белок. Настоящее изобретение относится также к способам получения рекомбинантного интерферона белка, причем условия роста клетки-хозяина Pseudomonas оптимизированы для получения максимальных выходов растворимого рекомбинантного белка интерферона, особенно, когда применяется способ экстракции по изобретению. Описаны исследования влияния условий роста E.coli на продукцию растворимых белков. Растворимость данного белка при экспрессии в Pseudomonas может быть отличной от таковой в E.coli. Данное явление проиллюстрировано, например, в патентной заявке США Pub. №2006/0040352, "Экспрессия белков млекопитающих в Pseudomonas fluorescens", в которой параллельно сравниваются растворимые количества нескольких белков, полученных с использованием E.coli или P. fluorescens в качестве хозяина. Более того, имеется существенное различие между растворимостями различных белков даже в одном и том же хозяине, так как на растворимость сильно влияет структура белка, например, аминокислотная последовательность. Ранее сообщалось о попытках производить интерферон-β в E.coli, приводивших к получению белка, нуждающегося в рефолдинге. См., например, Russell-Harde, 1995, "The Use of Zwittergent 3-14 in the Purification of Recombinant Human Interferon-P Ser17 (Betaseron) et al., J. Interferon and Cytokine Res. 15:31-37, и Ghane, et al., 2008, "Over Expression of Biologically Active Interferon Beta Using Synthetic Gene in E. coli," J. of Sciences, Islamic Republic of Iran 19(3):203-209, обе публикации включены сюда посредством отсылки.

Данные способы дополнительно предусматривают оптимизированные условия роста, в том числе, температуру роста, оптическую плотность (OD) во время индукции промотора, концентрацию индуктора и значение рН. Приведенные условия экстракции включают в себя тип и концентрацию детергента, хаотропный агент, космотропную соль и значение рН. Приводятся определенные величины, а также оптимальные диапазоны параметров. Также приведены способы оптимизации условий экстракции с использованием приведенных диапазонов значений.

Условия бактериального роста

В вариантах выполнения настоящего изобретения условия бактериального роста оптимизированы с тем, чтобы увеличить количество растворимого белка интерферона, получаемого с использованием способов экстракции, как это предусмотрено в настоящем документе. Также рассматривается использование условий роста по настоящему изобретению в сочетании с другими условиями экстракции, например, другими способами, описанными и применяемыми в данной области техники.

Оптимальные условия роста, особенно применимые в сочетании со способами экстракции по изобретению, содержат: температуру от около 25°C до 33°C; значение рН от около 5,7 до около 6,5 и индукцию от около 0,08 мМ до 0,4 мМ IPTG, когда значение оптической плотности при 575 нм (OD₅₇₅) культуры достигает от около 80 до около 160.

Уровень значения рН культуры можно поддерживать с помощью рН-буферов и способов, известных специалистам в данной области. Контроль уровня рН во время культивирования также может быть достигнут с помощью водного раствора аммиака. В некоторых вариантах выполнения изобретения значение рН культуры составляет от около 5,7 до около 6,5. В некоторых вариантах выполнения изобретения значение рН составляет 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4 или 6,5. В других вариантах выполнения изобретения значение рН составляет от 5,7 до 5,9, от 5,8 до 6,0, от 5,9 до 6,1, от 6,0 до 6,2, от 6,1 до 6,3 или от 6,2 до 6,5. В еще других вариантах выполнения изобретения значение рН составляет от 5,7 до 6,0, от 5,8 до 6,1, от 5,9 до 6,2, от 6,0 до 6,3, от 6,1 до 6,4 или от 6,2 до 6,5. В некоторых вариантах выполнения изобретения значение рН составляет от около 5,7 до около 6,25.

В вариантах выполнения изобретения температуру роста поддерживают от около 25°C до 33°C. В некоторых вариантах выполнения изобретения температура роста составляет около 25°C, около 26°C, около 27°C, около 28°C, около 29°C, около 30°C, около 31°C, около 32°C или около 33°C. В других вариантах выполнения изобретения температуру роста поддерживают от около 25°C до около 27°C, от около 25°C до около 28°C, от около 25°C до около 29°C, от около 25°C до около 30°C, от около 25°C до около 31°C, от около 25°C до около 32°C, от около 25°C до около 33°C, от около 26°C до около 28°C, от около 26°C до около 29°C, от около 26°C до около 30°C, от около 26°C до около 31°C, от около 26°C до около 32°C, от около 27°C до около 29°C, от около 27°C до около 30°C, от около 27°C до около 31°C, от около 27°C до около 32°C, от около 26°C до около 33°C, от около 28°C до около 30°C, от около 28°C до около 31°C, от около 28°C до около 32°C, от около 29°C до около 31°C, от около 29°C до около 32°C, от около 29°C до около 33°C, от 30°C до около 32°C, от 30°C до около 33°C, от около 31°C до около 33°C, от около 31°C до около 32°C, от около 30°C до около 33°C или от около 32°C до около 33°C.

Индукция

Как описано в настоящем документе далее, для контроля экспрессии рекомбинантного гена интерферона в экспрессионной конструкции могут быть применены индуцируемые промоторы. В случае производных или членов семейства промотора lac, например, промотора tac, вещество-эффектор представляет собой индуктор, такой как неметаболизируемый индуктор, подобный IPTG (изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид, также называемый "изопропилтиогалактозид"). В вариантах выполнения изобретения применяют производное lac промотора и экспрессию интерферона индуцируют добавлением IPTG до конечной концентрации, составляющей от около 0,08 мМ до 0,4 мМ, при плотности клеток, достигшей такого уровня, который определяется значением OD₅₇₅ от около 80 до около 160.

В вариантах выполнения изобретения значение OD₅₇₅ в момент индукции культуры составляет около 80, около 90, около 100, около 110, около 120, около 130, около 140, около 150, около 160, около 170 или около 180. В других вариантах выполнения изобретения значение OD₅₇₅ составляет от около 80 до около 100, от около 100 до около 120, от около 120 до около 140, от около 140 до около 160. В других вариантах выполнения изобретения значение OD₅₇₅ составляет от около 80 до около 120, от около 100 до около 140 или от около 120 до около 160. В других вариантах выполнения изобретения значение OD₅₇₅ составляет от около 80 до около 140 или от около от 100 до 160. Плотность клеток может быть измерена другими способами и выражена в других единицах измерения, например, в клетках на единицу объема. Например, значение OD₅₇₅ культуры Pseudomonas fluorescens, составляющее от около 80 до около 160, эквивалентно от около 8×10¹⁰ до около 1,6×10¹¹ колониеобразующих единиц на мл или от 35 до 70 г/л сухого веса клеток. В вариантах выполнения изобретения плотность клеток в момент индукции культуры эквивалентна плотности клеток, которая определяется в настоящем документе поглощением при OD₅₇₅, независимо от способа, используемого для определения плотности клеток, или единиц измерения. Специалист в данной области будет знать, как провести соответствующее перерасчет для любой клеточной культуры. В вариантах выполнения изобретения конечная концентрация IPTG в культуре составляет около 0,08 мМ, около 0,1 мМ, 0,2 мМ, около 0,3 мМ или около 0,4 мМ. В других вариантах выполнения изобретения конечная концентрация IPTG в культуре составляет от около 0,08 мМ до около 0,1 мМ, от около 0,1 мМ до около 0,2 мМ, от около 0,2 мМ до около 0,3 мМ, от около 0,3 мМ до около 0,4 мМ, от около 0,2 мМ до около 0,4 мМ или от около 0,08 мМ до около 0,2 мМ.

В вариантах выполнения изобретения интерферон экспрессируется индукцией промотора lac или его производного с помощью IPTG, лактозы или аллолактозы, способами, известными в данной области и описанными в литературе, например, в патенте США №7759109, "High density growth of T7 expression strains with auto-induction option", включенном сюда посредством отсылки в полном объеме.

В вариантах выполнения изобретения, в которых используется тип промотора, отличный от lac, как описано в настоящем документе и в литературе, могут быть применены другие индукторы или эффекторы.

После инициации индукции культуры выращивают в течение определенного периода времени, как правило, около 24 часов, в течение которого экспрессируется рекомбинантный белок интерферон. Клеточные культуры могут быть сконцентрированы центрифугированием, и культуральный осадок ресуспендирован в буфере или растворе, подходящем для последующей процедуры лизиса.

В вариантах выполнения изобретения клетки разрушают с помощью оборудования механического разрушения клеток при высоком давлении (которое является коммерчески доступным, например, микрофлюидизатор Microfluidics Microfluidizer, Constant Cell Disruptor, гомогенизатор Niro-Soavi или гомогенизатор APV-Gaulin). Любой подходящий способ лизиса клеток, известный в данной области, может быть применен для высвобождения нерастворимой фракции. Например, в вариантах выполнения изобретения могут быть применены химические и/или ферментативные реагенты лизиса клеток, такие как литический фермент, разрушающий клеточную стенку, и ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота). В способах по изобретению также рассматривается применение замороженных или ранее сохраненных культур. Перед лизисом культуры могут быть нормированы до одного и того же значения OD.

Центрифугирование осуществляют с помощью любого подходящего оборудования и способа. Центрифугирование культуры клеток или лизата в целях отделения растворимой фракции от нерастворимой фракции хорошо известно в данной области техники. Например, лизированные клетки могут быть центрифугированы при 20800×g в течение 20 минут (при 4°C), и супернатанты удалены вручную или с использованием систем автоматического удаления жидкости. Осадочную (нерастворимую) фракцию ресуспендируют в рН-буферном растворе, например, в фосфатном буферном растворе (PBS), рН 7,4. Ресуспендирование может быть осуществлено с помощью, например, оборудования, такого как лопастные насадки, соединенные с миксером, закрепленным сверху, цилиндрических магнитных мешалок, качающих шейкеров и т.д. "Растворимая фракция", т.е. растворимый супернатант, полученный после центрифугирования лизата, и "нерастворимая фракция", т.е. осадок, полученный после центрифугирования лизата, образуются в результате лизиса и центрифугирования культур. Данные две фракции могут также называться "первая растворимая фракция" и "первая нерастворимая фракция", соответственно.

Возможно получить растворимый IFN-β с использованием способов экстракции в соответствии с изобретением из экспрессионных культур, полученных из культур, которые были выращены в условиях, где значения рН и оптической плотности (OD) в момент индукции не контролируются строго (см., например, пример 2). Оптимизация условий роста, как описано в настоящем документе, приводит к существенному увеличению продукции растворимого IFN-β.

Способ экстракции в неденатурирующих условиях

Было обнаружено, что большие количества растворимого белка интерферона могут быть получены из нерастворимой фракции с помощью способов экстракции в неденатурирующих условиях по настоящему изобретению.

Неденатурирующие условия экстракции, определяемые как особенно применимые для получения больших количеств растворимого рекомбинантного белка интерферона, содержат: мягкий детергент в неденатурирующей концентрации, например, Zwittergent 3-14 (от 0,5 до 2% масс/об.); хаотропный агент, например, мочевину (от 0 до 2М), и космотропную соль, например, NaCl (от 0 до 2М), в рН-буфере со значениями рН от 6,5 до 8,5 и концентрацию твердых веществ, составляющую от 5 до 20% масс/об.

После получения растворимой фракции и нерастворимой фракции, как описано выше, растворимый рекомбинантный белок интерферон экстрагируют из нерастворимой фракции инкубацией ресуспендированной нерастворимой фракции при неденатурирующих условиях экстракции, описанных в настоящем документе. После инкубации экстрагированную смесь центрифугируют для получения "супернатанта экстракта" (растворимая фракция супернатанта, полученная после экстракции и содержащая растворенный рекомбинантный белок) и "осадка экстракта" (нерастворимая фракция супернатанта, полученная после экстракции). Данные фракции также могут называться "вторая растворимая фракция" и "вторая нерастворимая фракция".

Условия экстракции

Множество различных параметров условий экстракции было оценено по их воздействию на количество растворимого белка, наблюдаемое в супернатанте экстракта, как описано в примере 3 настоящего документа. Было установлено, что растворимый белок интерферон обнаруживался, когда условия экстракции содержали любой из целого ряда различных детергентов при различных концентрациях, а также при варьировании других параметров. Тем не менее, некоторые параметры оказывали особенно сильное воздействие на количество произведенного растворимого белка.

В частности, условия экстракции, содержащие цвиттерионные детергенты (Zwittergents), давали лучшие выходы растворимых белков. В частности, применение цвиттерионных детергентов Zwittergent 3-08, Zwittergent 3-10, Zwittergent 3-12 и особенно Zwittergent 3-14 приводило к самым высоким выходам. N-лаурилсаркозин (NLS) давал значительный выход, однако на основе анализа сродства (связывание на аффинной колонке с Sepharose blue) было установлено, что полученный растворимый белок неактивен. Таким образом, термин "мягкие детергенты" для целей настоящего изобретения не включает в себя N-лаурилсаркозин.

Детергенты были испытаны при неденатурирующих концентрациях. Было установлено, что концентрация Zwittergent 3-14 (3-(N,N-диметилмиристиламмонио) пропансульфонат), составляющая по меньшей мере 0,5% (масс/об.), и предпочтительно 1%, что значительно выше критической концентрации мицеллообразования (которая составляет 0,01%), обеспечивает наиболее эффективную экстракцию растворимого белка интерферона. Таким образом, для применения в условиях экстракции по изобретению может рассматриваться применение неденатурирующих концентраций мягких детергентов, в частности, цвиттерионных детергентов, в особенности, Zwittergent 3-08, Zwittergent 3-10, Zwittergent 3-12 и Zwittergent 3-14, в особенности, Zwittergent 3-14, ноне NLS.

В других вариантах выполнения настоящего изобретения неденатурирующие условия экстракции содержат концентрацию Zwittergent 3-14, составляющую от около 0,5% до около 2% (масс/об.). В вариантах выполнения изобретения концентрация Zwittergent 3-14 составляет от около 0,5% до около 1%, от около 1% до около 1,5%, от около 1,5% до около 2% или от около 1% до около 2% масс/об. В некоторых вариантах выполнения изобретения концентрация Zwittergent 3-14 составляет около 0,5%, около 0,6%, около 0,7%, около 0,8%, около 0,9%, около 1,0%, около 1,1%, около 1,2%, около 1,3%, около 1,4%, около 1,5%, около 1,6%, около 1,7%, около 1,8%, около 1,9% или около 2,0% масс/об.

В других вариантах выполнения изобретения неденатурирующие условия экстракции содержат концентрации Zwittergent 3-08, Zwittergent 3-10 или Zwittergent 3-12, составляющие от около 0,5% до около 2% (масс/об.). В вариантах выполнения изобретения концентрация (масс/об.) Zwittergent 3-08, Zwittergent 3-10 или Zwittergent 3-12 составляет от около 0,5% до около 1%, от около 1% до около 1,5%, от около 1,5% до около 2% или от около 1% до около 2%. В некоторых вариантах выполнения изобретения концентрация (масс/об.) Zwittergent 3-08, Zwittergent 3-10 или Zwittergent 3-12 составляет около 0,5%, около 0,6%, около 0,7%, около 0,8%, около 0,9%, около 1,0%, около 1,1%, около 1,2%, около 1,3%, около 1,4%, около 1,5%, около 1,6%, около 1,7%, около 1,8%, около 1,9% или около 2,0%.

Мягкий детергент не вызывает разворачивания белка при низких концентрациях, например, 2% или меньше. Например, SDS и NLS, как правило, считаются сильными детергентами, так как они могут денатурировать белки при таких концентрациях. Неденатурирующая концентрация указывает на концентрацию реагента, при которой белки не денатурируются. Белки, которые не денатурируются во время обработки, не требуют рефолдинга.

В вариантах выполнения изобретения неденатурирующие условия экстракции по настоящему изобретению содержат от около 0,5 до около 2% Zwittergent 3-14; от около 0 до около 2 М мочевины; от около 0 до около 2 М NaCl; и причем значение рН составляет от около 6,5 до около 8,5.

В следующей таблице перечислены примеры распространенных детергентов, в том числе, ионных, неионных и цвиттер-ионных детергентов, и их свойства. Важной характерист