Пептид для лечения сахарного диабета 2-го типа и его осложнений

Пептид для лечения сахарного диабета 2-го типа и его осложнений

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к новому аналогу эксенатида формулы H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Gly-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-Gly-OH, который может быть использован для лечения и профилактики сахарного диабета, а также для лечения и профилактики осложнений сахарного диабета 2-го типа, таких как диабетическая нейропатия, мышечная дистрофия и эндотелиопатия.

Изобретение относится к области медицины и фармации и может быть использовано в качестве лекарственных средств для профилактики и лечения сахарного диабета 2-го типа, а также его осложнений, таких как диабетическая нейропатия, мышечная дистрофия и эндотелиопатия.

Сахарный диабет 2-го типа (СД 2 или инсулиннезависимый диабет) - это хроническое, полиорганное заболевание, которое проявляется в основном нарушением обмена углеводов. В результате патологических изменений развивается гипергликемия, кроме того, имеет место дисфункция специализированных клеток поджелудочной железы, ответственных за выработку инсулина. Основной причиной летальности пациентов с сахарным диабетом 2-го типа является, прежде всего, развитие макрососудистых осложнений (поражение коронарных, церебральных и периферических артерий). Также СД 2 является одним из основных компонентов развития метаболического синдрома (инсулинрезистентного или синдрома X) [1]. В последнее время растет число наблюдений того, что СД 2 является патологическим маркером развития болезни Альцгеймера [2].

По данным ВОЗ на окончание 2013 года во всем мире насчитывается около 347 миллионов человек больных диабетом [3]. В 2004 году 3,4 миллиона человек умерли от последствий высокого содержания сахара в крови [4]. В 2010 году число смертельных случаев от осложненного диабета осталось на прежнем уровне [5]. По прогнозам ВОЗ, в 2030 году диабет станет седьмой по значимости причиной смерти [4]. Было принято считать, что СД 1-го типа в развитых странах встречается у 10-15% пациентов, а СД 2-го типа - у 85-90%. Но в последние годы частота СД 2-го типа в развитых странах очень быстро растет, а число больных СД 1-го типа изменилось мало. Согласно последней информации ВОЗ, соотношение СД 1-го и 2-го типов в мире сегодня изменилось в сторону увеличения частоты СД 2-го типа [5].

Наиболее ранним и частым осложнением сахарного диабета является диабетическая нейропатия [6], которая характеризуется расстройством нервной системы, связанным с поражением малых кровеносных сосудов (vasa vasorum, vasa nervorum). Данное осложнение не только приводит к снижению трудоспособности, но и нередко является причиной развития тяжелых инвалидизирующих поражений и гибели пациентов. Патологический процесс затрагивает все нервные волокна: чувствительные, двигательные и вегетативные. По данным разных авторов, диабетическая нейропатия встречается у 90-100% больных сахарным диабетом. Частота поражений нервной системы при сахарном диабете прямо пропорционально зависит от длительности заболевания, причем в некоторых случаях она предшествует появлению основных клинических признаков диабета. Так, у 5% пациентов с манифестацией сахарного диабета уже имеются симптомы поражения нервной системы, которые с увеличением длительности заболевания возрастают, достигая 60% при сроке диабета более 25 лет.

При сахарном диабете поражаются все отделы нервной системы: центральная нервная система (энцефалопатия, миелопатия), периферическая нервная система (поли- и мононейропатии) и периферическая вегетативная нервная система (автономная нейропатия).

Учитывая вышеизложенное, очевидно, что разработка и внедрение в повседневную практику препарата для терапии как самого сахарного диабета 2-ого типа, так и его осложнений представляется перспективным.

В настоящее время основу медикаментозного лечения сахарного диабета 2-го типа и его осложнений составляют сахароснижающие препараты, которые объединены в несколько групп:

- первая группа включает в себя два вида препаратов - тиазолидиндионы (розиглитазон и пиоглитазон), PPARγ-агонисты, стимуляторы ядерных гамма-рецепторов, и бигуаниды (Метформин, Сиофор, Авандамет, Багомет, Глюкофаж, Метфогамма). Препараты этой группы повышают чувствительность клеток к инсулину, снижают инсулинорезистентность и всасываемость глюкозы клетками кишечника, поэтому они часто назначаются людям с избыточной массой тела;

- вторая группа сахароснижающих препаратов также состоит из двух типов препаратов - производные сульфонилмочевины (Манинил, Диабетон, Амарил, Глюренорм, Глибинез-ретард), которые стимулируют выработку собственного инсулина, повышая тем самым его эффективность, и меглитиниды (Репаглинид (Новонорм) и Натеглинид (Старликс)), которые усиливают синтез инсулина поджелудочной железой, а также снижают постпрандиальные пики (повышение сахара после еды);

- третья группа сахароснижающих препаратов включает в себя препарат Акарбозу (Глюкобай), который снижает всасываемость клетками кишечника глюкозы за счет того, что блокирует фермент альфа-глюкозидазу, расщепляющий поступающие с пищей полисахариды.

Новым направлением в лечении и профилактике осложнений СД 2 являются прямые инкретиномиметики, агонисты рецепторов глюкагоноподобного пептида - 1 (ГПП-1) и непрямые - блокаторы дипептидилпептидазы 4 типа. К прямым миметикам инкретинов относятся такие препараты как эксенатид (Баета), лираглутид (Виктоза), альбиглутид и дулаглютид. К непрямым относятся Ситаглиптин (Янувия), Саксаглиптин (Онглиза), Линаглиптин (Тражента) и Вилдаглиптин (Галвус).

Особый интерес представляет группа инкретиноподобных препаратов.

Инкретины, такие как ГПП-1 улучшают функцию бета-клеток, подавляют неадекватно повышенную секрецию глюкагона и вызывают усиление глюкозозависимой секреции инсулина. Эксенатид (эксендин-4), представляющий собой миметик инкретиновых рецепторов (ГПП-1Р), является одним из лекарственных средств, эффективность лечения и профилактика его осложнений которым инсулиннезависимого сахарного диабета является доказанной в клинических испытаниях на людях.

Эксенатид представляет собой полипептид, известный первоначально под названием экзендин-4 (exendin-4), способ выделения которого из яда ящерицы Heloderma suspectum и аминокислотная последовательность (HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGG-PSSGAPPPS-NH2) впервые были опубликованы в апреле 1992 г. [7]. Экзендин-4, являясь представителем семейства инкретиновых пептидов, обладает широким спектром активностей, таких как глюкозозависимое увеличение секреции инсулина, усиление переработки глюкозы, подавление аппетита, замедление перемещения пищи из желудка и т.д.

У пациентов с сахарным диабетом 2-го типа на фоне гипергликемии введение эксенатида подавляет избыточную секрецию глюкагона, при этом эксенатид не нарушает нормального глюкагонового ответа на гипогликемию.

Терапия эксенатидом в сочетании с метформином и/или препаратами сульфонилмочевины приводит к снижению концентрации глюкозы в крови натощак, постпрандиальной глюкозы крови, а также показателя гликозилированного гемоглобина (HbA_1c), улучшая тем самым гликемический контроль у данных пациентов.

Известны области применения эксенатида: так, в патенте США [8] раскрывается применение эксенатида для стимуляции выделения инсулина с эффективностью большей, чем у эндогенного гормона ГПП-1. В описании изобретения приведенные примеры подтверждают, что эксенатид эффективен для лечения сахарного диабета.

В дальнейшем были обнаружены другие терапевтические эффекты эксенатида: снижение веса [9], снижение моторики и замедление опорожнения желудка [10, 11], а также инотропное и диуретическое действие эксенатида [12, 13, 14]. Описано применение эксенатида для лечения поликистоза яичника [15, 16, 17], лечения и профилактики нефропатии [18, 19], профилактики и лечения сердечной аритмии [20], для дифференцировки клеток костного мозга [21], лечения сахарного диабета у беременных [22, 23], для модуляции уровня триглицеридов и лечения дислипидемии [24, 25], подавления секреции глюкагона [26, 27], для дифференцировки неинсулинопроизводящих клеток в инсулинопроизводящие [28]. Заявка [29] описывает применение эксенатида, агонистов и антагонистов эксенатида для воздействия на центральную нервную систему. Патенты [30, 31] описывают применение эксенатида и других агонистов инкретиновых рецепторов, для снижения всасывания пищи. Заявка [32] описывает стабилизированные соединения эксенатида. Патенты [33, 34] описывают новые применения эксенатида (экзендина и агонистов экзендина).

Все вышеперечисленное указывает на высокую эффективность эксенатида в профилактике и лечении СД 2. Однако такие осложнения, возникающие при сахарном диабете 2 типа, как диабетическая нейропатия, мышечная дистрофия и эндотелиопатия не корригируются при терапии как эксенатидом так и всеми другими вышеперечисленными сахароснижающими средствами.

Поэтому существует задача создания новых аналогов эксенатида, эффективных при лечении осложнений, возникающих при сахарном диабете 2 типа, таких как диабетическая нейропатия, мышечная дистрофия и эндотелиопатия.

Ближайшим аналогом заявляемого изобретения является патент США US 5424286 [8], выбранный в качестве прототипа, в котором общим с заявляемым изобретением является применение инкретиномиметиков для стимуляции выделения инсулина.

Основным недостатком известного изобретения является отсутствие у заявленных инкретиномиметиков (эксенатидов) терапевтических эффектов, позволяющих проводить профилактику и лечение таких осложнений сахарного диабета как диабетическая нейропатия, мышечная дистрофия и эндотелиопатия.

Таким образом, техническим результатом заявленного изобретения будет профилактика и лечение таких осложнений сахарного диабета как диабетическая нейропатия, мышечная дистрофия и эндотелиопатия.

Технический результат в заявляемом изобретении достигается тем, что используется соединение формулы:

H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Gly-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-Gly-OH

обладающее терапевтическим эффектом, позволяющим проводить профилактику и лечение диабетической нейропатии, мышечной дистрофии и эндотелиопатии.

Синтез заявляемого соединения описан в примерах 1-5.

Пример 1. Синтез Fmoc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-OH

В реакторе для твердофазного синтеза суспендировали 6.0 г 2-хлортритильной смолы (емкость 1.5 ммоль/г) в 45 мл DCM, выдерживали в течение 5 мин, смолу отфильтровывали, промывали 2×30 мл DCM. К смоле добавляли раствор 2.95 г (9.9 ммоль) Fmoc-Gly-OH и 6 мл (36 ммоль) DIPEA в 30 мл DCM, перемешивали в течение 60 мин при комнатной температуре. Смолу отфильтровывали, промывали 2×30 мл DCM, обрабатывали 2×30 мл смеси DCM/метанол/DIPEA (17:2:1) в течение 10 мин, промывали 2×30 мл DCM и 3×30 мл DMF. В реактор загружали 30 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, перемешивали в течение 5 мин, отфильтровывали, промывали 3×30 мл DMF, добавляли 30 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, выдерживали в течение 20 мин, отфильтровывали, промывали 5×30 мл DMF.

В реактор загружали охлажденный (4°C) раствор 7.67 г (20.0 ммоль) Fmoc-Ser(tBu)-ОН, 2.98 г (22.0 ммоль) HOBt и 3.42 мл (22.0 ммоль) DIC в 30 мл DMF, перемешивали в течение 2 час при комнатной температуре. Смолу отфильтровывали, промывали 6×30 мл DMF, добавляли 30 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, перемешивали в течение 5 мин, отфильтровывали, промывали 3×30 мл DMF, добавляли 30 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, выдерживали в течение 20 мин, отфильтровывали, промывали 5×30 мл DMF.

В реактор загружали охлажденный (4°C) раствор 7.67 г (20.0 ммоль) Fmoc-Ser(tBu)-ОН, 2.98 г (22.0 ммоль) HOBt и 3.42 мл (22.0 ммоль) DIC в 30 мл DMF, перемешивали в течение 2 час при комнатной температуре. Смолу отфильтровывали, промывали 6×30 мл DMF, добавляли 30 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, перемешивали в течение 5 мин, отфильтровывали, промывали 3×30 мл DMF, добавляли 30 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, выдерживали в течение 20 мин, отфильтровывали, промывали 5×30 мл DMF.

В реактор загружали охлажденный (4°C) раствор 6.75 г (20.0 ммоль) Fmoc-Pro-OH, 2.98 г (22.0 ммоль) HOBt и 3.42 мл (22.0 ммоль) DIC в 30 мл DMF, перемешивали в течение 2 час при комнатной температуре. Смолу отфильтровывали, промывали 6×30 мл DMF, добавляли 30 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, перемешивали в течение 5 мин, отфильтровывали, промывали 3×30 мл DMF, добавляли 30 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, выдерживали в течение 20 мин, отфильтровывали, промывали 5×30 мл DMF.

В реактор загружали охлажденный (4°C) раствор 3.50 г (20.0 ммоль) Fmoc-Gly-OH, 2.98 г (22.0 ммоль) HOBt и 3.42 мл (22.0 ммоль) DIC в 30 мл DMF, перемешивали в течение 2 час при комнатной температуре. Смолу отфильтровывали, промывали 6×30 мл DMF, 3×30 мл DCM. Затем смолу обрабатывали 10×30 мл 1% раствором трифторуксусной кислоты в DCM, получаемые растворы объединяли в колбе, содержащей 30 мл 10% раствора пиридина в метаноле. Смесь упаривали до объема ~50 мл, к остатку добавляли 200 мл воды. Выпавший осадок отфильтровывали, промывали водой, сушили. Получено 6.4 г продукта (91%) с чистотой по ВЭЖХ 97%.

Пример 2. Синтез Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(CF3COOH)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-OH

В реакторе для твердофазного синтеза суспендировали 6.0 г 2-хлортритильной смолы (емкость 1.5 ммоль/г) в 45 мл DCM, выдерживали в течение 5 мин, смолу отфильтровывали, промывали 2×30 мл DCM. К смоле добавляли раствор 2.95 г (9.9 ммоль) Fmoc-Gly-OH и 6 мл (36 ммоль) DIPEA в 30 мл DCM, перемешивали в течение 60 мин при комнатной температуре. Смолу отфильтровывали, промывали 2×30 мл DCM, обрабатывали 2×30 мл смеси DCM/метанол)/DIPEA (17:2:1) в течение 10 мин, промывали 2×30 мл DCM и 3×30 мл DMF. В реактор загружали 30 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, перемешивали в течение 5 мин, отфильтровывали, промывали 3×30 мл DMF, добавляли 30 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, выдерживали в течение 20 мин, отфильтровывали, промывали 5×30 мл DMF.

В реактор загружали охлажденный (4°C) раствор 11.93 г (20.0 ммоль) Fmoc-Asn(Trt)-OH, 2.98 г (22.0 ммоль) HOBt и 3.42 мл (22.0 ммоль) DIC в 30 мл DMF, перемешивали в течение 2 час при комнатной температуре. Смолу отфильтровывали, промывали 6×30 мл DMF, добавляли 30 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, перемешивали в течение 5 мин, отфильтровывали, промывали 3×30 мл DMF, добавляли 30 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, выдерживали в течение 20 мин, отфильтровывали, промывали 5×30 мл DMF.

В реактор загружали охлажденный (4°C) раствор 9.37 г (20.0 ммоль) Fmoc-Lys(Boc)-OH, 2.98 г (22.0 ммоль) HOBt и 3.42 мл (22.0 ммоль) DIC в 30 мл DMF, перемешивали в течение 2 час при комнатной температуре. Смолу отфильтровывали, промывали 6×30 мл DMF, добавляли 30 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, перемешивали в течение 5 мин, отфильтровывали, промывали 3×30 мл DMF, добавляли 30 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, выдерживали в течение 20 мин, отфильтровывали, промывали 5×30 мл DMF.

В реактор загружали охлажденный (4°C) раствор 7.07 г (20.0 ммоль) Fmoc-Leu-OH, 2.98 г (22.0 ммоль) HOBt и 3.42 мл (22.0 ммоль) DIC в 30 мл DMF, перемешивали в течение 2 час при комнатной температуре. Смолу отфильтровывали, промывали 6×30 мл DMF, добавляли 30 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, перемешивали в течение 5 мин, отфильтровывали, промывали 3×30 мл DMF, добавляли 30 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, выдерживали в течение 20 мин, отфильтровывали, промывали 5×30 мл DMF.

В реактор загружали охлажденный (4°C) раствор 10.53 г (20.0 ммоль) Fmoc-Trp(Вос)-OH, 2.98 г (22.0 ммоль) HOBt и 3.42 мл (22.0 ммоль) DIC в 30 мл DMF, перемешивали в течение 2 час при комнатной температуре. Смолу отфильтровывали, промывали 6×30 мл DMF, добавляли 30 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, перемешивали в течение 5 мин, отфильтровывали, промывали 3×30 мл DMF, добавляли 30 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, выдерживали в течение 20 мин, отфильтровывали, промывали 5×30 мл DMF.

В реактор загружали охлажденный (4°C) раствор 8.51 г (20.0 ммоль) Fmoc-Glu(OtBu)-OH, 2.98 г (22.0 ммоль) HOBt и 3.42 мл (22.0 ммоль) DIC в 30 мл DMF, перемешивали в течение 2 час при комнатной температуре. Смолу отфильтровывали, промывали 6×30 мл DMF, добавляли 30 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, перемешивали в течение 5 мин, отфильтровывали, промывали 3×30 мл DMF, добавляли 30 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, выдерживали в течение 20 мин, отфильтровывали, промывали 5×30 мл DMF.

В реактор загружали охлажденный (4°C) раствор 7.07 г (20.0 ммоль) Fmoc-Ile-OH, 2.98 г (22.0 ммоль) HOBt и 3.42 мл (22.0 ммоль) DIC в 30 мл DMF, перемешивали в течение 2 час при комнатной температуре. Смолу отфильтровывали, промывали 6×30 мл DMF, добавляли 30 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, перемешивали в течение 5 мин, отфильтровывали, промывали 3×30 мл DMF, добавляли 30 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, выдерживали в течение 20 мин, отфильтровывали, промывали 5×30 мл DMF.

В реактор загружали охлажденный (4°C) раствор 7.75 г (20.0 ммоль) Fmoc-Phe-OH, 2.98 г (22.0 ммоль) HOBt и 3.42 мл (22.0 ммоль) DIC в 30 мл DMF, перемешивали в течение 2 час при комнатной температуре. Смолу отфильтровывали, промывали 6×30 мл DMF, добавляли 30 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, перемешивали в течение 5 мин, отфильтровывали, промывали 3×30 мл DMF, добавляли 30 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, выдерживали в течение 20 мин, отфильтровывали, промывали 5×30 мл DMF.

В реактор загружали охлажденный (4°C) раствор 7.07 г (20.0 ммоль) Fmoc-Leu-OH, 2.98 г (22.0 ммоль) HOBt и 3.42 мл (22.0 ммоль) DIC в 30 мл DMF, перемешивали в течение 2 час при комнатной температуре. Смолу отфильтровывали, промывали 6×30 мл DMF, добавляли 30 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, перемешивали в течение 5 мин, отфильтровывали, промывали 3×30 мл DMF, добавляли 30 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, выдерживали в течение 20 мин, отфильтровывали, промывали 5×30 мл DMF.

В реактор загружали охлажденный (4°C) раствор 8.66 г (20.0 ммоль) Fmoc-Arg-OH.HCl, 2.98 г (22.0 ммоль) HOBt и 3.42 мл (22.0 ммоль) DIC в 30 мл DMF, перемешивали в течение 2 час при комнатной температуре. Смолу отфильтровывали, промывали 6×30 мл DMF, добавляли 30 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, перемешивали в течение 5 мин, отфильтровывали, промывали 3×30 мл DMF, добавляли 30 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, выдерживали в течение 20 мин, отфильтровывали, промывали 5×30 мл DMF.

В реактор загружали охлажденный (4°C) раствор 6.79 г (20.0 ммоль) Fmoc-Val-OH, 2.98 г (22.0 ммоль) HOBt и 3.42 мл (22.0 ммоль) DIC в 30 мл DMF, перемешивали в течение 2 час при комнатной температуре. Смолу отфильтровывали, промывали 6×30 мл DMF, добавляли 30 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, перемешивали в течение 5 мин, отфильтровывали, промывали 3×30 мл DMF, добавляли 30 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, выдерживали в течение 20 мин, отфильтровывали, промывали 5×30 мл DMF.

В реактор загружали охлажденный (4°C) раствор 6.23 г (20.0 ммоль) Fmoc-Ala-OH, 2.98 г (22.0 ммоль) HOBt и 3.42 мл (22.0 ммоль) DIC в 30 мл DMF, перемешивали в течение 2 час при комнатной температуре. Смолу отфильтровывали, промывали 6×30 мл DMF, добавляли 30 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, перемешивали в течение 5 мин, отфильтровывали, промывали 3×30 мл DMF, добавляли 30 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, выдерживали в течение 20 мин, отфильтровывали, промывали 5×30 мл DMF.

В реактор загружали охлажденный (4°C) раствор 8.51 г (20.0 ммоль) Fmoc-Glu(OtBu)-OH, 2.98 г (22.0 ммоль) HOBt и 3.42 мл (22.0 ммоль) DIC в 30 мл DMF, перемешивали в течение 2 час при комнатной температуре. Смолу отфильтровывали, промывали 6×30 мл DMF, добавляли 30 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, перемешивали в течение 5 мин, отфильтровывали, промывали 3×30 мл DMF, добавляли 30 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, выдерживали в течение 20 мин, отфильтровывали, промывали 5×30 мл DMF.

В реактор загружали охлажденный (4°C) раствор 8.51 г (20.0 ммоль) Fmoc-Glu(OtBu)-OH, 2.98 г (22.0 ммоль) HOBt и 3.42 мл (22.0 ммоль) DIC в 30 мл DMF, перемешивали в течение 2 час при комнатной температуре. Смолу отфильтровывали, промывали 6×30 мл DMF, добавляли 30 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, перемешивали в течение 5 мин, отфильтровывали, промывали 3×30 мл DMF, добавляли 30 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, выдерживали в течение 20 мин, отфильтровывали, промывали 5×30 мл DMF.

В реактор загружали охлажденный (4°C) раствор 8.51 г (20.0 ммоль) Fmoc-Glu(OtBu)-OH, 2.98 г (22.0 ммоль) HOBt и 3.42 мл (22.0 ммоль) DIC в 30 мл DMF, перемешивали в течение 2 час при комнатной температуре. Смолу отфильтровывали, промывали 6×30 мл DMF, 3×30 мл DCM. Затем смолу обрабатывали 10×30 мл 1% раствором трифторуксусной кислоты в DCM, получаемые растворы объединяли в колбе, содержащей 30 мл 10% раствора пиридина в метаноле. Смесь упаривали до объема ~50 мл, к остатку добавляли 200 мл воды. Выпавший осадок отфильтровывали, промывали водой, сушили. Получено 21.8 г (80%) продукта с чистотой по ВЭЖХ 95%.

Пример 3. Синтез Boc-His(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Gly-OH

В реакторе для твердофазного синтеза суспендировали 6.0 г 2-хлортритильной смолы (емкость 1.5 ммоль/г) в 45 мл DCM, выдерживали в течение 5 мин, смолу отфильтровывали, промывали 2×30 мл DCM. К смоле добавляли раствор 2.95 г (9.9 ммоль) Fmoc-Gly-OH и 6 мл (36 ммоль) DIPEA в 30 мл DCM, перемешивали в течение 60 мин при комнатной температуре. Смолу отфильтровывали, промывали 2×30 мл DCM, обрабатывали 2×30 мл смеси DCM/метанол/DIPEA (17:2:1) в течение 10 мин, промывали 2×30 мл DCM и 3×30 мл DMF. В реактор загружали 30 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, перемешивали в течение 5 мин, отфильтровывали, промывали 3×30 мл DMF, добавляли 30 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, выдерживали в течение 20 мин, отфильтровывали, промывали 5×30 мл DMF.

В реактор загружали охлажденный (4°C) раствор 12.21 г (20.0 ммоль) Fmoc-Gln(Trt)-OH, 2.98 г (22.0 ммоль) HOBt и 3.42 мл (22.0 ммоль) DIC в 30 мл DMF, перемешивали в течение 2 час при комнатной температуре. Смолу отфильтровывали, промывали 6×30 мл DMF, добавляли 30 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, перемешивали в течение 5 мин, отфильтровывали, промывали 3×30 мл DMF, добавляли 30 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, выдерживали в течение 20 мин, отфильтровывали, промывали 5×30 мл DMF.

В реактор загружали охлажденный (4°C) раствор 9.37 г (20.0 ммоль) Fmoc-Lys(Boc)-OH, 2.98 г (22.0 ммоль) HOBt и 3.42 мл (22.0 ммоль) DIC в 30 мл DMF, перемешивали в течение 2 час при комнатной температуре. Смолу отфильтровывали, промывали 6×30 мл DMF, добавляли 30 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, перемешивали в течение 5 мин, отфильтровывали, промывали 3×30 мл DMF, добавляли 30 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, выдерживали в течение 20 мин, отфильтровывали, промывали 5×30 мл DMF.

В реактор загружали охлажденный (4°C) раствор 7.67 г (20.0 ммоль) Fmoc-Ser(tBu)-ОН, 2.98 г (22.0 ммоль) HOBt и 3.42 мл (22.0 ммоль) DIC в 30 мл DMF, перемешивали в течение 2 час при комнатной температуре. Смолу отфильтровывали, промывали 6×30 мл DMF, добавляли 30 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, перемешивали в течение 5 мин, отфильтровывали, промывали 3×30 мл DMF, добавляли 30 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, выдерживали в течение 20 мин, отфильтровывали, промывали 5×30 мл DMF.

В реактор загружали охлажденный (4°C) раствор 7.07 г (20.0 ммоль) Fmoc-Leu-OH, 2.98 г (22.0 ммоль) HOBt и 3.42 мл (22.0 ммоль) DIC в 30 мл DMF, перемешивали в течение 2 час при комнатной температуре. Смолу отфильтровывали, промывали 6×30 мл DMF, добавляли 30 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, перемешивали в течение 5 мин, отфильтровывали, промывали 3×30 мл DMF, добавляли 30 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, выдерживали в течение 20 мин, отфильтровывали, промывали 5×30 мл DMF.

В реактор загружали охлажденный (4°C) раствор 8.23 г (20.0 ммоль) Fmoc-Asp(OtBu)-OH, 2.98 г (22.0 ммоль) HOBt и 3.42 мл (22.0 ммоль) DIC в 30 мл DMF, перемешивали в течение 2 час при комнатной температуре. Смолу отфильтровывали, промывали 6×30 мл DMF, добавляли 30 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, перемешивали в течение 5 мин, отфильтровывали, промывали 3×30 мл DMF, добавляли 30 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, выдерживали в течение 20 мин, отфильтровывали, промывали 5×30 мл DMF.

В реактор загружали охлажденный (4°C) раствор 7.67 г (20.0 ммоль) Fmoc-Ser(tBu)-ОН, 2.98 г (22.0 ммоль) HOBt и 3.42 мл (22.0 ммоль) DIC в 30 мл DMF, перемешивали в течение 2 час при комнатной температуре. Смолу отфильтровывали, промывали 6×30 мл DMF, добавляли 30 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, перемешивали в течение 5 мин, отфильтровывали, промывали 3×30 мл DMF, добавляли 30 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, выдерживали в течение 20 мин, отфильтровывали, промывали 5×30 мл DMF.

В реактор загружали охлажденный (4°C) раствор 7.95 г (20.0 ммоль) Fmoc-Thr(tBu)-ОН, 2.98 г (22.0 ммоль) HOBt и 3.42 мл (22.0 ммоль) DIC в 30 мл DMF, перемешивали в течение 2 час при комнатной температуре. Смолу отфильтровывали, промывали 6×30 мл DMF, добавляли 30 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, перемешивали в течение 5 мин, отфильтровывали, промывали 3×30 мл DMF, добавляли 30 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, выдерживали в течение 20 мин, отфильтровывали, промывали 5×30 мл DMF.

В реактор загружали охлажденный (4°C) раствор 7.75 г (20.0 ммоль) Fmoc-Phe-OH, 2.98 г (22.0 ммоль) HOBt и 3.42 мл (22.0 ммоль) DIC в 30 мл DMF, перемешивали в течение 2 час при комнатной температуре. Смолу отфильтровывали, промывали 6×30 мл DMF, добавляли 30 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, перемешивали в течение 5 мин, отфильтровывали, промывали 3×30 мл DMF, добавляли 30 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, выдерживали в течение 20 мин, отфильтровывали, промывали 5×30 мл DMF.

В реактор загружали охлажденный (4°C) раствор 7.95 г (20.0 ммоль) Fmoc-Thr(tBu)-ОН, 2.98 г (22.0 ммоль) HOBt и 3.42 мл (22.0 ммоль) DIC в 30 мл DMF, перемешивали в течение 2 час при комнатной температуре. Смолу отфильтровывали, промывали 6×30 мл DMF, добавляли 30 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, перемешивали в течение 5 мин, отфильтровывали, промывали 3×30 мл DMF, добавляли 30 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, выдерживали в течение 20 мин, отфильтровывали, промывали 5×30 мл DMF.

В реактор загружали охлажденный (4°C) раствор 5.95 г (20.0 ммоль) Fmoc-Gly-OH, 2.98 г (22.0 ммоль) HOBt и 3.42 мл (22.0 ммоль) DIC в 30 мл DMF, перемешивали в течение 2 час при комнатной температуре. Смолу отфильтровывали, промывали 6×30 мл DMF, добавляли 30 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, перемешивали в течение 5 мин, отфильтровывали, промывали 3×30 мл DMF, добавляли 30 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, выдерживали в течение 20 мин, отфильтровывали, промывали 5×30 мл DMF.

В реактор загружали охлажденный (4°C) раствор 8.51 г (20.0 ммоль) Fmoc-Glu(OtBu)-OH, 2.98 г (22.0 ммоль) HOBt и 3.42 мл (22.0 ммоль) DIC в 30 мл DMF, перемешивали в течение 2 час при комнатной температуре. Смолу отфильтровывали, промывали 6×30 мл DMF, добавляли 30 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, перемешивали в течение 5 мин, отфильтровывали, промывали 3×30 мл DMF, добавляли 30 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, выдерживали в течение 20 мин, отфильтровывали, промывали 5×30 мл DMF.

В реактор загружали охлажденный (4°C) раствор 5.95 г (20.0 ммоль) Fmoc-GIy-OH, 2.98 г (22.0 ммоль) HOBt и 3.42 мл (22.0 ммоль) DIC в 30 мл DMF, перемешивали в течение 2 час при комнатной температуре. Смолу отфильтровывали, промывали 6×30 мл DMF, добавляли 30 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, перемешивали в течение 5 мин, отфильтровывали, промывали 3×30 мл DMF, добавляли 30 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, выдерживали в течение 20 мин, отфильтровывали, промывали 5×30 мл DMF.

В реактор загружали охлажденный (4°C) раствор 9.95 г (20.0 ммоль) Boc-His(Trt)-ОН, 2.98 г (22.0 ммоль) HOBt и 3.42 мл (22.0 ммоль) DIC в 30 мл DMF, перемешивали в течение 2 час при комнатной температуре. Смолу отфильтровывали, промывали 6×30 мл DMF, 3×30 мл DCM. Затем смолу обрабатывали 10×30 мл 1% раствором трифторуксусной кислоты в DCM, получаемые растворы объединяли в колбе, содержащей 30 мл 10% раствора пиридина в метаноле. Смесь упаривали до объема ~50 мл, к остатку добавляли 200 мл воды. Выпавший осадок отфильтровывали, промывали водой, сушили. Получено 20.9 г (85%) продукта с чистотой по ВЭЖХ 95%.

Пример 4. Синтез 14-глицин-экзендин-4 (Heloderma suspectum)-(1-39)-пептидил-окта-D-аргинил-глицина

H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Gly-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro_Pro-Ser-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-Gly-OH

В реакторе для твердофазного синтеза суспендировали 2.0 г 2-хлортритильной смолы (емкость 1.5 ммоль/г) в 15 мл DCM, выдерживали в течение 5 мин, смолу отфильтровывали, промывали 2×10 мл DCM. К смоле добавляли раствор 0.98 г (3.3 ммоль) Fmoc-Gly-OH и 2 мл (12 ммоль) DIPEA в 10 мл DCM, перемешивали в течение 60 мин при комнатной температуре. Смолу отфильтровывали, промывали 2×10 мл DCM, обрабатывали 2×10 мл смеси DCM/метанол/DIPEA (17:2:1) в течение 10 мин, промывали 2×10 мл DCM и 3×10 мл DMF. В реактор загружали 10 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, перемешивали в течение 5 мин, отфильтровывали, промывали 3×10 мл DMF, добавляли 10 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, выдерживали в течение 20 мин, отфильтровывали, промывали 5×10 мл DMF.

В реактор загружали охлажденный (4°C) раствор 2.60 г (6.0 ммоль) Fmoc-D-Arg-OH.HCl, 0.98 г (7.2 ммоль) HOBt и 1.12 мл (7.2 ммоль) DIC в 10 мл DMF, перемешивали в течение 2 час при комнатной температуре. Смолу отфильтровывали, промывали 6×10 мл DMF, добавляли 10 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, перемешивали в течение 5 мин, отфильтровывали, промывали 3×10 мл DMF, добавляли 10 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, выдерживали в течение 20 мин, отфильтровывали, промывали 5×10 мл DMF.

В реактор загружали охлажденный (4°C) раствор 2.60 г (6.0 ммоль) Fmoc-D-Arg-OH.HCl, 0.98 г (7.2 ммоль) HOBt и 1.12 мл (7.2 ммоль) DIC в 10 мл DMF, перемешивали в течение 4 час при комнатной температуре. Смолу отфильтровывали, промывали 6×10 мл DMF, добавляли 10 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, перемешивали в течение 5 мин, отфильтровывали, промывали 3×10 мл DMF, добавляли 10 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, выдерживали в течение 20 мин, отфильтровывали, промывали 5×10 мл DMF.

В реактор загружали охлажденный (4°C) раствор 3.46 г (8.0 ммоль) Fmoc-D-Arg-OH.HCl, 1.35 г (10.0 ммоль) HOBt и 1.56 мл (10.0 ммоль) DIC в 10 мл DMF, перемешивали в течение 3 час при комнатной температуре. Смолу отфильтровывали, промывали 6×10 мл DMF, добавляли 10 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, перемешивали в течение 5 мин, отфильтровывали, промывали 3×10 мл DMF, добавляли 10 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, выдерживали в течение 20 мин, отфильтровывали, промывали 5×10 мл DMF.

В реактор загружали охлажденный (4°C) раствор 3.46 г (8.0 ммоль) Fmoc-D-Arg-OH.HCl, 1.35 г (10.0 ммоль) HOBt и 1.56 мл (10.0 ммоль) DIC в 10 мл DMF, перемешивали в течение 4 час при комнатной температуре. Смолу отфильтровывали, промывали 6×10 мл DMF, добавляли 10 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, перемешивали в течение 5 мин, отфильтровывали, промывали 3×10 мл DMF, добавляли 10 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, выдерживали в течение 20 мин, отфильтровывали, промывали 5×10 мл DMF.

В реактор загружали охлажденный (4°C) раствор 3.46 г (8.0 ммоль) Fmoc-D-Arg-OH.HCl, 1.35 г (10.0 ммоль) HOBt и 1.56 мл (10.0 ммоль) DIC в 10 мл DMF, перемешивали в течение 10 час при комнатной температуре. Смолу отфильтровывали, промывали 6×10 мл DMF, добавляли 10 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, перемешивали в течение 5 мин, отфильтровывали, промывали 3×10 мл DMF, добавляли 10 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, выдерживали в течение 20 мин, отфильтровывали, промывали 5×10 мл DMF.

В реактор загружали охлажденный (4°C) раствор 4.33 г (10.0 ммоль) Fmoc-D-Arg-OH.HCl, 1.62 г (12.0 ммоль) HOBt и 1.88 мл (12.0 ммоль) DIC в 10 мл DMF, перемешивали в течение 12 час при комнатной температуре. Смолу отфильтровывали, промывали 6×10 мл DMF, добавляли 10 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, перемешивали в течение 5 мин, отфильтровывали, промывали 3×10 мл DMF, добавляли 10 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, выдерживали в течение 20 мин, отфильтровывали, промывали 5×10 мл DMF.

В реактор загружали охлажденный (4°C) раствор 4.33 г (10.0 ммоль) Fmoc-D-Arg-OH.HCl, 1.62 г (12.0 ммоль) HOBt и 1.88 мл (12.0 ммоль) DIC в 10 мл DMF, перемешивали в течение 12 час при комнатной температуре. Смолу отфильтровывали, промывали 6×10 мл DMF, добавляли 10 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, перемешивали в течение 5 мин, отфильтровывали, промывали 3×10 мл DMF, добавляли 10 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, выдерживали в течение 20 мин, отфильтровывали, промывали 5×10 мл DMF.

В реактор загружали охлажденный (4°C) раствор 4.33 г (10.0 ммоль) Fmoc-D-Arg-OH.HCl, 1.62 г (12.0 ммоль) HOBt и 1.88 мл (12.0 ммоль) DIC в 10 мл DMF, перемешивали в течение 16 час при комнатной температуре. Смолу отфильтровывали, промывали 6×10 мл DMF, добавляли 10 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, перемешивали в течение 5 мин, отфильтровывали, промывали 3×10 мл DMF, добавляли 10 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, выдерживали в течение 20 мин, отфильтровывали, промывали 5×10 мл DMF.

В реактор загружали охлажденный (4°C) раствор 3.07 г (8.0 ммоль) Fmoc-Ser(tBu)-ОН, 1.35 г (10.0 ммоль) HOBt и 1.56 мл (10.0 ммоль) DIC в 30 мл DMF, перемешивали в течение 12 час при комнатной температуре. Смолу отфильтровывали, промывали 6×10 мл DMF, добавляли 10 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, перемешивали в течение 5 мин, отфильтровывали, промывали 3×10 мл DMF, добавляли 10 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, выдерживали в течение 20 мин, отфильтровывали, промывали 5×10 мл DMF.

В реактор загружали охлажденный (4°C) раствор 2.70 г (8.0 ммоль) Fmoc-Pro-OH, 1.35 г (10.0 ммоль) HOBt и 1.56 мл (10.0 ммоль) DIC в 30 мл DMF, перемешивали в течение 12 час при комнатной температуре. Смолу отфильтровывали, промывали 6×10 мл DMF, добавляли 10 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, перемешивали в течение 5 мин, отфильтровывали, промывали 3×10 мл DMF, добавляли 10 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, выдерживали в течение 20 мин, отфильтровывали, промывали 5×10 мл DMF.

В реактор загружали охлажденный (4°C) раствор 2.70 г (8.0 ммоль) Fmoc-Pro-OH, 1.35 г (10.0 ммоль) HOBt и 1.56 мл (10.0 ммоль) DIC в 30 мл DMF, перемешивали в течение 12 час при комнатной температуре. Смолу отфильтровывали, промывали 6×10 мл DMF, добавляли 10 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, перемешивали в течение 5 мин, отфильтровывали, промывали 3×10 мл DMF, добавляли 10 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, выдерживали в течение 20 мин, отфильтровывали, промывали 5×10 мл DMF.

В реактор загружали охлажденный (4°C) раствор 2.70 г (8.0 ммоль) Fmoc-Pro-OH, 1.35 г (10.0 ммоль) HOBt и 1.56 мл (10.0 ммоль) DIC в 30 мл DMF, перемешивали в течение 12 час при комнатной температуре. Смолу отфильтровывали, промывали 6×10 мл DMF, добавляли 10 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, перемешивали в течение 5 мин, отфильтровывали, промывали 3×10 мл DMF, добавляли 10 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, выдерживали в течение 20 мин, отфильтровывали, промывали 5×10 мл DMF.

В реактор загружали охлажденный (4°C) раствор 2.49 г (8.0 ммоль) Fmoc-Ala-OH, 1.35 г (10.0 ммоль) HOBt и 1.56 мл (10.0 ммоль) DIC в 30 мл DMF, перемешивали в течение 12 час при комнатной температуре. Смолу отфильтровывали, промывали 6×10 мл DMF, добавляли 10 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, перемешивали в течение 5 мин, отфильтровывали, промывали 3×10 мл DMF, добавляли 10 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, выдерживали в течение 20 мин, отфильтровывали, промывали 5×10 мл DMF.

В реактор загружали охлажденный (4°C) раствор 5.90 г (8.0 ммоль) Fmoc-GlyProSer(tBu)Ser(tBu)Gly-OH (продукт примера 1), 1.62 г (12.0 ммоль) HOBt и 1.88 мл (12.0 ммоль) DIC в 30 мл DMF, перемешивали в течение 12 час при комнатной температуре. Смолу отфильтровывали, промывали 6×10 мл DMF, добавляли 10 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, перемешивали в течение 5 мин, отфильтровывали, промывали 3×10 мл DMF, добавляли 10 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, выдерживали в течение 20 мин, отфильтровывали, промывали 5×10 мл DMF.

В реактор загружали охлажденный (4°C) раствор 11.35 г (4.0 ммоль) Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)Glu(OtBu)AlaValArg(HCl)LeuPheIleGlu(OtBu)Trp(Boc)LeuLys(Boc)Asn(Trt)Gly-ОН (продукт примера 2), 0.81 г (6.0 ммоль) HOBt и 0.95 мл (6.0 ммоль) DIC в 30 мл DMF, перемешивали в течение 24 час при комнатной температуре. Смолу отфильтровывали, промывали 6×10 мл DMF, добавляли 10 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, перемешивали в течение 5 мин, отфильтровывали, промывали 3×10 мл DMF, добавляли 10 мл 20% раствора диэтиламина в DMF, выдерживали в течение 20 мин, отфильтровывали, промывали 5×10 мл DMF.

В реактор загружали охлажденный (4°C) раствор 9.94 г (4.0 ммоль) Boc-His(Trt)Gly-Glu(OtBu)GlyThr(tBu)PheThr(tBu)Ser(tBu)Asp(OtBu)LeuSer(tBu)Lys(Boc)Gln(Trt)Gly-OH (продукт примера 3), 0.81 г (6.0 ммоль) HOBt и 0.95 мл (6.0 ммоль) DIC в 30 мл DMF, перемешивали в течение 24 час при комнатной температуре. Смолу отфильтровывали, промывали 6×20 мл DMF, 4×20 мл DCM, сушили, добавляли 50 мл смеси TFA/TIS/EDT/H2O (97:1:1:1), выдерживали в течение 4 час при комнатной температуре, отфильтровывали, промывали 3×20 мл трифторуксусной кислотой, объединенные фильтраты упаривали до объема ~20 мл, к остатку добавляли 60 мл сухого эфира. Выпавший осадок отфильтровывали, промывали на фильтре эфиром, сушили. Полученный продукт растворяли в 50 мл воды, раствор замораживали и лиофилизовали. Лиофилизат растворяли в 40 мл воды и наносили на колонку с ионообменной смолой Amberlite IRA-400 (Cl-форма). Колонку промывали водой, фракции, содержащие продукт, объединяли, упаривали до объема ~50 мл и наносили на обращеннофазную колонку Waters X-Bridge C18, 10 мкм, 127 Å, 50×250 мм. Элюирование проводили при скорости потока элюента 50 мл/мин. Фаза A: 0,1% HCl/H2O, B: ацетонитрил. Градиент: 0% (В)-70% (В) за 70 минут. Фракции, содержащие основной продукт, объединяли, упаривали до объема ~50 мл, замораживали и лиофилизовали. Получено 3.9 г (20%) продукта с чистотой (ВЭЖХ) 97.5%. Масс спектр: вычислено для C231H374N82O70 МН+ 5420.98, получено МН+ 5420.80. Аминокислотный анализ: аланин 2.02 (2), аргинин 9.0 (9), аспарагиновая кислота + аспарагин 2.05 (2), глутаминовая кислота + глутамин 5.80 (6), глицин 7.25 (7), гистидин 1.02 (1), изолейцин 1.03 (1), лейцин 2.96 (3), лизин 2.07 (2), фенилаланин 2.05 (2), пролин 4.10 (4), серии 4.85 (5), треонин 1.90 (2), валин 1.02 (1).

Пример 5. Синтез H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Gly-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Arg-Gly-OH при помощи штамма Corynebacterium acetoacidophilum

1.1. Конструирование вектора pBSΔCg10278 для удаления гена Cg10278, кодирующего PBP1a

Геномная последовательность С.acetoacidophilum АТСС 13032 и нуклеотидная последовательность гена Cg1278, кодирующего пенициллинсвязывающий белок PBP1a, известны (GenBank, инвентарный номер ВА000036 (версия ВА000036.3 GI: 42602314, locus_tag=«NCg10274»). Со ссылкой на эту последовательность синтезировали праймеры P1, P2, P3 и P4. С помощью ПЦР, используя в качестве матрицы хромосомную ДНК штамма С.acetoacidophilum АТСС 13869, приготовленную обычным способом (Saito Н. and Miura K.I., Biochim. Biophys. Acta, 1963, 72:619-629), и праймеры P1 и P2, и P3 и P4, были получен