Получение функционализированной линейной днк-кассеты и опосредованная квантовыми точками/наночастицами доставка в растения

Получение функционализированной линейной днк-кассеты и опосредованная квантовыми точками/наночастицами доставка в растения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ЗАЯВКА НА ПРИОРИТЕТ

Данная заявка заявляет приоритет даты подачи предварительной патентной заявки США с серийным номером, 61/362,222, поданной 7 июля 2010 г. под названием "ПОЛУЧЕНИЕ ФУНКЦИОНАЛИЗИРОВАННОЙ ДНК-КАССЕТЫ И ОПОСРЕДОВАННАЯ КВАНТОВЫМИ ТОЧКАМИ/НАНОЧАСТИЦАМИ ДОСТАВКА В РАСТЕНИЯ".

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к способам использования наночастиц для неинвазивной доставки молекул функционализированных линейных нуклеотидных кассет в растительные клетки, имеющие интактную клеточную стенку.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Наночастицы обладают уникальными свойствами, которые используются для доставки ДНК в определенные животные клетки. Было найдено, что при инкубации некоторых наночастиц, покрытых ДНК, с клетками, не имеющими клеточной стенки, клетки поглощали наночастицы и начинали экспрессировать гены, кодируемые ДНК. Полупроводниковые наночастицы (например, квантовые точки ("QD")) с размером частиц в диапазоне 3-5 нм также использовались в качестве носителей для доставки молекул в клетки. ДНК и белки можно присоединить к некоторым лигандам, прикрепленным к поверхности QD. См., например, Patolsky, et al. (2003) J. Am. Chem. Soc. 125: 13918. Покрытые карбоновыми кислотами или аминами QD могут быть сшиты с молекулами, содержащими тиольную группу, см., например, Dubertret et al. (2002) Science 298: 1759; Akerman, et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99: 12617; Mitchell, et al. (1999) J. Am. Chem. Soc. 121:8122, или N-гидроксисукцинимильную ("NHS") сложноэфирную группу, с использованием стандартных протоколов биоконъюгации. См., например, Pinaud, et al. (2004) J. Am. Chem. Soc. 126:6115; Bruchez, et al. (1998) Science 281:2013. Альтернативным путем присоединения молекул к поверхности QD является конъюгация покрытых стрептавидином QD с биотинилированными белками, олигонуклеотидами или антителами. См., например, Dahan, et al. (2003) Science 302:442; Pinaud, et al. (2004) J. Am. Chem. Soc. 126:6115; Wu, et al. (2003) Nature Biotechnol. 21:41; Jaiswal, et al. (2003) Nature Biotechnol. 21:47; и Mansson, et al. (2004) Biochem. Biophys. Res. Commun. 314:529.

Доставка молекул чужеродных нуклеиновых кислот в растения осложняется наличием стенки у клеток растений. В основе существующих способов для генетической трансформации растений лежит инвазивная доставка. У клеток растений клеточная стенка представляет собой барьер, препятствующий доставке экзогенно вносимых молекул. Для доставки в покрытые стенкой клетки растений генов и низкомолекулярных соединений используется множество инвазивных способов клеточной доставки, например, биолистическая доставка (генная пушка), микроинъекция, электропорация и опосредованная агробактериями трансформация, но доставку белков можно осуществить только с помощью микроинъекции. Если необходима доставка молекул нуклеиновых кислот с помощью наночастиц, то клеточную стенку удаляют перед добавлением частиц к протопластам растения. См., например, Torney, et al. (2007) Nature Nanotechnol. 2:295-300.

Более того, общепринятые методики трансформации растений, такие как опосредованная агробактериями трансформация, требуют использования рекомбинантной плазмиды. Эти общепринятые методики, поэтому, приводят к нежелательному встраиванию каркасной последовательности бактериального вектора в геном хозяина вместе в присоединенными к нему экзогенными генами. См., например, Kohli et al. (1999) Plant J. 17:591-601; и Meza et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30(20):4556-66. Присутствие векторной базовой последовательности в трансплантате бесполезно в процедурах биолистического переноса. Кроме того, векторные базовые последовательности имеют тенденцию стимулировать нежелательную рекомбинацию, обеспечивая АТ-богатые последовательности в качестве "горячих точек" рекомбинации в процессе образовании вторичных структур. Muller et al. (1999) J. Mol. Biol. 291: 29-46. Векторные каркасные последовательности могут дополнительно обеспечивать новые последовательности "филлерной" ДНК (вставок ДНК), гомологичной фланкирующей геномной ДНК растений, которые могут выделяться в окружающую среду. Kohli et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:7203-8; Pawlowski and Somers (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95: 12106-10; Svitashev et al. (2002) Plant J. 32:433-45.

Трансформация трансгенными кассетами с использованием бомбардировки частицами имела ограниченный успех на культуре тканей и на растениях риса (Oryza sativa) и картофеля (Solarium tuberosum). Fu et al. (2000) Transgenic Res. 9: 11-9; Loc et al. (2002) Mol. Breeding 9:231-44; Romano et al. (2003) Transgenic Res. 12:461-73; и Agrawal et al. (2005) Mol. Breeding 16:247-60. Предполагается, что эти биолистические методики генерируют больший процент трансгенных растений риса и картофеля с простыми схемами встраивания. Две группы линейных генетических конструкций (gus и bar, и 1Ax1 и bar), в которых отсутствуют базовые векторные последовательности, независимо переносили в элитный сорт EM12 пшеницы (Triticum aestivum L.) бомбардировкой частицами и выделяли генетически стабильные растения с низкокопийным встроенным трансгеном. Yao et al. (2006) J. Exp. Botany 57(14):3737-46. Наблюдаемая эффективность трансформации при биолистической бомбардировке составляла от 0,2 до 0,6. Id. Предполагается, что три потенциальных элемента (а именно, снижение степени конкатемеризации перед встраиванием трансгена; ограничение возможности перестановок в трансгене; и предупреждение гомологичных взаимодействий между различными трансгенами в течение событий встраивания) действуют сообща, обеспечивая простые интактные трансгенные локусы, представленные простыми картинами гибридизации. Agrawal et al. (2005), выше.

На сегодняшний момент бомбардировка частицами и Whiskers™ (см. патенты США №№ 5,464,765 и 5,302,523) вместе с расщепленными ферментами рестрикции фрагментами ДНК являются единственным путем доставки линейных ДНК-кассет в клетки растений, имеющих интактные клеточные стенки.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем изобретении описаны способы и композиции для использования наночастиц и линеаризованных молекул нуклеиновых кислот для введения представляющей интерес молекулы в растительную клетку, имеющую клеточную стенку. Некоторые варианты осуществления способов по изобретению можно использовать для получения стабильно трансформированного генетически-модифицированного фертильного растения. В некоторых вариантах осуществления изобретения отличительные свойства молекул функционализированных линейных нуклеотидных кассет позволяют доставку представляющих интерес последовательностей определенных генов без нежелательных нуклеотидных последовательностей, например, без ограничения, векторных базовых последовательностей.

В вариантах осуществления изобретения для трансформации растительных клеток, имеющих клеточную стенку, можно использовать несколько различных типов наночастиц. В некоторых вариантах осуществления изобретения наночастицы могут быть ПЭГилированы (иметь присоединенные молекулы ПЭГ) с молекулами функционализированных линейных нуклеотидных кассет. В конкретных вариантах осуществления изобретения наночастицами могут быть полупроводниковые наночастицы, такие как квантовые точки ("QD"); или частицы золота. В других вариантах осуществления изобретения молекулами функционализированных линейных нуклеотидных кассет может быть линеаризованная плазмидная ДНК. В альтернативных вариантах осуществления изобретения молекулы функционализированных линейных нуклеотидных кассет могут содержать последовательности, кодирующие фосфинотрицин-N-ацетилтрансферазу (PAT) и/или желтый флуоресцентный белок (YFP).

Также изобретение относится к способам введения целевой молекулы в растительную клетку, имеющую клеточную стенку, причем способы могут включать в себя предоставление растительной клетки, имеющей клеточную стенку; покрытие поверхности наночастиц по меньшей мере одной молекулой функционализированной линейной нуклеотидной кассеты, представляющей интерес; осуществление контакта между растительной клеткой, имеющей клеточную стенку, и наночастицами, покрытыми молекулой(ами) функционализированной линейной нуклеотидной кассеты, представляющей интерес; и обеспечение возможности поглощения наночастицы и молекул(ы) функционализированных линейных нуклеотидных кассет, представляющих интерес, растительной клеткой, содержащей клеточную стенку. В конкретных вариантах осуществления изобретения представляющей интерес молекулой функционализированной линейной нуклеотидной кассеты может быть биотинилированная молекула линеаризованной двухцепочечной ДНК, содержащей представляющий интерес ген. В дополнительных вариантах осуществления изобретения представляющей интерес молекулой функционализированной линейной нуклеотидной кассеты может быть химически немодифицированная молекула двухцепочечной ДНК, содержащая представляющий интерес ген. В конкретных вариантах осуществления изобретения наночастицой может быть QD-стрептавидиновая наночастица. Функционализированные молекулы линейных нуклеотидных кассет можно конъюгировать с наночастицами с использованием разнообразных реагентов с различными функциональными группами. В некоторых вариантах осуществления изобретения поверхность наночастиц может быть функционализирована белками и/или другими молекулами, например, пестицидами, которые несут совместимые функциональные группы. В некоторых вариантах осуществления изобретения поверхность наночастицы может быть конъюгирована более чем с одним типом молекул. Поэтому, в конкретных вариантах осуществления изобретения поверхность наночастиц может быть совместно функционализирована проникающими в клетку пестицидами и молекулами линеаризованных нуклеотидных кассет, например, для облегчения направленной доставки биомолекул.

Дополнительно раскрыты способы интрогрессии признака в растение. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ может включать в себя предоставление растительной клетки; покрытие поверхности наночастиц средством для экспрессии признака в растении; осуществление контакта между растительной клеткой и наночастицами, покрытыми средством для экспрессии признака в растении; обеспечение возможности поглощения наночастицы и средства для экспрессии признака в растении растительной клеткой для получения трансформированной растительной клетки; регенерацию целого растения из трансформированной растительной клетки; и размножение растения. В некоторых вариантах осуществления изобретения признак, который можно интрогрессировать согласно способам по изобретению, включает в себя признак, выбранный, без ограничения, из: мужской стерильности, устойчивости к гербициду, устойчивости к насекомым и устойчивости к бактериальному заболеванию, грибковому заболеванию и/или вирусному заболеванию.

Также раскрыты способы по изобретению, которые можно использовать для in planta трансформации растений. В некоторых вариантах осуществления изобретения растение может быть выбрано из растений рода Arabidopsis, например, A. thaliana. В конкретных вариантах осуществления изобретения растение, трансформированное с помощью in planta трансформации, может быть выбрано из растений A. thaliana экотипа Columbia.

Дополнительно раскрыты генетически модифицированные растительные клетки (ГМ) и способы их получения, причем растительные клетки имеют одну или несколько нуклеиновых кислот, введенных в них способами по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления изобретения плазмида, содержащая по меньшей мере один представляющий интерес ген и селектируемый маркер, может быть введена в клетку растения, имеющую клеточную стенку, с помощью наночастиц согласно настоящему изобретению. В дополнительных вариантах осуществления изобретения можно отобрать стабильные трансформанты, которые имеют стабильно встроенный по меньшей мере один представляющий интерес ген и/или селектируемый маркер. В альтернативных вариантах осуществления изобретения растительную клетку, уже содержащую по меньшей мере один представляющий интерес ген, можно размножать для получения других клеток, содержащих представляющую интерес молекулу. В других вариантах осуществления изобретения растительной клеткой, содержащей представляющую интерес молекулу, может являться способная к регенерации клетка, которую можно использовать для регенерации целого растения, включающего молекулу, представляющую интерес.

Дополнительно раскрыты способы создания регенерируемых растительных клеток, включающих в себя представляющую интерес молекулу, для использования в культуре тканей. Культура тканей может обладать способностью к регенерации растений, имеющих по существу одинаковый генотип с регенерируемыми клетками. Регенерируемыми клетками в таких культурах тканей могут быть, например, зародыши, протопласты, меристемные клетки, каллюс, пыльца, листья, пыльники, корни, кончики корней, цветки, семена, стручки или стебли. Дополнительно, некоторые варианты осуществления изобретения относятся к растениям, регенерированным из культур тканей по изобретению.

Дополнительно раскрыты способы получения стабилизированных линий растений, включающих в себя желаемый признак или молекулу нуклеиновой кислоты, представляющую интерес, причем желаемый признак или молекула нуклеиновой кислоты, предоставляющая интерес, могут быть первоначало введены путем поглощения наночастицы через растительную клеточную стенку. Способы получения стабилизированных линий растений хорошо известны среднему специалисту в данной области и могут включать в себя методики, такие как, но не ограничиваясь ими: самоопыление; возвратное скрещивание; получение гибридов; скрещивание с популяциями; и т. п. Поэтому в изобретении раскрыты растения и растительные клетки, включающие в себя желаемый признак или молекулу нуклеиновой кислоты, представляющую интерес, первоначально введенную в растительную клетку (или ее предшественников) путем введения наночастицы через клеточную стенку. Растительную клетку, включающую в себя желаемый признак или молекулу нуклеиновой кислоты, представляющую интерес, первоначально введенные в растительную клетку (или ее предшественников) путем введения наночастицы через клеточную стенку, можно использовать в скрещивании с другими отличающимися от нее растительными клетками, чтобы получить гибридные клетки, семена и/или растения первого поколения (F₁) с желаемыми характеристиками.

Кроме типичных аспектов и вариантов осуществления изобретения, описанных выше, дополнительные аспекты и варианты осуществления будут очевидны в свете следующих описаний.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1 включает диаграмму нелинеаризованной плазмиды pDAB3831.

Фиг.2 включает последовательность ДНК плазмиды pDAB3831. Фрагмент ДНК от 7666 и до 3870 п.о. был амплифицирован с помощью ПЦР и использован для трансформации Arabidopsis, что дало растения Т₂ со стабильно встроенной вставкой.

Фиг.3 включает выравнивание последовательностей между последовательностью ДНК фосфинотрицин-N-ацетилтрансферазы (PAT) из трансформированного с помощью Dendrimer генома Arabidopsis и последовательностью РАТ из базы данных NCBI.

Фиг.4 включает выравнивание последовательностей между геномом Arabidopsis, трансформированного последовательностью ДНК желтого флуоресцентного белка (YFP), и последовательностью YFP из базы данных NCBI.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

SEQ ID NO:1 представляет собой последовательность прямого праймера, используемого для амплификации полноразмерной экспрессионной кассеты 4,6 т.п.о. на плазмиде pDAB3831: /5Biosq/TGAAAGTGTACATCAACGAA.

SEQ ID NO:2 представляет собой последовательность обратного праймера, используемого для амплификации полноразмерной экспрессионной кассеты 4,6 т.п.о. на плазмиде pDAB3831: /5Biosq/CCGCAACTATTTCAACAC.

SEQ ID NO:3 представляет собой последовательность прямого праймера, используемого для амплификации гена YFP: TGTTCCACGGCAAGATCCCCTACG.

SEQ ID NO:4 представляет собой последовательность обратного праймера, используемого для амплификации гена YFP: TATTCATCTGGGTGTGATCGGCCA.

SEQ ID NO: 5 представляет собой последовательность прямого праймера, используемого для амплификации гена РАТ: GGAGAGGAGACCAGTTGAGATTAG.

SEQ ID NO:6 представляет собой последовательность обратного праймера, используемого для амплификации гена РАТ: AGATCTGGGTAACTGGCCTAACTG.

ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

I. Общее описание нескольких вариантов осуществления изобретения

Способы по изобретению, позволяющие неинвазивный перенос генов, могут быть очень полезны для получения генетически модифицированных растений с желаемыми признаками. Неинвазивный перенос генов может облегчать направленное воздействие и редактирование молекулярных сайтов в клетке для областей, таких как включение желаемых входных данных, выходных данных и агрономических признаков в сельскохозяйственные растения. Описанные способы также могут быть полезны в качестве "не содержащей ГМО" возможности транзиентной трансформации растений, экспансии технологии интрогрессии признаков и устойчивости к заболеваниям на древесные и овощные культуры, технологии для которых на настоящий момент ограничены.

В недавней патентной заявке (США, серийный номер 60/978,059) продемонстрировано неинвазивное средство доставки ДНК на основе наночастиц с использованием наночастиц с различной полезной нагрузкой, inter alia, для доставки кольцевой плазмидной ДНК, и однозначно продемонстрировано стабильное встраивание трансгенов в семена Т₁ растений Arabidopsis. Полученные в ходе этого трансгенные растения, содержащие кольцевую плазмидную ДНК, проявляли желаемые фенотипы переносимости гербицида и показывали высокую степень переносимости по меньшей мере при 4 последовательных опрыскиваниях применяемым в сельском хозяйстве уровнем глуфосината аммония. В патенте США с серийным номером 60/978,059 была продемонстрирована, inter alia, генетическая трансформация Arabidopsis с помощью положительно заряженных золотых наночастиц с использованием кольцевой плазмидной ДНК. В настоящем исследовании описано, inter alia, использование молекул функционализированных линейных нуклеотидных кассет для стабильной генетической трансформации растений.

В патенте США с серийным номером 60/978,059 описана, inter alia, опосредованная положительно заряженными наночастицами доставка плазмидной ДНК. Однако до настоящего момента демонстрация стабильной геномной интеграции трансгена с использованием доставки линейной плазмиды не была опубликована. В настоящем изобретении описано применение опосредованной наночастицами доставки молекул функционализированных линейных нуклеотидных кассет для стабильной генетической трансформации в растениях. Молекулярный анализ показал экспрессию РАТ совместно с YFP в трансгенных растениях Т₁ Arabidopsis, трансформированных геном pat и геном yfp способами по изобретению. Трансгенные растения Т₁ являются фертильными и дают семена. Эти семена можно размножить и можно провести сегрегационный анализ совместно с молекулярным и беловым анализами.

В настоящем документе раскрыты способы, которые позволяют получить простые события интеграции ДНК в растениях, и, таким образом, упростить последующие попытки интрогрессии. Использование молекул функционализированных линейных нуклеотидных кассет обеспечивает преимущества в генетической трансформации по сравнению, например, с плазмидами. Например, молекулы функционализированных линейных нуклеотидных кассет могут не содержать векторных каркасных последовательностей или селектируемых маркерных генов.

II. Термины

В нижеследующих описании и таблицах используется ряд терминов. С целью обеспечения ясного и согласованного понимания описания и формулы изобретения, включая объем, даваемый в этих терминах, приведены следующие определения:

Возвратное скрещивание: в контексте настоящего изобретения возвратное скрещивание представляет собой процесс, при котором селекционер многократно скрещивает гибридное потомство с одним из родителей, например, первое поколение гибридов F₁ с одним из родительских генотипов гибрида F₁.

Зародыш: в контексте настоящего изобретения "зародыш" может относиться к маленькому растению, содержащемуся в зрелом семени.

Наночастица: в контексте настоящего изобретения "наночастица" может относиться к микроскопической частице с размерами в нанодиапазоне, например, меньше 100 нм. Наночастицы, подходящие для использования в настоящем изобретении, могут иметь размер от 1 нм до 0,84 мкм. Одним классом наночастиц являются "квантовые точки" (QD). Квантовая точка может иметь медианный диаметр 1-10 нм, например, 2-4 нм. Другие варианты наночастиц включают, без ограничения: золотые наночастицы, покрытые золотом наночастицы, пористые наночастицы, мезопористые наночастицы, кремниевые наночастицы, полимерные наночастицы, такие как дендримеры, вольфрамовые наночастицы, желатиновые наночастицы, нанооболочки, наноядра, наносферы, нанотрубочки, магнитные наночастицы и их комбинации.

Из доступных наночастиц, наиболее продемонстрировано применение в биовизуализации и биосенсорных технологиях люминесцентных полупроводниковых нанокристаллов (QD). Их применение основано на комбинации уникальных фотофизических характеристик и размеров, сравнимых с размерами крупных белков. Гидродинамический радиус гидрофильных вариантов квантовых точек CdSe-ZnS варьирует от 5 нм (для нанокристаллов, с группами на поверхности, замещенными на молекулярные лиганды) до 20 нм для нанокристаллов, заключенных в блок-сополимеры. Одна QD может быть конъюгирована с несколькими биомолекулами (например, антителами, пептидами и молекулами нуклеиновых кислот), чтобы обеспечить полифункциональные биоконъюгаты QD с повышенной авидностью. В дополнение, их сильная устойчивость к химической и фотодеградации может потенциально позволять длительное флуоресцентное наблюдение специфичных биологических процессов. Nie and Emory (1997) Science 275: 1102-6. Для того чтобы получить полифункциональные биоконъюгаты QD, стабильные даже во внутриклеточном окружении, можно одновременно применять на одном комплексе множество схем нековалентной конъгации на основе металлоаффинной самосборки и связывания биотина с авидином без необходимости дополнительной очистки. Yezhelyev et al. (2008) J. Am. Chem. Soc. 130(28):9006-12. Используя в среднем 10 YFP плюс номинально 50 проникающих в клетку пептидов (СРР) на QD, можно осуществить внутриклеточную доставку белков с молекулярным весом по меньшей мере 300 кДа и размером 150 ангстрем. Id. Конъюгаты QD-b-PE доставляют "груз" в гораздо большем диапазоне размеров и молекулярных весов; например, со средним соотношением 2,5 Стрептавидин-b-ПЭ на конъюгат доставляемые вещества имеют молекулярный вес, который превышает 10³ кДа, и общий размер, приближающийся к 500 ангстремам. Молекулярный вес и размер могут значительно увеличиваться при использовании коъюгатов с большими валентностями b-PE.

Молекула нуклеиновой кислоты: полимерная форма нуклеотидов, которая может включать как смысловую, так и антисмысловую цепи РНК, кДНК, геномной ДНК, искусственные хромосомы (АСЕ) и синтетические формы и смешанные полимеры вышеперечисленного. Нуклеотид относится к рибонуклеотиду, дезоксирибонуклеотиду или модифицированной форме нуклеотида любого типа. В контексте настоящего изобретения "молекула нуклеиновой кислоты" является синонимом "нуклеиновой кислоты" и "полинуклеотида". Если не указано иное, то молекула нуклеиновой кислоты обычно имеет длину по меньшей мере 10 оснований. Термин включает одно- и двухцепочечные формы ДНК. Молекула нуклеиновой кислоты может включать любые или все природные и модифицированные нуклеотиды, соединенные друг с другом природными и/или неприродными нуклеотидными связями.

Функционально связанный: первая нуклеотидная последовательность функционально связана со второй нуклеотидной последовательностью, когда первая нуклеотидная последовательность функционально взаимосвязана со второй нуклеотидной последовательностью. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, если промотор влияет на транскрипцию или экспрессию кодирующей последовательности. При рекомбинантном получении функционально связанные нуклеотидные последовательности могут быть непрерывными и, при необходимости соединения двух кодирующих белки областей, могут иметь одну рамку считывания. Однако нуклеиновые кислоты не должны быть непрерывными, для того чтобы быть функционально связанными.

ПЭГилированный: В контексте настоящего изобретения термин "ПЭГилированный" может относиться к наночастицам (например, золотым наночастицам и квантовым точкам), поверхность которых модифицирована полиэтиленгликолем (ПЭГ) для улучшения биосовместимости. ПЭГилированные наночастицы могут быть дополнительно покрыты различными лигандами направленного действия, например, пептидами и антителами, для увеличения эффективности доставки в определенные клетки и ткани. ПЭГ конъюгирован с наночастицами с различными лекарственными соединениями, липосомами и полимерными мицеллами, например, для того чтобы увеличить время нахождения в кровотоке имеющих оболочку наночастиц за счет снижения неспецифической адсорбции белков вследствие эффекта стерической стабилизации.

Квантовая точка: в контексте настоящего изобретения "квантовая точка" (QD) (также иногда именуемая нанокристаллами) может относиться к полупроводниковой наноструктуре, которая ограничивает движение электронов зоны проводимости, дырок валентной зоны или экситонов (связанных пар электронов зоны проводимости и дырок валентной зоны) во всех трех измерениях. Это ограничение может быть следствием, например, электростатических потенциалов (генерируемых внешними электродами, допированием, деформацией, примесями и т.д.); присутствия поверхности раздела между различными полупроводниковыми материалами (например, в нанокристаллических системах "ядро-оболочка"); присутствия полупроводниковой поверхности (например, полупроводниковый нанокристалл); или их комбинации. Квантовая точка может иметь дискретный (квантованный) энергетический спектр. Соответствующие волновые функции могут быть пространственно локализованы в квантовой точке, но распространяются на множество периодов кристаллической решетки. Квантовая точка содержит маленькое конечное число (например, порядка 1-100) электронов зоны проводимости; дырок валентной зоны; или экситонов (то есть, конечное число элементарных электрических зарядов).

Квантовые точки представляют собой особый класс полупроводниковых материалов, которые могут являться кристаллами, состоящими из веществ, относящихся к группам II-VI, III-V или IV-VI периодической системы элементов Менделеева. Их размеры могут варьировать в диапазоне, например, от 2 до 10 нанометров (10-50 атомов) в диаметре. В некоторых вариантах осуществления изобретения квантовые точки могут быть изготовлены с ядром из селенида кадмия и оболочкой из сульфида цинка (CdSe/ZnS), и обладают спектром полезных электрических и оптических свойств, которые отличаются по характеристикам от свойств исходных веществ. Квантовые точки исследовали в качестве визуализирующих агентов in vivo и in vitro вследствие их высокого квантового выхода, высокого молярного коэффициента экстинкции и высокой устойчивости к фотообесцвечиванию.

Устойчивый к глифосату: устойчивость к дозе глифосата относится к способности растения выживать (то есть растение может не умирать) при воздействии дозы глифосата. В некоторых случаях устойчивые растения могут временно приобрести желтую окраску, или как-либо иначе проявлять вызванное глифосатом поражение (например, избыточное количество ростков и/или ингибирование роста), но восстанавливаться.

Стабилизированный: в контексте настоящего изобретения термин "стабилизированный" может относиться к характеристикам растения, которые воспроизводимо передаются от одного поколения к другому поколению инбредных растений одного сорта.

Трансген: в контексте настоящего изобретения термин "трансген" может относиться к последовательности экзогенной нуклеиновой кислоты. В одном примере трансгеном является последовательность гена (например, гена устойчивости к гербициду); гена, кодирующего промышленно или фармацевтически полезное соединение; или гена, кодирующего желаемый арготехнический признак. В еще одном примере трансгеном является последовательность антисмысловой нуклеиновой кислоты, причем экспрессия последовательности антисмысловой нуклеиновой кислоты ингибирует экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты-мишени. Трансген может содержать регуляторные последовательности, функционально связанные с трансгеном (например, промотор). В некоторых вариантах осуществления изобретения представляющая интерес молекула функционализированной линейной нуклеотидной кассеты, вводимая с помощью опосредованной наночастицами трансформации, содержит трансген. Однако в других вариантах осуществления изобретения, когда желательны дополнительные геномные копии последовательности эндогенной нуклеиновой кислоты, представляющая интерес молекула функционализированной линейной нуклеотидной кассеты содержит последовательность эндогенной нуклеиновой кислоты, либо она содержит нуклеотидную последовательность, находящуюся в антисмысловой ориентации относительно молекулы нуклеиновой килоты-мишени в организме-хозяине.

Поглощение: в контексте настоящего изобретения термин "поглощение" может относиться к перемещению частицы, такой как наночастица (например, квантовые точки или наночастицы золота), через клеточную стенку или клеточную мембрану, причем перемещение не происходит исключительно в результате импульса, приданного частице чем-либо помимо клетки, которая поглощает частицу. Неограничивающими примерами устройств или способов, которые вызывают перемещение частицы через клеточную стенку или клеточную мембрану исключительно в результате импульса, приданного частице, являются биолистические устройства, генная пушка, микроинъекция и/или методики импалефекции.

III. Доставка молекул нуклеиновых кислот с использованием наночастиц для стабильной трансформации растительных клеток

А. Общее описание

В этом изобретении описаны, например, новые способы трансформации растений с использованием опосредованного наночастицами переноса молекул функционализированных линейных нуклеотидных кассет для генетической трансформации и получения стабильных трансгенных растений. В способах по некоторых вариантам осуществления изобретения может быть предложено не только быстрое создание трансгенного организма, но также несколько возможностей желаемых генетических модификаций по сравнению с другими способами трансформации. Варианты осуществления настоящего изобретения привели в результате к впервые опубликованному стабильно трансформированному растению, полученному посредством опосредованной наночастицами доставки линеаризованной плазмидной ДНК. Раскрытые способы генетической модификации отличаются от традиционных способов генетической трансформации растений, не зависят от биолистической доставки и могут быть очень полезны для создания трансгенных сельскохозяйственных культур.

Трансгенные растения обычно получают Agrobacterium-опосредованной трансформацией или бомбардировкой частицами. В дополнение к представляющему интерес гену трансгенные растения часто обязательно содержат последовательности векторного каркаса и гены селектируемого маркера, например, которые придают резистентность к антибиотикам или гербицидам. Поскольку гены селектируемых маркеров и векторные каркасные последовательности являются как лишними, так и нежелательными в методиках переноса ДНК, то получение свободных от вектора трансгенных растений является предпочтительным. Удаление векторных каркасных последовательностей, которое позволяют способы по некоторых вариантам осуществления, может ограничить число гомологичных рекомбинаций и влияние вызывающих рекомбинацию элементов на процесс интеграции.

В вариантах осуществления настоящего изобретения может быть достигнуто прямое создание трансгенных растений с помощью неинвазивной опосредованной наночастицами доставки линейных нуклеотидных кассет, например, посредством способа погружения цветка. Такие способы могут обеспечить более простой путь проведения желаемых трансформаций растений относительно других способов, доступных в данной области. В некоторых вариантах осуществления изобретения способы можно использовать для создания свободных как от вектора, так и от маркера, трансгенных растений. В некоторых вариантах осуществления изобретения способы трансформации не зависят от культуры тканей и поэтому могут быть более удобны и целесообразны для растений, воспроизводимых половым размножением.

В некоторых вариантах осуществления способы по изобретению могут обеспечивать способность неинвазивно трансформировать не совместимые с Agrobacterium растения и/или их клетки в суспензионной культуре. Такие способы могут обеспечить огромные возможности. Желаемые входные данные и агротехнические признаки могут требовать доставки множества генов в одной процедуре трансформации. В некоторых вариантах осуществления способы по изобретению позволяют доставку молекул множества нуклеиновых кислот, одновременно устраняя необходимость конструирования крупных плазмид, содержащих все представляющие интерес гены, что может быть обременительно, если вообще возможно.

В. Молекулы нуклеиновых кислот

С приходом методик молекулярной биологии, которые позволили выделение и характеристику генов, которые кодируют определенные белковые или РНК-продукты (например, интерферирующие РНК ("РНКи")), ученые в области биологии растений стали заинтересованы в генетической модификации генома клеток для включения в него чужеродных генов и их экспрессии, или дополнительных или модифицированных версий природных или эндогенных генов (иногда регулируемых разными промоторами), например, с целью изменения признаков клетки определенным образом. Такие чужеродные дополнительные и/или модифицированные гены собирательно именуются в настоящем документе "трансгенами". Трансгены могут, например, кодировать представляющий интерес белок, или могут транскрибироваться в РНКи. За последние пятнадцать-двадцать лет были разработаны несколько способов получения трансгенных клеток, и в конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к трансформированным версиям клеток и способам их получения посредством введения в растительную клетку, имеющую клеточную стенку, одной или нескольких молекул функционализированных нуклеотидных кассет посредством поглощения наночастицы через клеточную стенку. В некоторых вариантах осуществления изобретения трансген может содержаться в синтезированной линейной ДНК-кассете.

Трансформация клеток может включать в себя молекулу нуклеиновой кислоты, которая содержит ген под контролем или функционально связанный с регуляторным элементом (например, промотором, энхансером, последовательностью терминации или их комбинацией). Таким образом, молекула нуклеиновой кислоты может содержать один или несколько таких функционально связанных комбинаций гена и регуляторного элемента.

В вариантах осуществления изобретения представляющей интерес молекулой нуклеиновой кислоты может быть молекула функционализированной линейной нуклеотидной кассеты. Молекулы функционализированных линейных нуклеотидных кассет можно получить, например, расщеплением кольцевой плазмиды по меньшей мере одной рестрикционной эндонуклеазой, так чтобы вырезать содержащуюся в ней экспрессионную кассету. Рестрикционные эндонуклеазы будут расщеплять плазмиду по одному или нескольким сайтам рестрикции в нуклеотидной последовательности плазмиды. Поэтому, плазмиды можно конструировать таким образом, чтобы позволять создание одной или нескольких определенных молекул линейных нуклеотидных кассет путем расщепления с помощью по меньшей мере одной конкретной рестрикционной эндонуклеазы. В альтернативном варианте, в данной нуклеотидной последовательности плазмиды можно провести поиск сайтов, узнаваемых одной или несколькими конкретными рестрикционными эндонуклеазами, что позволит получить одну или несколько определенных молекул линейных нуклеотидных кассет. Путем отбора сайтов рестрикции, которые находятся в определенных местах в кольцевой плазмиде или линейной молекуле нуклеиновой кислоты, можно п