Реагент, позволяющий инактивировать микроорганизмы, экстрагировать и сохранять днк бактерий в форме, пригодной для высокоэффективной молекулярной диагностики

Реагент, позволяющий инактивировать микроорганизмы, экстрагировать и сохранять днк бактерий в форме, пригодной для высокоэффективной молекулярной диагностики

Реферат

Область изобретения

Изобретение относится к области биохимии, химии и медицины и касается разработки реагента для предварительной подготовки биологических образцов к in vitro диагностике инфекционных заболеваний молекулярно-генетическим методом.

Предпосылки изобретения

В настоящее время заболеваемость инфекционными заболеваниями остается очень высокой, а их распространенность - глобальной. До сих пор в мире ежегодно регистрируется свыше 1 миллиарда случаев инфекционных болезней желудочно-кишечного тракта и дыхательных путей. Например, заболеваемость гриппом в отдельные годы составляет свыше 10-15% населения только в странах Европы и Америки. Еще 75 млн человек переносят другие острые респираторные инфекции (ОРЗ). Во время пандемий грипп приобретает характер стихийного бедствия, нанося странам огромный экономический ущерб.

Каждый год в мире регистрируется несколько десятков миллионов случаев заболеваний, вызванных стрептококками (ангины, скарлатина, рожа и другие). Широко распространена холера, которая в последние годы регистрируется более чем в 30 странах мира. В мире насчитывается более 400 млн больных трахомой и 11 млн больных проказой. Продолжает расти заболеваемость вирусными гепатитами.

В условиях, когда отступили самые массовые и тяжелые инфекции, в структуре инфекционной патологии стали более заметными болезни, которые вызываются условно-патогенными микроорганизмами и даже обычными «нормальными» обитателями организма человека.

В последние годы в разряд инфекционных перешли болезни, ранее к таковым не относившиеся. Имеется в виду почти неизвестная ранее группа очень своеобразных «медленных» инфекций. Так, отечественными исследователями М.С. Маргулисом, В.Д. Соловьевым, А.К. Шубладзе, Е.Н. Бычковой была доказана вирусная природа тяжелых болезней центральной нервной системы - острого энцефаломиелита человека и рассеянного склероза.

В соответствии с информацией ВОЗ, около 2 миллиардов людей, треть общего населения Земли, инфицировано M. tuberculosis. В настоящее время туберкулезом ежегодно заболевает 9 миллионов человек во всем мире, из них 3 миллиона умирают от его осложнений.

Проблемы борьбы с туберкулезом прежде всего заключаются в ранней диагностике этого заболевания, своевременно начатом лечении и проведении комплекса профилактических мероприятий в «очаге туберкулезной инфекции».

Существующие методы лабораторной диагностики инфекционных заболеваний не отвечают потребностям клинической практики.

Быстрый метод бактериоскопии обладает низкой чувствительностью, так для обнаружения микобактерий туберкулеза (МБТ) в 1 мл патологического материала должно содержаться не менее 100000 клеток возбудителя. Люминесцентная микроскопия увеличивает чувствительность бактериоскопии на 10-30% и позволяет обнаружить 3000-10000 клеток возбудителя. Чувствительность бактериологического посева на плотные питательное среды в настоящее время остается золотым стандартом и составляет 50-100 МБТ. Однако по продолжительности это исследование составляет не менее 2 месяцев.

В этой связи разработка и внедрение в практику эффективных методов выявления и этиологического подтверждения этого заболевания, а также других инфекционных заболеваний приобретают первостепенное значение в современной клинической практике.

Одним из наиболее перспективных методов обнаружения возбудителей инфекционных заболеваний является метод обнаружения ДНК возбудителей с помощью полимеразой цепной реакции (ПЦР).

ПЦР-диагностика позволяет выявить инфекционные заболевания, в частности туберкулез, в несколько раз быстрее, чем бактериологический метод. С другой стороны, с помощью ПЦР можно осуществлять эпидемиологический контроль за бактериовыделителями и тем самым решать вопросы продолжения антибактериального лечения для каждого конкретного случая, несмотря на кажущуюся клинико-рентгенологическую стабилизацию специфического процесса.

Обнаружение ДНК микроорганизмов методом ПЦР применяется в составе комплексной диагностики инфекционных заболеваний, позволяет быстро определить наличие специфического возбудителя и разработать эффективные клинические и эпидемиологические мероприятия в отношении больного.

Метод ПЦР обеспечивает высокую чувствительность и специфичность (подавляющее число производителей подобных тестов гарантируют чувствительность выше 95%, специфичность выше 98%).

В этой связи этот метод может быть использован как скрининговый при диагностике инфекционного заболевания, определении политики лечения, контроля его качества и оценке эпидемической значимости больного.

Время, затрачиваемое на определение ДНК инфекционных агентов, составляет 4-5 часов.

В случае массового скрининга больных на инфекционные заболевания, включая определение лекарственной устойчивости, с учетом внедрения автоматизированных (роботизированных) платформ для пробоподготовки, количество образцов может возрастать до 300 и более (при норме нагрузки 36 образцов обычной бактериологической лаборатории) за рабочий день, что свидетельствует о возможности концентрации большого количества биологически опасного материала в одном месте.

Кроме того, существенным препятствием для широкомасштабного скрининга на инфекционные заболевания является то, что экстракция ДНК из биологических образцов должна быть проведена в течение 48 часов после забора материала. Это обстоятельство предполагает ограничения для проведения скрининга и делает доставку и транспортировку материла (в течение указанного времени) чрезвычайно дорогостоящей и трудоемкой, особенно при реализации исследований, проводимых в дальних труднодоступных регионах. В случае забора биологических образцов, их доставки и последующего хранения свыше указанного срока образцы должны быть заморожены. Размораживание-замораживание образцов не допустимо из-за возможности разрушения в них ДНК, что существенно ограничивает скрининг на инфекционные заболевания, даже при наличии высокоспециализированной сети ПЦР-лабораторий (в доступных источниках не описан способ (кроме заморозки) доставки и транспортировки).

При обработке и исследовании биологического материала в ПЦР-лабораториях создается высокий риск инфицирования сотрудников и объектов окружающей среды. Несмотря на существующие меры противоэпидемической защиты в соответствии с действующими нормативно-методическими документами разработаны комплексные меры защиты персонала лабораторий. Заболеваемость персонала лабораторий, осуществляющих диагностику туберкулеза, остается чрезвычайно высокой и в 6-10 раз превышает таковую среди общего населения. Лекарственная устойчивость микобактерий среди сотрудников противотуберкулезной службы существенно превышает уровень лекарственной устойчивости среди общего населения и доходит до 50%. Лекарственная устойчивость среди других инфекционных заболеваний неуклонно возрастает по данным государственной статистики.

Образцы мокроты, поступающие в лаборатории на исследования, отличаются высоким содержанием инфекционного агента (от 5000 до 1000000 микроорганизмов в 1 мл материала). Манипуляции, производимые в лабораториях, даже при наличии средств защиты, являются несомненным фактором риска заражения медицинского персонала, поскольку при обработке данного материала формируется аэрозоль, который может содержать до 1000000 микроорганизмов.

Опасность также представляют транспортировка и хранение биологического материала, для которых требуются специальные условия по безопасности в определенный временной промежуток.

В настоящее время широко распространена ПЦР-диагностика различных возбудителей в крови. Однако, даже при самых серьезных заболеваниях, возбудитель достаточно редко определяется в крови (за исключением инфекций, передаваемых через кровь), что свидетельствует о необходимости исследования других биологических материалов, взятых у больных, с целью этиологического подтверждения диагноза.

Вместе с тем, биологический материал, полученный у больных, такой как мокрота, биоптаты, спинно-мозговая жидкость и тому подобное, содержит достаточно много биологических примесей, таких как кровь, гной, разнообразные белковые субстанции, которые в свою очередь являются ингибиторами ПЦР-реакции и не позволяют эффективно выделить ДНК возбудителя.

Разработка методов предварительной подготовки биологических образцов, позволяющих в последующем проводить эффективную экстракцию ДНК на основе очищения микробных клеток от ингибиторов ПЦР-реакции на стадии подготовки самого биологического образца, одновременно инактивировать микроорганизмы, разжижать образец и проводить данную подготовку однократным добавлением реагента к биологическому образцу (без дополнительных стадий смешения различных ингредиентов) и в последующем эффективно экстрагировать ДНК, хранить и транспортировать данный образец в течение длительного периода времени в целях проведения текущих и дальнейших исследований (на определение лекарственной устойчивости микроорганизмов), является важной задачей, позволяющей одновременно проводить качественную и быструю диагностику инфекционных заболеваний, эффективное лечение больного и осуществлять противоэпидемические мероприятия, направленные на защиту персонала лабораторий.

Наиболее сложными в отношении инактивации являются микобактерии туберкулеза. Благодаря особому химическому строению микобактерии туберкулеза обладают значительной устойчивостью к физическим и химическим агентам. Во влажной мокроте микобактерии выдерживают нагревание в течение 30 минут при 75ºС, при кипячении погибают через 5 минут. В выделенной мокроте МБТ погибают при 100ºС через 45 минут. В мокроте, выделенной и сохраняемой в темноте при комнатой температуре, жизнеспособность палочек сохраняется не менее 4 месяцев, в рассеянном свете они погибают через 1-11/2 месяца. В суховоздушной камере при увлажнении и температуре 80ºС МБТ выживают в течение 2 часов. Во внешней среде микобактерия туберкулеза достаточно устойчива. В уличной пыли МБТ сохраняются до 10 дней, на страницах книг - до 3 месяцев. В воде она может сохраняться до 150 дней. Высохшие микобактерии вызывают туберкулез у морских свинок через 1-1,5 года, лиофилизированные и замороженные жизнеспособны до 30 лет.

Существуют физические и химические способы инактивации микроорганизмов, к числу которых следует отнести кипячение, использование дезинфектантов, спиртов (этилового и изопропилового), четвертичных аммониевых соединений, гуанидиновых производных, альдегидов, третичных аминов. Устойчивость МБТ к физическим и химическим факторам обусловлена особенностью строения ее наружной мембраны.

С липидной фракцией внешней оболочки МБТ связывают устойчивость возбудителей туберкулеза к кислотам, щелочам и спиртам.

Известно, что гидроксид натрия (NaOH) обладает хорошим разжижающим эффектом. Этот реагент широко используется в пробоподготовке материала, особенно мокроты, полученной у больных туберкулезом, с целью его разжижения. Известно, что помимо разжижающего эффекта щелочь в концентрации более 2% способствует гибели клеток.

Обычно очистка от ингибиторов ПЦР-реакции проводится на стадии выделения ДНК, что предполагает лизис микробной клетки, выход ДНК в супернатант и ее смешивание с ингибиторами ПЦР-реакции, для чего требуются вспомогательные методы для дополнительного отделения искомой ДНК от других субстанций и ее последующая очистка и концентрация. В этой связи существующие методы выделения ДНК не обеспечивают достаточную чувствительность и специфичность ПЦР-анализа.

В доступных источниках описаны различные способы инактивации микроорганизмов, включая МБТ, к которым относятся кипячение, использование щелочей, органических растворителей, спиртов, детергентов и дезинфектантов.

Известны биоцидные моющие составы на основе N,N-бис-(3-аминопропил)лауриламина, содержащие N,N-бис-(3-аминопропил)лауриламин (ЕР 333143, 20.09.89), предназначенные для дезинфекции помещений и оборудования, но не предназначенные для использования в молекулярной диагностике.

Известно дезинфицирующее противомикобактиральное средство на основе N,N-бис-(3-аминопропил)лауриламина и воды, содержащее, кроме N,N-бис-(3-аминопропил)лауриламина и воды, хлорид дидецилдиметиламмония, этоксилаты жирных спиртов С₈-С₁₂, N-(лауриламинопропилен)глицин, додецилгуанидинацетат, метилендиаминтетраацетат натрия, хлорид лаурилдиметилбензиламмония, сульфаты жирных спиртов С₁₂-С₁₄, децилсульфонат, этанол, изопропиловый спирт (ЕР 343605, 29.05.89). Эти средства обладают бактерицидными свойствами, однако их использование в ПЦР-реакциях не предусматривается, они используются только в составе моющих средств при дезинфекции помещений и эндоскопического оборудования.

Описан инактивирующий реагент, входящий в состав диагностической системы GeneXpert. Составляющие этого инактивирующего реагента авторами не раскрыты. Однако в инструкции для пользователя и в многочисленных публикациях авторов сообщается, что инактивация МБТ ограничивается 100 клетками, полная инактивация образцов не гарантирована.

Известен раствор для инактивации микобактерий в биологическом образце, содержащий гидроксид натрия и изопропанол (Journal of Clinical Microbiology, Jan., 2010, p.229-237). Использование этого инактивирующего реагента, как отмечают сами авторы, не приводит к полной инактивации образца, а лишь снижает концентрацию микобактерий в образце до >2 КОЕ/мл.

Известен реагент для инактивации или деконтаминации микобактерий в клинических образцах, содержащий изотиоцианат гуанидина, Tris-Cl, N-лаурил саркозил, ЭДТК, меркаптоэтанол и ацетат аммония (патент RU 2338789, 20.01.08; заявка 2006124570). Использование этого раствора позволило авторам достигнуть чистоты выделенной ДНК. Вместе с тем, обработка клинических образцов этим раствором не приводит к адекватной концентрации ДНК в образце, что существенно снижает чувствительность ПЦР-анализа. Описанный реагент используется в модифицированном буфере для лизиса, который позволяет провести инактивацию образца на данной конкретной стадии. Обработка клинического образца данным реагентом приводит к лизису микобактериальной клетки и позволяет оптимизировать стадии очистки ДНК. Для разжижения образца по настоящему изобретению применяются вспомогательные стадии обработки щелочью средней силы и муколитическим средством. Авторы не сообщают об эффективности выделения ДНК с использованием описанного реагента и не указывают на возможность использования данного реагента для хранения и транспортировки образцов, а также о сохранении стабильности инактивированного образца со временем.

Таким образом, в литературе описаны многочисленные исследования, касающиеся использования различных реагентов для инактивации микроорганизмов в биологических (клинических) образцах. Однако ни в одном из них не рассматривается возможность использования такого реагента для комплексной подготовки биологических (клинических) образцов для ПЦР-исследования, включая очищение от ингибиторов ПЦР-реакции на стадии подготовки самих образцов, инактивацию, разжижение, возможность безопасной транспортировки, хранения клинических образцов и сохранения стабильности ДНК в данных образцах в течение длительного периода времени.

Цель изобретения

Основной целью изобретения является разработка реагента для предварительной подготовки биологического образца в форме, пригодной для in vitro диагностики инфекционных заболеваний молекулярно-генетическим методом.

Другая цель изобретения относится к дизайну реагента, позволяющего одновременно провести комплексную подготовку образца, включающую очищение микробных клеток от ингибиторов ПЦР-реакции, инактивацию и разжижение биологического образца.

Еще одна цель изобретения относится к разработке метода безопасной транспортировки клинических образцов в связи с поддержанием стабильности сохраняемой ДНК в клинических образцах (после получения образцов до поступления в скрининговую лабораторию может пройти до 4 суток).

Еще одной целью изобретения является безопасное хранение клинических образцов за счет их консервации в новом реагенте в случае необходимости проведения дополнительных ПЦР-исследований, в частности, для динамических наблюдений за больным на состояние носительства, определения лекарственной устойчивости МБТ и контроля качества лечения.

Еще одна цель изобретения заключается в возможности сохранения самого реагента в подходящей таре, в частности, в пластиковой или стеклянной, в течение не менее 1 года для использования с сохранением стабильности всех его параметров.

Еще одной целью изобретения является возможность сокращения времени подготовки биологического образца с помощью его однократного добавления к биологическому материалу.

Сущность изобретения

В одном аспекте изобретение относится к реагенту для подготовки биологического образца к in vitro диагностике инфекционного заболевания методом ПЦР. Реагент представляет собой водный раствор, содержащий спирт, щелочь и третичный амин в концентрациях, обеспечивающих повышение эффективности амплификации не менее чем на 2 цикла.

Совокупность признаков реагента обеспечивает комплексную подготовку биологических образцов, включающую очистку, отмывку микробных клеток от ингибиторов ПЦР-реакции, инактивацию, разжижение и сохранение стабильности ДНК в течение не менее 3 месяцев, что позволяет безопасно транспортировать и хранить клинические образцы, а также использовать их для последующих исследований.

В некоторых случаях допустимо снижение содержания щелочи в составе реагента, что приводит к снижению коррозийных свойств, увеличивает срок годности реагента, упрощает условия хранения и использования, при этом не отмечается снижения эффективности пробоподготовки.

В другом аспекте изобретение относится к способу подготовки биологического образца к in vitro диагностике инфекционного заболевания методом ПЦР, предусматривающему обработку его реагентом в течение не менее 1 часа.

Также изобретение относится к способу хранения биологического образца, пригодного для in vitro диагностики инфекционного заболевания методом ПЦР, предусматривающему обработку его реагентом в течение не менее 1 часа. Предложенный способ хранения позволяет повысить выход исследуемой ДНК после 4 дней и до 3 месяцев хранения.

Подробное описание изобретения

Авторами настоящего изобретения получен реагент для предварительной подготовки биологических образцов, таких как мокрота, спинно-мозговая жидкость, биоптаты тканей и другие, в форме, пригодной для in vitro диагностики инфекционных заболеваний молекулярно-генетическим методом вследствие очищения микробных клеток от ингибиторов ПЦР-реакции на стадии подготовки данных образцов, инактивации микроорганизмов, в том числе микобактерий туберкулезного комплекса (МБТ), в биологических (клинических) образцах, разжижения образцов и сохранения стабильности ДНК в биологических образцах для проведения последующих исследований (после добавления реагента и экспозиции биологического материала в течение от не менее 1 часа до 4 суток). Возможность исследования данного биологического образца сохраняется в течение не более 3 месяцев. Кроме того, хранение реагента в стеклянной или пластиковой таре (полипропилен) в течение года обеспечивает сохранение и стабильность всех составляющих реагента, возможность его использования в течение данного времени, а также транспортировку к месту сбора биологических образцов. В связи с применением реагента (однократного добавления к биологическому материалу) и экспозиции не менее 1 часа сокращается время подготовки биологического образца (особенно мокроты) для ПЦР-диагностики по меньшей мере на 2-3 часа.

В состав реагента входят:

1. Спирт, например изопропанол. Использование изопропилового спирта позволяет снизить поверхностное натяжение на границе дезинфектант - клеточная мембрана микроорганизма, повысить проникновение действующих веществ (дезинфектанта) в клеточные структуры микроорганизма, что, в свою очередь, позволяет быстрее достигать инактивации микроорганизма и использовать для этого меньшие концентрации дезинфицирующего средства. Известно, что при равных концентрациях раствор изопропилового спирта проявляет большую бактерицидную активность, чем раствор этилового спирта.

2. Третичный амин, например N,N-бис-(3-аминопропил)додециламина. В ходе проведенных исследований было неожиданно установлено, что третичный амин в сочетании со спиртом обеспечивает очистку микробных клеток и избавляет их от прилипших ингибиторов ПЦР-реакции, при этом не оказывая разрушающего действия на клеточную стенку и способствуя сохранению стабильности ДНК и облегчая ее экстракцию при дальнейшем исследовании.

3. NaOH в качестве разжижающего агента.

Были получены различные варианты реагента (изменялись соотношения компонентов, входящих в его состав) и изучена их активность. Подбор количественного соотношения компонентов, входящих в состав реагента, находится в компетенции специалиста в данной области и зависит от вида биологического образца, исследуемого на наличие того или иного патогенного или условно-патогенного инфекционного агента.

Изучение активности различных вариантов состава реагента

В этой связи, в соответствии с различиями в концентрациях были исследованы растворы А, В, С, D (таблица 1) и обычный метод - кипячение.

Таблица 1Состав растворов, используемых в работе
Раствор	Состав раствора
A	Изопропанол 40%, 0,2М (2,4%) NaOH, 0,075% N,N-бис-(3-аминопропил)додециламина
B	Изопропанол 40%
C	Н-Бутанол 20%
D	Н-Бутанол 20%, 0,2М (4%) NaOH

Были исследованы образцы, полученные у больных с диагнозом туберкулез легких. Из каждого образца был сделан мазок, который красили люминесцентными красителями для выявления кислотоустойчивых палочек. Во всех образцах были обнаружены кислотоустойчивые бациллы. Образцы мокроты разделяли на 5 групп, которые обрабатывались растворами А, В, С, D и кипячением.

Лучше всего разжижал мокроту раствор А (реагент).

Было использовано разное время экспозиции с растворами A, B, C, D: 1 час, 24 часа и 4 суток. По истечении срока экспозиции 0,5 мл каждого разжиженного и хорошо перемешанного образца отбирали в микроцентрифужную пробирку и использовали для выделения ДНК, 0,5 мл отбирали в 50-мл пробирку, отмывали 2 раза фосфатным буфером и засевали на жидкую питательную среду Middlebrook 7H9 в пробирки MGIT, которые помещали в аппарат BACTEC MGIT 960 для автоматической детекции роста.

В качестве контроля использовали мокроту 12 бациллярных больных, предобработанную стандартным методом с использованием реагента NALC-NaOH.

Отрицательный результат (роста микобактериальной культуры нет) выдавали через 42 дня после посева.

Результаты посева на BACTEC MGIT 960 представлены в таблице 2.

Таблица 2Результаты посева образцов мокроты, обработанных растворами А, В, С и D и стандартным реагентом NALC-NaOH

Метод предобработки мокроты	Время предобработки	Номер образца	Результат посева	Время от момента посева до детекции роста в пробирке, дни
Стандартное разжижение NALC-NaOH	20 минут (стандартное)	1	рост есть	7
2	рост есть	8
3	рост есть	9
4	рост есть	8
5	рост есть	8
6	рост есть	9
7	рост есть	8
8	рост есть	7
9	рост есть	7
10	рост есть	10
11	рост есть	7
12	рост есть	8

Метод предобработки мокроты	Время предобработки	Номер образца	Результат посева	Время от момента посева до детекции роста в пробирке, дни
Раствор А	1 час	1А	роста нет	--
2А	роста нет	--
3А	роста нет	--
24 часа	1А	роста нет	--
2А	роста нет	--
3А	роста нет	--
4 суток	1А	роста нет	--
2А	роста нет	--
3А	роста нет	--

Метод предобработки мокроты	Время предобработки	Номер образца	Результат посева	Время от момента посева до детекции роста в пробирке, дни
Раствор B	1 час	4B	роста нет	--
5B	роста нет	--
6B	роста нет	--
24 часа	4B	роста нет	--
5B	роста нет	--
6B	роста нет	--
4 суток	4B	роста нет	--
5B	роста нет	--
6B	роста нет	--

Метод предобработки мокроты	Время предобработки	Номер образца	Результат посева	Время от момента посева до детекции роста в пробирке, дни
Раствор C	1 час	7C	роста нет	--
8C	роста нет	--
9C	роста нет	--
24 часа	7C	роста нет	--
8C	роста нет	--
9C	роста нет	--
4 суток	7C	роста нет	--
8C	роста нет	--
9C	роста нет	--

Метод предобработки мокроты	Время предобработки	Номер образца	Результат посева	Время от момента посева до детекции роста в пробирке, дни
Раствор D	1 час	10D	роста нет	--
11D	роста нет	--
12D	роста нет	--
24 часа	10D	роста нет	--
11D	роста нет	--
12D	роста нет	--
4 суток	10D	роста нет	--
11D	роста нет	--
12D	роста нет	--

Результаты ПЦР представлены в таблицах 3-6.

Таблица 3Результаты ПЦР после предобработки мокроты раствором А
Краситель	Время экспозиции	Образец # 1А	Образец # 2А	Образец # 3А
Среднее значение (Ct)	SD (Ct)	Среднее значение (Ct)	SD (Ct)	Среднее значение (Ct)	SD (Ct)
FAM	1 час	22,13	0,04	22,56	0,28	20,08	0,08
24 часа	21,12	0,00	21,40	0,01	19,34	0,04
4 суток	19,55	0,04	20,07	0,03	17,32	0,03
ROX	1 час	27,43	0,01	27,78	0,15	25,32	0,08
24 часа	26,31	0,06	26,71	0,06	24,51	0,10
4 суток	24,78	0,01	25,36	0,01	22,37	0,06

Таблица 4Результаты ПЦР после предобработки мокроты раствором В
Краситель	Время экспозиции	Образец # 4В	Образец # 5В	Образец # 6В
Среднее значение (Ct)	SD (Ct)	Среднее значение (Ct)	SD (Ct)	Среднее значение (Ct)	SD (Ct)
FAM	1 час	20,49	0,11	16,30	0,06	22,89	0,20
24 часа	20,86	0,07	16,91	0,10	23,31	0,21
4 суток	21,00	0,30	16,82	0,33	23,38	0,01
ROX	1 час	26,09	0,10	21,64	0,02	28,40	0,21
24 часа	26,41	0,04	22,23	0,09	28,62	0,18
4 суток	26,41	0,25	22,08	0,24	28,88	0,01

Таблица 5Результаты ПЦР после предобработки мокроты раствором С
Краситель	Время экспозиции	Образец # 7С	Образец # 8С	Образец # 9С
Среднее значение(Ct)	SD (Ct)	Среднее значение (Ct)	SD (Ct)	Среднее значение (Ct)	SD (Ct)
FAM	1 час	23,40	0,06	22,85	0,05	23,70	0,57
24 часа	23,02	0,06	22,80	0,06	22,04	0,03
4 суток	20,35	0,16	20,45	0,07	19,87	0,12
ROX	1 час	28,96	0,01	28,22	0,04	28,75	0,32
24 часа	28,13	0,06	27,81	0,06	27,09	0,02
4 суток	24,84	0,03	25,21	0,13	24,45	0,11

Таблица 6Результаты ПЦР после предобработки мокроты раствором D
Краситель	Время экспозиции	Образец # 10D	Образец # 11D	Образец # 12D
Среднее значение (Ct)	SD (Ct)	Среднее значение (Ct)	SD (Ct)	Среднее значение (Ct)	SD (Ct)
FAM	1 час	21,79	0,30	20,14	0,09	19,19	0,05
24 часа	22,17	0,01	21,15	0,25	18,62	0,27
4 суток	21,69	0,01	20,23	0,28	18,75	0,18
ROX	1 час	27,13	0,18	25,37	0,10	24,21	0,01
24 часа	26,79	0,01	26,41	0,29	23,80	0,01
4 суток	26,62	0,09	25,04	0,13	23,97	0,22

В результате проведенных исследований было установлено следующее.

1. Лучше всего разжижал мокроту раствор А (реагент).

2. Обработка материала растворами A, B, C и D в течение 1 ч и 24 ч экспозиции не влияла на эффективность выделения ДНК и ПЦР.

3. Экспозиция в течение 4 суток с растворами А и С приводила к увеличению эффективности выделения ДНК (в среднем на 2 амплификационных цикла) по сравнению с 1 ч и 24 ч экспозиции, тогда как экспозиция с растворами B и D в течение 4 суток не оказывала влияния на эффективность ПЦР.

4. Обработка мокроты растворами А, В, С и D приводила к гибели микобактериальных клеток при всех сроках экспозиции.

5. Предобработка реагентами более предпочтительна, чем кипячение, так как является более технологичным методом, сочетающим в себе разжижение, деконтаминацию и инактивацию мокроты одновременно.

На второй стадии была проведена работа по подбору оптимальных концентраций компонентов раствора (таблица 7), объемов реагента и протоколов пробоподготовки для молекулярно-генетического исследования мокроты больных с диагнозом туберкулез легких.

Таблица 7Подбор оптимальных концентраций компонентов раствора
Раствор	Состав раствора
A2	Изопропанол 40%, 0,6М (12%) NaOH
A3	Изопропанол 40%, 0,2М (2,4%) NaOH, 0,3% N,N-бис-(3-аминопропил)додециламина
A4	Изопропанол 40%, 1М (20%) NaOH
A5	Изопропанол 40%, 0,2М (2,4%) NaOH, 0,075% N,N-бис-(3-аминопропил)додециламина

Схему пробоподготовки образцов мокроты разрабатывали, используя растворы А2 и А3, далее сравнивали ее со стандартной схемой пробоподготовки с использованием NALC-NaOH. Выделение ДНК проводили ручным и автоматическим способами. Результат оценивали по следующим критериям: разжижение мокроты, образование осадка после центрифугирования, выход ДНК после выделения, деградация ДНК при действии реагента. Исследовали следующие способы пробоподготовки:

- стандартная обработка NALC-NaOH;

- добавление раствора А в количестве от 20 до 50 мл к образцу объемом 3-5 мл.

В результате проведенных исследований образцов мокроты было установлено следующее.

1. Лучше всего разжижает образцы раствор А3. В этом случае отмечался неожиданный эффект: по мере снижения концентрации щелочи и добавления третичного амина отмечалось более гомогенное разжижение, позволяющее эффективно проводить последующие стадии исследования. Кроме того, содержание в растворе щелочи в количестве 12% обуславливает выраженный коррозийный эффект, что создает опасность при работе с реагентом и ограничивает его транспортировку. Снижение концентрации щелочи до 2,4% существенным образом снижает это нежелательное свойство.

На образцах нативной мокроты был проведен эксперимент по влиянию предобработки с использованием растворов А2, А4 и А5 на выделение ДНК ручным и автоматическим способами. Схема пробоподготовки состояла в добавлении раствора А к образцам в количестве от 20 до 50 мл. Критерии оценки результата были аналогичны предыдущим экспериментам. Использованная схема пробоподготовки показала хорошие результаты, растворы А2 и А5 были выбраны для дальнейших экспериментов.

Влияние различных способов предобработки мокроты с использованием растворов А2 и А5 на выделение и деградацию ДНК в сравнении со стандартной процедурой обработки с помощью NALC-NaOH проводили на образцах мокроты. Исследовали следующие способы пробоподготовки:

- стандартная обработка NALC-NaOH;

- добавление раствора A2 к образцу мокроты в количестве до 50 мл и перемешивание в течение 1 ч;

- добавление раствора A2 к образцу мокроты в количестве до 50 мл, перемешивание в течение 1 ч и инкубация в течение 96 часов;

- добавление раствора A5 к образцу мокроты в количестве до 50 мл и перемешивание в течение 1 ч;

- добавление раствора A5 к образцу мокроты в количестве до 50 мл, перемешивание в течение 1 ч и инкубация в течение 96 часов.

В результате проведенных исследований были сделаны следующие выводы.

1. Предобработка А5 повышает выход ДНК и, следовательно, чувствительность системы по сравнению со стандартной предобработкой NALC-NaOH при автоматическом способе выделения в среднем в 16,3 раза, при ручном способе - в среднем в 11,4 раза.

2. Инкубация образцов, обработанных А5 в течение 96 часов, не только не приводит к деградации ДНК и уменьшению выхода при выделении, в сравнении с обработкой NALC-NaOH, но и значительно повышает выход ДНК даже при сравнении с образцами, которые перемешивали в присутствии реагента в течение 1 часа без последующей инкубации.

Для окончательного выбора состава реагента проводили сравнение обработки образцов мокроты с различным содержанием ДНК M. tuberculosis complex, обработанных растворами А2 и А5. Результаты представлены в таблице 8.

Таблица 8Оценка воздействия реагентов А2 и А5 на выделение ДНК из клеток M. tuberculosis при использовании ручного и автоматического способов пробоподготовки
Количество клеток	Количество копий ДНК, А2	Количество копий ДНК, А5
ручной способ	автоматический способ	ручной способ	автоматический способ
107-109	0,3×108	0,6×107	0,6×108	0,8×107
104-106	0,4×105	0,3×105	0,7×105	0,6×105
50-100	0,6×102	0,4×102	0,8×102	0,6×102
0-20	50	24	70	36

Как видно из таблицы, обработка реагентом А5 приводила к более эффективному выделению ДНК как при ручном, так и при автоматическом способе пробоподготовки. Особенно важным является эффективная экстракция ДНК при малом количестве клеток в материале, которая заметно выше при обработке материала реагентом А5, который был выбран как наиболее эффективный.

В последующих экспериментах была показана возможность использования реагента А5 как на нативном материале, так и на материале, прошедшем стандартную пробоподготовку с помощью NALC-NaOH, причем эффективность выделения ДНК при использовании реагента по сравнению со стандартной пробоподготовкой была выше в 5-10 раз.

Испытания реагента для обработки диагностического материала проводили с использованием образцов мокроты у больных туберкулезом с массивным бактериовыделением, подтвержденным бактериоскопическим методом исследования. Образцы были поделены на 3 части. Первую часть образцов (контроль роста МБТ) подвергали стандартной предобработке NALC-NaOH, затем культивировали на жидкой среде в системе BACTEC MGIT 960. Другую часть образцов инкубировали 1 ч с 20-50 мл реагента, затем дважды отмывали фосфатным буфером и также культивировали в системе BACTEC MGIT 960. Третью часть образцов обрабатывали стандартным методом NALC-NaOH, к полученным осадкам добавляли 0,5 мл реагента.

Ни в одном из исследованных образцов при культивировании в течение 42 дней в системе BACTEC MGIT 960 после инкубации с реагентом А5 рост МБТ не выявлен. В контрольных пробирках, без обработки реагентом