Композиции и способы характеризации миопатии

Композиции и способы характеризации миопатии

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ

Данная заявка притязает на приоритет следующих предварительных заявок на патенты США (№№): 61/324857, поданной 16 апреля 2010 г., и 61/371798, поданной 9 августа 2010 г.; содержание каждой из которых полностью включено сюда посредством ссылки.

ЗАЯВЛЕНИЕ О ПРАВАХ НА ИЗОБРЕТЕНИЯ, СДЕЛАННЫЕ ПРИ ИССЛЕДОВАНИЯХ, ФИНАНСИРУЕМЫХ ИЗ ФЕДЕРАЛЬНОГО БЮДЖЕТА

Данное изобретение было поддержано следующими грантами Национальными институтами здравоохранения, (National Institutes of Health) (№№): AR44684, R37DE12354, K23-AR-053197 и K08-AR-054783. Правительство имеет определенные права на данное изобретение.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

У взрослых со слабостью проксимальных мышц, повышенными уровнями креатинкиназы (СК), признаками миопатии при электромиографии (EMG) и признаками отека мышц при магнитно-резонансной томографии (MRI) проводят обширный дифференциальный диагноз, включающий аутоиммунные миопатии, токсические миопатии, паранеопластические миопатии и мышечные дистрофии. Миопатия является частым нежелательным побочным эффектом, возникающим у субъектов, которым вводят статины для снижения у них уровня холестерина. Тяжесть возникающей у этих пациентов мышечной боли иногда приводит к необходимости прекращения терапии статинами. Разграничение иммуноопосредованных миопатии и миопатии другой этиологии очень важно, поскольку обычно только аутоиммунные заболевания мышц чувствительны к иммуносупрессивной терапии.

Во многих случаях определенные клинические признаки и/или биопсия мышц позволяют поставить окончательный диагноз. Например, перифасцикулярная атрофия патогномонична для дерматомиозита (DM), даже при отсутствии высыпаний; вакуольная миопатия у пациента, получающего лечение колхицином, является убедительным признаком токсической миопатии; и слабое окрашивание мышцы на дистрофии у молодого человека с гипертрофией икроножных мышц является диагностическим признаком дистрофинопатии.

Тем не менее, в значительном числе случаев в образцах биопсии мышц присутствуют дегенеративные и некротические мышечные волокна без признаков, специфичных для каких-либо конкретных заболеваний. В этих случаях присутствие аутоантител, специфичных для миозита (MSA), может указывать на принадлежность расстройства к семейству аутоиммунных миопатий. Например, у пациентов с антителами, направленными против частицы, распознающей сигнал (SRP), обычно имеет место тяжелая некротизирующая миопатия, чувствительная только к очень агрессивной иммуносупрессии. К сожалению, клиническая оценка и доступные в настоящее время диагностические тесты не всегда позволяют поставить окончательный диагноз, и не всегда возможно определить, является ли некротизирующая миопатия иммуноопосредованной. Эта неясность может приводить к недостаточному лечению аутоиммунных миопатий или не уместной иммуносупрессии у пациентов без иммуноопосредованного заболевания. В целом, современные клинические способы не обеспечивают адекватной диагностики специфических заболеваний мышц у пациентов, страдающих от миопатий, и существует неотложная потребность в усовершенствованных способах.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Как описано ниже, в настоящем изобретении описаны композиции, способы и наборы для лечения, диагностики, мониторинга и иной характеризации миопатий (например иммуноопосредованной некротизирующей миопатий) у субъекта.

В одном аспекте согласно изобретению предложен способ выявления аутоиммунного ответа у субъекта, включающий выявление аутоантитела, распознающего белок 3-гидрокси-3-метилглутарил-коэнзим А-редуктазу (HMGCR), в биологическом образце, полученном от субъекта.

В другом аспекте согласно изобретению предложен способ характеризации миопатий у субъекта, включающий выявление аутоантитела, распознающего белок 3-гидрокси-3-метилглутарил-коэнзим А-редуктазу (HMGCR), в биологическом образце, полученном от субъекта.

В другом аспекте согласно изобретению предложен способ характеризации миопатии у субъекта, включающий выявление белка массой 100 кДа и/или белка массой 200 кДа, связывающегося с HMGCR антителом, в биологическом образце, полученном от субъекта.

В другом аспекте согласно изобретению предложен способ определения целесообразности продолжения терапии статинами у субъекта, включающий анализ присутствия аутоантитела, распознающего белок 3-гидрокси-3-метилглутарил-коэнзим А-редуктазу (HMGCR),>в биологическом образце, полученном от субъекта, где выявление аутоантитела указывает на необходимость прекращения терапии статинами. В одном воплощении отсутствие аутоантитела у субъекта, у которого установлено наличие мышечной боли, указывает на то, что терапия статинами может быть продолжена с проведением у субъекта периодического мониторинга на предмет появления аутоантитела. В другом воплощении выявление аутоантитела у субъекта с мышечной болью и слабостью указывает на необходимость прекращения терапии статинами и необходимость начала иммуносупрессивной терапии.

В другом аспекте согласно изобретению предложен способ мониторинга при терапии статинами у субъекта, включающий периодическое тестирование биологического образца, полученного от субъекта, на предмет аутоантитела, распознающего белок 3-гидрокси-3-метилгпутарил-коэнзим А-редуктазу (HMGCR), в биологическом образце, полученном от субъекта. В одном воплощении периодическое тестирование проводят на 3, 6, 9, 12, 24 и/или 36 месяцы после начала терапии статинами. В другом воплощении способ дополнительно включает установление наличия у субъекта мышечной боли или слабости после начала терапии статинами.

В другом аспекте согласно изобретению предложен способ выбора схемы лечения субъекта, у которого установлено наличие миопатии, включающий выявление аутоантитела, распознающего белок 3-гидрокси-3-метилглутарил-коэнзим А-редуктазу (HMGCR), в биологическом образце, полученном от субъекта, где выявление аутоантитела указывает на необходимость выбора иммуносупрессивной терапии. В одном воплощении способ дополнительно включает установление наличия у субъекта мышечной боли и слабости. В другом воплощении биологический образец представляет собой жидкий биологический образец или образец ткани. В другом воплощении жидкий биологический образец представляет собой кровь, сыворотку или плазму. В другом воплощении аутоантитело выявляют иммунологическим анализом (например, твердофазным иммуноферментным анализом (ELISA), иммунопреципитацией, твердофазным иммунофлуоресцентным анализом, твердофазным иммунохимическим анализом, радиоиммунным анализом, иммуноблоттингом, количественным иммунологическим анализом, проточной цитометрией, вестерн-блоттингом или иммуногистохимией).

В другом аспекте согласно изобретению предложен способ характеризации миопатии у субъекта, включающий приведение белка 3-гидрокси-3-метилглутарил-коэнзим А-редуктазы (HMGCR) или его фрагмента в контакт с сывороткой, кровью или плазмой субъекта и выявление специфического связывания аутоантитела против HMGCR или ее фрагмента, осуществляя посредством этого характеризацию миопатии у субъекта. В одном воплощении белок HMGCR или его фрагмент фиксирован на субстрате. В другом воплощении субстрат представляет собой мембрану, гранулу или микрочип. В другом воплощении связывание выявляют колориметрическим или радиоактивным анализом.

В другом аспекте согласно изобретению предложен набор для характеризации миопатии у субъекта, содержащий белок 3-гидрокси-3-метилглутарил-коэнзим А-редуктазу (HMGCR) или его фрагмент, фиксированный на субстрате. В одном воплощении набор дополнительно включает инструкции по применению набора в способе по любому предыдущему аспекту. В одном воплощении субстрат представляет собой мембрану, шарик или микрочип. В другом воплощении связывание выявляют колориметрическим анализом. В другом воплощении фрагмент HMGCR редуктазы содержит С-концевой фрагмент, содержащий аминокислоты 340-888.

В различных воплощениях любых описанных выше аспектов или любого другого аспекта изобретения, описанного здесь, способ дополнительно включает выявление в биологическом образце, полученном от субъекта, белка массой 100 кДа и/или белка массой 200 кДа, связывающегося с HMGCR антителом. В определенных воплощениях описанных выше аспектов белок выявляют иммунопреципитацией. В других воплощениях описанных выше аспектов HMGCR антитело, связывающееся с белком массой 100 кДа и/или 200 кДа, выявляют колориметрическим или радиоактивным анализом. В других воплощениях миопатия представляет собой аутоиммунную миопатию или некротизирующую миопатию, ассоциированную с терапией статинами. В других воплощениях способ дополнительно включает определение силы проксимальных мышц, отека мышц при двусторонней магнитно-резонансной томографии (MRI) бедер, уровней креатинкиназы и/или признаков миопатии при электромиографии. В других воплощениях способ включает выявление маркера, выбранного из группы, состоящей из антисинтетазных аутоантител, аутоантител против частицы, распознающей сигнал (SRP), повышенных уровней креатинкиназы (СК), выраженных воспалительных клеточных инфильтратов при биопсии мышц, вакуолей с ободком, перифасцикулярной атрофии, положительного результата анализа на молекулы главного комплекса гистосовместимости (МНС) I класса, отложения мембраноатакующего комплекса в малых кровеносных сосудах перимизия и окрашивания регенерирующих мышечных волокон антителом против нейрональной молекулы клеточной адгезии (NCAM). В других воплощениях выявление включает сравнение уровня аутоантител в образце, полученном от субъекта, с контрольным уровнем (например средним уровнем в группе нормальных контролей). В определенных воплощениях описанных выше аспектов выявление повышения уровня аутоантитела, распознающего белок 3-гидрокси-3-метилглутарил-коэнзим А-редуктазу (HMGCR), приблизительно на 2-5 стандартных отклонений относительно контроля указывает на аутоиммунную миопатию, ассоциированную со статинами. В других воплощениях выявление повышения уровня аутоантитела приблизительно на 3 стандартных отклонения указывает на аутоиммунную миопатию, ассоциированную со статинами. В других воплощениях описанных выше аспектов способ дополнительно включает установление наличия у субъекта мышечной боли и слабости. В других воплощениях биологический образец представляет собой жидкий биологический образец или образец ткани. В, других воплощениях жидкий биологический образец представляет собой кровь, сыворотку или плазму. В других воплощениях аутоантитело выявляют иммунологическим анализом (например ELISA, иммунопреципитацией, твердофазным иммунофлуоресцентным анализом, твердофазным иммунохимическим анализом, радиоиммунным анализом, иммуноблоттингом, количественным иммунологическим анализом, проточной цитометрией, вестерн-блоттингом или иммуногистохимией). В определенных воплощениях описанных выше аспектов фрагмент HMGCR содержит С-концевой фрагмент, содержащий аминокислоты 340-888.

Согласно изобретению предложены способы характеризации миопатии, в частности, миопатии, ассоциированных с терапией статинами. Композиции и продукты, предложенные согласно изобретению, были выделены или изготовлены иным образом в связи с примерами, представленными ниже. Другие признаки и преимущества изобретения будут очевидны из подробного описания и формулы изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1 включает авторадиограмму, на которой показаны белки, осажденные иммунопреципитацией из экстрактов клеток HeLa сыворотками, полученными от пациентов с некротизирующей миопатией. Иммунопреципитация белков массой приблизительно 200 кДа и приблизительно 100 кДа сыворотками, полученными от пациентов с некротизирующей миопатией. Сыворотки пациентов использовали для иммунопреципитации радиоактивно меченых белков из экстрактов клеток HeLa, инкубированных с ³⁵S-метионином. Осажденные иммунопреципитацией белки разделяли электрофорезом в 10%-ных полиакриламидных гелях с додецилсульфатом натрия. На левой и правой панелях показаны авторадиограммы от двух раздельных экспериментов; результаты, показанные на правой панели, получены из одной авторадиограммы, разрезанной между дорожками 7 и 8 для исключения иммунопреципитации, не имеющей отношения к настоящему исследованию. Номера над дорожками 1-4 и 6-9 представляют собой номера пациентов. Для иммунопреципитации, показанной на дорожках 5 и 10, использовали сыворотки, полученные от двух здоровых контролей (Cont 33 и Cont 35). Стрелками слева показаны полосы белков массой приблизительно 200 кДа (-200) и приблизительно 100 кДа (~100). Значениями справа показаны положения стандартов маркера молекулярной массы.

Фиг.2А и 2Б включают микрофотографии, на которых показана морфология капилляров в образцах биопсии мышц, полученных от здорового донора (Фиг.2А) и пациента (пациента 8024) с анти-200/100-кДа аутоантителами (Фиг.2Б). Образцы окашивали антителом против CD31, маркера эндотелиальных клеток. Стрелками показаны капилляры эндомизия с нормальными морфологическими признаками в контрольном образце (Фиг.2А) и капилляры с утолщенными стенками и расширенным просветом у пациента с анти-200/100-кДа аутоантителами (Фиг.2Б). Данные биопсийные образцы обрабатывали одновременно в одинаковых условиях (исходное увеличение Х 40).

Фиг.3А-3Г включают микрофотографии, на которых показано отложение мембраноатакующего комплекса в малых кровеносных сосудах и ненекротических мышечных волокнах. Серийные срезы биопсийного образца мышцы, полученного от пациента, позитивного в отношении анти-200/100-кДа антител, с некротизирующей миопатией (пациента 8076). Окрашивание антителом против мембраноатакующего комплекса (Фиг.3А) или гематоксилином и эозином (Фиг.3Б) продемонстрировало значительное отложение комплемента в кровеносном сосуде перимизия. На Фиг.3В представлен биопсийный образец мышцы, полученный от позитивного в отношении анти-200/100-кДа антител пациента (пациента 8076), демонстрирующий отложение мембраноатакующего комплекса в разрозненных не-некротических волокнах. На Фиг.3Г показан вид поля зрения, показанного на Фиг.3В, при большем увеличении. На Фиг.3Г стрелками показано отсутствие окрашивания мембраноатакующего комплекса в капиллярах эндомизия. Звездочками на Фиг.3В и 3Г показано одно и то же мышечное волокно. (Исходное увеличение Х 40 на Фиг.3А, 3Б и 3Г; Х 20 на Фиг.3В. Звездочками на Фиг.3В и 3Г показано одно и то же мышечное волокно.)

Фиг.4А-4 В включают микрофотографии, на которых показано отложение молекул МНС I класса в не-некротических волокнах биопсийных образцов, полученных от позитивных в отношении анти-200/100-кДа антител пациентов. На Фиг.4А показано окрашивание капилляров эндомизия (показано стрелкой), но не сарколеммы, антителами против молекул МНС I класса в нормальной человеческой мышце. На Фиг.4Б и 4В показано окрашивание сарколеммы разрозненных мышечных волокон антителами против молекул МНС 1 класса у 2 пациентов с анти-200/100-кДа аутоантителами (одиночные звездочки). Антитела против молекул МНС I класса также окрашивали цитоплазму волокна, положительного в отношении анти-200/100-кДа антител (двойные звездочки);

вероятно, это волокно является регенерирующим волокном. Данные биопсийные образцы обрабатывали одновременно в одинаковых условиях. (Исходное увеличение Х 40.)

Фиг.5А и 5Б включают авторадиограммы, на которых показана активированная экспрессия 200-кДа и 100-кДа аутоантигенов статинами (Фиг.5А) и идентификация 100-кДа аутоантигена как 3-гидрокси-3-метилглутарил-коэнзим А-редуктазы (ГМГ-КоА-редуктазы). Проводили иммунопреципитацию радиоактивно меченых лизатов, полученных из клеток HeLa, обработанных в течение двадцати четырех часов в отсутствие (дорожка 1) или в присутствии (дорожка 2) 10 мкМ мевинолина, с сывороткой пациента 9190, как описано ниже. На Фиг.5Б полноразмерный in vitro транскрибированный/транслированный (IVTT). белок ГМГ-КоА-редуктазу, меченный ³⁵S-метионином, подвергали иммунопреципитации с использованием сывороток, полученных от анти-200/100-кДа-позитивных пациентов (дорожки 3-7; показаны типичные результаты, полученные с использованием 16 протестированных анти-200/100-кДа-позитивных образцов сыворотки), от анти-200/100-кДа-негативных пациентов с дерматомиозитом (дорожки 8-10) или от здоровых контрольных пациентов (дорожки 11-13). Вносимый IVTT-продукт показан на дорожке 14. Результаты, показанные на Фиг.5А и 5Б, типичны для по меньшей мере 3 отдельных экспериментов. Маркеры молекулярной массы показаны слева.

На Фиг.6 представлена авторадиограмма, на которой показаны результаты иммунопреципитации (IP) полноразмерной 3-гидрокси-3-метилглутарил-коэнзим А-редуктазы (HMGCR) и фрагмента, соответствующего ее С-концу (аминокислоты 340-888), человеческими антителами против ГМГ-КоА-редуктазы. Реакции иммунопреципитации проводили с использованием 3 разных меченных ³⁵S-метионином HMGCR продуктов: полноразмерного белка (FL; дорожки 4-8), С-конца (C-term, дорожки 9-13) и N-конца (N-term, дорожки 14-18). Образцы сыворотки 10009, 9190 и 8050 получены от анти-200/100-кДа-позитивных пациентов, образцы 488 и 495 получены от здоровых контрольных субъектов. Вносимые in vitro транскрибированные/транслированные (IVTT) продукты показаны на дорожках 1-3; в каждом случае использовали количество, составляющее 0,4 количества, использованного для иммунопреципитации. Результаты типичны для 2-8 отдельных экспериментов. Маркеры молекулярной массы показаны слева. FL - полноразмерный белок, C-term - С-конец, N-term - N-конец, FL IP - иммунопреципитация полноразмерного белка, C-term IP-иммунопреципитация С-конца, N-term IP - иммунопреципитация N-конца.

Фиг.7А и 7Б включают три авторадиограммы. На Фиг.7А показаны результаты экспериментов конкурентной иммунопреципитации (IP), подтверждающие, что человеческие антитела против 3-гидрокси-3-метилглутарил-коэнзим А-редуктазы (анти-HMGCR) распознают ее С-конец, и что белок массой 200 кДа не распознается индивидуальным антителом. Образцы сыворотки 10009 и 9190 предварительно инкубировали с указанными количествами немеченой С-концевой HMGCR и затем использовали для иммунопреципитации полноразмерной меченной ³⁵S-метионином HMGCR. На Фиг.7Б образцы сыворотки от пациентов 9190 и 9176 предварительно инкубировали в отсутствие или в присутствии 300 нг немеченой С-концевой HMGCR и затем добавляли к радиоактивно меченым лизатам, полученным из клеток HeLa, обработанных 10 мкМ мевинолином в течение двадцати четырех часов. Полученные иммунопреципитаты обрабатывали, как описано ниже. В двух отдельных экспериментах с использованием сывороток от четырех (Фиг.7А) или шести (Фиг.7Б) разных пациентов были получены идентичные данные. Маркеры молекулярной массы показаны слева.

Фиг.8А-8Е включают микрофотографии, на которых показана активация экспрессии ГМГ-КоА-редуктазы в регенерирующих мышечных волокнах, экспрессирующих нейрональную молекулу клеточной адгезии (NCAM). Образцы биопсии мышц от анти-HMGCR-позитивных пациентов (Фиг.8А-В) и контрольных субъектов (Фиг.8Г-Е) одновременно окрашивали антителами против NCAM (зеленый) (Фиг.8А и 8Г), анти-HMGCR антителами (красный) (Фиг.8Б и 8Д) и DAPI (4,6-диамидино-2-фенилиндол) (синий) для окрашивания ядер. Изображения, полученные наложением (Фиг.8В и 8Е), демонстрируют, что в анти-HMGCR-позитивных тканях, полученных биопсией мышц, HMGCR и NCAM часто экспрессированы совместно на высоких уровнях в одних и тех же мышечных волокнах (стрелки), чего не наблюдали в контрольных тканях, полученных биопсией мышц. Для обеспечения сопоставимости данных Фиг.8А-8В и 8Г-8Е получали с использованием одинаковых параметров экспозиции для каждого канала. Результаты типичны для окрашивания, наблюдаемого в шести анти-HMGCR-позитивных биопсийных образцах мышц и трех биопсийных образцах нормальных мышц. Исходное увеличение Х 20.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Под «белком 3-гидрокси-3-метилглутарил-коэнзим А-редуктазой (HMGCR)» понимают полипептид или его фрагмент, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 85% идентична последовательности с идентификационным номером в Национальном центре биотехнологической информации (NCBI) NP_000850.1, или его фрагмент, обладающий связывающей активностью в отношении антител, присущей HMGCR. Одним предпочтительным фрагментом является С-концевой фрагмент, включающий внутриклеточную часть молекулы (аминокислоты 340-888), показанную ниже жирным/подчеркнутым шрифтом.

Типичная последовательность белка HMGCR показана ниже:

>gi|4557643|ref|NP_000850.1| 3-гидрокси-3-метилглутарил-коэнзим А-редуктаза, изоформа 1 [Homo sapiens]

Под «аутоантителом» понимают антитело, направленное против аутоантигена. Типичным аутоантителом является аутоантитело, направленное против HMGCR.

Под «HMGCR антителом» понимают антитело, специфично связывающееся с белком HMGCR.

Под «миопатией» понимают состояние мышц, ассоциированное с мышечной слабостью или болью. Другие маркеры миопатии включают, без ограничения ими, присутствие антисинтетазных аутоантител, аутоантител против частицы, распознающей сигнал (SRP), повышенных уровней креатинкиназы (СК), выраженных воспалительных клеточных инфильтратов при биопсии мышц, вакуолей с ободком, перифасцикулярной атрофии, положительный результат анализа на молекулы МНС I класса, отложение мембраноатакующего комплекса в малых кровеносных сосудах перимизия и окрашивание регенерирующих мышечных волокон антителом против NCAM. Другие маркеры включают слабость проксимальных мышц, признаки миопатии при электромиографии (EMG), выраженные воспалительные клеточные инфильтраты при биопсии мышц, вакуоли с ободком, перифасцикулярную атрофию и отек мышц при двусторонней MRI бедер.

Под «иммуноанализами» понимают тест, позволяющий измерить присутствие или уровень вещества на основании его специфичного связывания с антителами.

Под «иммуносупрессией» понимают снижение по меньшей мере одной нежелательной функции иммунной системы.

Под «иммуносупрессором» понимают агент, снижающий функцию иммунной системы. Примеры иммуносупрессоров включают глюкокортикоиды (например преднизон), цитостатики (например азатиоприн и метотрексат), лекарственные средства, действующие на иммунофилины (например циклоспорин и такролимус), и другие лекарственные средства (например гидроксихлорохин, иммуноглобулины для внутривенного введения, мофетил микофенолата и ритуксимаб).

Под «субстратом» понимают любую твердую подложку. Типичные твердые подложки включают титрационный микропланшет, предметное стекло, полистирольный шарик, пробирку, устройство для иммунохроматографии, тест-полоску или индикаторную полоску.

Под «статинами» понимают класс лекарственных средств, используемых для снижения уровней холестерина посредством Lipitor® и торваст (torvast)), флувастатин (лескол), ловастатин (Mevacor®, алтокор, мевинолин и Altoprev®), питавастатин (Livalo®, питава (pitava)), правастатин (правахол, селектин (selektine) и липостат), розувастатин (Crestor®) и симвастатин (Zocor® и Lipex™).

Под «агентом» подразумевают любое химическое соединение, представляющее собой малую молекулу, антитело, молекулу нуклеиновой кислоты, полипептид или их фрагменты.

Под «изменением» понимают изменение (повышение или снижение) уровней экспрессии или активности гена или полипептида, как выявлено стандартными известными способами, такими как способы, описанные здесь. При использовании здесь «изменение» включает изменение уровней экспрессии на 10%, предпочтительно изменение уровней экспрессии на 25%, более предпочтительно изменение уровней экспрессии на 40% и наиболее предпочтительно изменение уровней экспрессии на 50% или более.

Под «улучшением/уменьшением интенсивности» понимают уменьшение, подавление, ослабление, снижение, остановку или стабилизацию развития или прогрессирования заболевания.

Под «аналогом» понимают молекулу, не являющуюся идентичной, но имеющую аналогичные функциональные или структурные свойства. Например, аналог полипептида сохраняет биологическую активность соответствующего встречающегося в природе полипептида и в то же время имеет определенные биохимические модификации, усиливающие функцию аналога по сравнению с встречающимся в природе полипептидом. Такие биохимические модификации могут повышать устойчивость аналога к протеазам, его способность проникать через мембраны, увеличивать его период полувыведения, не изменяя, например, связывание с лигандом. Аналог может содержать не встречающуюся в природе аминокислоту.

Под «биологическим образцом» понимают любую ткань, клетку, жидкость или другой материал, имеющий происхождение от организма.

В данном описании «включает», «включающий», «содержащий», «имеющий» и тому подобное могут иметь значение, определенное для них в патентном законодательстве США, и могут означать «включает», «включающий» и тому подобное; сходным образом, «состоящий по существу из» или «состоит по существу из» имеют значение, определенное в патентном законодательстве США, и эти термины являются открытыми, допуская присутствие неуказанных элементов, при условии, что присутствие неуказанных элементов не изменяет основные или новые свойства указанных элементов, но исключают воплощения из предшествующего уровня техники.

Под «контролем» понимают стандарт, с которым проводят сравнение. Например, уровень аутоантитела в образце, полученном от субъекта, у которого подозревают наличие иммуноопосредованной некротизирующей миопатии, можно сравнивать с уровнем аутоантитела, присутствующего в соответствующем образце, полученном от здорового субъекта, то есть субъекта без миопатии.

«Выявление» относится к определению присутствия, отсутствия или количества анализируемого вещества, подлежащего выявлению.

Под «выявляемой меткой» понимают композицию, которая будучи связанной с интересующей молекулой позволяет выявлять ее спектроскопическим, фотохимическим, биохимическим, иммунохимическим или химическим способом. Например, полезные метки включают радиоактивные изотопы, магнитные шарики, металлические шарики, коллоидные частицы, флуоресцентные красители, электроноплотные реагенты, ферменты (например, обычно используемые в ELISA), биотин, дигоксигенин или гаптены.

Под «диагностикой» понимают любой способ, позволяющий определить наличие патологического состояния или охарктеризовать природу патологического состояния (например, миопатии). Диагностические способы отличаются по их чувствительности и специфичности. Когда определенный диагностический способ не может обеспечить окончательную диагностику состояния, достаточно того, что этот способ обеспечивает положительный результат, способствующий постановке диагноза.

Под «заболеванием» понимают любое состояние или расстройство, нарушающее или препятствующее нормальному функционированию клетки, ткани или органа. Примеры заболеваний включают аутоиммунные заболевания, миопатию и аутоиммунную миопатию, ассоциированную со статинами.

Под «эффективным количеством» понимают количество, необходимое для уменьшения интенсивности симптомов заболевания по сравнению с пациентом, не получающим лечение. Эффективное количество активного соединения (соединений), используемое при практическом применении настоящего изобретения для терапевтического лечения заболевания, варьирует в зависимости от способа введения, возраста, массы тела и общего состояния здоровья субъекта. В конечном счете, подходящее количество и схему введения будет определять практикующий врач или ветеринар. Такое количество называют «эффективным» количеством.

Под «фрагментом» понимают часть полипептида или молекулы нуклеиновой кислоты. Предпочтительно, эта часть содержит по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% всей длины исходного полипептида или молекулы нуклеиновой кислоты. Фрагмент может содержать 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80,90 или 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 или 1000 нуклеотидов или аминокислот.

Под «выделенным полипептидом» понимают полипептид по изобретению, отделенный от компонентов, с которыми он обычно встречается в природе. Обычно полипептид является выделенным, когда он по меньшей мере на 60% по массе свободен от белков и встречающихся в природе органических молекул, с которыми он связан в природе. Предпочтительно, полипептид по изобретению составляет по меньшей мере 75%, более предпочтительно по меньшей мере 90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99% препарата по массе. Выделенный полипептид по изобретению может быть получен, например, экстракцией из природного источника, экспрессией рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей такой полипептид, или химическим синтезом белка. Чистота может быть оценена любым подходящим способом, например колоночной хроматографией, электрофорезом в полиакриламидном геле или анализом высокоэффективной жидкостной хроматографией (HPLC).

Под «маркером» понимают любое изменение белка, полинуклеотида или клинического признака, ассоциированного с заболеванием или расстройством.

При использовании здесь «получение», как во фразе «получение агента», включает синтез, приобретение или иное получение агента.

Под «периодическим» понимают происходящий через равные промежутки времени. Периодический мониторинг у пациента включает, например, серию исследований, проводимых один раз в неделю, один раз месяц, два раза в год или один раз в год.

Под «снижением/уменьшением» или «повышением/увеличением» понимают отрицательное или положительное изменение, соответственно, на по меньшей мере приблизительно 10%, 25%, 50%, 75% или 100% относительно исходной величины.

Под «контролем/эталоном» понимают стандартное или контрольное условие.

«Эталонная последовательность» представляет собой определенную последовательность, используемую в качестве основной для сравнения последовательностей. Эталонная последовательность может представлять собой часть указанной последовательности или полноразмерную последовательность, например сегмент последовательности полноразмерной кДНК или гена или полную последовательность кДНК или гена. Для полипептидов длина эталонной полипептидной последовательности будет обычно составлять по меньшей мере приблизительно 16 аминокислот, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 20 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 25 аминокислот, и еще более приблизительно 35 аминокислот, приблизительно 50 аминокислот или приблизительно 100 аминокислот. Для нуклеиновых кислот длина эталонной последовательности нуклеиновой кислоты будет обычно составлять по меньшей мере приблизительно 50 нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 60 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 75 нуклеотидов и еще более предпочтительно приблизительно 100 нуклеотидов, или приблизительно 300 нуклеотидов, или любое близкое или промежуточное целое число.

Под «специфичным связыванием» понимают, что соединение или антитело распознает полипептид по изобретению и связывается с ним, но по существу не распознает и не связывается с другими молекулами образца, например биологического образца, естественным образом содержащего полипептид по изобретению.

Идентичность последовательностей обычно оценивают с использованием программного обеспечения для анализа последовательностей (например программ Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705, BLAST, BESTFIT, GAP или PILEUP/PRETTYBOX). Такие программы отмечают идентичные или сходные последовательности, присваивая степени гомологии различным заменам, делециям и/или другим модификациям. Консервативные замены обычно включают замены в пределах следующих групп: глицин, аланин; валин, изолейцин, лейцин; аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, аспарагин, глутамин; серин, треонин; лизин, аргинин; и фенилаланин, тирозин. В типичном способе определения степени идентичности может быть использована программа BLAST с показателем вероятности от е^-3 до е^-100, что является признаком близкородственных последовательностей.

Под «субъектом» понимают млекопитающего, включая, без ограничения, человека или млекопитающих, не являющихся людьми, таких представители семейств бычьих, лошадиных, собачьих, овец или кошачьих.

Под «по существу идентичными» понимают молекулу полипептида или нуклеиновой кислоты, имеющие по меньшей мере 50%-ную идентичность с эталонной аминокислотной последовательностью (например с любой из аминокислотных последовательностей, описанных здесь) или с последовательностью нуклеиновой кислоты (например с любой из последовательностей нуклеиновых кислот, описанных здесь). Предпочтительно такая последовательности является на по меньшей мере 60%, более предпочтительно 80% или 85% и более предпочтительно 90%, 95% или даже 99% идентичной на аминокислотном или нуклеотидном уровне последовательности, используемой для сравнения,

Согласно изобретению предложены несколько мишеней, полезных для разработки высокоспецифичных лекарственных средств для лечения расстройства, характеризуемого способами, описанными здесь. Кроме того, способы по изобретению обеспечивают простое средство определения терапий, безопасных для применения у субъектов. Кроме того, способы по изобретению обеспечивают путь для анализа практически любого числа соединений на предмет их эффектов на описанное здесь заболевание с высокой пропускной способностью, высокой чувствительностью и низкой сложностью.

Подразумевают, что диапазоны, приведенные здесь, являются условным обозначением для всех значений, входящих в диапазон. Например, подразумевают, что диапазон от 1 до 50 включает любое число, комбинацию чисел или поддиапазон из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50.

При использовании здесь термины «лечить», «лечение» и тому подобное относятся к ослаблению или уменьшению интенсивности расстройства и/или ассоциированных с ним симптомов. Следует понимать, что лечение расстройства или состояния не обязательно приводит к полному устранению расстройства, состояния или связанных с ними симптомов, несмотря на возможность их полного устранения.

Если не указано специально или не очевидно из контекста, подразумевают, что при использовании здесь термин «или» является включающе-отличающим. Если не указано специально или не очевидно из контекста, подразумевают, что при использовании здесь формы единственного числа включают формы множественного числа, и наоборот.

Если не указано специально или не очевидно из контекста, подразумевают, что при использовании здесь термин «приблизительно» означает «в пределах диапазона, принятого в данной области техники», например, в пределах 2 стандартных отклонений среднего. «Приблизительно» следует понимать как «в пределах 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1%, 0,05% или 0,01%» указанного значения. Если из контеста не ясно иное, все числовые значения, приведенные здесь, модифицированы термином «приблизительно».

Указание перечня химических групп в любом определении переменной, приведенном здесь, включает определения этой переменной в форме любой одной группы или комбинации перечисленных групп. Указание воплощения переменной или аспекта, приведенного здесь, включает это воплощение в форме любого воплощения самого по себе или в комбинации с любыми другими воплощениями или их частями.

Любые композиции и способы, предложенные здесь, можно комбинировать с одной/одним или несколькими из любых других композиций и способов, предложенных здесь.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данном изобретении описаны композиции и способы, полезные в качестве композиций, способов и наборов для лечения, диагностики, мониторинга и иной характеризации миопатии (например иммуноопосредованной некротизирующей миопатии) у субъекта.

Изобретение основано, по меньшей мере частично, на обнаружении того, что у некоторых пациентов применение статинов ассоциировано с аутоиммунной некротизирующей миопатией с аутоантителами, распознающими белок 3-гидрокси-3-метилглутарил-коэнзим А-редуктазу (HMGCR).

Как подробно описано ниже, новые аутоантитела у пациентов с некротизирующей миопатией были обна