Сконструированное антитело против tslp

Сконструированное антитело против tslp

Иллюстрации

Показать все

Реферат

По данной заявке испрашивается приоритет по предварительной патентной заявке США № 61/297008, которая подана 21 января 2010 года, и предварительной патентной заявке США № 61/258051, которая подана 4 ноября 2009 года, каждая из которых включена в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение в основном относится к специфическому антителу к тимическому стромальному лимфопоэтину (TSLP) и его применению, в частности при воспалительных и аллергических воспалительных нарушениях.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

TSLP представляет собой иммунный цитокин, который индуцирует опосредованные дендритными клетками CD4⁺ T-клеточные ответы, в которых DC с проаллогенным фенотипом, активируемые посредством TSLP, играют ключевую роль в индукции и поддержании ответов аллергических воспалительных Th2 и тучных клеток посредством продуцирования проаллергенных цитокинов, хемокинов и костимулирующих молекул, которые направляют превращение наивных T-клеток в Th2 клетки, продуцирующие ключевые медиаторы аллергического воспаления IL-4, IL-5 и IL-13. Сверхэкспрессия TSLP при атопическом дерматите (AtD), синдроме Незертона и астме указывает на ключевую роль этого цитокина в патогенезе этих аллергических воспалительных заболеваний. Это подтверждено с помощью моделей на животных, у которых трансгенная сверхэкспрессия TSLP в коже или легких, а также удаление посредством направленного воздействия на ген негативных регуляторов TSLP ведут к аллергическим воспалительным заболеваниям, которые близко схожи с атопическим дерматитом или астмой человека. Настоящее изобретение относится к сконструированным антителам к TSLP и их применению для лечения воспалительных и, в частности, аллергических воспалительных нарушений, включающих астму и атопический дерматит.

Настоящее изобретение избегает возможных проблем с дезамидированием у антител предшествующего уровня техники. Дезамидирование остатков Asn (N) представляет собой обыкновенное расщепление белков и оно может значительно влиять на структуру и функцию белка. В антителах Asn (N), расположенные в CDR, могут подвергаться быстрому дезамидированию, и это может вести к изменениям во взаимодействиях антитело-антиген и, следовательно, представляет серьезную проблему во время разработки терапевтических средств на основе антител. См., например, Vlaska et al., Analytical Biochemistry 392:145-154 (2009). Таким образом, важно избегать этих возможных проблем с дезамидированием в антителах, которые предназначены для разработки для применения у человека. Кроме того, важно избегать этих проблем без изменения каких-либо важных характеристик (таких как аффинность связывания) антитела.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к связывающему соединению, специфически связывающему TSLP человека, содержащему по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи антитела или ее TSLP-связывающий фрагмент, при этом указанная вариабельная область тяжелой цепи содержит SEQ ID NO: 2.

Настоящее изобретение также относится к связывающему соединению, которое специфически связывает TSLP человека, содержащему по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи антитела или ее TSLP-связывающий фрагмент, при этом указанная вариабельная область тяжелой цепи содержит по меньшей мере SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3.

Настоящее изобретение также относится к связывающему соединению, которое специфически связывает TSLP человека, содержащему по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи антитела или ее TSLP-связывающий фрагмент, при этом указанная вариабельная область тяжелой цепи содержит SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3.

Связывающие соединения по изобретению могут дополнительно содержать одну вариабельную область легкой цепи антитела или его TSLP-связывающий фрагмент. В одном из вариантов осуществления вариабельная область легкой цепи антитела или ее TSLP-связывающий фрагмент, содержит по меньшей мере одну последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, 5 и 6. В другом варианте осуществления вариабельная область легкой цепи антитела или ее TSLP-связывающий фрагмент, содержит по меньшей мере две последовательности, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, 5 и 6. В других вариантах осуществления вариабельная область легкой цепи антитела или ее TSLP-связывающий фрагмент, содержит три последовательности, приведенные в SEQ ID NO: 4, 5 и 6.

В некоторых вариантах осуществления описанных выше связывающих соединений, вся или по существу вся остальная часть вариабельной области тяжелой цепи представляет собой всю или по существу всю область Ig человека; и вся или по существу вся остальная часть вариабельной области легкой цепи представляет собой всю или по существу всю область Ig человека. В предпочтительных вариантах осуществления остальная часть вариабельной области тяжелой цепи представляет собой аминокислотную последовательность тяжелой цепи человека; и остальная часть вариабельной области легкой цепи представляет собой аминокислотную последовательность легкой цепи человека.

Настоящее изобретение также относится к связывающему соединению, которое специфически связывает TSLP человека, содержащему: вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (i) SEQ ID NO: 7; (ii) SEQ ID NO: 7 или варианта, содержащего вплоть до 3 модифицированных аминокислотных остатков; и (iii) последовательности, обладающей по меньшей мере 97% гомологией с SEQ ID NO: 7. В одном из вариантов осуществления вариабельная область тяжелой цепи содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах осуществления связывающее соединение по изобретению дополнительно содержит вариабельную область легкой цепи. В одном из вариантов осуществления вариабельная область легкой цепи содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (i) SEQ ID NO: 8; (ii) SEQ ID NO: 8 или варианта, содержащего вплоть до 3 модифицированных аминокислотных остатков; и (iii) последовательности, обладающей по меньшей мере 97% гомологией с SEQ ID NO: 8. В одном из вариантов осуществления вариабельная область легкой цепи содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8.

В предпочтительном варианте осуществления связывающее соединение содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7, и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8.

В некоторых вариантах осуществления связывающие соединения по изобретению также содержат константную область тяжелой цепи и/или константную область легкой цепи. В одном из вариантов осуществления константная область тяжелой цепи содержит константную область тяжелой цепи человека γ1, γ2, γ3 или γ4 или ее вариант. В других вариантах осуществления константная область легкой цепи содержит константную область легкой цепи человека κ или λ.

В некоторых вариантах осуществления связывающее соединение по изобретению представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. В различных вариантах осуществления антитело или его фрагмент по настоящему изобретению является поликлональным, моноклональным, химерным, циноизированным, гуманизированным или полностью человеческим. В предпочтительном варианте осуществления антитело представляет собой гуманизированное антитело или его фрагмент.

Настоящее изобретение также предполагает, что связывающий фрагмент представляет собой фрагмент антитела, выбранный из группы, состоящей из Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, scFv, F(ab')2 и диатела. Настоящее изобретение также предполагает, что связывающее соединение представляет собой нанотело, авимер или аптимер.

В одном из вариантов осуществления связывающее соединение представляет собой антитело, содержащее тяжелую цепь, которая содержит SEQ ID NO: 11. В одном из вариантов осуществления связывающее соединение содержит тяжелую цепь, содержащую SEQ ID NO: 11, и легкую цепь, содержащую SEQ ID NO: 12.

В другом предпочтительном варианте осуществления связывающее соединение по изобретению связывает TSLP человека и яванского макака.

В одном из вариантов осуществления связывающее соединение по изобретению можно экспрессировать из экспрессирующего вектора, депонированного под номером депозита ATCC PTA-10482.

В другом варианте осуществления связывающее соединение по изобретению содержит тяжелую цепь и легкую цепь, которые можно экспрессировать из экспрессирующего вектора, депонированного под номером депозита ATCC PTA-10482. В другом варианте осуществления связывающее соединение по изобретению содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, которые можно экспрессировать из экспрессирующего вектора, депонированного под номером депозита ATCC PTA-10482. В другом варианте осуществления связывающее соединение по изобретению содержит области CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 и CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 антитела, экспрессируемые посредством экспрессирующего вектора, депонированного под номером депозита ATCC PTA-10482.

В другом варианте осуществления связывающее соединение по изобретению содержит тяжелую цепь, которую можно экспрессировать из экспрессирующего вектора, депонированного под номером депозита ATCC PTA-10482. В другом варианте осуществления связывающее соединение по изобретению содержит вариабельную область тяжелой цепи, которую можно экспрессировать из экспрессирующего вектора, депонированного под номером депозита ATCC PTA-10482. В другом варианте осуществления связывающее соединение по изобретению содержит области CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 антитела, экспрессируемые посредством экспрессирующего вектора, депонированного под номером депозита ATCC PTA-10482.

Настоящее изобретение также относится к изолированным нуклеиновым кислотам, кодирующим связывающее соединение по изобретению. В одном из вариантов осуществления изобретение содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи связывающего соединения (например, антитела или фрагмента антитела) по изобретению. В другом варианте осуществления изобретение содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую связывающее соединение, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, где указанная вариабельная область тяжелой цепи содержит SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3. В другом варианте осуществления изобретение содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую SEQ ID NO: 7. В другом варианте осуществления изобретение содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую SEQ ID NO: 2. В одном из вариантов осуществления изобретение содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи, кодируемую экспрессирующим вектором, депонированным под номером депозита ATCC PTA-10482. Изобретение также предусматривает экспрессирующие векторы, содержащие нуклеиновые кислоты по изобретению, функционально связанные с управляющими последовательностями, которые распознает клетка-хозяин, когда клетку-хозяина трансфицируют вектором. В одном из вариантов осуществления изобретение относится к экспрессирующему вектору, депонированному под номером депозита ATCC PTA-10482. Также предусмотрены клетки-хозяева, содержащие эти экспрессирующие векторы, и способы применения этих экспрессирующих векторов для получения полипептидов. В одном из вариантов осуществления клетка-хозяин содержит экспрессирующий вектор, депонированный под номером депозита ATCC PTA-10482. Способы получения полипептида содержат стадии: культивирование клетки-хозяина в культуральной среде в условиях, в которых происходит экспрессия последовательности нуклеиновой кислоты, тем самым получая полипептиды, содержащие вариабельные области легкой и тяжелой цепи; и извлечение полипептидов из клетки-хозяина или среды для культивирования. В одном из вариантов осуществления изобретение содержит способ получения полипептида, включающий стадии: культивирование клетки-хозяина, содержащей экспрессирующий вектор, депонированный под номером депозита ATCC PTA-10482, в культуральной среде в условиях, в которых происходит экспрессия вектора, тем самым получая полипептиды, содержащие вариабельные области легкой и тяжелой цепи; и извлечение полипептидов из клетки-хозяина или среды для культивирования.

Настоящее изобретение относится к способу супрессии иммунного ответа у субъекта человека, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, связывающего соединения в соответствии с изобретением, которое специфически связывает TSLP человека, в количестве, эффективном для блокирования биологической активности TSLP. Настоящее изобретение также предполагает введение дополнительного иммуносупрессорного или противовоспалительного средства. В предпочтительном варианте осуществления иммунный ответ представляет собой астму. В другом предпочтительном варианте осуществления иммунный ответ представляет собой аллергическое воспаление. В другом предпочтительном варианте осуществления аллергическое воспаление представляет собой аллергический риносинусит, аллергическую астму, аллергический конъюнктивит или атопический дерматит. В другом предпочтительном варианте осуществления иммунный ответ представляет собой фиброз, воспалительное заболевание кишечника или лимфому Ходжкина. в другом предпочтительном варианте осуществления связывающее соединение вводят в сочетании с другим иммуномодулирующим средством.

Связывающее соединение по настоящему изобретению может представлять собой композицию, содержащую связывающее соединение по изобретению (например, антитело или его фрагмент) в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем. В дополнительном варианте осуществления композиция дополнительно содержит иммуносупрессорное или противовоспалительное средство.

В различных вариантах осуществления изобретение относится к лекарственным средствам, содержащим связывающее соединение (например, антитело или его фрагмент) по настоящему изобретению. Например, данное изобретение относится к применению связывающего соединения, которое специфически связывает TSLP человека, для получения лекарственного средства для супрессии иммунного ответа. Настоящее изобретение относится к применению связывающего соединения, которое специфически связывает TSLP человека (например, любое одно из связывающих соединений в соответствии с изобретением), для получения лекарственного средства для лечения астмы. Настоящее изобретение относится к применению связывающего соединения, которое специфически связывает TSLP человека, для получения лекарственного средства для лечения воспалительного нарушения. В одном из вариантов осуществления воспалительное нарушение представляет собой аллергическое воспалительное нарушение. В одном из вариантов осуществления аллергическое воспалительное нарушение представляет собой аллергический риносинусит, аллергическую астму, аллергический конъюнктивит или атопический дерматит. В предпочтительном варианте осуществления аллергическое воспалительное нарушение представляет собой аллергическую астму. В другом предпочтительном варианте осуществления аллергическое воспалительное нарушение представляет собой атопический дерматит. Например, антитела и фрагмент по настоящему изобретению можно использовать для лечения человека.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУРЫ

Фиг.1 - выравнивание SEQ ID NO: 11 по текущей заявке относительно SEQ ID NO: 14 WO 2008/076321.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Как применяют в настоящем документе, включая приложенную формулу изобретения, формы слов в единственном числе включают соответствующие им ссылки на формы множественного числа до тех пор, пока контекст явно не диктует иное. Все цитируемые в данном документе ссылки включены посредством ссылки в такой же степени, как если бы конкретно и индивидуально указали, что каждая отдельная публикация, патентная заявка или патент включен путем ссылки.

I. Определения

«Активация», «стимуляция» и «лечение», как это применяют к клеткам или рецепторам, могут иметь такое же значение, например активация, стимуляция или лечение клетки или рецептора лигандом, если не указано иное с помощью контекста или в явной форме. «Лиганд» охватывает естественные и синтетические лиганды, например, цитокины, варианты цитокинов, аналоги, мутеины и связывающие композиции, полученные из антител. «Лиганд» также охватывает низкомолекулярные соединения, например, пептидомиметики цитокинов и пептидомиметики антител. «Активация» может относиться к активации клетки, которую регулируют посредством внутренних механизмов, а также посредством внешних факторов или факторов окружающей среды. «Ответ», например, клетки, ткани, органа или организма, охватывает изменение биохимического или физиологического состояния, например, концентрации, плотности, адгезии или миграции внутри биологического компартмента, уровня экспрессии гена или состояния дифференциации, где изменение коррелирует с активацией, стимуляцией или лечением или с внутренними механизмами, такими как генетическое программирование.

«Активность» молекулы может описывать или относиться к связыванию молекулы с лигандом или с рецептором, к каталитической активности; к способности стимулировать экспрессию гена или клеточную сигнализацию, дифференциацию или созревание; к антигенной активности, к модуляции активностей других молекул и т.п. «Активность» также может обозначать удельную активность, например [каталитическую активность]/[мг белка], или [иммунологическую активность]/[мг белка] концентрацию в биологическом компартменте или т.п.

«Введение» и «лечение», как это применяют к животному, человеку, экспериментальному субъекту, клетке, ткани, органу или биологическому текучему веществу, относится к контакту экзогенного фармацевтического, терапевтического, диагностического средства или композиции с животным, человеком, субъектом, клеткой, тканью, органом или биологическим текучим веществом. «Введение» и «лечение» могут относиться, например, к терапевтическим, фармакокинетическим, диагностическим, исследовательским и экспериментальным способам. Лечение клетки включает контакт реактива с клеткой, а также контакт реактива с текучим веществом, где текучее вещество находится в контакте с клеткой. «Введение» и «лечение» также обозначают лечение in vitro и ex vivo, например, клетки, посредством реактива, диагностического средства, связывающей композиции или посредством другой клетки. «Лечение», как это применяют у человека, ветеринарного или исследовательского субъекта, относится к терапевтическому лечению, профилактическим или предупредительным мерам, к исследовательским и диагностическим применениям.

«Связывающее соединение» относится к молекуле, которая содержит одну или несколько аминокислотных последовательностей, которые специфически связываются с TSLP человека. В одном из предпочтительных вариантов осуществления связывающее соединение представляет собой антитело, предпочтительно изолированное антитело. В другом предпочтительном варианте осуществления связывающее соединение содержит антигенсвязывающий фрагмент антитела.

«Связывающая композиция» относится к TSLP-связывающему соединению в сочетании со стабилизатором, эксципиентом, солью, буфером, растворителем или добавкой, которое способно связываться с мишенью.

Объем настоящего изобретения также включает комплексы, содержащие любое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению, образующие в комплекс с полипептидом TSLP или его антигенным фрагментом. Комплексы можно получать посредством приведения антитела или фрагмента в контакт с полипептидом TSLP или фрагментом антигена.

Как применяют в настоящем документе, термин «антитело» относится к любой форме антитела или его фрагменту, который проявляет желаемую биологическую активность. Таким образом, его используют в самом широком смысле и он в частности охватывает моноклональные антитела (включая полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела, полиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител при условии, что они проявляют желательную биологическую активность. «Изолированное антитело» относится к состоянию очистки связывающего соединения и в таком контексте обозначает, что молекула по существу освобождена от других биологических молекул, таких как нуклеиновые кислоты, белки, липиды, углеводы или другое вещество, такое как клеточный дебрис и среды для выращивания. В целом, термин «изолированный» не предназначен для того, чтобы указывать на полное отсутствие такого вещества или на отсутствие воды, буферов или солей до тех пор, пока они не присутствуют в количествах, которые по существу препятствуют экспериментальному или терапевтическому применению связывающего соединения, как описано в настоящем документе.

«Fab фрагмент» состоит из одной легкой цепи и CH1 и вариабельных областей одной тяжелой цепи. Тяжелая цепь Fab молекулы не может образовывать дисульфидную связь с другой молекулой тяжелой цепи.

«Fc» область содержит два фрагмента тяжелой цепи, содержащие домены CH2 и CH3 антитела. Два фрагмента тяжелой цепи удерживаются вместе посредством двух или более дисульфидных связей и посредством гидрофобных взаимодействий доменов CH3.

«Фрагмент Fab'» содержит одну легкую цепь и часть или фрагмент одной тяжелой цепи, который содержит домен V_H и домен CH1, а также область между доменами CH1 и CH2 так, что межцепную дисульфидную связь можно сформировать между двумя тяжелыми цепями двух фрагментов Fab', чтобы сформировать молекулу F(ab')2.

«Фрагмент F(ab')2» содержит две легкие цепи и две тяжелые цепи, содержащие часть константной области между доменами CH1 и CH2, так что межцепную дисульфидную связь формируют между двумя тяжелыми цепями. Таким образом, фрагмент F(ab')2 состоит из двух фрагментов Fab', которые удерживаются вместе посредством дисульфидной связи между двумя тяжелыми цепями.

«Область Fv» содержит вариабельные области как из тяжелой, так и из легкой цепи, но не содержит константные области.

Как применяют в настоящем документе, термин «TSLP-связывающий фрагмент» или «его связывающий фрагмент» охватывает фрагмент или производное антитела (или другого связывающего вещества), которые по существу все еще сохраняют его биологическую активность ингибирования активности TSLP. Следовательно, термин «фрагмент антитела» или TSLP-связывающий фрагмент относится к части полноразмерного антитела, как правило, к его антигенсвязывающей или вариабельной области. Примеры фрагментов антител включают фрагменты Fab, Fab', F(ab')2 и Fv; диатела; линейные антитела; одноцепочечные молекулы антител, например, sc-Fv; доменные антитела; и полиспецифические антитела, сформированные из фрагментов антител. Типично, связывающий фрагмент или производно сохраняет по меньшей мере 10% его TSLP-ингибиторной активности. Предпочтительно, связывающий фрагмент или производное сохраняет по меньшей мере 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или 100% (или более) его TSLP-ингибиторной активности, хотя будет полезен любой связывающий фрагмент с достаточной аффинностью для того, чтобы вызывать желаемый биологический эффект. Также предполагается, что TSLP-связывающий фрагмент может содержать консервативные аминокислотные замены, которые по существу не изменяют его биологическую активность.

Термин «моноклональное антитело», как применяют в настоящем документе, относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, т.е., отдельные антитела, входящие в состав популяции, идентичны за исключением возможных встречающихся в природе мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональные антитела высоко специфичны, направлены против одного антигенного эпитопа. В отличие от этого, препараты стандартных (поликлональных) антител типично содержат несколько антител, направленных против (или специфичных к) различных эпитопов. Определение «моноклональный» указывает на характер антител, как полученных из по существу гомогенной популяции антител, и его не следует рассматривать в качестве требования получать антитела посредством какого-либо конкретного способа. Например, моноклональные антитела, подлежащие применению в соответствии с настоящим изобретением, можно создавать с помощью гибридомного способа, впервые описанного авторами Kohler et al., (1975) Nature 256: 495, или можно создавать с помощью способов рекомбинантной ДНК (см., например, патент США № 4816567). «Моноклональные антитела» также можно изолировать из библиотек фаговых антител с применением способов, описанных, например, в Clackson et al., (1991) Nature 352: 624-628 и Marks et al., (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597.

Моноклональные антитела в настоящем документе, в частности, включают «химерные» антитела (иммуноглобулины), в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных от конкретных видов или принадлежащих к конкретному классу или субклассу антител, тогда как остальная часть цепи(ей) идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных от других видов или принадлежащих другому классу или субклассу антител, а также фрагменты таких антител при условии, что они проявляют желательной биологической активностью (патент США № 4816567; и Morrison et al., (1984) Proc. Natl. Acad Sci. USA 81: 6851-6855).

«Доменное антитело» представляет собой иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина, содержащий только вариабельную область тяжелой цепи или вариабельную область легкой цепи. В некоторых случаях, две или более области V_H ковалентно соединены с пептидным линкер для создания бивалентного доменного антитела. Две области V_H бивалентного доменного антитела могут быть нацелены на одинаковые или различные антигены.

«Бивалентное антитело» содержит два антигенсвязывающих участка. В некоторых случаях два сайта связывания обладают одинаковыми антигенными специфичностями. Однако бивалентные антитела могут быть биспецифическими.

Как применяют в настоящем документе, термин «одноцепочечное Fv» или «scFv» антитело относится к фрагментам антител, содержащим V_H и V_L домены антитела, где эти домены присутствуют в одной полипептидной цепи. В целом, Fv полипептид дополнительно содержит полипептидный линкер между V_H и V_L доменам, который позволяет sFv формировать желаемую структуру для связывания антигена. Обзор по sFv см. в Pluckthun (1994) THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315.

Моноклональные антитела в настоящем документе также включают камелизированные однодоменные антитела. См., например, Muyldermans et al. (2001) Trends Biochem. Sci. 26:230; Reichmann et al. (1999) J. Immunol. Methods 231:25; WO 94/04678; WO 94/25591; патент США № 6005079, которые включены, таким образом, посредством ссылки в полном объеме). В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к однодоменным антителам, содержащим два V_H домена с такими модификациями, что они формируют однодоменные антитела.

Как применяют в настоящем документе, термин «диатела» относится к малым фрагментам антител с двумя антигенсвязывающими сайтами, эти фрагменты содержат вариабельный домен (V_H) тяжелой цепи, соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (V_L) в одной и той же полипептидной цепи (V_H-V_L или V_L-V_H). Используя линкер, который слишком короток для того, чтобы сделать возможным образование пар между двумя доменами одной цепи, домены заставляют образовывать пары с комплементарными доменами другой цепи и создавать два антигенсвязывающих сайта. Более полно диатела описаны, например, в EP 404097; WO 93/11161; и Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448. В целом, обзор по сконструированным вариантам антител см. в Holliger and Hudson (2005) Nat. Biotechnol. 23:1126-1136.

Как применяют в настоящем документе, термин «гуманизированное антитело» относится к формам антител, которые содержат последовательности из нечеловеческих антител (например, антител мыши), а также антител человека. Такие антитела содержат минимальную последовательность, полученную из нечеловеческого иммуноглобулина. В целом, гуманизированное антитело должно содержать по существу все из по меньшей мере одного и типично двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все гипервариабельные петли соответствуют таковым нечеловеческого иммуноглобулина и все или по существу все FR области представляют собой таковые последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело необязательно также должно содержать по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), типично таковой иммуноглобулина человека. Приставку «h», «hu» или «hum» добавляют к обозначению клона антитела, когда необходимо отличать гуманизированные антитела (например, «hu23B12») от родительских антител грызунов (например, rat 23B12 или «r23B12»). Гуманизированные формы антител грызунов, как правило, должны содержать те же последовательности CDR родительских антител грызунов, хотя определенные замены аминокислот могут быть включены для повышения аффинности или повышения стабильности гуманизированного антитела.

Антитела по настоящему изобретению также включают антитела с модифицированными (или блокированными) Fc-областями, чтобы обеспечить измененные эффекторные функции. См., например, патент США № 5624821; WO 2003/086310; WO 2005/120571; WO 2006/0057702; Presta (2006) Adv. Drug Delivery Rev. 58:640-656. Такие модификации можно использовать для усиления или супрессии различных реакций иммунной системы, с возможными положительным воздействием в диагностике и терапии. Изменения Fc-области включают изменения аминокислот (замены, делеции и инсерции), гликозилирование или дегликозилирование и добавление нескольких Fc. Изменения в Fc также могут изменять время полужизни антител у терапевтических антител и более длительное время полужизни должно приводить к менее частому дозированию с сопутствующим повышенным удобством и пониженным применением вещества. См. Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116:131 на 734-35.

Термин «полностью антитело человека» относится к антителу, которое содержит только белковые последовательности иммуноглобулинов человека. Полностью антитело человека может содержать углеводные цепи мыши, если его продуцирует мышь, клетка мыши или гибридома, полученная из клетки мыши. Аналогичным образом «антитело мыши» относится к антителу, которое содержит только последовательности иммуноглобулинов мыши.

Как применяют в настоящем документе, термин «гипервариабельная область» относится к аминокислотным остаткам антитела, которые отвечают за связывание антигена. Гипервариабельная область содержит аминокислотные остатки из «определяющей комплементарность области» или «CDR» (например, остатки 24-34 (CDRL1), 50-56 (CDRL2) и 89-97 (CDRL3) в вариабельном домене легкой цепи и остатки 31-35 (CDRH1), 50-65 (CDRH2) и 95-102 (CDRH3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.) и/или такие остатки из «гипервариабельной петли» (т.е. остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 26-32 (H1), 53-55 (H2) и 96-101 (H3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Chothia and Lesk, (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917). Как применяют в настоящем документе, термин «каркасные» или «FR» остатки относится к тем остаткам вариабельного домена, которые отличаются от остатков гипервариабельной области, определяемых в настоящем документе как остатки CDR. Приведенная выше нумерация остатков относится к системе нумерации по Kabat и не обязательно точно соответствует нумерации в последовательностях в сопроводительном списке последовательностей.

«Связывание» относится к образованию связи между связывающей композицией и мишенью, где образование связи ведет к снижению нормального броуновского движения связывающей композиции в случаях, когда связывающая композиция может быть растворена или суспендирована в растворе.

«Консервативно модифицированные варианты» или «консервативные замены» относятся к заменам аминокислот, которые известны специалистам в данной области и могут быть созданы, как правило, без изменения биологической активности полученной молекулы. Специалисты в данной области признают, в целом, что одиночные замены аминокислот не в важных областях полипептида, по существу, не изменяют биологическую активность (см., например, Watson, et al, Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4th Edition 1987)). Такие образцовые замены предпочтительно создают в соответствии с теми, что приведены в следующей таблице 1:

Таблица 1Образцовые консервативные аминокислотные замены
Исходный остаток	Консервативная замена
Ala (A)	Gly; Ser
Arg (R)	Lys; His
Asn (N)	Gln; His
Asp (D)	Glu; Asn
Cys (C)	Ser; Ala
Gln (Q)	Asn
Glu (E)	Asp; Gln
Gly (G)	Ala
His (H)	Asn; Gln
Ile (I)	Leu; Val
Leu (L)	Ile; Val
Lys (K)	Arg; His
Met (M)	Leu; Ile; Tyr
Phe (F)	Tyr; Met; Leu
Pro (P)	Ala
Ser (S)	Thr
Thr (T)	Ser
Trp (W)	Tyr; Phe
Tyr (Y)	Trp; Phe
Val (V)	Ile; Leu

«Эффективное количество» охватывает количество, достаточное для того, чтобы улучшать или предотвращать симптом или признак медицинского состояния. Эффективное количество также обозначает количество, достаточное для того, чтобы сделать возможным или облегчить диагностику. Эффективное количество для конкретного пациента или ветеринарного субъекта может варьировать в зависимости от факторов, таких как состояние, которое лечат, общее состояние здоровья пациента, путь и доза для способа введения и тяжесть побочных эффектов (см., например, патент США № 5888530, выданный Netti, et al.). Эффективное количество может представлять собой максимальную дозу или протокол дозирования, который избегает значительных побочных эффектов или токсических эффектов. Эффект должен приводить к улучшению диагностической меры или параметра по меньшей мере на 5%, обычно по меньшей мере на 10%, более обычно по меньшей мере на 20%, наиболее обычно по меньшей мере на 30%, предпочтительно по меньшей мере на 40%, более предпочтительно по меньшей мере на 50%, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 60%, идеально по меньшей мере 70%, более идеально по меньшей мере 80% и наиболее идеально по меньшей мере на 90%, где 100% определяют как диагностический параметр, который проявляет нормальный субъект (см., например, Maynard, et al. (1996) A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Boca Raton, FL; Dent (2001) Good Laboratory and Good Clinical Practice, Urch Publ., London, UK).

Как применяют в настоящем документе, термин «изолированная молекула нуклеиновой кислоты» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которую идентифицируют и отделяют по меньшей мере от одной загрязняющей молекулы нуклеиновой кислоты, вместе с которой она, как правило, ассоциирована в естественном источнике нуклеиновой кислоты антитела. Изолированная молекула нуклеиновой кислоты отличается от той формы или окружения, в которых ее находят в природе. Следовательно, изолированные молекулы нуклеиновой кислоты отличаются от молекулы нуклеиновой кислоты, как она существует в естественных клетках. Однако, изолированная молекула нуклеиновой кислоты содержит молекулу нуклеиновой кислоты, содержащуюся в клетках, которые как правило, экспрессируют антитело, где, например, молекула нуклеиновой кислоты находится в хромосомной локализации, отличающееся от таковой в естественной клетке.

Выражение «управляющие последовательности» относится к последовательностям ДНК, необходимым для экспрессии функционально связанной кодирующей последовательности в конкретном организме-хозяине. Управляющие последовательности, которые подходят для прокариотов, например, содержат промотор, необязательно последовательность оператора и участок связывания рибосомы. Известно, что эукариотические клетки используют промоторы, сигналы полиаденилирования и энхансеры.

Нуклеиновая кислота является «функционально связанной», когда она находится в функциональной взаимосвязи с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, ДНК для предпоследовательности или секреторной лидерной последовательности функционально связана с ДНК для полипептида, если происходит ее экспрессия в виде белка-предшественника, который участвует в секр