Композиции и способы, включающие в себя применение вариантных микробных протеаз

Композиции и способы, включающие в себя применение вариантных микробных протеаз

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение предлагает способы получения рекомбинантных белков и вариантных протеаз. Конкретно настоящее изобретение предлагает способы применения сайт-определяющих библиотек. Настоящее изобретение также предлагает варианты субтилизина, подходящие для разных применений.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Сериновые протеазы составляют подгруппу карбонильных гидролаз, представляющую собой отдельный класс ферментов, обладающих широким диапазоном специфичности и биологических функций. Субтилизины являются предметом многочисленных исследований, в основном, вследствие их применения в чистке и пищевой промышленности. Дополнительные усилия направлены на вредные условия окружающей среды (такие как воздействие окисляющих средств, хелатирующих средств, экстремальных значений температуры и/или pH), которые могут оказывать неблагоприятное влияние на функционирование указанных ферментов при разных применениях. Тем не менее, в данной области остается потребность в ферментативных системах, обладающих устойчивостью к указанным неблагоприятным условиям при сохранении прежней активности, или при повышенной активности по сравнению с известными в данной области ферментами.

В данной области известны разные способы получения рекомбинантных белков. Как правило, белки модифицируют с целью получения желательных свойств. В большинстве способов в нуклеотидную последовательность клонированного гена, кодирующего белок, вводят мутации, после чего модифицированный ген экспрессируют с получением мутантов, которые подвергают скринингу на представляющую интерес активность. Свойства мутантов обычно сравнивают со свойствами белка дикого типа.

Исторически процесс конструирования белков используют как эквивалентный подход к решению проблемы, связанной с обнаружением в пространстве целого белка последовательности, наиболее подходящей для целевого применения. Данная проблема является крайне сложной и "NP-тяжелой". В теории сложности проблемы, которые относят к классу P, считаются простыми и поддающимися эффективному решению, для их решения существуют алгоритмы полиномиального времени. NP-тяжелые проблемы представляют собой проблемы, для решения которых в настоящее время отсутствуют алгоритмы полиномиального времени, и если одна NP-тяжелая проблема будет решена, можно будет решить все NP-тяжелые проблемы (см., например, Pierce and Winfree, Protein Engineer., 15:779-782 [2002]). Существующие в настоящее время стратегии создания и скрининга библиотек, как правило, включают в себя получение множества белковых последовательностей, которые содержат случайные различия на протяжении всей последовательности, или различия, встречающиеся в контролируемой случайной манере в определенных положениях белка. Такие библиотеки обычно содержат большое число членов, которые являются "отрицательными" в отношении исходного представляющего интерес свойства, следовательно, чтобы обнаружить относительно небольшое количество членов с положительными мутациями, нужно провести скрининг большого числа объектов. Как правило, отрицательные мутации игнорируют и информацию о последовательности получают только для положительных членов.

Насыщающий мутагенез (Estell et al., in World Biotech Report 1984, vol. 2: USA, Online Publications, London [1984], pages 181-187; и Wells et al., Gene 34:315-323 [1985]) представляет собой метод, который можно использовать для поиска в пространстве белка мутаций, оптимизирующих некоторые свойства белка. В нескольких группах разработаны стратегии идентификации участков, подлежащих изменению под действием насыщающего мутагенеза (Reetz et al., Agnew. Chem. Int. Edn., 44:4192-4196 [2005]; Kato et al., J. MoI. Biol., 351 :683-692 [2005]; и Sandberg et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90:8367-8371 [1993]), однако общая система идентификации участков отсутствует.

Кроме того, поскольку большинство способов получения рекомбинантных белков приводит к генерированию множества аминокислотных мутаций, для получения белка с желательным свойством требуется скрининг большого числа вариантов. Как правило, чтобы получить полезный вариант, скрининг повторяют снова и снова. Следовательно, большинство способов являются трудоемкими и занимают много времени. В данной области продолжает существовать потребность в эффективных способах получения рекомбинантных белков, которые дают желательные результаты.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение предлагает способы получения рекомбинантных белков. Конкретно, настоящее изобретение предлагает способы применения сайт-определяющих библиотек. В частности, настоящее изобретение предлагает способы применения полученной информации о ряде целевых свойств, позволяющие рационально и эффективно конструировать библиотеки для оптимизации этих свойств. В некоторых воплощениях настоящее изобретение предлагает способы конструирования библиотек, улучшенных, по меньшей мере, по двум целевым свойствам.

Настоящее изобретение предлагает способы идентификации положений аминокислотной последовательности белка, которые связаны с улучшением целевых свойств белка. В некоторых особенно предпочтительных воплощениях настоящее изобретение предлагает способы определения мутаций, приводящих к получению белка с указанными целевыми свойствами, а также с улучшенными свойствами. В некоторых других особенно предпочтительных воплощениях настоящее изобретение предлагает способы идентификации аминокислотных положений и мутаций, приводящих к определенному проценту улучшения свойств по сравнению с белком дикого типа (например, одно из свойств улучшается на 110% по сравнению с белком дикого типа). В следующих предпочтительных воплощениях настоящее изобретение предлагает способы идентификации мутаций, которые приводят к получению белка, по меньшей мере, одно свойство которого значительно улучшено, и, по меньшей мере, одно другое свойство не сильно ухудшено по сравнению с белком дикого типа (например, одно свойство лучше на 110% по сравнению с белком дикого типа, а другое свойство хуже не более чем на 90% по сравнению с белком дикого типа). В следующих предпочтительных воплощениях библиотеки конструируют на основе данной информации. В некоторых воплощениях библиотеки конструируют с использованием всех идентифицированных мутаций, тогда как в некоторых других воплощениях библиотеки конструируют с использованием подгруппы идентифицированных мутаций. Действительно, предполагается, что библиотеки не ограничиваются каким-либо конкретным числом и/или типом мутаций.

Настоящее изобретение предлагает способы получения рекомбинантных белков, включающие в себя следующие стадии: получение библиотеки вариантов белка; тестирование библиотеки вариантов белка, по меньшей мере, по одному представляющему интерес свойству с помощью представляющего интерес анализа; идентификация диапазона значений для указанного, по меньшей мере, одного представляющего интерес свойства; идентификация минимума диапазона значений, связанных с благоприятным результатом представляющего интерес анализа; и получение множества вариантов белка, содержащих, по меньшей мере, одну мутацию, превосходящую указанный минимум диапазона значений, характеризующих, по меньшей мере, одно представляющее интерес свойство, которые составляют библиотеку вариантов белка, содержащих, по меньшей мере, одну мутацию, где библиотека обогащена компонентами, которые дают благоприятный результат в представляющем интерес анализе. В некоторых воплощениях благоприятный результат соответствует значению, превышающему примерно 50%, примерно 60%, примерно 70%, примерно 80%, примерно 90% или примерно 95% от максимального значения, наблюдаемого при тестировании, описанном на указанной выше первой стадии. В некоторых альтернативных воплощениях способов настоящего изобретения используют несколько представляющих интерес анализов. В некоторых предпочтительных воплощениях белок представляет собой фермент. В некоторых особенно предпочтительных воплощениях фермент выбран из группы, включающей в себя протеазы, трансферазы, металлопротеазы, эстеразы, амилазы, целлюлазы, оксидазы, кутиназы и липазы.

Настоящее изобретение также предлагает способы получения рекомбинантных белков, включающие в себя следующие стадии: получение библиотеки вариантов белка; тестирование библиотеки вариантов белка по меньшей мере, по двум представляющим интерес свойствам с помощью представляющего интерес анализа; идентификация диапазона значений для, по меньшей мере, двух представляющих интерес свойств; идентификация минимума диапазона значений, связанных с благоприятным результатом представляющего интерес анализа; и получение множества вариантов белка, превосходящих минимум диапазона, по меньшей мере, по двум представляющим интерес свойствам, которые составляют библиотеку вариантов белка, обогащенную компонентами, характеризующимися благоприятными результатами в представляющем интерес анализе. В некоторых воплощениях благоприятный результат соответствует значению, превышающему примерно 50%, примерно 60%, примерно 70%, примерно 80%, примерно 90% или примерно 95% от максимального значения, наблюдаемого при тестировании, описанном на указанной выше первой стадии. В некоторых предпочтительных воплощениях белок представляет собой фермент. В некоторых особенно предпочтительных воплощениях фермент выбран из группы, включающей в себя протеазы, трансферазы, металлопротеазы, эстеразы, амилазы, целлюлазы, оксидазы, кутиназы и липазы.

Настоящее изобретение также предлагает способы получения рекомбинантных белков, включающие в себя следующие стадии: получение белка дикого типа и библиотеки вариантов белка дикого типа; тестирование библиотеки вариантов белка и белка дикого типа, по меньшей мере, по одному представляющему интерес свойству с помощью представляющего интерес анализа; идентификация диапазона значений для, по меньшей мере, одного представляющего интерес свойства; идентификация минимума диапазона значений, связанных с благоприятным результатом представляющего интерес анализа; идентификация вариантов белка, имеющих благоприятный результат по сравнению с результатами, полученными для белка дикого типа, где благоприятный результат связан с улучшенным представляющим интерес свойством; и получение множества вариантов белка, превосходящих минимум диапазона, по меньшей мере, по одному представляющему интерес свойству, которые составляют библиотеку улучшенных вариантов белка, обогащенную компонентами, характеризующимися благоприятными результатами в представляющем интерес анализе. В некоторых предпочтительных воплощениях способы дополнительно включают в себя стадию определения показателя функционирования, где показатель функционирования определяют путем деления значения, полученного для каждого улучшенного варианта белка, на значение, полученное для белка дикого типа. В некоторых особенно предпочтительных воплощениях способы дополнительно включают в себя стадию идентификации улучшенных вариантов белка, где улучшенные варианты белка имеют значения показателя функционирования выше 1,1 по результатам представляющего интерес анализа. В некоторых других воплощениях белок представляет собой фермент. В некоторых особенно предпочтительных воплощениях, фермент выбран из группы, включающей в себя протеазы, трансферазы, металлопротеазы, эстеразы, амилазы, целлюлазы, оксидазы, кутиназы и липазы. В некоторых альтернативных воплощениях белок выбран из антител и факторов роста. В следующих предпочтительных воплощениях белок дикого типа представляет собой зрелую форму фермента, выбранного из группы, включающей в себя протеазы, трансферазы, металлопротеазы, эстеразы, амилазы, целлюлазы, оксидазы, кутиназы и липазы. В некоторых предпочтительных воплощениях, представляющее интерес свойство выбрано из группы, включающей в себя заряд, эффективность стирки, эффективность чистки твердых поверхностей, растворимость, термостабильность, стабильность при хранении, устойчивость к детергентам, связывание субстрата, ингибирование ферментов, уровень экспрессии, скорость реакции и деградацию субстрата. В некоторых воплощениях белок дикого типа и вариант белка являются компонентами, по меньшей мере, одной детергентной композиции. В некоторых предпочтительных воплощениях эффективность стирки тестируют с применением детергентной композиции, которая находится в порошкообразной или жидкой форме, имеющей pH от 5 до 12,0.

Настоящее изобретение также предлагает способы получения улучшенного варианта исходного белка с определенной укладкой, включающие в себя следующие стадии: анализ множества вариантов тестируемого белка с определенной укладкой, соответствующих диапазону представляющего интерес свойства по данным представляющего интерес анализа; идентификация минимума диапазона представляющего интерес свойства, связанного с благоприятным результатом представляющего интерес анализа; анализ исходного белка с определенной укладкой с помощью представляющего интерес способа; и получение улучшенного варианта исходного белка путем введения аминокислотной замены в исходный белок, где улучшенный вариант характеризуется значениями, превышающими минимум диапазона представляющего интерес свойства. В некоторых предпочтительных воплощениях исходный белок отличается от тестируемого белка. В некоторых воплощениях способы дополнительно включают в себя стадию определения показателя функционирования, где показатель функционирования определяют путем деления значения, полученного для улучшенного варианта белка, на значение, полученное для исходного белка. В некоторых воплощениях тестируемые белки и исходные белки являются ферментами. В некоторых особенно предпочтительных воплощениях, ферменты выбраны из группы, включающей в себя протеазы, трансферазы, металлопротеазы, эстеразы, амилазы, целлюлазы, оксидазы, кутиназы и липазы. В некоторых альтернативных воплощениях тестируемые и исходные белки выбраны из антител и факторов роста. В следующих предпочтительных воплощениях исходный белок представляет собой зрелую форму фермента, выбранного из группы, включающей в себя протеазы, трансферазы, металлопротеазы, эстеразы, амилазы, целлюлазы, оксидазы, кутиназы и липазы. В некоторых предпочтительных воплощениях представляющее интерес свойство выбрано из группы, включающей в себя заряд, эффективность стирки, эффективность чистки твердых поверхностей, термостабильность, растворимость, стабильность при хранении, устойчивость к детергентам, связывание субстрата, ингибирование ферментов, уровень экспрессии, скорость реакции и деградацию субстрата. В некоторых воплощениях тестируемые и исходные белки являются компонентами, по меньшей мере, одной детергентной композиции. В отдельном альтернативном воплощении улучшенный вариант белка является компонентом детергентной композиции. В некоторых предпочтительных воплощениях эффективность стирки тестируют с применением детергентной композиции, которая находится в порошкообразной или жидкой форме, имеющей pH от 5 до 12,0.

Настоящее изобретение также предлагает выделенные варианты субтилизина Bacillus, где вариант субтилизина представляет собой зрелую форму, обладающую протеолитической активностью и содержащую замену по одному или более положениям, выбранным из следующей группы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 35, 36, 37, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 62, 65, 66, 67, 71, 72, 73, 76, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 141, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 156, 157, 158, 159, 160, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 203, 204, 206, 207, 209, 210, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 222, 223, 224, 225, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273 и 274, где положения пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина B. amyloliquefaciens BPN', описанной как SEQ ID NO:2. В некоторых воплощениях одно или более положений выбраны из следующей группы: 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 28, 29, 30, 31, 33, 35, 36, 37, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 62, 65, 66, 67, 71, 72, 73, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 118, 119, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 131, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 141, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 156, 157, 158, 159, 160, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 203, 204, 206, 207, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 222, 223, 224, 225, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273 и 274, и где положения пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина B. amyloliquefaciens BPN', описанной как SEQ ID NO:2. В некоторых воплощениях одно или более положений выбраны из следующей группы: 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19, 20, 21, 21, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 30, 31, 33, 35, 36, 37, 39, 40, 41, 42, 44, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 62, 65, 66, 67, 71, 73, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 102, 105, 106, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 122, 123, 124, 125, 126, 128, 129, 131, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 141, 143, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 156, 157, 158, 159, 160, 162, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 186, 187, 189, 190, 191, 192, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 203, 204, 206, 207, 212, 214, 216, 217, 218, 219, 220, 222, 223, 224, 225, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 253, 254, 255, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273 и 274, и где положения пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина B. amyloliquefaciens BPN', описанной как SEQ ID NO:2. В некоторых воплощениях, вариант субтилизина также содержит замену по одному или более положениям, выбранным из 18, 52, 72, 117, 119, 127, 144, 185, 209 и 213, и где положения пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью субтилизина B. amyloliquefaciens BPN', описанной как SEQ ID NO:2. В некоторых предпочтительных воплощениях, замена включает в себя одну или несколько, выбранных из следующей группы: A001C, A001D, A001E, A001F, A001G, A001H, A001I, A001K, A001L, A001M, A001N, A001Q, A001R, A001S, A001V, A001W, Q002A, Q002D, Q002E, Q002G, Q002S, S003A, S003D, S003F, S003G, S003I, S003K, S003L, S003M, S003N, S003P, S003Q, S003R, S003T, S003V, S003W, S003Y, P005C, P005E, P005G, P005N, P005Q, P005T, Y006A, Y006C, Y006E, Y006F, Y006G, Y006K, Y006M, Y006N, Y006P, Y006Q, Y006R, Y006T, Y006V, Y006W, S009A, S009C, S009E, S009F, S009G, S009H, S009K, S009L, S009M, S009P, S009Q, S009R, S009T, S009V, S009W, Q010A, Q010C, Q010E, Q010F, Q010G, Q010H, Q010I, Q010K, Q010L, Q010M, Q010R, Q010S, Q010T, Q010V, Q010W, I011C, I011L, I011T, I011V, I011Y, K012A, K012C, K012D, K012E, K012F, K012G, K012H, K012I, K012N, K012Q, K012S, K012T, K012V, K012W, K012Y, A013C, A013F, A013G, A013H, A013L, A013R, A013S, A013T, A013V, P014A, P014C, P014D, P014E, P014F, P014G, P014I, P014K, P014L, P014M, P014N, P014Q, P014R, P014S, P014T, P014V, P014W, P014Y, A015C, A015D, A015E, A015F, A015G, A015H, A015I, A015K, A015L, A015M, A015P, A015Q, A015R, A015T, A015V, A015Y, L016A, L016C, L016I, L016M, L016Q, L016S, L016T, H017F, H017I, H017L, H017M, H017V, H017W, H017Y, S018A, S018E, S018F, S018G, S018H, S018I, S018K, S018L, S018M, S018N, S018P, S018Q, S018R, S018T, S018V, S018W, S018Y, Q019A, Q019C, Q019D, Q019E, Q019G, Q019I, Q019K, Q019M, Q019R, Q019T, Q019V, G020A, G020C, G020D, G020E, G020F, G020H, G020K, G020M, G020N, G020P, G020Q, G020R, G020S, G020W, Y021A, Y021C, Y021D, Y021E, Y021F, Y021G, Y021H, Y021K, Y021M, Y021R, Y021S, Y021T, Y021V, Y021W, T022A, T022C, T022E, T022F, T022G, T022H, T022I, T022K, T022L, T022M, T022N, T022Q, T022S, T022V, T022W, T022Y, S024C, S024F, S024G, S024H, S024I, S024K , S024L, S024M, S024N, S024Q, S024R, S024T, S024W, S024Y, N025C, N025E, N025F, N025G, N025H, N025I, N025K, N025L, N025M, N025P, N025R, N025S, N025T, N025V, N025W, K027A, K027D, K027E, K027F, K027G, K027H, K027L, K027M, K027P, K027R, K027S, K027W, K027Y, S033A, S033F, S033G, S033H, S033P, S033T, S033W, I035A, I035C, I035D, I035R, I035S, I035T, I035V, D036A, D036C, D036E, D036Q, D036S, D036W, S037A, S037C, S037E, S037F, S037G , S037H, S037K, S037L, S037M, S037P, S037Q, S037R, S037T, S037W, H039C, H039Q, H039T, H039V, P040A, P040C, P040E, P040F, P040G, P040G, P040H, P040I, P040K, P040L , P040M, P040N, P040Q, P040R, P040S, P040T, P040V, P040W, D041E, L042I, L042M, L042V, K043A, K043C, K043D, K043E, K043F, K043G, K043I, K043L, K043M, K043N, K043R, K043S, K043T, K043V, K043W, K043Y, V044A, V044C, V044I, V044L, V044M, V044P, V044S, V044T, A045C, A045E, A045F, A045H, A045I, A045K, A045L, A045M, A045N, A045P, A045Q, A045S, A045T, A045V, A045Y, G046A, G046C, G046E, G046H, G046K, G046M, G046N, G046Q, G046T, G046W, G046Y, A048C, A048D, A048E, A048F, A048H, A048I, A048K, A048L, A048M, A048Q, A048R, A048S, A048T, A048V, A048W, A048Y, M050A, M050C, M050F, M050H, M050I, M050K, M050L, M050Q, M050R, M050S, M050T, M050V, M050W, M050Y, V051A, V051C, V051D, V051E, V051H, V051I , V051L, V051P, V051Q, P052C, P052D, P052E, P052F, P052H, P052I, P052K, P052L, P052Q, P052R, P052S, P052T, P052V, P052W, P052Y, S053E, S053F, S053G, S053H, S053I, S053K, S053L, S053M, S053N, S053Q, S053R, S053T, S053V, S053W, E054A, E054N, E054Q, E054S, T055A, T055C, T055D, T055F, T055G, T055H, T055I, T055K, T055M, T055P, T055Q, T055R, T055S, T055V, T055W, T055Y, N056D, N056M, N056P, N056Q, N056S, N056T, N056V, P057N, P057Q, P057T, P057V, P057W, F058C, F058E, F058G, F058H, F058L, F058M, F058N, F058Q, F058S, F058V, F058Y, Q059A, Q059C, Q059D, Q059E, Q059F, Q059G, Q059H, Q059K, Q059L, Q059M, Q059N, Q059P, Q059R, Q059S, Q059T, Q059V, Q059W, Q059Y, D060E, D060G, N062A, N062C, N062D, N062E, N062F, N062G, N062H, N062I, N062K, N062L, N062M, N062Q, N062R, N062S, N062T, N062V, N062W, N062Y, T066S, T066W, T066Y, H067A, H067C, H067F, H067I, H067L, H067M, H067N, H067P, H067R, H067S, H067T, T071I, T071Y, N077S, S078A, S078C, S078D, S078F, S078G, S078I, S078K, S078L, S078M, S078N, S078P, S078Q, S078R, S078T, S078V, S078W, S078Y, I079A, I079C, I079E, I079F, I079G, I079H, I079K, I079L, I079N, I079Q, I079R, I079S, I079T, I079V, I079W, I079Y, V081F, V081I, V081L, V081M, V081T, G083F, G083P, Q084A, Q084C, Q084H, Q084I, Q084N, Q084T, A085C, A085F, A085G, A085R, A085S, P086A, P086D, P086E, P086G, P086M, P086N, P086Q, P086R, P086S, P086T, P086W, P086Y, S089C, S089D, S089E, S089F, S089G, S089H, S089K, S089L, S089V, S089W, S089Y, L090A, L090D, L090E, L090G, L090H, L090M, L090Q, L090T, L090V, Y091A, Y091C, Y091D, Y091E, Y091F, Y091H, Y091I, Y091L, Y091M, Y091Q, Y091S, Y091T, Y091V, L096F, L096H, L096I, L096K, L096M, L096T, L096V, G097A, G097C, G097D, G097E, G097H, G097K, G097L, G097M, G097P, G097Q, G097R, G097S, G097T, G097V, A098C, A098D, A098F, A098G, A098H, A098I, A098L, A098P, A098Q, A098R, A098S, A098T, A098V, A098Y, D099C, D099E, D099I, D099K, D099L, D099N, D099P, D099Q, D099R, D099S, D099T, S101A, S101C, S101E, S101F, S101G, S101I, S101K, S101L, S101M, S101N, S101P, S101Q, S101R, S101T, S101V, S101Y, G102A, G102C, G102E, G102F, G102I, G102N, G102S, G102V, G102Y, Q103A, Q103C, Q103E, Q103F, Q103G, Q103I, Q103K, Q103L, Q103M, Q103N, Q103R, Q103S, Q103T, Q103V, Q103W, S105A, S105C, S105D, S105E, S105F, S105G, S105I, S105K, S105L, S105M, S105N, S105P, S105R, S105V, S105W, W106A, W106C, W106E, W106F, W106G, W106H, W106I, W106L, W106M, W106N, W106R, W106S, W106T, W106V, W106Y, N109A, N109C, N109E, N109F, N109G, N109H, N109L, N109M, N109P, N109Q, N109R, N109S, N109T, N109V, N109W, N109Y, I111C, I111F, I111L, I111M, I111N, I111P, I111T, I111V, I111W, E112A, E112C, E112D, E112F, E112G, E112I, E112L, E112M, E112N, E112Q, E112R, E112S, E112T, E112V, E112W, E112Y, W113D, W113E, W113F, W113N, W113P, W113Q, W113S, W113V, W113Y, I115E, I115H, I115N, I115R, I115T, I115V, I115W, I115Y, A116C, A116D, A116E, A116F, A116G, A116H, A116I, A116K, A116L, A116M, A116N, A116P, A116Q, A116R, A116S, A116T, A116V, A116W, A116Y, N118A, N118C, N118D, N118E, N118F, N118G, N118H, N118I, N118K, N118L, N118M, N118Q, N118R, N118S, N118T, N118V, N118W, N118Y, I122A, I122C, I122H, I122K, I122L, I122M, I122N, I122P, N123A, N123C, N123D, N123E, N123G, N123I, N123L, N123M, N123Q, N123S, N123T, N123V, M124C, M124D, M124I, M124L, M124S, M124T, M124V, M124W, S125A, S125C, S125E, S125F, S125I, S125K, S125M, S125N, S125P, S125Q, S125R, S125T, S125W, L126A, L126C, L126I, L126K, L126N, L126R, L126S, L126T, L126V, L126W, L126Y, G127A, G127C, G127E, G127F, G127I, G127K, G127M, G127N, G127P, G127Q, G127S, G127T, G127V, G127W, G127Y, G128A, G128D, G128F, G128H, G128L, G128N, G128P, G128S, G128T, G128V, G128W, G128Y, P129A, P129C, P129D, P129E, P129F, P129G, P129I, P129K, P129L, P129M, P129N, P129Q, P129S, P129T, P129V, P129Y, G131A, G131C, G131E, G131F, G131K, G131L, G131M, G131N, G131P, G131Q, G131R, G131S, G131T, G131V, G131W, G131Y, A133C, A133D, A133E, A133F, A133G, A133I, A133K, A133L, A133M, A133P, A133R, A133S, A133T, A133V, A133W, A133Y, A134D, A134E, A134F, A134G, A134I, A134K, A134L, A134M, A134P, A134Q, A134R, A134S, A134T, A134V, A134W, L135D, L135E, L135M, L135R, L135W, L135Y, K136E, K136H, K136L, K136M, K136N, K136R, K136S, K136T, K136V, K136W, K136Y, A137C, A137E, A137F, A137H, A137K, A137L, A137M, A137N, A137P, A137Q, A137R, A137S, A137T, A137V, A137W, A137Y, V139C, V139I, V139L, V139N, V139S, V139T, K141A, K141C, K141D, K141E, K141F, K141G, K141H, K141I, K141L, K141M, K141N , K141Q, K141R, K141S, K141V, K141W, K141Y, V143A, V143C, V143D, V143E, V143F, V143G, V143K, V143L, V143M, V143N, V143Q, V143R, V143S, V143T, V143W, A144C, A144D, A144E, A144G, A144I, A144K, A144L, A144M, A144R, A144S, A144T, A144V, A144W, S145A, S145C, S145D, S145E, S145F, S145G, S145H, S145I, S145L, S145M, S145Q, S145R, S145T, S145V, S145W, S145Y, G146A, G146C, G146D, G146E, G146M, G146Q, G146R, G146S, G146T, G146Y, A153S, G154L, G154P, G154T, E156A, E156C, E156F, E156K, E156L, E156N, E156Q, E156R, E156S, E156T, E156V, E156W, E156Y, T158A, T158D, T158E, T158G, T158H, T158I, T158K, T158L, T158M, T158N, T158Q, T158S, T158V, T158Y, S159A, S159C, S159D, S159E, S159G, S159H, S159I, S159K, S159M, S159Q, S159R, S159T, G160D, G160E, G160K, G160N, G160P, G160Q, G160S, G160T, S162A, S162C, S162E, S162H, S162K, S162L, S162M, S162N, S162Q, S162R, S162T, S162V, S163G, S163P, Y167A, Y167F, Y167H, Y167I, P168D, P168G, P168I, P168M, P168S, P168Y, G169A, G169E, G169F, G169H, G169I, G169M, G169N, G169R, G169T, G169V, G169Y, K170A, K170C, K170F, K170G, K170H, K170R, K170V, K170W, K170Y, Y171G, Y171K, Y171P, P172A, P172C, P172E, P172K, P172L, P172M, P172N, P172Q, P172R, P172S, P172T, P172V, P172Y, S173A, S173C, S173E, S173I, S173T, S173V, V174C, V174F, V174H, V174R, V174T, I175G, I175L, I175M, I175R, I175T, I175V, A176C, A176E, A176F, A176K, A176M, A176S, A176Y, A179G , V180A, V180C, V180L, V180N, V180S, V180T, D181C, D181E, D181G, D181H, D181M, D181N, D181S, D181T, D181W, S182A, S182C, S182D, S182F, S182G, S182H, S182I, S182K, S182M, S182P, S182Q, S182R, S182V, S182Y, S183A, S183C, S183E, S183F, S183G, S183H, S183I, S183K, S183L, S183M, S183N, S183Q, S183R, S183T, S183V, S183W, S183Y, N184C, N184D, N184E, N184G, N184H, N184K, N184L, N184M, N184Q, N184S, N184T, N184V, N184W, Q185A, Q185C, Q185E, Q185F, Q185G, Q185H, Q185I, Q185K, Q185L, Q185M, Q185N, Q185S, Q185T, Q185V, Q185W, R186I, R186L, R186W, A187C, A187D, A187E, A187F, A187G, A187P, A187S, A187W, A187Y, S188A, S188C, S188D, S188E, S188F, S188G, S188H, S188I, S188K, S188L, S188M, S188P, S188Q, S188T, S188V, S188W, S188Y, S190F, S190H, S190I, S190K, S191A, S191G, S191N, S191P, V192A, V192S, V192T, V192Y, G193F, G193H, G193I, G193N, G193P, G193R , G193T, P194C, P194E, P194H, P194I, P194K, P194L, P194M, P194Q, P194T, P194V, P194W, L196A, M199P, M199S, A200C, A200G, A200K, A200Y, G202D, G202E, G202F, G202L, G202P, G202V, G202Y, Q206A, Q206C, Q206D, Q206E, Q206F, Q206G, Q206H, Q206I, Q206L, Q206M, Q206N, Q206P, Q206R, Q206S, Q206T, Q206V, Q206W, Q206Y, S207D, S207E, S207K, S207Q, S207T, S207V, P210A, P210C, P210S, P210T, N212A, N212C, N212E, N212F, N212G, N212H, N212K, N212L, N212M, N212P, N212Q, N212R, N212S, N212V, K213A, K213C, K213D, K213E, K213F, K213H, K213I , K213L, K213M, K213N, K213Q, K213R, K213S, K213T, K213V, K213Y, Y214W, G215A, G215C, G215D, G215E, G215I, G215M, G215N, G215Q, G215S, G215T, G215V, A216C, A216D, A216E, A216G, A216K, A216L, A216M, A216N, A216P, A216Q, A216R, A216S, A216V, A216W, Y217A, Y217C, Y217D, Y217E, Y217F, Y217G, Y217H, Y217I, Y217K, Y217L, Y217M, Y217N, Y217Q, Y217R, Y217S, Y217T, Y217V, Y217W, N218A, N218C, N218E, N218F, N218G, N218H, N218K, N218M, N218R, N218S, N218T, N218W, N218Y, G219A, G219C, G219D, G219H, G219I, G219M, G219P, G219Q, G219R, G219S, G219T, G219V, G219W, T220D, T220E, T220F, T220G, T220K, T220M, T220S, T220Y, A223E, A223F, A223L, A223M, A223R, A223S, A223V, A223W, A223Y, S224A, S224C, S224F, S224G, S224H, S224M, S224N, S224Q, S224R, S224T, P225A, P225C, P225F, P225G, P225H, P225I, P225K, P225L, P225M, P225R, P225S, P225T, P225V, P225Y, A228P, A228R, A228S, A228T, A228W, G229A, G229H, G229I, G229S, A230C, A230E, A230G , A230Q, A230R, A230S, A230T, A230V, A231C, A231I, A231P, A231R, I234A, I234C, I234L, I234M, I234N, I234P, I234Q, I234S, I234T, I234V, L235A, L235C, L235G, L235I , L235K, L235M, L235N, L235Q, L235R, L235S, L235T, L235V, L235W, L235Y, S236A, S236C, S236D, S236E, S236G, S236H, S236N, S236Q, S236T, S236V, S236Y, K237A, K237E , K237F, K237G, K237H, K237I, K237L, K237M, K237N, K237Q, K237R, K237S, K237T, K237V, K237W, K237Y, H238C, H238D, H238E, H238F, H238M, H238R, H238S, P239C, P239D, P239E, P239F, P239H, P239L, P239M, P239N, P239Q, P239R, P239S, P239T, P239V, P239W, P239Y, N240A, N240C, N240D, N240F, N240G, N240K, N240L, N240Q, N240R, N240S, N240T, N240V, N240W, N240Y, W241A, W241F, W241G, W241H, W241I, W241K, W241M, W241Q, W241T, W241V, T242A, T242C, T242E, T242F, T242G, T242K, T242M, T242N, T242P, T242R, T242S, T242W, T242Y, N243C, N243E, N243F, N243G, N243I, N243Q, N243S, N243T, N243V, N243W, N243Y, T244A, T244D, T244F, T244G, T244H, T244K, T244L, T244M, T244N, T244P, T244Q, T244R, T244S, T244V, T244W, T244Y, Q245A, Q245C, Q245D, Q245E, Q245H, Q245I, Q245K, Q245L, Q245M, Q245R, Q245T, Q245V, Q245Y, R247W, S248A, S248E, S248F, S248G, S248H, S248I, S248L, S248M, S248N, S248Q, S248R, S248T, S248V, S248W, S248Y, S249C, S249D, S249H, S249I, S249K, S249L, S249M, S249N, S249Q, S249R, S249T, S249V, S249W, S249Y, L250D, L250F, L250H, L250I, L250M, L250T, L250V, E251A, E251T, E251W, N252A, N252C, N252E, N252G, N252H, N252I, N252L, N252M, N252Q, N252R, N252S, N252T, N252V, N252Y, T253A, T253C, T253E, T253G, T253H, T253K, T253M, T253S, T253V, T254A, T254C, T254L, T254M, T254R, T254S, T254V, T255A, T255C, T255D, T255E, T255F, T255G, T255H, T255I, T255K, T255L, T255M, T255R, T255S, T255V, K256A, K256C, K256D, K256E, K256F, K256H, K256I, K256L, K256M, K256N, K256P, K256Q, K256R, K256S, K256T, K256V, K256W, K256Y, L257A, L257C, L257F, L257G, L257H, L257I, L257K, L257M, L257N, L257R, L257S, L257T, L257V, L257W, L257Y, G258Q, D259A, D259E, D259F, D259G, D259L, D259N, D259P, D259Q, D259R, D259S, D259T, D259V, D259W, D259Y, S260A, S260C, S260D, S260E, S260F, S260G, S260H, S260L, S260M, S260N, S260P, S260R, S260V, S260W, S260Y, F261H, F261W, Y262A, Y262C, Y262E, Y262F, Y262H, Y262L, Y262M, Y262N, Y263F, Y263M, Y263T, G264F, G264I, G264L, K265A, K265C, K265E, K265G, K265H, K265L, K265M, K265N, K265Q, K265R, K265S, K265W, K265Y, G266C, G266F, G266L, G266M, G266P, G266R, G266V, G266W, G266Y, L267A, L267C, L267E, L267G, L267H, L267I, L267M, L267N, L267Q, L267S, L267T, L267V, I268A, I268C, I268K, I268L, I268M, I268P, I268R, I268V, N269D, N269E, N269K, N269L, N269P, N269Q, N269S, Q271A, Q271C, Q271D, Q271E, Q271F, Q271G, Q271H, Q271I, Q271K, Q271L, Q271M, Q271N, Q271P, Q271R, Q271S, Q271T, Q271V, Q271W, Q271Y, A272E, A272F, A272G, A272H, A272K, A272L, A272M, A272N, A272Q, A272R, A272S, A272T, A272V, A272W, A272Y, A274C, A274D, A274F, A274G, A274H, A274I, A274K, A274L, A274Q, A274S, A274T и A274V.

В некоторых предпочтительных воплощениях замена включает в себя сочетание, выбранное из следующей группы: Y021H-A045V-Y217E, Y021W-S101E-G128R-Y217Q, Y021H-Y217E, Y021H-A045V-S101N-Y217Q, Y021H-A045I-Y217E, Y021H-A045I-S101E-Y217Q, Y021W-A045I-S101E-Y217E, D036N-S101E-Y217L, Y021H-A045V-Y217Q, Y021H-A045I-S101E-Y217L, Y021H-A045I-Y217E, Y021H-Y217Q, Y021W-S101E-Y217L, Y021W-A045V-S101E-Y217L, Y021H-A045V-S101E-Y217E, S101E-Y217L, Y021H-A045V-S101E-Y217Q, Y021H-Y217L, Y021W-A045I-S101N-Y217L, S101N-K213I-Y217Q, Y021W-S101N-Y217L, Y021H-S101E-Y217E, M119F-K213K-Y217Q, Y021W-A045V-Y217E, Y021W-A045I-Y217E, M119F-K213I-Y217Q, Y021W-Y217E-N212S, M119F-K213L-Y217E, K213I-Y217Q, A045I-Y217Q, Y021W-A045V-S101E-Y217Q, Y021H-A045V-S101E-Y217L, S101S-M119F-K213I-Y217Q, K213N-Y217Q, M119F-Y217Q, S024H-A092G-A114G, S101N-M119F-K213I-Y217Q, S101N-K213L-Y217Q, S101N-M119F-K213K-Y217L, S101N-M119F-K213I-Y217L, Y021H-A045V-S101E, S101N-K213L-Y217E, A045V-Y217L, S101N-K213I-Y217L, S101S-M119M-K213K-Y217L, Y021H-Y217L, S101E-K213L-Y217L, K213I-Y217E, S101N-M119F-Y217E, Y021W-A045V-Y217L, A092G-A114G, S024H-A092G-Q103E, Y021W-S101E, V26Q-K213I, Y021H-S101N, S101E-K213N-Y217E. В некоторых предпочтительных воплощениях замена включает в себя сочетание, выбранное из следующей группы: S024S-V028V-M050M-A092A-Q103E-A114G-V246V, S024S-V028V-M050V-A092A-Q103Q-A114A-V246V, S024S-V028V-M050V-A092A-Q103Q-A114G-V246V, S024H-V028V-M050V-A092A-Q103Q-A114A-V246T, S024H-V028V-M050V-A092A-Q103E-A114A-V246V, S024H-V028V-M050V-A092A-Q103Q-A114G-V246V, S024H-V028V-M050M-A092A-Q103E-A114A-V246V, S024H-V028V-M050M-A092A-Q103E-A114A-V246T, S024S-V028V-M050M-A092G-Q103Q-A114A-V246T, S024H-V028V-M050M-A092A-Q103Q-A114G-V246T, S101E-M119N-K213N, S101N-K213I, S101N-M119H, M119H-K213I-Y217L, S101N-M119H-K213N-Y217L, S101N-K213L-Y217E, M119N-K213N-Y217L, M119F-K213L-Y217E, S101P-K213N, S101N-M119H-K213N, S101N-M119F-K213I-Y217L, K213L, M119N-K213N, K213N, K213I-Y217E, S101N-M119H-Y217Q, S101P-K213N-Y217L, M119N-K213I, K213N-Y217Q, M119H-K213N, S101N-K213L-Y217Q, S101P-K213N, S101E-K213N-Y217E, S101E-M119H-K213I-Y217Q, S101E-M119H-K213N, K213I-Y217Q, S101N-K213I-Y217Q, M119H-Y217Q, S101N-M119N-K213N-Y217Q, M119H-K213I-Y217Q, K213I-Y217Q, S101E-M119N-Y217L, M119F-K213L, M119H-K213N-Y217E, S101N-M119N-K213N-Y217Q, S101N-M119H-K213N-Y217Q, M119H-K213I-Y217Q, Y217Q, M119H-K213N-Y217Q, S101N-M119F-Y217E, M119F-Y217Q, S101N-M119F-K213I-Y217Q, S101N-K213I-Y217L, S101N-M119H-K213N-Y217L, S101E-K213L-Y217L, S101N-K213N-Y217Q, S101N-M119H-K213L, S101N-M119H-K213I, S101P-K213N-Y217L, M119F-K213I-Y217Q, S101N-K213I-Y217Q, S101E-M119H-K213I-Y217L, S101N-M119H-K213I-Y217Q, M119H-K213N-Y217E, S101N-M119N-K213N-Y217L, A048E-K213L, A048H-K213L, V026Q-A048Y-K213L, K213N, V026N-K213L, V026N-K213L, V026Y-K213N, A048D-K213N, V026Q-A048E-K213L, A048H-K213N, V026Q-A048H-K213L, A048H-K213L, K213L, K213N, V147D-K213L, K213I, V026Q-A048E-K213N, V026N-A048E-K213N, A048E-K213L, V026Y-A048E-K213I, A048D-K213N, K213I, A048H-K213N, V147D-K213N, Y021H-A045V-S101E-Y217L, Y021H-Y217L, Y021H-A045V-S101E-Y217Q, Y021H-A045I-S101E-Y217L, Y021H-Y217Q, Y021H-A045V-Y217E, A045V-Y217L, Y021H-A045V-S101N-Y217Q, Y021W-S101P-Y217L, Y021W-A045I-Y217E, Y021H-A045V-S101E-Y217E, Y021H-A045I-S101E-Y217L, Y021H-A045I-S101E-Y217Q, Y021H-A045V-Y217E, Y021W-S101E-Y217L, S101E-Y217L, Y021H-A045V-Y217Q, Y021H-Y217E, Y021W-Y217E-(N0212S), A045I-Y217Q, Y021H-A045V-Y217E, Y021W-A045V-S101E-Y217Q, Y021H-S101E-Y217E, Y021W-S101N-Y217L, S024S-V028V-M050M-A092A-Q103Q-A114A-V246T, Y021H-A045V-S101E, Y021W-A045V-S101E-Y217L, S101N-M119H-K213K-Y217Q, S101S-M119N-K213N-Y217Q, Y021H-A045V-S101P-Y217L, S024S-V028V-M050M-A092A-Q103Q-A114G-V246T, S101S-M119F-K213I-Y217Q, S101S-M119M-K213K-Y217L, Y021H-A045I-S101E-Y217Q, Y021H-A045V-S101E-Y217E, Y021H-A045V-S101E, Y021H-Y217L, Y021H-A045I-Y217E, Y021W-A045I-S101E-Y217E, S101N-M119F-K213K-Y217L, S101E-M119H-K213N-Y217E, Y021H-A045I-Y217E, S101S-M119H-K213L-Y217L, Y021H-Y217E, S101S-M119F-K213K-Y217Q и Y021H-A045I-S101E-Y217L. В некоторых предпочтительных воплощениях замена включает в себя сочетание, выбранное из следующей группы: S024S-V028T-M050V-A092G-Q103E-A114G-V246T, S101N-M119H, M119N-K213N-Y217L, Y217L, M119N-K213N, K213N, K213N-Y217Q, S101E-K213N-Y217E, S101E-M119N-Y217L, Y217Q, S101N-M119N-K213N-Y217E, S101N-M119N-K213N-Y217L, Y021H-A045I-S101E-Y217L, S101E-Y217L, A045I-Y217Q, S101S-M119M-K213K-Y217L, Y021H-A045I-S101E-Y217L.

Кроме того, настоящее изобретение предлагает варианты, описанные в таблицах в разделе Примеры, а также композиции, содержащие указанные варианты.

Настоящее изобретение также предлагает выделенные нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант субтилизина, векторы экспрессии, содержащие указанные нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, содержащие указанные векторы. Кроме того, настоящее изобретение предлагает чистящие композиции, содержащие вариант субтилизина. В некоторых воплощениях чистящая композиция представляет собой стиральный детергент. В некоторых воплощениях стиральный детергент представляет собой детергент для стирки в холодной воде, детергент с низким pH или компактный детергент. Кроме того, настоящее изобретение предлагает способы получения варианта субтилизина Bacillus, включающие в себя: трансформацию клетки-хозяина вектором экспрессии, содержащим нуклеиновую кислоту, кодирующую вариант субтилизина; и культивирование трансформированной клетки-хозяина в условиях, подходящих для получения варианта субтилизина. В некоторых воплощениях способы дополнительно включают в себя стадию выделения полученного варианта субтилизина. В некоторых воплощениях клетка-хозяин представляет собой разновидность Bacillus, а в подгруппе указанных воплощений разновидность Bacillus представляет собой B. subtilis. Настоящее изобретение также предлагает способ чистки, включающий в себя стадию приведения в контакт поверхности и/или изделия, содержащего ткань, с чистящей композицией, содержащей выделенный вариант субтилизина.

Кроме того, настоящее изобретение предлагает способы получения рекомбинантной протеазы, включающие в себя следующие стадии: a) получение совокупности сайт-определяющих библиотек (SEL), каждая из которых содержит множество вариантов протеазы, содержащих разные замены в одинаковых аминокислотных положениях; b) тестирование вариантов протеазы из SEL и стандартной протеазы по представляющему интерес свойству; c) определение показателя функционирования (PI) для всех тестируемых вариантов протеазы; d) идентификация двух или более аминокислотных положений как неограничивающих, где, по меньшей мере, один из множества вариантов протеазы каждой из двух SEL имеет PI выше 0,5; и f) получение библиотеки множественных мутаций, содержащей совокупность вариантов протеазы с множественными заменами, причем каждый вариант содержит замены в двух или более неограничивающих положениях. В некоторых воплощениях тест включает в себя два или более разных анализов, выбранных из группы, включающей в себя анализ на удаление пятен (с микрообразцов), анализ устойчивости к LAS, анализ устойчивости к детергенту и анализ удельной активности. В некоторых воплощениях протеаза выбрана из группы, включающей в себя бактериальную сериновую протеазу, бактериальный субтилизин и бактериальную нейтральную металлопротеазу.

В других воплощениях настоящее изобретение предлагает способы получения варианта субтилизина Bacillus с множественными заменами, включающие в себя: тестирование множества вариантов субтилизина с одной заменой с помощью первого анализа первого свойства и второго анализа второго свойства, где свойству исходного субтилизина присваивают значение 1,0 в каждом тесте, благоприятное первое или второе свойство имеет значение больше 1,0, а излишне неблагоприятное первое или второе свойство имеет значение менее чем примерно 0,80, или, в некоторых предпочтительных воплощениях, менее чем примерно 0,60; идентификацию замены, по меньшей мере, в одном из вариантов субтилизина с одной заменой, которая связана с благоприятным первым свойством, и которая не связана с излишне неблагоприятным вторым свойством; идентификацию замены, по меньшей мере, в одном из вариантов субтилизина с одной заменой, которая связана с благоприятным вторым свойством, и которая не связана с излишне неблагоприятным первым свойством; и введение замены, идентифицированной на предыдущих стадиях, в субтилизин с получением варианта субтилизина с множественными заменами. В некоторых воплощениях способы дополнительно включают в себя тестирование вариантов субтилизина с множественными заменами с помощью первого анализа и второго анализа, где улучшенный вариант субтилизина достигает значения более 1,0 по результатам как первого, так и второго анализов, значения более 1,0 в первом анализе и значения от 0,80 до 1,0 во втором анализе. В некоторых воплощениях способы дополнительно включают в себя получение улучшенного варианта (вариантов) субтилизина. В некоторых воплощениях, первое и второе свойства имеют отрицательную корреляцию. В некоторых воплощениях благоприятное первое или второе свойство имеет значение больше, чем примерно 1,2. В некоторых воплощениях излишне неблагоприятное первое или второе свойство имеет значение менее чем примерно 0,40. В некоторых воплощениях первое свойство представляет собой стабильность, а второе свойство представляет собой эффективность чистки. В подгруппе данных свойств стабильность включает в себя устойчивость к детергенту, а эффективность чистки включает в себя эффективность удаления крови, молока, чернил (BMI) в детергенте. В некоторых воплощениях исходный бактериальный субтилизин представляет собой зрелую форму субтилизина B. amyloliquefaciens BPN', имеющего аминокислотную последоватлеьность, описанную как SEQ ID NO:2. В других воплощениях исходный бактериальный субтилизин представляет собой зрелую форму субтилизина дикого типа B. lentus GG36, имеющую аминокислотную последовательность, описанную как SEQ ID NO:562, или BPN", содержащий замену Y217L (SEQ ID NO:565), одну или в сочетании с другими модификациями. В некоторых воплощениях настоящего изобретения, эффективность стирки тестируют в порошкообразной или жидкой детергентной композиции, имеющей pH от 5 до 12,0. Предполагается, что порядок стадий не ограничивается точно перечисленным выше, поскольку в настоящем изобретении можно использовать любой подходящий порядок. Однако в некоторых предпочтительных воплощениях более чем примерно 50%, или более чем примерно 65% замен находятся в положениях, составляющих в исходном субтилизине доступную для растворителя поверхность (SAS).

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

На фиг.1A приведена карта pHPLT-VAAcl, а на фиг.1B приведена карта pHPLT-BPN'.

На фиг.2A изображена зависимость чистящей способности BPN'-Y217L CCL в североамериканском стиральном детергенте в отношении BMI от изменения заряда. Подобным образом, на фиг.2B изображена зависимость чистящей способности GG36 CCL в североамериканском стиральном детергенте в отношении BMI от изменения заряда.

На фиг.3A изображена зависимость чистящей способности BPN'-Y217L CCL в западноевропейском жидком стиральном детергенте в отношении BMI от изменения заряда. Подобным образом, на фиг.3B изображена зависимость чистящей способности GG36 CCL в западноевропейском жидком стиральном детергенте в отношении BMI от изменения заряда.

На фиг.4A изображена зависимость чистящей способности BPN'-Y217L CCL в японском порошкообразном стиральном детергенте в отношении BMI от изменения заряда. Подобным образом, на фиг.4B изображена зависимость чистящей способности GG36 CCL в японском порошкообразном стиральном детергенте в отношении BMI от изменения заряда.

На фиг.5A изображена зависимость чистящей способности BPN'-Y217L CCL в детергенте для посудомоечных машин в отношении спекшегося яичного желтка от изменения заряда. Подобным образом, на фиг.5B изображена зависимость чистящей способности GG36 CCL в детергенте для посудомоечных машин в отношении спекшегося яичного желтка от изменения заряда.

На фиг.6 изображена зависимость устойчивости к LAS/EDTA от изменения суммарного заряда по сравнению с исходным BPN'-Y217L, для библиотеки, содержащей 80 вариантов.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение предлагает способы получения рекомбинантных белков. Конкретно, настоящее изобретение предлага