Гуманизированное антитело против олигомера бета-амилоида

Гуманизированное антитело против олигомера бета-амилоида

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к антителу, которое специфически связывается с олигомером β-амилоидного белка (далее обозначенного как «Аβ») и к его применению.

Уровень техники

Основываясь на различных данных, было сделано предположение, что снижение памяти при болезни Альцгеймера (далее обозначенной как «AD») происходит результатом дисфункции синапсов, возникающей за счет растворимых олигомеров β-амилоидного белка (далее β-амилоидный белок обозначен как «Аβ» и олигомер β-амилоидного белка обозначен как «Аβ-олигомер») (непатентные документы 1 и 2).

Следовательно, существует вероятность, что избыточное накопление или отложение Аβ-олигомеров в мозге «запускает» серию патологических каскадов, которые могут привести к развитию AD. Это определяет возможность эффективности медикаментозного лечения, направленного на Аβ-олигомеры, для замедления или профилактики начала и прогрессирования клинического проявления AD.

Однако информация, касающаяся нейродегенерации, вызванной молекулами, лежащими в основе гипотезы амилоидного каскада в качестве основного фактора, в частности, Аβ-олигомерами, была в основном получена в экспериментах in vitro (непатентный документ 3) и не была подтверждена непосредственно in vivo.

Поскольку структуры, специфические для Аβ-олигомеров, не изучались в опытах in vivo, о которых сообщалось ранее (непатентный документ 4), то токсичность эндогенных Аβ-олигомеров для синапсов не исследовалась.

Кроме того, несмотря на то, что проводились опыты на различных моделях AD на мышах, ранее не была выявлена нейрональная токсичность Аβ-олигомеров в мозге пациентов, страдающих AD.

Кроме того, ранее не было установлено, почему образование нейрофибриллярного узла (далее обозначен как «NFT») и потеря нервных клеток имеют место до патологического формирования сенильных бляшек в энториальной области коры и каким образом Аβ-олигомеры связаны с дегенерацией ткани и возникновением дисфункций.

В качестве антител против Аβ-олигомеров известны моноклональные антитела мышей против Аβ-олигомеров NAB61 (непатентный документ 4), 1A9, 2C3, E12, 1C10 и 4D3 (патентный документ 1).

В общих чертах известно, что когда антитело, отличное от антитела человека, такое как антитело мыши, вводят человеку, то оно распознается как чужеродное вещество таким образом, что в организме человека индуцируется образование антител человека на антитело мыши (антимышиные антитела человека: HAMA). Известно, что HAMA взаимодействуют с введенным антителом мыши, вызывая побочные реакции (непатентные документы 5-8), ускоряя выведение антитела мыши из организма (непатентные документы 6, 9 и 10) и снижая терапевтический эффект антитела мыши (непатентные документы 11 и 12).

Для решения этих проблем предпринимались попытки получить рекомбинантное антитело, такое как химерное антитело человека и гуманизированное антитело из антитела, отличного от антитела человека, с использованием методов генетической рекомбинации.

Химерное антитело человека, гуманизированное антитело и тому подобное имеет различные преимущества для клинического применения антитела человека по сравнению с антителом, отличным от антитела человека, таким как антитело мыши. Например, сообщалось, что его иммуногенность снижалась, и его период полураспада удлинялся в опыте на обезьянах по сравнению с антителом мыши (непатентный документ 13).

То есть, поскольку химерное антитело человека, гуманизированное антитело и тому подобное реже вызывают побочные эффекты у человека по сравнению с антителами, отличными от антител человека, предполагается, что их терапевтический эффект будет сохраняться в течение длительного периода времени.

Также, поскольку рекомбинантное антитело, такое как химерное антитело человека, гуманизированное антитело и антитело человека готовят с использованием рекомбинантных методов, то его можно получить в различных молекулярных формах.

Например, подкласс γ1 можно использовать в качестве константной области (далее обозначена как «С-область») тяжелой цепи (далее обозначена как «Н-цепь») антитела человека (С-область Н-цепи обозначена как «СН») для получения рекомбинантного антитела, обладающего высокими эффекторными функциями, такими как антителозависимая клеточная цитотоксичность (далее обозначена как «ADCC-активность»). Кроме того, подкласс γ2 или γ4 можно использовать в качестве тяжелой цепи для получения рекомбинантного антитела, которое обладает пониженной эффекторной функцией и, как полагается, обладает пролонгированным периодом полураспада в крови по сравнению с антителами мыши (непатентный документ 14).

В частности, поскольку цитотоксичность, такая как комплемент-зависимая цитотоксичность (далее обозначена как «CDC-активность») и ADCC-активность опосредуются через Fc-область антитела (область, находящаяся после шарнирной области тяжелой цепи антитела) являются важными для проявления терапевтической эффективности, то химерное антитело человека, гуманизированное антитело или антитело человека являются предпочтительными по сравнению с антителом, отличным от антитела человека, таким как антитело мыши (непатентные документы 15 и 16).

Кроме того, используя недавние достижения в области инженерии белков и генной инженерии, также можно получить рекомбинантное антитело в виде фрагмента антитела, обладающего меньшей молекулярной массой, такого как Fab, Fab', F(ab')₂, одноцепочечное антитело (далее обозначено как «scFv») (непатентный документ 17), фрагмент димеризованной V-области (далее обозначен как «диатело») (непатентный документ 18), фрагмент стабилизированной дисульфидной связью V-области (далее обозначен как «dsFv») (непатентный документ 19) и пептид, содержащий CDR (непатентный документ 20). Эти фрагменты антител обладают преимуществом в переносе к тканям-мишеням по сравнению с молекулами цельного антитела (непатентный документ 21).

Вышеприведенные факты указывают, что химерное антитело человека, гуманизированное антитело, антитело человека или фрагмент антитела являются более предпочтительными для использования при лечении человека по сравнению с антителами, отличными от антител человека, такими как антитело мыши.

Перечень источников

Патентный документ 1: WO 2009/051220

Непатентная литература

Непатентный документ 1: Klein W.L., Trends Neurosci., 24:219-224, 2011.

Непатентный документ 2: Selkoe D.J., Science, 298:789-791, 2002.

Непатентный документ 3: Hass C. et al., Nature Review 8:101-112, 2007.

Непатентный документ 4: Lee E.B. et al., J. Biol. Chem., 281:4292-4299, 2006.

Непатентный документ 5: J. Clin. Oncol., 2, 881 (1984).

Непатентный документ 6: Blood, 65, 1349 (1985).

Непатентный документ 7: J. Natl. Cancer Inst., 80, 932 (1988).

Непатентный документ 8: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 1242 (1985).

Непатентный документ 9: J. Nucl. Med., 26, 1011 (1985).

Непатентный документ 10: J. Natl. Cancer Inst., 80, 937 (1988).

Непатентный документ 11: J. Immunol., 135, 1530 (1985).

Непатентный документ 12: Cancer Res., 46, 6489 (1986).

Непатентный документ 13: Cancer Res., 56, 1118 (1996).

Непатентный документ 14: Immunol., 85, 668 (1995).

Непатентный документ 15: J. Immunol., 144, 1382 (1990).

Непатентный документ 16: Nature, 322, 323 (1988).

Непатентный документ 17: Science, 242, 423 (1988).

Непатентный документ 18: Nature Biotechnol., 15, 629 (1997).

Непатентный документ 19: Molecular Immunol., 32, 249 (1995).

Непатентный документ 20: J. Biol. Chem., 271, 2966 (1996).

Непатентный документ 21: Cancer Res., 52, 3402 (1992).

Сущность изобретения

Техническая проблема, решаемая изобретением

В вышеприведенном непатентном документе 4 и патентном документе 1 описаны антитела к Аβ-олигомерам. Однако данные антитела связываются не только с Аβ-олигомером, но также с Аβ-мономером. Следовательно, существует проблема, связанная с серьезными побочными эффектами антитела во время лечения пациентов с AD антителами, которые направлены на патологию в мозге.

По этой причине настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу, которое не связывается с Аβ-мономером и специфически связывается только с Аβ-олигомером, и к его применению. Более конкретно, изобретение относится к антителам, которые специфически связываются с Аβ-олигомером, к способу определения Аβ-олигомера с использованием антитела, к способу диагностики AD с использованием антитела и к лекарственному препарату, содержащему антитело.

Средства для решение проблемы

В результате интенсивных размышлений по поводу вышеуказанной проблемы заявители настоящего изобретения обнаружили гуманизированное антитело, которое не связывается с Аβ-мономером, а специфически связывается только с Аβ-олигомером, и на этом основании было создано настоящее изобретение.

Таким образом, в настоящем изобретении описано следующее:

1. Гуманизированное антитело, которое не связывается с мономером β-амилоидного белка, но связывается с олигомером β-амилоидного белка, и которое содержит следующую (а) вариабельную область тяжелой цепи и (b) вариабельную область легкой цепи:

(а) вариабельную область тяжелой цепи антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12 или аминокислотную последовательность, в которой проведена по меньшей мере одна модификация из аминокислотных модификаций для замещения Lys в положении 12 на Val, Val в положении 20 на Leu, Arg в положении 38 на Lys, Gln в положении 39 на Leu, Leu в положении 45 на Phe, Met в положении 48 на Ile, Arg в положении 67 на Lys, Val в положении 68 на Ala, Ile в положении 70 на Leu, Ala в положении 72 на Val, Thr в положении 74 на Lys и Ala в положении 97 на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(b) вариабельную область легкой цепи антитела, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14 или аминокислотную последовательность, в которой проведена по меньшей мере одна модификация из аминокислотных модификаций для замещения Ile в положении 2 на Val, Pro в положении 15 на Leu, Gln в положении 50 на Lys и Tyr в положении 92 на Phe в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14.

2. Гуманизированное антитело по п.1, где вариабельная область тяжелой цепи антитела содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12 или 15, и вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14, 16 или 17.

3. Средство против когнитивной дисфункции, содержащее гуманизированное антитело по пп.1 или 2 в качестве активного ингредиента.

4. Лекарственный препарат для лечения болезни Альцгеймера, содержащий гуманизированное антитело по пп.1 или 2 в качестве активного ингредиента.

5. Средство для подавления образования сенильных бляшек, содержащее гуманизированное антитело по пп.1 или 2 в качестве активного ингредиента.

6. Ингибитор образования β-амилоидных волокон, содержащий гуманизированное антитело по пп.1 или 2 в качестве активного ингредиента.

7. Способ по меньшей мере профилактики и/или лечения когнитивной дисфункции, включающий введение гуманизированного антитела по п.п. 1 или 2.

8. Способ по меньшей мере для одного из профилактики и/или лечения болезни Альцгеймера, включающий введение гуманизированного антитела по пп.1 или 2.

9. Способ подавления прогрессирования болезни Альцгеймера, включающий введение гуманизированного антитела по пп.1 или 2.

Преимущественные эффекты изобретения

Предполагается, что антитело по настоящему изобретению будет использоваться в способах профилактики и лечения AD и в качестве диагностического маркера на ранней стадии заболевания за счет направленного воздействия на Аβ-белок, который является вызывающей AD молекулой.

Существует проблема относительно внутрицеребрального переноса антитела во время лечения пациентов с AD антителом, направленным на патологию в мозге. Однако имеется вероятность того, что антитело по настоящему изобретению можно использовать для лечения в клинике путем введения в периферическую вену, и можно полагать, что прогресс в лечении AD антителом будет очевиден сразу же.

Краткое описание фигур

[Фиг.1] На фиг.1 показана аминокислотная последовательность вариабельной области Н-цепи HV0 и модифицированные аминокислотные остатки из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12 в HV2, HV3, HV4, HV5, HV7a, HV7b, HV9 и HV12. Первая и вторая линия на фигуре указывают номера аминокислот в вариабельной области Н-цепи, и буквы на других соответствующих линиях указывают замещенную аминокислоту (представлена однобуквенным кодом).

[Фиг.2] На фиг.2 показана аминокислотная последовательность вариабельной области L-цепи LV0 и модифицированные аминокислотные остатки из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14 в LV2a, LV2b, LV2c, LV2d, LV3 и LV4. Первая и вторая линия на фигуре указывают номера аминокислот в вариабельной области L-цепи, и буквы на других соответствующих линиях указывают модифицированную аминокислоту (представлена одной буквой).

[Фиг.3] На фиг.3 приведены сенсограммы, полученные при оценке связывающей активности каждого гуманизированного антитела против Аβ-олигомера для Аβ-мономеров с использованием системы Biacore.

Описание вариантов осуществления

Гуманизированное антитело против Аβ-олигомера по настоящему изобретению (далее также обозначено как «антитело по настоящему изобретению» или «гуманизированное антитело по настоящему изобретению») представляет собой гуманизированное антитело, отличающееся тем, что оно не связывается с Аβ-мономером. Антитело по настоящему изобретению, предпочтительно, представляет собой выделенное антитело, очищенное антитело или композицию антитела.

Выделенное антитело, очищенное антитело и композиция антитела представляют собой антитела, которые по существу содержат 100% желаемого антитела и не содержат каких-либо примесей, таких как загрязняющие белки, появление которых возможно при получении антитела из антитело-продуцирующих клеток, тканей, антитело-продуцирующих животных и тому подобное.

Антитело является гетеротетрамерным белком, состоящим из двух тяжелых цепей (Н-цепи) и двух легких цепей (L-цепи). Антитело классифицируется как поликлональное антитело и моноклональное антитело, которые распознают один и тот же антиген.

Поликлональное антитело представляет собой смесь антител, которые распознают один и тот же антиген. Примеры поликлонального антитела включают антисыворотку животного-хозяина, иммунизированного антигеном.

Моноклональное антитело представляет собой антитело, секретированное одним клоном антитело-продуцирующих клеток, и которое распознает только один эпитоп (также называемый антигенной детерминантой) и обладает однородностью в аминокислотной последовательности (первичной структуре).

Антитело по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой моноклональное антитело. Примеры моноклонального антитела по настоящему изобретению включают моноклональное антитело, в котором гипервариабельные участки 1-3 (далее обозначены как «CDR») тяжелой цепи антитела (далее обозначена как «Н-цепь») содержат соответственно аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1-2, и CDR 1-3 в L-цепи содержат соответственно аминокислотные последовательности SEQ ID NO:4-6; моноклональное антитело, в котором вариабельная область Н-цепи антитела (далее обозначена как «VH») содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, и вариабельная область L-цепи (далее обозначена как «VL») содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10 и моноклональное антитело мыши против Аβ-олигомера 6Е4.

В качестве примера эпитопа можно привести одну аминокислотную последовательность, которая распознается и связывается моноклональным антителом, конформацию, содержащую вышеприведенную аминокислотную последовательность, вышеприведенную аминокислотную последовательность, с которой связана сахарная цепь, и конформацию, содержащую вышеприведенные аминокислотные последовательности, с которыми связаны сахарные цепи.

Эпитоп для распознавания антителом по настоящему изобретению может представлять собой любой белок, при условии, что он включает по меньшей мере один Аβ-белок и его фрагмент, и он находится на Аβ-олигомере, с которым образует комплекс.

Примеры эпитопа, с которым связывается антитело по настоящему изобретению, включают эпитоп, содержащий первичную аминокислотную последовательность Аβ, которая находится на Аβ-олигомере, эпитоп, содержащий конформацию Аβ-олигомера и тому подобное.

Известно, что Аβ-белок, являющийся основным компонентом амилоида, представляет пептид, содержащий 40-42 аминокислоты и образуется из белка-предшественника, называемого предшественником белка амилоида (далее обозначен как «APP») под действием протеазы.

Молекулы амилоида, образующиеся из АРР, включают нефибриллярный полимер растворимых мономеров и растворимых олигомеров в дополнении к амилоидным волокнам, находящимся в осадке при ультрацентрифугировании.

В настоящем изобретении Аβ-олигомер представляет собой нефибриллярный полимер, и он является Аβ-олигомером, который содержит по меньшей мере один из Аβ-белков и его фрагмент, и образует комплекс.

В частности, примеры Аβ-олигомера включают Аβ40(Аβ1-40)олигомер, Аβ42(Аβ1-42)олигомер и Аβ-олигомер, содержащий по меньшей мере один из Аβ40 и Аβ42.

Кроме того, примеры Аβ-олигомера по настоящему изобретению также включают Аβ-олигомер, содержащий Аβ-фрагмент без N-конца Аβ по меньшей мере в одном из Аβ40 и Аβ42.

В частности, Аβ42-олигомер по настоящему изобретению представляет молекулы с молекулярной массой 45-160 кДа по данным SDS-PAGE и молекулярной массой 22,5-1,035 кДа по данным Blue Native-PAGE.

Аβ42-олигомер выделяют в основном до >100 кДа, удерживая жидкость в молекулярном сите. Кроме того, Аβ-олигомер является смесью конфигураций, которая состоит из молекул в форме частиц, каплевидных молекул и круглых молекул с высотой 1,5-3,1 нм под атомно-силовым микроскопом.

Кроме того, вышеуказанный Аβ42-олигомер элюируется в истинной объемной фракции 8, соответствующей молекулярной массе 680 кДа или выше, и во фракции 15, соответствующей молекулярной массе 17-44 кДа, при использовании гель-фильтрации.

Антитело по настоящему изобретению можно использовать при условии, что оно является гуманизированным антителом, которое связывается с Аβ-олигомером и не связывается с Аβ-мономером, и его источник и форма не ограничиваются.

Предпочтительно, антитело по настоящему изобретению не распознает растворимый β-амилоидный (Аβ) мономер, который является физиологической молекулой, и взаимодействует только с растворимым Аβ-олигомером.

В настоящем изобретении связывание только с растворимым Аβ-олигомером без связывания с растворимым Аβ-мономером означает, что среди Аβ-мономеров и Аβ-олигомеров, которые разделяются ультрафильтрацией и молекулярным ситом, антитело не распознает мономеры (примерно 4,5 кДа), но специфически распознает растворимый Аβ-олигомер, который аналогичен или крупнее Аβ-димеров. Следовательно, предпочтительно, чтобы антитело по настоящему изобретению специфически связывалось с растворимым Аβ-олигомером, который аналогичен или крупнее Аβ-димера.

Антитело по настоящему изобретению предпочтительно обладает по меньшей мере одной активностью из следующего (1)-(5):

(1) активностью против нейротоксичности;

(2) способностью подавлять образование Аβ-амилоидных волокон;

(3) специфичностью распознавать только Аβ-олигомер;

(4) способностью захватывать Аβ-олигомер в мозге пациентов с AD;

(5) способностью предупреждать AD-подобный патогенез (снижение памяти, накопление Аβ в мозге) у APPswe-трансгенных мышей (Tg2576).

Активность антитела по настоящему изобретению, относящиеся к вышеприведенным (1)-(5), можно подтвердить с использованием способа, описанного в международной заявке WO 2009/051220.

Антитело по настоящему изобретению можно получить в виде рекомбинантного антитела. В настоящем изобретении рекомбинантное антитело включает антитела, полученные рекомбинантной технологией, такие как химерное антитело человека, гуманизированное антитело (или антитело с трансплантированным CDR), антитело человека и фрагмент антитела.

Рекомбинантное антитело, имеющее свойства моноклональных антител, обладающее низкой иммуногенностью и длительным периодом полураспада, является предпочтительным в качестве лекарственного препарата. Примеры рекомбинантного антитела включают антитело, полученное модификацией моноклонального антитела по настоящему изобретению с использованием рекомбинантной технологии.

Химерное антитело человека представляет антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи (далее обозначено как «VH») и вариабельную область легкой цепи (далее обозначено как «VL») антитела животного, отличного от человека, и константную область тяжелой цепи (далее обозначено как «CH») и константную область легкой цепи (далее обозначено как «CL») антитела человека.

Химерное антитело человека можно получить с помощью кДНК, кодирующих вышеуказанные VH и VL, из гибридомы, продуцирующей моноклональное антитело, которое специфически связывается с Аβ-олигомером, путем встраивания кДНК в вектор экспрессии животной клетки, содержащий ДНК, кодирующие CH и CL, тем самым конструируя вектор для экспрессии химерного антитела человека, и затем введением вектора в животную клетку для экспрессии антитела.

В качестве вышеприведенной СН химерного антитела человека можно использовать любые СН, при условии, что они относятся к иммуноглобулину человека (далее обозначено как «hIgG»), и которые относятся к классу hIgG, являются предпочтительными, и можно использовать любой из подклассов, относящихся к классу hIgG, такой как hIgG1, hIgG2, hIgG3 и hIgG4.

В качестве вышеприведенной CL химерного антитела человека можно использовать любые CL, при условии, что они относятся к классу hIg, и которые относятся к классу κ или классу λ.

Гуманизированное антитело по настоящему изобретению представляет антитело, в котором аминокислотные последовательности CDR VH и VL антитела, полученные у животного, отличного от человека, пересаживают в соответствующие положения VH и VL антитела человека.

Гуманизированное антитело можно получить конструированием аминокислотной последовательности V-областей, в которых аминокислотные последовательности CDR обеих VH и VL моноклонального антитела, которое продуцируется гибридомой животного, отличного от человека, и специфически связывается с Аβ-олигомером, пересаживаются в каркасные области (далее обозначены как «FR») VH и VL любого антитела человека соответственно, конструированием кДНК, кодирующих V-области, вставкой каждой из них в вектор экспрессии животных клеток, содержащих гены, кодирующие CH и CL антитела человека, тем самым получив вектор для экспрессии гуманизированного антитела, и его введением в животную клетку для экспрессии и продукции гуманизированного антитела.

В качестве аминокислотных последовательностей FR VH и VL гуманизированного антитела можно использовать любые аминокислотные последовательности, при условии, что они являются аминокислотными последовательностями VH и VL, соответственно, полученными из антитела человека.

Примеры включают аминокислотные последовательности FR VH и VL антител человека, зарегистрированных в базе данных, такой как Protein Data Bank, обычные аминокислотные последовательности каждой подгруппы FR VH и VL антител человека, описанных в Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991) и тому подобное.

Примеры гуманизированного антитела по настоящему изобретению включают гуманизированное антитело, в котором CDR 1-3 в VH антитела содержат аминокислотные последовательности, соответственно SEQ ID NO:1-3, и CDR 1-3 в VL антитела содержат аминокислотные последовательности, соответственно SEQ ID NO:4-6.

Гуманизированное антитело по настоящему изобретению, предпочтительно, представляет собой гуманизированное антитело, содержащее по меньшей мере одну из следующих (а) VH и (b) VL. Кроме того, в следующих (а) и (b) число введенных замен не ограничивается: (а) VH, содержащая аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12 или аминокислотную последовательность, в которой по меньшей мере один аминокислотный остаток, выбранный из Lys в положении 12, Val в положении 20, Arg в положении 38, Gln в положении 39, Leu в положении 45, Met в положении 48, Arg в положении 67, Val в положении 68, Ile в положении 70, Ala в положении 72, Thr в положении 74 и Ala в положении 97 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12, замещен другим аминокислотным остатком;

(b) VL, содержащая аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14 или аминокислотную последовательность, в которой по меньшей мере один аминокислотный остаток, выбранный из Ile в положении 2, Pro в положении 15, Gln в положении 50 и Tyr в положении 92 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14, замещен другим аминокислотным остатком.

Предпочтительные примеры VH, входящей в состав гуманизированного антитела по настоящему изобретению, включают, например, VH, содержащую аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12, Val в положении 20, Arg в положении 38, Gln в положении 39, Leu в положении 45, Met в положении 48, Arg в положении 67, Val в положении 68, Ile в положении 70, Ala в положении 72, Thr в положении 74 и Ala в положении 97 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12, замещены другими аминокислотными остатками.

Кроме того, VH, выбранная из следующих (1)-(9), также является предпочтительной в качестве VH, входящей в гуманизированное антитело по настоящему изобретению:

(1) VH, содержащая аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12, Val в положении 20, Arg в положении 38, Gln в положении 39, Leu в положении 45, Met в положении 48, Arg в положении 67, Val в положении 68, Ala в положении 72, Thr в положении 74 и Ala в положении 97 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12, замещены другими аминокислотными остатками;

(2) VH, содержащая аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12, Arg в положении 38, Gln в положении 39, Leu в положении 45, Met в положении 48, Arg в положении 67, Val в положении 68, Ala в положении 72, Thr в положении 74 и Ala в положении 97 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12, замещены другими аминокислотными остатками;

(3) VH, содержащая аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12, Gln в положении 39, Leu в положении 45, Met в положении 48, Arg в положении 67, Val в положении 68, Ala в положении 72, Thr в положении 74 и Ala в положении 97 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12, замещены другими аминокислотными остатками;

(4) VH, содержащая аминокислотную последовательность, в которой Gln в положении 39, Leu в положении 45, Met в положении 48, Arg в положении 67, Val в положении 68, Thr в положении 74 и Ala в положении 97 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12, замещены другими аминокислотными остатками;

(5) VH, содержащая аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45, Met в положении 48, Arg в положении 67, Val в положении 68, Ala в положении 72, Thr в положении 74 и Ala в положении 97 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12, замещены другими аминокислотными остатками;

(6) VH, содержащая аминокислотную последовательность, в которой Gln в положении 39, Leu в положении 45, Met в положении 48, Arg в положении 67 и Ala в положении 97 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12, замещены другими аминокислотными остатками;

(7) VH, содержащая аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45, Met в положении 48, Arg в положении 67 и Ala в положении 97 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12, замещены другими аминокислотными остатками;

(8) VH, содержащая аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45, Met в положении 48 и Ala в положении 97 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12, замещены другими аминокислотными остатками;

(9) VH, содержащая аминокислотную последовательность, в которой Leu в положении 45 и Ala в положении 97 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12, замещены другими аминокислотными остатками.

Примеры аминокислотной последовательности VH включают аминокислотную последовательность, в которую введена по меньшей мере одна модификация, выбранная из модификаций замещением Lys в положении 12 на Val, Val в положении 20 на Leu, Arg в положении 38 на Lys, Gln в положении 39 на Leu, Leu в положении 45 на Phe, Met в положении 48 на Ile, Arg в положении 67 на Val, Val в положении 68 на Ala, Ile в положении 70 на Leu, Ala в положении 72 на Val, Thr в положении 74 на Lys и Ala в положении 97 на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12.

Более конкретные примеры аминокислотной последовательности VH включают аминокислотные последовательности, в которые введено от 12 до 1 следующих замен.

Конкретные примеры аминокислотной последовательности VH, в которую введено 12 замен, включают аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12.

Конкретные примеры аминокислотной последовательности VH, в которую введено 11 замен, включают следующие аминокислотные последовательности (1)-(12):

(1) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(2) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(3) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(4) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(5) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(6) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(7) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(8) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(9) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(10) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(11) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(12) аминокислотную последовательность, в которой Lys в положении 12 замещен на Val, Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val и Thr в положении 74 замещен на Lys в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12.

Конкретные примеры аминокислотной последовательности VH, в которую введено 10 замен, включают, например, следующие аминокислотные последовательности (1)-(66):

(1) аминокислотную последовательность, в которой Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(2) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(3) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Leu в положении 45 замещен на Phe, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(4) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Met в положении 48 замещен на Ile, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(5) аминокислотную последовательность, в которой Val в положении 20 замещен на Leu, Arg в положении 38 замещен на Lys, Gln в положении 39 замещен на Leu, Leu в положении 45 замещен на Phe, Arg в положении 67 замещен на Lys, Val в положении 68 замещен на Ala, Ile в положении 70 замещен на Leu, Ala в положении 72 замещен на Val, Thr в положении 74 замещен на Lys и Ala в положении 97 замещен на Thr в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12;

(6) аминокислотную последовате